JPH0889245A

JPH0889245A - 組換えβ−アミラーゼ

Info

Publication number: JPH0889245A
Application number: JP6233086A
Authority: JP
Inventors: Hisahiro Yoshigi; 尚浩吉儀; Hideo Maehane; 英雄前羽; Yukio Okada; 行夫岡田
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 1996-04-09
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: JP3471916B2; DE69510430T2; EP0713916B1; US5688684A; EP0713916A3; US5863784A; EP0713916A2; DE69510430D1; DK0713916T3

Abstract

(57)【要約】【目的】熱安定性が向上しかつアルカリ性ｐＨ域での
安定性が向上した組換えβ−アミラーゼを提供する。【構成】５３１アミノ酸残基からなる組換えβ−アミ
ラーゼの遺伝子に、部位特異的変異を導入し、該酵素の
第１８１番目のMet （メチオニン）をLeu （ロイシン）
に、第２９１番目のSer （セリン）をAla （アラニン）
に、第２９３番目のIle （イソロイシン）をVal （バリ
ン）に、第３４６番目のSer （セリン）をPro （プロリ
ン）に、第３４７番目のSer （セリン）をPro （プロリ
ン）に、第３４８番目のGln （グルタミン）をAsp （ア
スパラギン酸）に、第３７２番目のAla （アラニン）を
Ser （セリン）に置換することにより、元々の組換えβ
−アミラーゼよりも熱安定性が優れている組換えβ−ア
ミラーゼを得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、熱安定性が向上しかつアルカリ
性ｐＨ域での安定性が向上した組換えβ−アミラーゼ、
その遺伝子並びにそれを含有する発現ベクターに関す
る。

【０００２】

【背景技術】

［大麦β−アミラーゼ］大麦β−アミラーゼは、大麦種
子から得られるβ−アミラーゼ（1,4-α−Ｄ−グルカン
マルトヒドロラーゼ [EC 3.2.1.2] ）であり、大豆β−
アミラーゼと共に、輸液用マルトースや食品用マルトー
スを工業的に生産するのに有用な酵素として知られてい
る。

【０００３】しかし、大麦は飼料用および食品（ビー
ル、ウイスキー等）製造用の主要農産物であるため、世
界的見地から将来の食糧事情を考慮した場合には、収穫
された大麦をβ−アミラーゼの供給源として消費してし
まうのは妥当ではない。

【０００４】このようなことから、遺伝子工学的手法に
より微生物にβ−アミラーゼを産生させる方法が、大麦
以外の供給源として注目されている。もし、大麦β−ア
ミラーゼ遺伝子の微生物による効率的発現が可能となれ
ば、安価な大麦β−アミラーゼを安定して供給すること
が可能となり、マルトース生産に大いに貢献できるよう
になるのは明らかである。

【０００５】［大麦β−アミラーゼ遺伝子］大麦β−ア
ミラーゼの遺伝子としては、品種Hiproly の1754塩基か
らなるcDNAの全塩基配列が報告されており、同時に、53
5 残基からなるそのアミノ酸配列も明らかにされている
（Eur. J. Biochem., 169, 517 (1987) ）。また、品種
はるな二条の1775塩基からなるcDNAの全塩基配列も報告
されており、同時に、535 残基からなるそのアミノ酸配
列も明らかにされている（J. Biochem., 115, 47 (199
4) ）。

【０００６】品種はるな二条のβ−アミラーゼの研究で
は、全長cDNAの5'末端側55塩基対を除去し、新たにSmaI
リンカーを連結したDNA を調製し、プラスミドpKK223-3
（ファルマシアバイオテク社製）のSmaIサイトに導入し
た発現ベクター（pBETA92 ）が既に構築されている。ま
た、エシェリヒア・コリJM109 （東洋紡社製）に、この
発現ベクターを導入して組換えβ−アミラーゼ遺伝子を
発現させることによる組換えβ−アミラーゼの生産にも
成功しており、更にこの 531残基からなる組換えβ−ア
ミラーゼが、大麦種子から精製したβ−アミラーゼと殆
ど同じ性質を示すことも明らかにされている（特願平 6
ー58119 号）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、大麦種
子から精製されるβ−アミラーゼと殆ど同じ性質を示す
組換えβ−アミラーゼを微生物に産生させるだけでは十
分とは言えない。それは、熱安定性に関しては、大麦β
−アミラーゼよりも大豆β−アミラーゼの方がやや優れ
ているために、実際には大豆β−アミラーゼの方が多用
されているという事実があるからである。このようなこ
とから、上記大麦由来の組換えβ−アミラーゼの利用価
値を高めるためには、少なくとも大豆β−アミラーゼと
同等の機能（熱安定性）を備えるようにする必要があ
る。

