JPH01132379A - 新規ウレアーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酒類又は酒類発酵もろみ中に含まれ、酒類の
酒質劣化の原因となる°尿素を分解することのできる新
規なウレアーゼ及びその製造法、更に詳しくは、アルス
ロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新
規微生物の生産する酸性領域に反応至適ｐｌを持ち耐酸
耐アルコール性を有する新規なウレアーゼ及びその製造
法に関する。

従来の技術及び本発明の解決しようとする問題点 清酒、ビール、ブドウ酒、醤油などの発酵食品中には尿
素が含まれている。この尿素は発酵に関与する酵母、カ
ビの生産するアルギナーゼという酵素により、アミノ酸
の１種であるアルギニンから発酵中に生成する。通常、
酒類中には２〜８０ｐｌ）［１１含まれるが、かす歩合
をへらし、収得歩合を高めることを目的としてもろみを
長時間発酵させた場合は１１００ｐｐ以上に達すること
もある。

酒類に含まれる尿素は、その含有量が多いと酒に苦味を
与え、また加熱殺菌、長期間の貯蔵により酒類の着色増
加、香味の劣化を引き起こす原因となる。

また、酒類中から発がん性の高い化合物であるエチルカ
ルバメイトが検出され問題となっている。

（Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　２４．
３２３．１９７６）エチルカルバメイトの生成機構は未
だ解明されていないが、主として尿素あるいはカルバミ
ルリン酸から生成されるという説が有力である。すなわ
ち、酒類中に共存する尿素とエチルアルコールが非酵素
的に反応し、エチルカルバメイトが生成することが考え
られている。

近年、変敗防止のため比較的高温（６５℃以上）で長時
間（１０分以上）にわたり加熱殺菌をする必要が生じ、
また、酒類の多用化に伴い醸造酒を長期間貯蔵する方法
が行なわれるようになった。これに伴い、加熱又は長期
間貯蔵による着色や香味の劣化防止、および発がん物質
であるエチルカルバメイトの生成防止のために、この解
決手段として植物（刀豆）由来のウレアーゼ酵素剤を添
加することにより尿素を二酸化炭素とアンモニアに分解
する方法が知られている（特公昭５Ｂ　−２０８３０）
。

また、蒸留酒においても蒸留に供する発酵もろみ中の尿
素を除去する目的でウレアーゼ処理を行なうことは、高
温下で促進されるエチルカルバメイト生成を防止する上
から有効であると考えられる。

しかし、この目的に叶った特性を有するウレアーゼはほ
とんど知られていないのが現状である。

すなわち通常、ウレアーゼの多くは中性、微アルカリに
酵素反応至適ｐＨを持ち（特公昭６０−５５１１９、特
開昭５９−１７９８７、特開昭６ｌ−２５７１８３）　
、酒類のような酸性ｐ１１、高濃度アルコール下ではほ
とんど活性を示さず、しかも著しく不安定であることが
知られている〔ナタ豆ウレアーゼ；Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７３．１８５．１９７７、バチルス
　パスツエリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｓｔｅｕｒｉｉ
）ウレアーゼ；　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ３ｒｄ　ｅｄ
、　４．１．１９７１など〕。従って、本発明の目的は
、発酵食品（とくに酒類）中に含まれる尿素を効率良く
分解できる特性、すなわち酸性域に反応至適ｐＨを持ち
、適度の耐酸性ならびに耐アルコール性を有するウレア
ーゼを提供することにある。

本発明の菌株と同居のバクテリアであるアルスロバクタ
ー　オキシダンス（Ａ、　ｏｘｙｄａｎｓ）がウレアー
ゼを生成することが知られているが（Ａｒｃｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３９．３５５．１９８４）、
多くのバクテリア由来ウレアーゼ同様に反応至適ｐｌを
中性域を持ち、本発明の目的には即さないものである。

酸性域に反応至適ｐＨを持つ数少ないウレアーゼとして
、嫌気性菌ラクトバチルス　ファーメンタム（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の生成する
ウレアーゼが知られている（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

３７、．３７９．１９７９）。

しかし、この菌株の生産するウレアーゼは菌体に対して
膜結合性が強く精製が難しいという欠点があり、満足す
べきものではなかった。

問題点を解決する手段 本発明者らは、酒類のように酸性ｐＨ１高濃度アルコー
ル存在下において含有する尿素を分解する特性を持つウ
レアーゼを広く自然界より検索した結果、アルスロバク
タ−に属する一菌株が、上記目的に叶う特性を有するウ
レアーゼを生産することを見いだした。本菌株を液体培
養又は固体培養することによりウレアーゼを生産させ、
これを必要に即して精製純化することにより酒類中の尿
素除去作用酵素剤として効率的に利用することができる
。すなわち、本発明は新規なウレアーゼ及び該酵素の製
造方法に関する。

本発明者らは、酸性ｐＨ域において有効な活性を示すウ
レアーゼを産生ずる微生物を探索した結果、北海道沙流
郡日高町の牧草地土壌から分離した微生物が酸性ウレア
ーゼを産生じていることを見いだした。本発明において
用いる微生物の菌学的特徴を以下に述べる。

