JPH0892284A

JPH0892284A - キシラナーゼ、それを生産する微生物、ｄｎａ分子、そのキシラナーゼの調製方法及び使用

Info

Publication number: JPH0892284A
Application number: JP7190838A
Authority: JP
Inventors: Buyl Eric De; ドビュイエリック; Andree Lahaye; ラアーイェアンドレー; Pierre Ledoux; レドゥーピエール; Rene Detroz; デトロルネ
Original assignee: Solvay SA
Current assignee: Solvay SA
Priority date: 1994-07-26
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 1996-04-09
Also published as: US20090041896A1; EP0698667B1; FI953578L; ATE269408T1; AU2508695A; US20020115181A1; DE69533152T2; DK0698667T3; NZ272637A; US20060020122A1; CA2154628A1; US7022827B2; DE69533152D1; US8148104B2; BE1008751A3; CA2154628C; AU711105B2; US6346407B1; US7638613B2; EP0698667A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】紙パルプ処理に用いられ、広範囲の温度並びに
塩基性ｐＨ及び酸性ｐＨに安定かつ活性なキシラナーゼ
の提供。【解決手段】バシラス株に由来し、ｐＨ約５〜１０の範
囲及び約５０〜８０℃の温度範囲にわたって活性である
キシラナーゼを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なキシラナー
ゼに関する。本発明は、また、そのキシラナーゼの調製
方法、その使用及びそれを含む組成物に関する。本発明
は、また、そのキシラナーゼを産生する微生物の新規な
菌株及びそのキシラナーゼをコードするヌクレオチド配
列を含むＤＮＡ分子に関する。本発明は、また、そのＤ
ＮＡ分子を含むベクター及びそのベクターによって形質
転換された菌株に関する。本発明は、また、バシラス・
ピュミルス(Bacillus pumilus)ＰＲＬＢ１２キシラナ
ーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター及びバシラ
ス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナル
ペプチドをコードするプレ配列に関する。本発明は、ま
た、そのプロモーター及びそのプレ配列を含むベクター
及び本発明のキシラナーゼの成熟部分をコードするヌク
レオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。本発明は、ま
た、そのベクターによって形質転換された菌株に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】広範囲のｐＨに活性な熱安定キシラナー
ゼ、特に好アルカリ性バシラス株によって産生されたキ
シラナーゼは既知である(Guptaら, Biotechnology Lett
ers, 1992, 14(11), p.1045-1046及び国際出願第94/046
64号）。しかしながら、この性質にもかかわらず、この
酵素は紙パルプを漂白するのに効果が不十分であると考
えられる。従って、紙パルプ処理に用いられ、広範囲の
温度並びに塩基性ｐＨ及び酸性ｐＨに非常に安定でかつ
非常に活性なキシラナーゼが現在求められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アル
カリ性ｐＨ及び酸性ｐＨ双方の広範囲のｐＨに活性であ
る新規なキシラナーゼを提供することである。本発明の
目的は、また、前記キシラナーゼを天然に生産する菌
株、特にバシラス(Bacillus)株を同定、分離及び提供す
ることである。本発明の目的は、また、前記キシラナー
ゼをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を分
離及び提供することである。本発明の目的は、また、前
記キシラナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発
現ベクターを調製及び提供することである。本発明の目
的は、また、前記キシラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列を含む組込みベクターを調製及び提供することで
ある。