【０００８】ここで、上記大麦由来の組換えβ−アミラ
ーゼの熱安定性をタンパク質工学的に向上させたものと
しては、 531アミノ酸残基からなる組換えβ−アミラー
ゼの遺伝子に部位特異的変異を導入することにより、該
酵素の第２９１番目のSer （セリン）をAla （アラニ
ン）に、さらに第３４６番目のSer （セリン）をPro
（プロリン）に置換した組換えβ−アミラーゼが、元々
の組換えβ−アミラーゼよりも熱安定性が優れているこ
とが明らかとなっている（特願平6-126151号）。

【０００９】組換えβ−アミラーゼの利用価値をさらに
高めるためには、タンパク質工学的手法により、さらに
熱安定性が向上したβ−アミラーゼを構築する必要があ
る。本発明は以上のような課題に鑑みなされたものであ
り、その目的は、熱安定性が一段と向上した組換えβ−
アミラーゼの遺伝子を部位特異的変異手法により構築
し、それを含有する組換えベクターを提供し、さらに、
該ベクターを微生物に組み込んで、それによって熱安定
性が一段と向上した組換えβ−アミラーゼを提供するこ
とにある。

【００１０】

【発明の開示】本発明者は、β−アミラーゼの酵素活性
を保持しながらその熱安定性を一段と高めることを目的
として鋭意研究を重ねた結果、第２９１番目のSer （セ
リン）をAla （アラニン）に、第３４６番目のSer （セ
リン）をPro （プロリン）に置換する（特願平6-126151
号）ことに加えて、更に第１８１番目のMet （メチオニ
ン）をLeu （ロイシン）に、第２９３番目のIle （イソ
ロイシン）をVal （バリン）に、第３４７番目のSer
（セリン）をPro （プロリン）に、第３４８番目のGln
（グルタミン）をAsp （アスパラギン酸）に、第３７２
番目のAla （アラニン）をSer （セリン）に置換した７
重変異体酵素が、上記２重変異体酵素よりも一段と熱安
定性が優れているということを見出し、本発明を完成す
るに至った。

【００１１】即ち、本発明に係わる組換えβ−アミラー
ゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する組換
えβ−アミラーゼである（請求項１）。

【００１２】本発明に係わるβ−アミラーゼは、「可溶
性デンプン、アミロース、アミロペクチンなどのα-1,4
−グルコシド結合を有する多糖および重合度３以上のマ
ルトオリゴ糖に作用して、その非還元末端から順次β−
マルトースを遊離し、更に、３７℃で８０％以上の酵素
活性を示すｐＨは３．５〜７．０であり、３７℃１時間
処理で８０％以上の残存活性を示すｐＨは３．５〜１
２．５であり、ｐＨ７．０で可溶性デンプンに対して６
５℃で最大活性を示し、７０℃で最大活性の８７％を示
し、基質の非存在下でｐＨ７．０、３０分処理で６２．
５℃まで安定である」という酵素化学的特性を有する組
換えβ−アミラーゼである（請求項２）。

【００１３】また、本願の請求項３に係わる遺伝子は、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する組換えβ−
アミラーゼをコードする遺伝子である。

【００１４】請求項４に係わる遺伝子は、配列番号２で
表される塩基配列を有する、請求項１記載の組換えβ−
アミラーゼをコードする遺伝子である。

【００１５】請求項５に係わる発現ベクターは、請求項
３または４記載の遺伝子を含有する組換えβ−アミラー
ゼ発現ベクターである。この発現ベクターの具体例とし
ては、配列表の配列番号３に示す塩基配列で表されるも
のを挙げることができる。

【００１６】請求項６に係わる宿主細胞は、請求項５記
載の発現ベクターを含む宿主細胞である。

【００１７】以下に、本発明に係わる組換えβ−アミラ
ーゼ、その遺伝子およびそれを含有する発現ベクターを
製造するための具体的な手段を説明する。

【００１８】（１）部位特異的変異によるβ−アミラ
ーゼ発現ベクターpBETA92 の塩基置換 β−アミラーゼ発現ベクターpBETA92 の遺伝子配列の特
定部位の塩基置換は、部位特異的変異（Anal. Bioche
m., 200, 81 (1992)）により行うことができる。

【００１９】（２） β−アミラーゼ発現ベクターの宿
主微生物への導入宿主微生物としては、熱安定性が改良された組換えβ−
アミラーゼ発現ベクターが安定かつ自律的増殖ができる
ものであれば、いかなるものをも用いることができる。

【００２０】宿主微生物に組換えβ−アミラーゼ発現ベ
クターを導入する方法としては、公知の方法、例えば宿
主微生物がエシェリヒア・コリの場合にはコンピテント
セル法（J. Mol. Biol., 53, 159 (1970) ）を採用する
ことができる。