（Ａ）形　態 （１）細胞は多形性を示す。２４時間以上培地上で生育
させた菌体は幅約０．８μｍ１長さ約１．０μｍの短か
ん菌であるが、これを新鮮なし培地（ポリペプトン１％
、Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　Ｏ、５％、ＮａＣｌ　
Ｏ，５％、グルコース０．１％、　ｐＨ７，０）に接種
し、３０℃で振盪培養すると、約３時間後には幅約０．
８μｍ１長さ約２．５μｍのかん菌となり、７字型の細
胞も観察される。さらに培養を続けると約９時間後から
しだいに分裂を生じ、約２４時間後には再びもとの球状
に近い短かん菌となる。

（２）胞子を形成しない。

（３）運動性があり、べん毛は極毛である。

（４）　　ダラム染色性は、Ｌ培地に寒天１．５％を加
えた培地で３０℃、２４時間培養したとき、陰性を示す
が、同じ条件で培養した菌体をアラニンアミノペプチダ
ーゼ活性によりダラム反応性を調べたところ陽性を示す
。

（Ｂ）培地における生育状態 （１）肉汁液体培地 菌体は淡黄色で、底に沈渣がみられ、全体的に濁りが観
察される。

（２）肉汁寒天平板培地 発育は旺盛で、菌体は淡黄色を呈する。コロニーの直径
は約３〜５ｍｍで、表面は滑らかで光沢があり、周縁は
金縁を呈する。

（３）肉汁寒天斜面培地 （２）と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培地 ゼラチンを液化する。

（５）　　リドマスミルク リドマスミルクを淡褐色に変色させるが、凝固、液化は
認められない。

（Ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の還元　＋ （２）デンプンの加水分解　　　＝ （３）カゼインの分解　　− （４）５％ＮａＣｌに対する耐性　　　　斗（５）　　
１０％ＮａＣｌに対する耐性　　　　＋（６）カタラー
ゼの生成　　＋ （７）オキシダーゼの生成　　　− （８）ウレアーゼの生成　　＋ （９）細胞外Ｄ　Ｎ　ａｓｅの生成　　　＋（１０）ゼ
ラチンの液化能　　＋ （１１）酸素に対する態度　　好気性 （１２）生育温度範囲　１０℃〜３６℃至適生育温度；
８１℃ （１３）生育ｐＨ範囲　　　　　　　　　６．０〜１Ｏ
１０至適　　ｐＨ；　７．８ （Ｄ）糖から酸およびガスの生成 酸　の　ガスの 生成生成 （１）Ｌ−アラビノース　　　　　−−（２）Ｄ−キシ
ロース　　　　−− （３）Ｄ−グルコース　　　　−　　−（４）Ｄ−マン
ノース　　　　−− （５）、Ｄ−フラクトース　　　　　−−酸　の　ガス
の 生成生成 （６）Ｄ−ガラクトース　　　　　−　　　−（７）マ
ルトース　　　−　− （８）サッカロース　　　−− （９）　　ラ　　り　　ト　　−　　ス　　　　　　　
　　　−−（１０）　）レバロース　　　　−　　−（
１１）可溶性デンプン　　　　−　　−（１２）　Ｄ−
ソルビット　　　　　−−（１３）　Ｄ−マンニット　
　　　　−−（１４）　イ　　ノ　　シ　　ッ　　ト　
　　　　　　　　　　−　　　　　　　−（１５）　グ
　　リ　　セ　　リ　　ン　　　　　　　　　−−（Ｅ
）炭素源の資化性 （１）４−アミノ−酪酸　　　士 （２）ｐ−ヒドロキシ安息香酸　　− （３）　　Ｌ　−ロ　　イ　　シ　　ン　　　　　　　
±（４）Ｌ−アスパラギン　　　＋ （５）Ｌ−アルギニン　　　＋ （６）Ｌ−ヒスチジン　　− （７）Ｄ−キシロース　　　＋ （８）Ｄ−リ　ボ　−　ス　　　　＋ （９）Ｄ−アラビノース　　　＋ （１０）　Ｌ−ラムノース　　　＋ （１１）イノシトール　　　± （１２）　マ　　　ロ　　　ン　　　酸　　　　　　　
士（１３）り　　エ　　ン　　酸　　　　　−（１４）
　グ　　ル　　コ　　−　　ス　　　　　　　＋なお、
炭素源の資化性については、ツエントラルブラット　フ
ユーア　バクテリオロギ−（Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ
　ｆｕｒ　Ｂａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ）第１巻。

３５７〜３７５頁、　１９８０年に従って試験を行なっ
た。

（Ｆ）有機酸の利用性 （１）クエン酸　　　　− （２）　　ギ　　　　　酸　　　　　　　　　十（３）
マロン酸　　　　− （４）　　ゲルタール酸　　　　　　　士（５）アジピ
ン酸　　　　　− （６）ピメリン酸　　　　　　− （７）　　尿　　　　　酸　　　　　　　　　−（８）
安息香酸　　　　− （９）　　プロピオン酸　　　　　　　　十なお、有機
酸の利用性については、ザ・ジャーナル・オブ９ジェネ
ラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｔ
ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ　
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１８巻
、　３９９〜４１６頁、　’　１９７２年に従って試験
を行なった。