【０００４】本発明の目的は、また、バシラス・ピュミ
ルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子由
来のプロモーターを調製及び提供することである。本発
明の目的は、また、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１
２キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプレ配
列を調製及び提供することである。更に、そのプロモー
ター及び／又はそのプレ配列を含むベクターは、本発明
のキシラナーゼの成熟部分をコードするヌクレオチド配
列を含むＤＮＡ分子を含む。そのベクターによって形質
転換された菌株は、本発明のキシラナーゼを異種生産す
る。本発明の目的は、また、前記キシラナーゼをコード
するバシラス株のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を
含む発現ベクターで形質転換されたバシラス宿主を調製
及び提供することである。本発明の目的は、また、その
キシラナーゼを含む組成物を調製及び提供することであ
る。本発明の目的は、また、紙パルプ及び塩基性、中性
又は酸性ｐＨを有するパルプ、特に塩基性ｐＨを有する
パルプ及び種々の起原の紙パルプ、例えば、針葉樹由来
のパルプ、広葉樹由来のパルプ、特にユーカリパルプの
処理に用いられるキシラナーゼを調製及び提供すること
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】こ
れを目的として、本発明は、バシラス、更に詳細には好
気性及び非好熱性微生物に由来するキシラナーゼに関す
る。バシラス種７２０／１株又はその菌種の誘導体又は
変異体を用いることが好ましい。本発明のキシラナーゼ
は、バシラス種７２０／１株に由来する（天然に生産す
る）。キシラナーゼは、国際方式においてＥＣ番号 3.
2.1.8. として分類されている。これは、エンド−1,４
−β−キシラナーゼである。分離及び精製キシラナーゼ
は、分子量約２５ｋＤａを有する単一タイプのポリペプ
チドからなることが好ましい。本発明は、１〜２２１の
アミノ酸のアミノ酸配列（配列番号３）又はその配列に
由来する修飾配列を含む分離及び精製キシラナーゼに関
する。成熟キシラナーゼをコードするアミノ酸配列及び
ヌクレオチド配列（配列番号１）をそのアミノ酸への翻
訳（配列番号２）と共に図１及び図２に示す。本発明の
キシラナーゼは、前駆体として合成される。前駆体は、
２４８個のアミノ酸（配列番号６）を含んでいる。キシ
ラナーゼ前駆体をコードするヌクレオチド配列（配列番
号４）及びそのアミノ酸への翻訳（配列番号５）が同定
される。

【０００６】前駆体は、成熟キシラナーゼの２２１個の
アミノ酸の配列（配列番号３）及びプレ配列の２７個の
アミノ酸の配列（配列番号９）を含んでいる。成熟キシ
ラナーゼ配列の前にはプレ配列がある。後者は、２７個
のアミノ酸の追加配列（配列番号９）である。対応する
ヌクレオチド配列（配列番号７）及びそのアミノ酸への
翻訳（配列番号８）が同定される。そのプレ配列は、本
発明のキシラナーゼのシグナルペプチドをコードする。
前記キシラナーゼは、実験的等電点約9.５〜約9.７を有
することが特に好ましい。本発明のキシラナーゼは、耐
熱性であり、広範囲のｐＨに活性である。本発明のキシ
ラナーゼは、アルカリ性であることが好ましい。更に、
本発明のキシラナーゼは、紙パルプの酵素処理の実際の
工業的条件とすべて適合した適切な性質を有する。工業
的に用いられる種々の紙パルプ処理の多くの工程によれ
ば、これらの性質は、ｐＨ及び温度に関する良好な安定
性及び広範囲のｐＨ及び温度、特にｐＨ約５〜１０及び
約５０〜８０℃の温度での酵素活性である。

【０００７】本発明のキシラナーゼは、ｐＨ約５以上の
範囲で活性である。本発明のキシラナーゼは、ｐＨ約１
１以下の範囲で活性である。キシラナーゼは、約５０℃
の温度及びキシランの存在下ｐＨ約5.０以上の範囲で測
定した最大活性５０％を超える酵素活性を発現する。キ
シラナーゼは、約５０℃の温度及びキシランの存在下ｐ
Ｈ約１0.５よりも小さい範囲で最大活性５０％を超える
酵素活性を発現する。本発明のキシラナーゼは、約５０
℃以上の温度範囲で活性である。本発明のキシラナーゼ
は、約８０℃以下の温度範囲で活性である。キシラナー
ゼは、ｐＨ約９及びキシランの存在下約５０℃以上の温
度範囲で測定した最大活性５０％を超える酵素活性を発
現する。キシラナーゼは、ｐＨ約９及びキシランの存在
下約８０℃よりも低い温度範囲で測定した最大活性５０
％を超える酵素活性を発現する。本発明は、また、修飾
キシラナーゼ、即ち、アミノ酸配列が少なくとも１個の
アミノ酸によって野生型酵素と異なる酵素に関する。こ
れらの修飾は、ＤＮＡに関する標準突然変異手法、例え
ば、紫外線照射又はエチルメタンスルホン酸（ＥＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（ＭＮＮＧ）、亜硝酸ナトリウム又はＯ−メチルヒド
ロキシルアミンのような化学生成物への露出又は遺伝子
工学手法、例えば、部位特異的突然変異誘発又はランダ
ム突然変異誘発によって得られる。これらの手法は、当
業者に既知であり、特にMolecular cloning - a labora
tory manual - Sambrook, Fritsch, Maniatis - sec. e
dit.,1989, Chap.15に記載されている。