【００２１】（３） DNA 塩基配列の確認置換部分の塩基配列の確認は、マキサム−ギルバートの
化学修飾法（Methodsin Enzymology, 65, 499 (1980)
）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Gene,19, 269
(1982)）等により確認することができる。

【００２２】そして、本発明に係わるβ−アミラーゼの
アミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読すること
ができる。

【００２３】（４）組換えβ−アミラーゼの生産と精
製 β−アミラーゼ発現用ベクターが導入された宿主微生物
を一定期間培養した後、必要に応じて溶菌操作を行な
い、これを硫安分画、ゲル濾過或いはイオン交換などの
各種クロマトグラフィーにかけることにより、組換えβ
−アミラーゼの精製品を得ることができる。

【００２４】β−アミラーゼ活性の測定は、ジクロロフ
ェニル β−マルトペンタオサイド（小野薬品社製）を
基質として測定できる。この場合においては、３７℃で
基質に酵素を作用させ、１分間に１μモルのジクロロフ
ェノールを生成する酵素量が１単位となる。

【００２５】（５）熱安定性の評価酵素標品３０μｌを１．５ｍｌ容のエッペンドルフチュ
ーブに分注し、５０〜７２．５℃（２．５℃刻み）の湯
浴上で、３０分間処理した。このうち２０μｌを用いて
残存活性を測定し、無処理の場合を１００％として熱失
活曲線を作成した。各標品の残存活性が５０％になる温
度を熱失活曲線から求め、その数値で熱安定性を評価し
た。

【００２６】対照として用いる大豆β−アミラーゼは、
天野製薬社製のもの（商品名ビオザイムM-5 ）を用い
た。なお、酵素標品の希釈は、５０ｍＭグッド緩衝液
（ｐＨ７．０）／１％ウシ血清アルブミン溶液で行っ
た。

【００２７】作用温度と酵素活性の関係を調べる場合に
は、ｐＨ７．０で可溶性デンプンに作用させ、生成する
還元糖をジニトロサリチル酸法（澱粉科学ハンドブッ
ク、朝倉書店、188-189 頁 (1977) ）により測定し、１
分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量を１単位
とした。

【００２８】（６）至適ｐＨの測定１％可溶性デンプン（ｐＨ７．０）０．４ｍｌに、１０
０ｍＭの各緩衝液（下記）０．２ｍｌと酵素標品０．２
ｍｌを加えて３７℃で反応させた。生成した還元糖をジ
ニトロサリチル酸法で定量し、最高活性値を示したｐＨ
を１００％として表示した。このような手法により至適
ｐＨの測定を行った結果、８０％以上の酵素活性を示す
至適ｐＨは、３．５〜７．０であることが分かった。

【００２９】なお、使用した緩衝液は以下のものであ
る。

【００３０】『ｐＨ２．５〜３．０ …クエン酸緩衝液ｐＨ３．５〜５．５ …酢酸緩衝液ｐＨ６．０〜８．０ …グッド緩衝液ｐＨ８．５ …トリス−マレイン酸緩衝液ｐＨ９．０〜１１．０ …グリシン緩衝液』（７）安定ｐＨ域の測定酵素標品５０μｌに１００ｍＭの各緩衝液（下記）５０
μｌを加え、３７℃で１時間処理した。処理後、５００
ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ７. ０）／１％ウシ血清アルブ
ミン溶液を０．９ｍｌ加えた。処理液から０．４ｍｌを
抜き取り、０．４ｍｌの１％可溶性デンプン（ｐＨ７．
０）を加えて３７℃で反応させ、残存する酵素活性を測
定した。このような手法により安定ｐＨ域の測定を行っ
た結果、８０％以上の残存活性を示す安定ｐＨ域は、
３．５〜１２．５であることが分かった。

【００３１】なお、使用した緩衝液は、以下のものであ
る。

【００３２】『ｐＨ３．０ …クエン酸緩衝液ｐＨ３．５〜５．５ …酢酸緩衝液ｐＨ６．０〜８．０ …グッド緩衝液ｐＨ８．５ …トリス−マレイン酸緩衝液ｐＨ９．０〜１１．５ …グリシン緩衝液ｐＨ１２．０〜１３．０ …塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液』

【００３３】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。

【００３４】［実施例１；部位特異的変異による組換え
β−アミラーゼ発現ベクターpBETA92の塩基置換］部位
特異的変異は、トランスファーサイトダイレクテッドミ
ュータゲネシスキット（クロンテックラボラトリーズ社
製）を用いて行った。