（Ｇ）ＤＮＡのＧＣ含量 ＤＮＡのＧＣ含量は、６５．２％であった。測定は、Ｆ
ＥＭＳ・マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）第２５巻
、　１２５〜１２８頁、　１９８４年に従って行なった
。

（Ｈ）細胞内キノンの分子種の同定 ＭＫ−９（Ｈ２）を主成分として有する。測定は、山田
雄三、倉石行著　ユビキノンとメナキノン　駒形相男編
「微生物の化学分類実験法」、１４３〜１５５頁、　１
９８２年、学会出版センター出版（東京）に従って行な
った。

（１）菌体内脂肪酸組成 菌体内脂肪酸組成（％）は、分枝（イソ、アンチイソ）
脂肪酸が主成分で、不飽和脂肪酸はは−１Ａ　　　　− とんど含まれていない。各脂肪酸組成比を第１表に示す
。

第　　　１　　　表 測定は、インターナショナルφジャーナル番オブ・シス
テマティック・バクテリオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第３３巻、　１８８〜２
００頁、　１９８３年に従って行なった。

（Ｊ）細胞壁のペプチドグリカンタイブ本菌は細胞壁の
ペプチドグリカン中のジアミノ酸としてリジンを有し、
ペプチドグリカンタイブは、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ａｌａ型である。

細胞壁ペプチドグリカン中のジアミノ酸の決定、および
構成アミノ酸のモル比は、ザ・ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ
　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１６
巻、　１０３〜１１３頁、　１９７０年に従って細胞壁
の精製と加水分解を行ない、アミノ酸自動分析機（［Ｔ
ＡＣＨＩ　ＡＭＩＮＯＡＣＩＤＡＮＡＬＹＺＥＲ８３５
−５０）を用いて行なった。

ただし、菌体の破砕には超音波破壊機を用いた。

ペプチドグリカンタイブは、本菌株の細胞壁のアミノ酸
組成モル比が、リジン：グルタミン酸：アラニン：スレ
オニン−１：１：４：１であることよりジャーナル台オ
ブ争バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１３巻、　　８〜１７頁。

１９７３年に従うと、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ
型かＬｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ型のどちらかであ
ると考えられる。

上記文献に従えば、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ型
のペプチドグリカンを酸部分加水分解して生じたオリゴ
ペプチドにはＴｈｒ−Ｌｙｓが存在し、Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ａｌａ型ではＡｌａ−ＬｙＳが存在する。

そこで、本菌株の細胞壁ペプチドグリカンを４Ｎ　　Ｍ
ＣＩで３０分及び１時間、１００℃にて部分加水分解し
生じたオリゴペプチド及び合成したＡｌａ−Ｌｙｓ、Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓのジペプチドをそれぞれ、アミノ酸自動分
析機（ＨＩＴＡＣＨＩ　ＡＭＩＮＯＡＣＩＤＡＮＡＬＹ
ＺＥＲ８３５−５０）で分析し、保持時間を比較したと
ころ本菌株の細胞壁ペプチドグリカンの酸部分加水分解
物にはＴｈｒ−Ｌｙｓと保持時間が一致するピークが検
出されたが、Ａｌａ−Ｌｙｓの保持時間と一致するピー
クは検出されなかった。

また、本菌株の細胞壁ペプチドグリカンの酸部分加水分
解物と合成Ｔｈｒ−Ｌｙｓを混合し、アミノ酸自動分析
機にかけたところ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓと一致するピークの
面積が増加し、このペプチドグリカン部分加水分解物中
にＴｈｒ−Ｌｙｓが存在することが確認できた。

以上の結果、本菌株はＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ
型のペプチドグリカンを有することが明らかになった。

（Ｋ）ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑試験 細胞壁ペプチドグリカンタイブがＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ型であるアルスロバクタ−シトレウスＩ　Ａ
Ｍ１２３４４　（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｉｔｒ
ｅｕｓ　ＩＡＭ１２３４１）および細胞壁ペプチドグリ
カンタイブがＬｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ型である
アルスロバクタ−ウレアファシェンスＩ　ＡＭ１６５８
　（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
　ＩＡＭ１Ｂ５ｇ）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性（％）を
第２表に示す。

測定は、インターナショナル会ジャーナル・イブ・シス
テマテインク・バクテリオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第３１巻、　１３１〜１
３８頁、　１９８１年に従って行なった。

以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株ＳＡＭ０７５２
の分類学的地位をパージエイズ・マニュアル・イブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻により求めると、ダラム陽
性の好気性菌で多形性を示し、胞子を形成せず、ＤＮＡ
のＧＣ含量が６５．２％であることから、本菌株はコリ
ネフォームグループに属する細菌であると考えられる。