【０００８】本発明は、また、バシラス種７２０／１株
から得られたキシラナーゼと同一又は部分的に同一の免
疫化学的性質を有するキシラナーゼに関する。免疫化学
的性質は、同定試験によって免疫学的に、特に特異的ポ
リクローナル又はモノクローナル抗体を用いて求められ
る。同定試験、特に、オクタロニー拡散法又は免疫電気
泳動法は当業者に既知である。その方法の例は、Axelse
n N.H., Handbook ofImmunoprecipitation Gel Techniq
ues, Blackwell Scientific Publication, 1983, Chap.
5 & 14 に記載されており、『抗原同定』及び『部分的
抗原同定』なる語は、この文献の第５、１９及び２０章
に記載されている。特異抗体を含む血清は、記載されて
いる方法に従って動物（例えば、マウス、ウサギ又はヤ
ギ）を精製キシラナーゼ標品で免疫することにより調製
される。その標品はフロイントアジュバントのような添
加剤と混合され、得られた混合液が動物に注射される。
ポリクローナル抗体は、１回又は数回の免疫後に得られ
る。例は、各々が１５０μg の精製キシラナーゼを含む
４画分を２週おきに皮下注射することからなり、その免
疫は８週間続けられる。その血清は免疫期間の後に回収
され、免疫グロブリンがAxelsen N.H.(1983)に記載され
ている方法に従って分離される。

【０００９】本発明は、また、キシラナーゼを産生する
新規な分離及び精製好気性菌の同定及び提供に関する。
一般にはバシラス科に属する。好ましくはバシラス属に
属する。前記バシラスは、バシラス種７２０／１株又は
その菌株の誘導体又は変異体である。その菌株の誘導体
は、天然に修飾された細菌を意味すると理解されるもの
である。その菌株の誘導体は、特定培地による培養、紫
外線照射又はＸ線のような既知の修飾手法によって得ら
れる。その菌株の変異体は、人工的に修飾された細菌を
意味すると理解されるものである。その菌株の変異株
は、突然変異原への露出及び遺伝子工学手法のような既
知の修飾手法によって得られる。これらの手法は、当業
者に既知であり、特にSambrookら, 1989, Chap.15 に記
載されている。バシラス種７２０／１株は、1994年６月
９日にＬＭＧ番号Ｐ−１４７９８としてブダペスト条約
に基づくBelgian Coordinated Collections of Microor
ganisms(ＬＭＧカルチュアコレクション, Ghent Univer
sity, Microbiology Laboratory - K.L. Ledeganckstra
at 35, B-9000 ゲント、ベルギー) と呼ばれるコレクシ
ョンに寄託された。本発明は、バシラス種７２０／１株
の分離及び精製培養物及びその誘導又は突然変異培養物
に関する。

【００１０】本発明の菌株は、その生化学的特徴：内生
胞子を形成する桿状菌の形を取る好気性グラム陽性菌に
よって同定された。本発明は、また、バシラス種７２０
／１株（ＬＭＧＰ−１４７９８）の成熟キシラナーゼ
をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）又はその
配列由来の修飾配列を含むＤＮＡ分子の分離及び提供に
関する。そのＤＮＡ分子は、バシラス種７２０／１キシ
ラナーゼ全遺伝子を含むことが好ましい。キシラナーゼ
全遺伝子（配列番号１０）は、少なくとも転写プロモー
ター、シグナル配列、成熟キシラナーゼをコードするヌ
クレオチド配列及び転写ターミネーターを意味すると理
解されるものである。ＤＮＡ分子由来の修飾配列は、本
発明のキシラナーゼをコードする遺伝子の１種以上のヌ
クレオチドの修飾によって得られたＤＮＡ分子を意味す
ると理解されるものである。その配列を得る手法は、当
業者に既知であり、特にMolecular Cloning - a labora
tory manual - Sambrook, Fritsch, Maniatis - sec. e
dit.,1989, Chap.15 に記載されている。通常、ＤＮＡ
分子由来の修飾配列は、本発明のキシラナーゼをコード
する遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と少なく
とも７０％の相同性、即ち、配列中同じ位置を有する同
一ヌクレオチドを少なくとも７０％含む。ＤＮＡ分子由
来の修飾配列は、本発明のキシラナーゼをコードする遺
伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも８
０％の相同性を含むことが好ましい。ＤＮＡ分子由来の
修飾配列は、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子
のヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも９０％
の相同性を含むことが特に好ましい。