【００３５】ミュータゲネシスプライマーとして、 5'ーAGCTGGAGAGTTGAGGTACCC-3' （第１８１番目のMet のLeu への置換用；配列番号４） 5'-AATCAAGATCGCTGGCGTTCACTGGTG-3' （第２９１番目のSer のAla への置換と第２９３番目の
Ile のVal への置換用；配列番号５） 5'-TTCGGAGCAACCCCCGGACGCGATGAGCGCA-3' （第３４６番目のSer のPro への置換、第３４７番目の
Ser のPro への置換および第３４８番目のGln のAsp へ
の置換用；配列番号６） 5'-CCTAAATGTGTCATGCGAAAA-3' （第３７２番目のAla のSer への置換用；配列番号７）を用い、セレクションプライマーとして、 5'-GGTTGAGTATTCACCAGTC-3' （配列番号８）を用いて、キットの説明書に従って部位
特異的変異を行い、配列番号３に示す組換えβ−アミラ
ーゼ（７重変異β−アミラーゼ）発現ベクター（pBETA9
2/７重変異体）を得た。

【００３６】［実施例２；塩基配列の確認］塩基配列を
調べたところ、配列表の配列番号２に示したように、５
４１番目のＡがＴに、８７１番目のＴがＧに、８７７番
目のＡがＧに、１０３６〜１０３７番目のＡＧがＣＣ
に、１０３９番目のＴがＣに、１０４２番目のＣがＧ
に、１０４４番目のＧがＣに、１１１４番目のＧがＴに
置換されていることが確認できた。これにより発現ベク
ターpBETA92/７重変異体は、配列表の配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有する組換えβ−アミラーゼをコー
ドしていることが確認された。

【００３７】［実施例３；組換えβ−アミラーゼの生産
と精製］組換えβ−アミラーゼ発現ベクターpBETA92/７
重変異体が導入されたエシェリヒア・コリJM109 を液体
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％食
塩、０．００５％アンピシリンナトリウム、０．１ｍＭ
イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド、水
４００ｍｌ、ｐＨ７．０）にて３７℃で２４時間培養
し、遠心分離を行って集菌、洗浄した。リゾチーム溶液
（０．０２５％リゾチーム、２０ｍＭトリス−塩酸、３
０ｍＭ食塩、ｐＨ７．５）で３０分間、氷上で処理して
溶菌させた後、超音波処理（５０Ｗ、３０秒）してから
遠心分離して粗酵素液を得た。

【００３８】粗酵素液に、３０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを添加し、不溶物を遠心除去した液を、ブ
チルトヨパール650S（東ソー社製）カラム（2.5 ×18.5
cm）に負荷した。５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
で溶出される活性画分を集め、１５ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で透析した。不溶物を遠心除去した
透析液を、次にDEAEトヨパール650S（東ソー社製）カラ
ム（2.5 × 18.5 cm）に負荷した。１５ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）／５０ｍＭ食塩で溶出される活
性画分を集め、７０％飽和になるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、遠心分離にて集めた沈澱物を５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、同緩衝液で透析した。
更に、この透析液を、トヨパールHW-50S（東ソー社製）
カラム（1.5 × 48.5 cm）に負荷した。５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．５）で溶出し、活性画分を集め、組換え
β−アミラーゼ精製酵素標品とした。精製酵素標品をSD
S-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べたところ、元
々の組換えβ−アミラーゼと同じ分子量約56,000の均一
なバンドを示した。

【００３９】［実施例４；７重変異β−アミラーゼの酵
素化学的諸性質］７重変異β−アミラーゼの酵素化学的
諸性質を、元々の組換えβ−アミラーゼと比較したとこ
ろ、作用温度と酵素活性の関係、熱安定性および安定ｐ
Ｈ域を除いてはほとんど同じであった。

【００４０】作用温度と酵素活性の関係を調べた結果を
図１に示した。大麦および元々の組換えβ−アミラーゼ
が５５℃で最大活性を示し、６５〜７０℃では殆ど作用
しないのに対して、７重変異β−アミラーゼは６５℃で
最大活性を示し、７０℃でも十分に作用することが分か
った。６０℃で最大活性を示す大豆β−アミラーゼと比
較しても、その熱安定性がかなり向上していることが認
められた。

【００４１】図２に示した熱失活曲線から、各酵素標品
の残存活性が５０％になる温度を求めると次のようにな
る。

【００４２】大麦β−アミラーゼ →５６．８℃ 元々の組換えβ−アミラーゼ→５７．４℃ ７重変異β−アミラーゼ →６９．０℃ 大豆β−アミラーゼ →６３．２℃ ７重変異β−アミラーゼは元々の組換えβ−アミラーゼ
よりも、熱安定性が１１．６℃上昇し、さらに大豆β−
アミラーゼを５．８℃上回るという結果が得られた。

【００４３】元々の組換えβ−アミラーゼが６２．５℃
３０分処理でほぼ完全に失活するのに対し、７重変異β
−アミラーゼは同じ処理で全く失活しないことから、７
重変異β−アミラーゼは熱安定性が大きく向上している
ことが確認された。