さらに、細胞壁のペプチドグリカン中にリジンを含むこ
と、細胞内キノンとしてＭＫ−９（Ｈ２）を有し、菌体
脂肪酸組成が１２−メチルテトラデカン酸（ａ−１５）
　、１４−メチルヘキサデカン酸（ａ−１７）を主成分
とする分枝型であることから、ザ・ジャーナル・イブφ
ジェネラル・アンド・アブライド・マイクロバイオロジ
ー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａ
ｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ）第
１８巻、４１７〜４３１頁、　１９７２年、第２２巻、
２０３〜２１４頁、　１９７６年、およびインターナシ
ョナル会ジャーナル・イブ・システマティック・バクテ
リオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第３３巻、　１８８〜２００頁、　１９８３年
に従うと本菌株はアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属に属する細菌であると考えられる。

さらに詳しい検討を行った結果、本菌株の細胞壁のペプ
チドグリカンタイブが、Ｌ　ｙｓ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ａｌａ型である事から、アルカイブス・イブ・マイクロ
バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ）第１２巻、　２８９〜２９５頁、　１９７
９年及びジャーナル・イブ・バクテリオロジ−（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１３
巻、８〜１７頁。

１９７３年により、本菌株はアルスロバクタ−シトレウ
スと同じグループに含まれる事が判明した。

なお、アルスロバクタ−属でＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ａｌａ−型のペプチドグリカンタイブを有する種は現在
のところアルスロバクタ−シトレウスしか知られていな
い。

本菌株とアルスロバクタ−シトレウスＩＡＭ１２３４１
（基準菌株）との生理的性質の相違点としては、第３表
に示すように、クエン酸の利用、マロン酸の利用、１０
％ＮａＣｌに対する耐性、ウレアーゼの生成能、および
アルギニン、キシロースの資化性で異なっている。

さらに、本菌株とアルスロバクタ−シトレウスＩ　ＡＭ
１２３４１　、およびアルスロバクタ−ウレアファシェ
ンスＩ　ＡＭ１６５８　（基準菌株）とのＤＮＡ−ＤＮ
Ａ交雑試験を行った結果、本菌株は、これら２種のいず
れとも３０％以下の相同性を示し、これら２種とは別種
と考えられる。

以上のことから、本発明者らは、本菌株ＳＡＭ０７５２
はアルスロバクタ−属の新菌種に属するものであると判
断し、この新菌種をアルスロバクタ−モビリス（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｍｏｂｉｌｉｓ）と命名した。

アルスロバクタ−モビリスＳＡＭＯ７５２は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第９６５８号（Ｆ　
Ｅ　ＲＭ　　Ｐ　−９６５８）として寄託されている。

第　　　３　　　表 本菌株の培養は通常行なわれている通気撹拌培養、振盪
培養、静置培養などの液体培養法もしくは固体培養法を
用いて行なうことができる。

培養培地組成としては、炭素源としてグルコース、澱粉
、シュクロース、ラクトースなど、窒素源としてペプト
ン、酵母エキス、尿素、硫酸アンモニウムなど、無機塩
としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウムなど、その他必要に応じてＺｎ　　、Ｃｕ＋＋、Ｆ
ｅ＋＋、Ｎｉ　　などの微量金属やビオチン、チアミン
などのビタミン類などを適宜加えたものを用いる。培養
温度は生育できる範囲ならとくに限定されないが、３０
℃付近が望ましい。培養はいずれの培養法においても１
５〜７２時間行なう。

このような方法で得られた培養物からウレア−。

ゼを採取するには、はじめに遠心分離法や濾過法などに
より培養物をブロス画分と菌体濃縮画分に分画する。菌
体濃縮画分は更にガラスピーズ法、フレンチプレス法、
超音波処理法、自己溶解法などを単独あるいは組み合わ
せ菌体破砕を行ない、菌体残渣を除去することにより粗
酵素標品を得ることができる。

更に、必要に応じた濃縮標品や精製標品を得るためには
、限外濾過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、等電点沈殿など周知の精製手法を単独
あるいは組み合わせることにより達成することができる
。

このようにして精製された本菌株の生産するウレアーゼ
の酵素学的性質は以下のとおりである。

１）熱安定性 ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）および２０％（ｖ／
ｖ）エタノール含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）
中で１０〜７０℃、１５分間処理し、各温度における残
存活性を測定した結果、エタノール無添加では４０℃、
エタノール含有条件では５０℃までほぼ安定である。（
第１図） ２）至適温度 １）と同様の緩衝液における至適温度は、エタノール無
添加では５０℃付近、エタノール含有条件では６０℃付
近にある。（第２図） ３）　ｐＨ安定性 ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，２〜５．５）、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ５，０〜８．５）を用い、エタノー
ル無添加、２０％エタノール含有の両条件下、４℃、１
６時間処理した後の残存活性から、両条件下においてと
もにｐＨ４，５以上で安定である。（第３図）４）至適
ｐＨ ０６１Ｍ酢酸緩衝液における至適ｐｌは、エタノール無
添加ではｐＨ４，２付近、２０％エタノール含有条件で
はｐＨ５，０付近である。（第４図）５）エタノール耐
性 ０〜８０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有した０、１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）中での酵素活性は２５％付近
まで安定であり、無添加に比べて活性が増加する傾向が
認められた。（第５図） ６）尿素に対するＫｍ値 ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）、３７℃における本
酵素の尿素に対するＫｍ値は、エタノール無添加におい
ては約３．６ｍＭ、　’２０％２０％エタノール含有で
は約３．１ｍＭである。