【００１１】成熟キシラナーゼをコードする完全ヌクレ
オチド配列をそのアミノ酸への翻訳（配列番号２）と共
に図１及び図２に示す。通常、本発明のＤＮＡ分子は、
少なくともキシラナーゼ前駆体又はその配列由来の修飾
配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）を含
む。そのヌクレオチド配列（配列番号４）は、バシラス
種７２０／１（ＬＭＧＰ−１４７９８）の成熟キシラ
ナーゼ及びそのシグナル配列（プレ配列)(配列番号７）
をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。
そのＤＮＡ分子は、好ましくはバシラス種７２０／１キ
シラナーゼ全遺伝子、特に好ましくはヌクレオチド配列
（配列番号１０）を含む。ヌクレオチド配列（配列番号
１０）は、アミノカルボキシの向きに左から右にキシラ
ナーゼプロモーターを含むヌクレオチド配列（配列番号
１２）、プレ配列のヌクレオチド配列（配列番号７）、
成熟キシラナーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）及
びキシラナーゼターミネーターを含むヌクレオチド配列
（配列番号１３）からなる。図３及び図４は、キシラナ
ーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列をそのアミ
ノ酸への翻訳（配列番号１１）と共に示すものである。

【００１２】１態様においては、本発明は、また、バシ
ラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコード
する遺伝子由来のプロモーター、プレ配列及びバシラス
種７２０／１キシラナーゼをコードするヌクレオチド配
列（配列番号１）又はその配列由来の修飾配列を含むＤ
ＮＡ分子に関する。他の態様においては、本発明は、ま
た、プロモーター、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１
２キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプレ配
列及びバシラス種７２０／１キシラナーゼをコードする
ヌクレオチド配列（配列番号１）又はその配列由来の修
飾配列を含むＤＮＡ分子に関する。好ましくは、本発明
は、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
をコードする遺伝子由来のプロモーター（配列番号２
６）、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナー
ゼのシグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号
２７）及びバシラス種７２０／１キシラナーゼをコード
するヌクレオチド配列（配列番号１）又はその配列由来
の修飾配列を含むＤＮＡ分子に関する。

【００１３】本発明は、また、バシラス・ピュミルスＰ
ＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子由来のプ
ロモーター（配列番号２６）に関する。プロモーター配
列は、図１３に示されている。本発明は、また、バシラ
ス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナル
ペプチドをコードするプレ配列（配列番号２７）に関す
る。２７個のアミノ酸の対応配列が同定された（配列番
号２９）。そのヌクレオチド配列は、そのアミノ酸への
翻訳（配列番号２８）と共に図１４に示されている。バ
シラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコー
ドする遺伝子由来のプロモーター及びバシラス・ピュミ
ルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナルペプチドを
コードするプレ配列の入手及び調製方法は、欧州特許出
願第 0,634,490号の実施例１７及び図１に記載されてお
り、これを参考として本明細書に引用する。バシラス・
ピュミルスＰＲＬＢ１２株は、1993年６月24日にＡＴ
ＣＣ番号５５４４３としてブダペスト条約に基づくＡＴ
ＣＣコレクション（アメリカン・タイプ・カルチュア・
コレクション、12301 パークラウンドライブ、ロックビ
ル、メリーランド、20852 、米国）に寄託された。

【００１４】本発明は、また、上記で定義されたキシラ
ナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の修飾に
よって得られた成熟ＤＮＡ分子及びそれに由来する成熟
キシラナーゼ（成熟ＤＮＡ分子がコードしている）に関
する。その成熟キシラナーゼを得る手法は、当業者に既
知であり、特にMolecular Cloning - a laboratory man
ual - Sambrook, Fritsch, Maniatis - sec. edit., 19
89, Chap.15 に記載されている。本発明はまた、上記で
定義されたＤＮＡ分子を含む発現ベクター又は染色体組
込みベクターに関する。一般に、発現ベクター又は染色
体組込みベクターは、バシラス種７２０／１キシラナー
ゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）又はそ
の配列由来の修飾配列を含むＤＮＡ分子を含む。通常、
発現ベクター又は染色体組込みベクターは、キシラナー
ゼをコードする遺伝子又はその配列由来の修飾配列を含
むＤＮＡ分子を含む。好ましくは、発現ベクター又は染
色体組込みベクターは、バシラス種７２０／１キシラナ
ーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）又
はその配列由来の修飾配列を含むＤＮＡ分子を含む。特
に好ましくは、そのベクターは、発現ベクターｐＵＢＲ
Ｄ−７２０Ｘ１１である。良好な結果は、発現ベクター
ｐＵＢＲ−７２０Ｘ１１でも得られた。