【００４４】安定ｐＨ域を調べたところ、図３に示すよ
うに、大麦β−アミラーゼおよび元々の組換えβ−アミ
ラーゼがｐＨ３．５〜９．５で安定であるのに対して、
７重変異β−アミラーゼの安定ｐＨ域は３．５〜１２．
５であり、アルカリ性領域での安定性がかなり向上して
いることが認められた。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、熱安定性が一段と向上し
かつアルカリ性ｐＨ域での安定性が向上した組換えβ−
アミラーゼを生産することが可能となった。

【００４６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５３１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Met Lys Gly Asn Tyr Val Gln Val Tyr Val Met Leu Pro Leu Asp Ala 1 5 10 15 Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly Asp Glu Leu Arg Ala Gln 20 25 30 Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp Gly Val Met Val Asp Val 35 40 45 Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro Lys Ala Tyr Asp Trp Ser 50 55 60 Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Glu Leu Val Gln Lys Ala Gly Leu Lys Leu 65 70 75 80 Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ala 85 90 95 Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg Asp Val Gly Thr Arg Asp 100 105 110 Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly Thr Arg Asn Ile Glu Tyr 115 120 125 Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu Phe His Gly Arg Ser Ala 130 135 140 Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser Phe Arg Glu Asn Met Lys 145 150 155 160 Asp Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp Ile Glu Val Gly Leu Gly 165 170 175 Pro Ala Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Gln Ser His Gly Trp 180 185 190 Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys Tyr Asp Lys Tyr Leu Gln 195 200 205 Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly His Pro Glu Trp Glu 210 215 220 Phe Pro Asn Asp Ala Gly Gln Tyr Asn Asp Thr Pro Glu Arg Thr Gln 225 230 235 240 Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Lys Gly Arg Phe Phe 245 250 255 Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys His Gly Asp Arg Ile Leu 260 265 270 Asp Glu Ala Asn Lys Val Phe Leu Gly Tyr Lys Val Gln Leu Ala Ile 275 280 285 Lys Ile Ala Gly Val His Trp Trp Tyr Lys Val Pro Ser His Ala Ala 290 295 300 Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His Asp Arg Asp Gly Tyr Arg 305 310 315 320 Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg Ala Ser Ile Asn Phe Thr 325 330 335 Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Pro Pro Asp Ala Met Ser Ala 340 345 350 Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser Ala Gly Trp Arg Glu Gly 355 360 365 Leu Asn Val Ser Cys Glu Asn Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Pro Thr Ala 370 375 380 Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro His Gly Ile Asn Gln Ser 385 390 395 400 Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Leu Arg Leu Ser 405 410 415 Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Val Asn Phe Lys Thr Phe Val 420 425 430 Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp Pro Tyr Val Asp Pro Met 435 440 445 Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ser Ile Glu Met Ile Leu 450 455 460 Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Pro Phe Pro Phe Gln Glu His Thr 465 470 475 480 Asp Leu Pro Val Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Gly 485 490 495 Pro Thr Cys Gly Met Gly Gly Gln Val Lys Gly Pro Thr Gly Gly Met 500 505 510 Gly Gly Gln Ala Glu Asp Pro Thr Ser Gly Met Gly Gly Glu Leu Pro 515 520 525 Ala Thr Met 530 531 配列番号：２配列の長さ：１５９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA 配列 GTGAAAGGCA ACTATGTCCA AGTCTACGTC ATGCTCCCTC TGGACGCCGT GAGCGTGAAC 60 AACAGGTTCG AGAAGGGCGA CGAGCTGAGG GCGCAATTGA GGAAGCTGGT AGAGGCCGGT 120 GTGGATGGTG TCATGGTAGA CGTCTGGTGG GGCTTGGTGG AGGGCAAGGG CCCCAAGGCG 180 TATGACTGGT CCGCCTACAA GCAGTTGTTT GAGCTGGTGC AGAAGGCTGG GCTGAAGCTA 240 CAGGCCATCA TGTCGTTCCA CCAGTGTGGT GGCAACGTCG GCGACGCCGT CAACATCCCA 300 ATCCCACAGT GGGTGCGGGA CGTCGGCACG CGTGATCCCG ACATTTTCTA CACCGACGGT 360 CACGGGACTA GGAACATTGA GTACCTCACT CTTGGAGTTG ATAACCAGCC TCTCTTCCAT 420 GGAAGATCTG CCGTCCAGAT GTATGCCGAT TACATGACAA GCTTCAGGGA GAACATGAAA 480 GACTTCTTGG ATGCTGGTGT TATCGTCGAC ATTGAAGTGG GACTTGGCCC AGCTGGAGAG 540 TTGAGGTACC CATCATATCC TCAGAGCCAC GGATGGTCGT TCCCAGGCAT CGGAGAATTC 600 ATCTGCTATG ATAAATACCT ACAAGCAGAC TTCAAAGCAG CAGCAGCGGC GGTCGGCCAT 660 CCTGAGTGGG AATTTCCTAA CGATGCCGGA CAGTACAATG ACACTCCCGA GAGAACTCAA 720 TTCTTCAGGG ACAACGGGAC ATACCTAAGT GAGAAGGGGA GGTTTTTCCT TGCATGGTAC 780 TCCAACAATC TGATCAAGCA CGGTGACAGG ATCTTGGATG