７〉分子量 高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過法により分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は約２４０，０００
であった。ゲル濾過担体としてＴＳＫ　　Ｇ３０００Ｓ
Ｗ　　ＸＬ分析用カラム（東ソー社製）を用い、０．７
Ｍ　　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ　）リス・塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）を０．５ｍｌ／分の流速で流したとき
の各種標準タンパク質（オリエンタル酵母社製）との相
対溶出保持時間から分子量を算出した。

（７）分子量 ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による本酵素のサ
ブユニット分子量は６７０００であった。

Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ電気泳動装置（ゲルはＰｈａ
ｓｔ　Ｇｅ１Ｇｒａｄｉｅｎｔ　８−２５使用、ファル
マシア製）を用い、各種標準蛋白質との相対移動度から
求めた。本酵素は四量体であると思われる。

（８）等電点 等電点電気泳動法により本酵素のｐＩは６．８付近であ
った。Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ電気泳動装置（ゲルは
Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌ　ＩＥＰ　３−９を使用、ファルマ
シア製）を用い、各種標準蛋白質（ＢＤＨケミカル製）
との相対移動度から求めた。

（９）基質特異性 尿素に類似の化合物について、基質濃度１００ｍＭにお
ける酵素反応を行なわせた結果、本酵素は尿素にきわめ
て特異性が高かった（第４表）。

（１０）阻害剤 本酵素はＨｇ　　、Ａｇ　　、Ｃｕ　　なとの金属イオ
ンによって反応が阻害される（第５表）。

基　質（ｌｏｏｍＭ）　　　相対活性（％）Ｕｒｅａ　
　　　　　　　　　　１００．ＯＮ−Ｍｅｔｈｙｌｕｒ
ｅａ　　　　　　　　１．７＊Ａｃｅｔａｍｉｄｅ　　
　　　　　　　Ｏ，０Ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ　　、　　
　　　　　　０．０Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　・ＩＩ　Ｃｌ
　　　　　　Ｏ，０Ｔｈｉｏｕｒｅａ　　　　　　　　
　　Ｏ，Ｏ８ｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ　　　　　　　
１．０＊Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ　　　　　　　　Ｏ，
０Ｅｔｈｙｌｕｒｃｔｈａｎｃ　　　　　　　Ｏ，ＯＣ
ａｒｂａｍｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　　　　Ｏ，０
金属塩（１ｍＭ）　　　　相対活性（％）無添加　　　
　　　１００ Ｃａ　Ｃ１２８１ Ｍ　ｎ　Ｃ１２１０２ Ｂ　ａ　Ｃ１２５９ Ｎ　ｉＣ１２６１ Ｃｏ　Ｃ１２１００ Ｃｕ　Ｃ１２３ ＰｂＣ１２１１５ ＣｄＣ１２１２５ ＢｇＣ１２３ Ｚ　ｎ　Ｃ１２６８ ＡｇＮＯ３０ Ｋ　ＣＩ　　　　　　　　１００ ＮａＣＩ　　　　　　　９５ 活性測定は、単位時間中に基質である尿素が酵素反応に
より分解し生じるアンモニアを定量する一　　２８　− ことにより行なった。具体的には、通常、０．２ｍｌの
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）、０．０２５ｍ１の
０．１Ｍ尿素液を混合した反応液に０．０２５ｍ１の酵
素液を加え、３７℃で所定の時間（１０〜２０分）イン
キュベーションを行ない、反応は０．０２５ｍ１の３３
％トリクロロ酢酸溶液を添加し停止させる。反応停止さ
せた上記反応液を１ｍｌの発色液〔発色液は０．３Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を１０ｍ１、メタノール１ｍ
ｌ当たり２５■の０−フタルアルデヒドを溶解した液を
０．５６ｍ１、メタノール１ｍｌ当たり５μｍのメルカ
プトエタノールを溶解した液を０．５６ｍ１ずつ混合し
て調整する〕に添加し、室温にて４５分間放置した後の
４１０Ｂｍ吸光度の増加を測定し、同時に塩化アンモニ
ウムを標準物質として作成した定量曲線がら酵素活性を
算出した。この方法は、ｌ１ｅｉｎｉらの方法に準じて
いる（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２．５
４１゜１９８７）。酵素の活性単位（ユニット）はアン
モニア生成量μｍｏｌ／分として定義した。

本発明の新規微生物の生産するウレアーゼは、上記の酵
素学的緒特性から新規ウレアーゼと考えられる。

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例　１ ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１
０，５％、ｐＨ７，２の培地２００ｍ１ずつを５００ｍ
１マイヤーフラスコに入れ１２０℃にて１５分間オート
クレーブ殺菌したものに、本菌株を一白金耳ずつ植菌し
、２８℃、２４時間振盪培養した。これを以下に述べる
本培養のための種菌として用いた。

グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、肉エキス
０．０５％、酵母エキス０．００１％、ＫＨ２ＰＯ４０
，２％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７，２の培地３０ｇを
５０Ｑ通気撹拌培養槽に入れ、３０分間蒸気殺菌したも
のに上に記した培養種菌を植菌し、０　、８ｖｖｍ、３
０℃にて２４時間培養を行なった。培養終了後、培養物
を遠心処理し得られた菌体を１０ｍＭのリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）で洗浄し、湿重量８０ｇの菌体を得た。

上記のリン酸緩衝液に懸濁した菌体を、ダイノミル（Ｗ
ｉｌｌｙ　Ａ、　Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製、ガラスピーズ
径０．１　ｍｍ、流速６０ｍ１／分）を用い破砕した。

得られた菌体破砕液中には１３０００ユニツトの酵素活
性が含まれていた。また、比活性は１．０ユニツト／　
ｍｇタンパクであった。

菌体破砕液（１，６ｇ）を、あらかじめ１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）にて平衡化しておいたイオン交換
樹脂ＦＰ　　ＤＡ１３カラム（三菱化成社製、６×１０
ｃｍ）にかけ、上記リン酸緩衝液（２，０ｇ）に０〜０
．８Ｍ　　Ｋ　ＣＩの直線勾配をつけて溶出させ、主要
なウレアーゼ活性画分６００ｍ１　（９６００ユニツト
）を得た。この標品の比活性は５．０ユニツト／　ｍｇ
タンパクであった。

次に上記活性画分を用い、疎水クロマトグラフィーによ
る精製を行なった。あらかじめ２．５ＭＫＣｌを含有す
ル０．１Ｍ　ＩＪ　ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ニおいて
平衡化しておいたブチル　トヨパール６５０Ｃ（東ソー
社製、３Ｘ３０ｃｍ）に同じ＜　　２．５ＭＫＣｌとな
るように調製しておいた活性画分をのせ、蒸留水を希釈
液としＫＣＩの濃度を直線的に低下させながら酵素活性
画分を溶出させた。得ら−３１＝ れた標品の総活性は４８００ユニツト、比活性は４０ユ
ニツト／■タンパクであった。

実施例　２ 実施例１で得られた酵素（６０ｍｇタンパク）を２０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）で透析し
、透析酵素標品を得た。本標品を用い更にイオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを組み
あわせ精製を行った。透析に用いた緩衝液で平衡化した
ＰＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）に透析標
品をのせ２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ緩衝液にＮａＣ
ｌの濃度を直線的に上昇させて酵素活性画分を溶出させ
た。

得られた標品の総活性は１２００ユニツトで、比活性は
１８０ユニット／ｍｇタンパクであった。

さらに７０％飽和硫安により沈澱濃縮せしめ、遠心分離
後、少量の０．７Ｍ　　ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス
・塩酸緩衝液に溶解した。溶解に用いた緩衝液で平衡化
したＴ　Ｓ　Ｋ　　Ｇ３０００ＳＷＸ　Ｌカラム（東ソ
ー社製）を用い、上記緩衝液を流速０．５ｍｌ／分で流
し分離溶出してきた酵素活性両分を集めた。この操作に
より、得られた精製物は総活性５８０ユニット、比活性
９７０ユニツト／　ｍｇタンパクであった。

実施例　３ 実施例１で得られたウレアーゼ標品を用いて、清酒（こ
の実施例では、エタノール１９％、ｐＨ４，０のものを
用いた）中に含まれる尿素の分解除去についてみた。

清酒１０ｍ１に最終的に０〜８ユニット／ｍｌとなるよ
うにウレアーゼ酵素標品を添加し低温下（１０℃）でイ
ンキュベーションし、反応させた清酒を０．１ｍｌずつ
経時的に採取し、これを３３％トリクロロ酢酸１．８μ
ｌを添加することにより反応停止させ５μＩの１．ＯＮ
水酸化ナトリウムで中和した後に、尿素・アンモニア定
量Ｆキット（ベーリンガーマンハイム、山之内■社製）
を用い、残存尿素含量を測定した。その結果は、第６図
に示したように、ここで用いた酵素力価においては、す
べての場合において４８時間内に尿素を測定限界値（〜
１　ｐｐｍ）以下にまで分解除去することが認められた
。

なお、この清酒について、ウレアーゼ添加による味臭い
の変化について官能試験を行なったが、ウレアーゼ添加
による異味異臭は全く認められなかった。

実施例　４ ウレアーゼ標品による清酒中の尿素の分解活性について
温度の影響をみた。清酒はエタノール１９％、ｐＨ４、
１のものを用い、最終酵素量４ユニツト／ｍ１で反応を
行なった。残存尿素量測定法などはすべて実施例３と同
じである。結果を第７図に示すように、中温域（２０〜
３７℃）では速やかに尿素を測定限界値以下にまで分解
除去することが認められた。

実施例　５ 発酵もろみにおける尿素除去について清酒最終発酵もろ
み（エタノール１９％、Ｉ）Ｈ４，Ｌ　、尿素３５ｐｐ
ｍ）およびバーボンウィスキー用発酵最終もろみ（エタ
ノール８．５％、ｐＨ４，２、尿素４５ｐｐｍ）を用い
本ウレアーゼの効果を見た。ウレアーゼ添加条件、反応
処理法、残存尿素の測定方法などすべて実施例３と同じ
に行ない、どちらの場合にも４８時間内に尿素を測定限
界値以下にまで分解除去することが認められた。

実施例　６ 清酒に本発明菌株生菌体を添加することによる尿素分解
について検討した。本菌株の生菌体は、実施例１で述べ
た種菌調製用培地に一白金耳の本菌株を植菌し２８℃で
２４時間振盪培養し、この培養物から遠心処理により得
られた菌体を蒸留水で三度洗浄したものを培養物に対し
て十倍濃縮になるように懸濁して用いた。清酒は、実施
例３と同じものを用いた。清酒１０ｍ１に対し菌懸濁液
０．１ｍｌを加え、１０℃で４８時間放置した結果、対
照として蒸留水を加えた清酒中に３１ｐｐｍ含まれてい
た尿素が測定限界値（〜１　ｐｐｍ）以下にまで低下し
ていた。

実施例　７ 実施例２で得た精製ウレアーゼ標品５．Ｏｍｇ（５５０
ユニツト）を含んだ水溶液５０ｍ１中にキトサンビーズ
ＢＣＷ−３０１３（富士紡績社製）　１０００粒を加え
、２時間室温で穏やかに撹拌した。ここに５％ゲニピン
水溶液５ｍｌを加え更に１８時時間中かに撹拌した。キ
トサンビーズを集め、蒸留水１０ｍ１で２度洗浄してウ
レアーゼ固定化ビーズを得た。

本ビーズのウレアーゼ酵素活性は５００ユニツト／１０
００ビーズであった。実施例３で用いた清酒１０ｍ１に
本ウレアーゼ固定化ビーズ５０粒を添加し撹拌しながら
３０℃で１０時間反応させた後の残存尿素量を測定した
ところ測定限界値以下にまで尿素が分解されていた。

発明の効果 本発明のウレアーゼ標品、あるいはこのウレアーゼを生
産する本菌株を添加することにより、清酒など醸造酒中
の尿素が測定限界値以下にまで分解されることが認めら
れた。また、清酒発酵もろみやバーボンウィスキーなど
蒸留酒用の発酵もろみについても、発酵終了段階近くで
本ウレアーゼ標品を添加することにより同様な効果が認
められた。

また、尿素除去反応に使用するウレアーゼ酵素剤として
は、周知の酵素固定化技術を用い各種支持体に本発明ウ
レアーゼ標品を固定化して目的を達することもできる。

′４．　〔図面の簡単な説明〕 第１図から第４図までの実線はエタノール無添加の場合
、破線はエタノール含有条件の場合をそれぞれ示してい
る。

第１図は精製ウレアーゼの熱安定性、第２図は至適温度
、第３図はｐＨ安定性、第４図は至適ｐＨ１第５図は酵
素活性に対するエタノール添加濃度の影響を示したグラ
フである。第６図は清酒中にウレアーゼ標品を添加した
ときの１０℃における残存尿素量の変化を経時的に測定
したグラフ、また第７図はウレアーゼによる尿素分解に
対する温度の影響を示したグラフである。

喝宴征計 区 Ｎ） 科宴征隣 褐姿征計 第６図 時間　　（ｈ） 第７図 時間　　（ｈ） 手　　続　　補　　正　　書 昭和６３年１月１３日 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２８９９９４号 ２、発明の名称 新規ウレアーゼ及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名称　（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。

（２）明細書の記載を下記の通り訂正する。

頁　　行　　　　補正前　　　　　補正後１７　　２．
７ ２４　　１６、　　沈殿　　　　　　沈澱１８〜１９ ２７　　５　　　（７）分子量　　　（削除）２８　　
９　　　１．７＊１．７ ２８　　１４　　１．０′ｇ１．０ ３０　８．１０　　　メタノール　　　エタノール３３
　　　　９　　　　　　ＰＥＡＥ　　　　　　　　　　
　　　ＤＥ八へ３３　　１７　　　）リス・塩酸　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（１（別級） 特許請求の範囲を次の通り訂正する。

「１）下記の理化学的性質を有する新規なウレアーゼ （１）作用 １モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。