AAGCAAACAA GGTCTTCTTG 840 GGATACAAGG TGCAATTGGC AATCAAGATC GCTGGCGTTC ACTGGTGGTA CAAGGTTCCA 900 AGCCATGCAG CCGAGCTCAC AGCTGGGTAC TATAACTTAC ATGATAGAGA CGGCTACAGA 960 ACCATAGCAC GCATGCTCAA AAGGCACCGT GCTAGCATTA ACTTCACTTG CGCGGAGATG 1020 AGGGATTCGG AGCAACCCCC GGACGCGATG AGCGCACCAG AAGAACTAGT CCAACAGGTG 1080 TTGAGTGCTG GATGGAGAGA GGGCCTAAAT GTGTCATGCG AAAACGCGCT TCCACGATAT 1140 GATCCAACTG CTTACAACAC CATACTCAGG AATGCGAGGC CTCATGGAAT CAACCAGAGC 1200 GGCCCTCCTG AGCACAAGCT GTTTGGATTC ACCTACCTTC GGCTGTCGAA TCAGCTGGTG 1260 GAGGGACAAA ACTATGTCAA CTTCAAGACC TTTGTCGACA GAATGCATGC CAACCTGCCT 1320 CGTGACCCAT ATGTTGATCC AATGGCGCCC TTGCCAAGAT CAGGGCCAGA AATATCGATT 1380 GAGATGATCC TACAAGCAGC ACAGCCAAAA CTGCAGCCAT TCCCCTTCCA GGAGCACACC 1440 GACCTGCCAG TAGGCCCTAC TGGTGGCATG GGTGGGCAGG CTGAAGGCCC CACCTGTGGC 1500 ATGGGTGGGC AAGTTAAAGG CCCTACTGGT GGCATGGGTG GGCAGGCTGA AGACCCTACT 1560 AGTGGCATGG GTGGGGAGCT CCCTGCCACC ATGTAA 1596 配列番号：３配列の長さ：６３１２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：DNA 配列 TTCCGGGATG GAGGTGAACG TGAAAGGCAA CTATGTCCAA GTCTACGTCA TGCTCCCTCT 60 GGACGCCGTG AGCGTGAACA ACAGGTTCGA GAAGGGCGAC GAGCTGAGGG CGCAATTGAG 120 GAAGCTGGTA GAGGCCGGTG TGGATGGTGT CATGGTAGAC GTCTGGTGGG GCTTGGTGGA 180 GGGCAAGGGC CCCAAGGCGT ATGACTGGTC CGCCTACAAG CAGTTGTTTG AGCTGGTGCA 240 GAAGGCTGGG CTGAAGCTAC AGGCCATCAT GTCGTTCCAC CAGTGTGGTG GCAACGTCGG 300 CGACGCCGTC AACATCCCAA TCCCACAGTG GGTGCGGGAC GTCGGCACGC GTGATCCCGA 360 CATTTTCTAC ACCGACGGTC ACGGGACTAG GAACATTGAG TACCTCACTC TTGGAGTTGA 420 TAACCAGCCT CTCTTCCATG GAAGATCTGC CGTCCAGATG TATGCCGATT ACATGACAAG 480 CTTCAGGGAG AACATGAAAG ACTTCTTGGA TGCTGGTGTT ATCGTCGACA TTGAAGTGGG 540 ACTTGGCCCA GCTGGAGAGT TGAGGTACCC ATCATATCCT CAGAGCCACG GATGGTCGTT 600 CCCAGGCATC GGAGAATTCA TCTGCTATGA TAAATACCTA CAAGCAGACT TCAAAGCAGC 660 AGCAGCGGCG GTCGGCCATC CTGAGTGGGA ATTTCCTAAC GATGCCGGAC AGTACAATGA 720 CACTCCCGAG AGAACTCAAT TCTTCAGGGA CAACGGGACA TACCTAAGTG AGAAGGGGAG 780 GTTTTTCCTT GCATGGTACT CCAACAATCT GATCAAGCAC GGTGACAGGA TCTTGGATGA 840 AGCAAACAAG GTCTTCTTGG GATACAAGGT GCAATTGGCA ATCAAGATCG CTGGCGTTCA 900 CTGGTGGTAC AAGGTTCCAA GCCATGCAGC CGAGCTCACA GCTGGGTACT ATAACTTACA 960 TGATAGAGAC GGCTACAGAA CCATAGCACG CATGCTCAAA AGGCACCGTG CTAGCATTAA 1020 CTTCACTTGC GCGGAGATGA GGGATTCGGA GCAACCCCCG GACGCGATGA GCGCACCAGA 1080 AGAACTAGTC CAACAGGTGT TGAGTGCTGG ATGGAGAGAG GGCCTAAATG TGTCATGCGA 1140 AAACGCGCTT CCACGATATG ATCCAACTGC TTACAACACC ATACTCAGGA ATGCGAGGCC 1200 TCATGGAATC AACCAGAGCG GCCCTCCTGA GCACAAGCTG TTTGGATTCA CCTACCTTCG 1260 GCTGTCGAAT CAGCTGGTGG AGGGACAAAA CTATGTCAAC TTCAAGACCT TTGTCGACAG 1320 AATGCATGCC AACCTGCCTC GTGACCCATA TGTTGATCCA ATGGCGCCCT TGCCAAGATC 1380 AGGGCCAGAA ATATCGATTG AGATGATCCT ACAAGCAGCA CAGCCAAAAC TGCAGCCATT 1440 CCCCTTCCAG GAGCACACCG ACCTGCCAGT AGGCCCTACT GGTGGCATGG GTGGGCAGGC 1500 TGAAGGCCCC ACCTGTGGCA TGGGTGGGCA AGTTAAAGGC CCTACTGGTG GCATGGGTGG 1560 GCAGGCTGAA GACCCTACTA GTGGCATGGG TGGGGAGCTC CCTGCCACCA TGTAATGGAA 1620 CCTTTATGAT TTACTACCCT TTATGTTGTG TGTGAGTGTG ACAGAGAAAC CTTTCTCTGC 1680 CTTATTAATA ATAAATAAAG CACATCACTT GTGTGTGTTC TGAAAAGCCC GGGGATCCGT 1740 CGACCTGCAG CCAAGCTTGG CTGTTTTGGC GGATGAGAGA AGATTTTCAG CCTGATACAG 1800 ATTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTGGCGG CAGTAGCGCG 1860 GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGT 1920 GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGGGAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCA 1980 GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAG 2040 GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGC 2100 AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGG 2160 CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC 2220 CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA 2280 GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT 2340 TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG 2400 TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG 2460 AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTG 2520 TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG 2580 AGTATTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA 2640 GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG 2700 GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC 2760 GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG 2820 TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC 2880 GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG 2940 CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG 3000 GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA 3060 CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 3120 TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA 3180 AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 3240 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG 3300 GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC 3360 CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 3420 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC 3480 ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 3540 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 3600 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC 3660 GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC 3720 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA 3780 CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 3840 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 3900 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT 3960 TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 4020 CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 4080 GCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT TTCACACCGC ATATGGTGCA 4140 CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA GTATACACTC CGCTATCGCT 4200 ACGTGACTGG GTCATGGCTG CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG 4260 GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 4320 GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGCTGCGGT AAAGCTCATC 4380 AGCGTGGTCG TGAAGCGATT CACAGATGTC TGCCTGTTCA TCCGCGTCCA GCTCGTTGAG 4440 TTTCTCCAGA AGCGTTAATG TCTGGCTTCT GATAAAGCGG GCCATGTTAA GGGCGGTTTT 4500 TTCCTGTTTG GTCACTTGAT GCCTCCGTGT AAGGGGGAAT TTCTGTTCAT GGGGGTAATG 4560 ATACCGATGA AACGAGAGAG GATGCTCACG ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG 4620 TTACTGGAAC GTTGTGAGGG TAAACAACTG GCGGTATGGA TGCGGCGGGA CCAGAGAAAA 4680 ATCACTCAGG GTCAATGCCA GCGCTTCGTT AATACAGATG TAGGTGTTCC ACAGGGTAGC 4740 CAGCAGCATC CTGCGATGCA GATCCGGAAC ATAATGGTGC AGGGCGCTGA CTTCCGCGTT 4800 TCCAGACTTT ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC 4860 GTTTTGCAGC AGCAGTCGCT TCACGTTCGC TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA 4920 GTAAGGCAAC CCCGCCAGCC TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC 4980 CGTGGCCAGG ACCCAACGCT GCCCGAGATG CGCCGCGTGC GGCTGCTGGA GATGGCGGAC 5040 GCGATGGATA TGTTCTGCCA AGGGTTGGTT TGCGCATTCA CAGTTCTCCG CAAGAATTGA 5100 TTGGCTCCAA TTCTTGGAGT GGTGAATCCG TTAGCGAGGT GCCGCCGGCT TCCATTCAGG 5160 TCGAGGTGGC CCGGCTCCAT GCACCGCGAC GCAACGCGGG GAGGCAGACA AGGTATAGGG 5220 CGGCGCCTAC AATCCATGCC AACCCGTTCC ATGTGCTCGC CGAGGCGGCA TAAATCGCCG 5280 TGACGATCAG CGGTCCAGTG ATCGAAGTTA GGCTGGTAAG AGCCGCGAGC GATCCTTGAA 5340 GCTGTCCCTG ATGGTCGTCA TCTACCTGCC TGGACAGCAT GGCCTGCAAC GCGGGCATCC 5400 CGATGCCGCC GGAAGCGAGA AGAATCATAA TGGGGAAGGC CATCCAGCCT CGCGTCGCGA 5460 ACGCCAGCAA GACGTAGCCC AGCGCGTCGG CCGCCATGCC GGCGATAATG GCCTGCTTCT 5520 CGCCGAAACG TTTGGTGGCG GGACCAGTGA CGAAGGCTTG AGCGAGGGCG TGCAAGATTC 5580 CGAATACCGC AAGCGACAGG CCGATCATCG TCGCGCTCCA GCGAAAGCGG TCCTCGCCGA 5640 AAATGACCCA GAGCGCTGCC GGCACCTGTC CTACGAGTTG CATGATAAAG AAGACAGTCA 5700 TAAGTGCGGC GACGATAGTC ATGCCCCGCG CCCACCGGAA GGAGCTGACT GGGTTGAAGG 5760 CTCTCAAGGG CATCGGTCGA CGCTCTCCCT TATGCGACTC CTGCATTAGG AAGCAGCCCA 5820 GTAGTAGGTT GAGGCCGTTG AGCACCGCCG CCGCAAGGAA TGGTGCATGC AAGGAGATGG 5880 CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA 5940 TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG 6000 CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCCGGG 6060 CTTATCGACT GCACGGTGCA CCAATGCTTC TGGCGTCAGG CAGCCATCGG AAGCTGTGGT 6120 ATGGCTGTGC AGGTCGTAAA TCACTGCATA ATTCGTGTCG CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC 6180 TGGATAATGT TTTTTGCGCC GACATCATAA CGGTTCTGGC AAATATTCTG AAATGAGCTG 6240 TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 6300 CAGGAAACAG AA 6312 配列番号：４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： AGCTGGAGAG TTGAGGTACC C 21 配列番号：５配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： AATCAAGATC GCTGGCGTTC ACTGGTG 27 配列番号：６配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： TTCGGAGCAA CCCCCGGACG CGATGAGCGC A 31 配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： CCTAAATGTG TCATGCGAAA A 21 配列番号：８配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列： GGTTGAGTAT TCACCAGTC 19