（２）至適　ｐＨ ４，２〜５．０ （３）ｐＨ安定性 ４℃、１６時間の処理でｐＨ４，５以上で安定（４）至
適温度 ５０〜６０℃ （５）温度安定性 ｐＨ４，５，１５分間の処理で５０℃まで安定（６）基
質特異性 尿素に極めて特異性が高い （７）阻害剤 Ｈｇ＋＋、Ａｇ＋、Ｃｕ十十等の金属イオン（８）ＫＩ
ｎ値 ３．６−３．１ｍＭ（ｐＨ４，５，０，１Ｍ酢酸緩衝液
） （９）分子量 約２４０．０００（デル濾過法により測定）（サブユニ
ット分子量６７．０００） （１０）等電点 ｐｒ　　約６．８ ２）　アルスロバクタ−（Ａ　ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
）属に属する微生物が産生する特許請求の範囲＃１項記
載ウレアーゼ。

３）アルスロバクタ−属に属する微生物がアルスロバク
タ−モビリス（Ａｏｍｏｂｉｌｉｓ）である特許請求の
範囲第２項記載のウレアーゼ。

４）アルスロバクタ−属に属し、下記の理化学的性質を
有する新規なウレアーゼ産生能を有する微生物を培養し
、培養物中に該酵素を蓄積させ、これを採取することを
特徴とする新規なウレアーゼの製造方法。

（１）作用 １モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。

（２）至適　ｐＨ ４，２〜５．０ （３）ｐＨ安定性 ４℃、１６時間の処理でｐＨ４，５以上で安定（４）至
適温度 ５０〜６０℃ （５）温度安定性 ｐＨ４，５，１５分間の処理で５０℃まで安定（６）基
質特異性 尿素に極めて特異性が高い （７）阻害剤 ＨＨ＋＋Ａｇ＋、Ｃｕ＋十等の金属イオン（８）　Ｋｍ
値 ３．６〜３．７　＋ｎＭ（ｐＨ４、５，０，１Ｍ酢酸緩
衝液） （９）分子量 約２４０，０００（ゲル濾過法により測定）（サブユニ
ット分子量６７．０００） （１０）等電点 ｐＩ　　約６．８ ５）　アルスロバクタ−属に属する微生物がフルスロバ
クター　モビリス（Ａ、　ｍｏｂｉｌｉｓ）である特許
請求の範囲第４項記載の製造方法。」以　　　上 第４図 第５図 ０　　２０　　４０　　　ＥＯ８０ 工タノール濃度　（％） 手続補正書 イ戒尤４柚弓斗年り月／Ｑ日 ２、発明の名称 新規ウレアーゼ及びその製造方法 ３、補正をする者 ５、補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６、補正の内容 明細書第９頁第１５〜末行の記載「（４）ダラム染色性
は、・・・・・・調べたところ陽性を示す、」紮下記の
通り訂正する。

「（４）ダラム染色性は、Ｌ培地に寒天１．５係を加え
た培地で６０℃、１６時間培養したとき、陽性を示す。

」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の理化学的性質を有する新規なウレアーゼ （１）作用 １モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
   ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。 （２）至適ｐＨ ４．２〜５．０ （３）ｐＨ安定性 ４℃、１６時間の処理でｐＨ４．５以上で安定（４）至
   適温度 ５０〜６０℃ （５）温度安定性 ｐＨ４．５、１５分間の処理で５０℃まで安定（６）基
   質特異性 尿素に極めて特異性が高い （７）阻害剤 Ｈｇ＾＋＾＋、Ａｇ＾＋、Ｃｕ＾＋＾＋等の金属イオン
   （８）Ｋｍ値 ３．６〜３．１ｍＭ（ｐＨ４．５、０．１Ｍ酢酸緩衝液
   ）（９）分子量 約２４０，０００（ゲル濾過法により測定）（サブユニ
   ット分子量６７，０００） （１０）等電点 ｐＩ約６．８ ２）アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属
   に属する微生物が産生する特許請求の範囲第１項記載の
   ウレアーゼ。 ３）アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバク
   ターモビリス（Ａ．ｍｏｂｉｌｉｓ）である特許請求の
   範囲第２項記載のウレアーゼ。 ４）アルスロバクター属に属し、下記の理化学的性質を
   有する新規なウレアーゼ産生能を有する微生物を培養し
   、培養物中に該酵素を蓄積させ、これを採取することを
   特徴とする新規なウレアーゼの製造方法。 （１）作用 １モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
   ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。 （２）至適ｐＨ ４．２〜５．０ （３）ｐＨ安定性 ４℃、１６時間の処理でｐＨ４．５以上で安定（４）至
   適温度 ５０〜６０℃ （５）温度安定性 ｐＨ４．５、１５分間の処理で５０℃まで安定（６）基
   質特異性 尿素に極めて特異性が高い （７）阻害剤 Ｈｇ＾＋＾＋、Ａｇ＾＋、Ｃｕ＾＋＾＋等の金属イオン
   （８）Ｋｍ値 ３．６〜３．１ｍＭ（ｐＨ４．５、０．１Ｍ酢酸緩衝液
   ）（９）分子量 約１６０，０００（ゲル濾過法により測定）（サブユニ
   ット分子量６７，０００） （１０）等電点 ｐＩ約６．８ ５）アルスロバクター属に属する微生物がアルスロバク
   ターモビリス（Ａ．ｍｏｂｉｌｉｓ）である特許請求の
   範囲第４項記載の製造方法。