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る７重変異β−アミラーゼ（白四
角）、大麦β−アミラーゼ（黒丸）、元々の組換えβ−
アミラーゼ（白丸）、大豆β−アミラーゼ（黒四角）の
各標品の作用温度と酵素活性の関係を示した図である。

【図２】本発明に係る７重変異β−アミラーゼ（白四
角）、大麦β−アミラーゼ（黒丸）、元々の組換えβ−
アミラーゼ（白丸）、大豆β−アミラーゼ（黒四角）の
各標品の熱安定性を示した図である。

【図３】本発明に係る７重変異β−アミラーゼ（白四
角）、大麦β−アミラーゼ（黒丸）、元々の組換えβ−
アミラーゼ（白丸）の各標品の安定ｐＨ域を示した図で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１０月６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
する組換えβ−アミラーゼ。
【請求項２】以下の酵素化学的特性を有する組換えβ
−アミラーゼ。作用；α-1,4−グルカンに作用し、非還元末端から順次
β−マルトースを遊離する。基質特異性；可溶性デンプン、アミロース、アミロペク
チンなどのα-1,4−グルコシド結合を有する多糖および
重合度３以上のマルトオリゴ糖に作用する。至適ｐＨ；３７℃で８０％以上の酵素活性を示すｐＨは
３．５〜７．０である。安定ｐＨ域；３７℃１時間処理で８０％以上の残存活性
を示すｐＨは３．５〜１２．５である。作用温度と酵素活性の関係；ｐＨ７．０で可溶性デンプ
ンに対して６５℃で最大活性を示し、７０℃で最大活性
の８７％を示す。安定温度；基質の非存在下でｐＨ７．０、３０分処理で
６２．５℃まで安定である。
【請求項３】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
する組換えβ−アミラーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】配列番号２で表される塩基配列を有す
る、請求項１記載の組換えβ−アミラーゼをコードする
遺伝子。
【請求項５】請求項３または４記載の遺伝子を含有す
る組換えβ−アミラーゼ発現ベクター。
【請求項６】請求項５記載の発現ベクターを含む宿主
細胞。