【００１５】本発明の１態様は、キシラナーゼの成熟部
分をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子又はその分子由
来の修飾配列を含む発現ベクター又は染色体組込みベク
ターに関する。一般に、発現ベクター又は染色体組込み
ベクターは、バシラス種７２０／１キシラナーゼをコー
ドするヌクレオチド配列（配列番号１）又はその配列由
来の修飾配列を含むＤＮＡ分子を含む。通常、発現ベク
ター又は染色体組込みベクターは、バシラス・ピュミル
スＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子（配
列番号２６）由来のプロモーター、プレ配列及びバシラ
ス種７２０／１キシラナーゼをコードするヌクレオチド
配列（配列番号１）又はその配列由来の修飾配列を含む
ＤＮＡ分子を含む。通常の態様においては、発現ベクタ
ーは、プロモーター、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ
１２キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプレ
配列（配列番号２７）及びバシラス種７２０／１キシラ
ナーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）又
はその配列由来の修飾配列を含むＤＮＡ分子を含む。好
ましくは、発現ベクター又は染色体組込みベクターは、
バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコ
ードする遺伝子（配列番号２６）由来のプロモーター、
バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシ
グナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２７）
及びバシラス種７２０／１キシラナーゼをコードするヌ
クレオチド配列（配列番号１）又はその配列由来の修飾
配列を含むＤＮＡ分子を含む。特に好ましくは、そのベ
クターは、発現ベクターｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘ
である。良好な結果は、発現ベクターｐＣ−ＢＰＸ−Ｐ
ＲＥ−７２０Ｘでも得られた。

【００１６】本発明は、また、ポリペプチドの生産に用
いられる発現系に関する。本発現系は、 − バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
をコードする遺伝子由来のプロモーター配列（配列番号
２６）、 − シグナルペプチドをコードする配列、及び − 問題のポリペプチド配列、を含む。一般に、その発現系は、ターミネーター配列を
含む。１態様においては、本発現系は、 − プロモーター配列、 − バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼの
シグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２
７）、及び − 問題のポリペプチド配列、を含む。

【００１７】一般に、その発現系は、ターミネーター配
列を含む。通常、本発現系は、 − バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼを
コードする遺伝子由来のプロモーター配列（配列番号２
６）、 − バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼの
シグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２
７）、 − 問題のポリペプチド配列、及び − ターミネーター配列、を含む。好ましくは、問題のポリペプチドは、ヒドロラ
ーゼのような酵素である。特に好ましくは、問題のポリ
ペプチドは、プロテアーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、
セルラーゼ、アミラーゼ又はプルラナーゼである。良好
な結果は、バシラス種７２０／１株によって天然に産生
されたキシラナーゼで、即ち、発現系において、ポリペ
プチド配列がバシラス種７２０／１キシラナーゼをコー
ドするヌクレオチド配列（配列番号１）に相当する場合
に得られた。

【００１８】本発明は、また、キシラナーゼをコードす
る遺伝子が遺伝子工学手法によって導入される組換え菌
株に関する。その遺伝子は、複製ベクターによって導入
されるか又は組込みベクターによって１コピー以上で宿
主染色体に組込まれ、キシラナーゼをコードするヌクレ
オチド配列が染色体ＤＮＡに組込まれた形あるいは自己
複製（プラスミド）の形で形質転換により導入される。
本発明は、また、開始生産微生物と異なる微生物の菌株
に関し、その菌株にキシラナーゼをコードするヌクレオ
チド配列が染色体ＤＮＡに組込まれた形あるいは自己複
製（プラスミド）の形で形質転換により導入され、キシ
ラナーゼをコードする遺伝子が複製ベクターによって導
入されるか又は組込みベクターによって１コピー以上で
宿主染色体に組込まれる。本発明は、バシラス種７２０
／１の成熟キシラナーゼをコードする構造遺伝子を含む
ＤＮＡ分子を含む形質転換株に関する。一般に、形質転
換株は、細菌の菌株である。通常、形質転換株は、エシ
ェリキア(Escherichia) 、シュードモナス(Pseudomona
s) 又はバシラス株より選ばれる。好ましくは、形質転
換株はバシラス株である。特に好ましくは、形質転換バ
シラス株は、バシラス・リケニホルミス株、バシラス・
ピュミルス株、バシラス・アルカロフィルス (Bacillus
alcalophilus)株又はバシラス種７２０／１株である。
良好な結果は、バシラス・リケニホルミス株及びバシラ
ス・ピュミルス株で得られた。

【００１９】本発明は、そのＤＮＡ分子を含む発現ベク
ター又は染色体組込みベクターを含む形質転換バシラス
株に関する。形質転換バシラス株は、バシラス・リケニ
ホルミス株であることが好ましい。形質転換バシラス株
は、バシラス種７２０／１株であることも好ましい。本
発明は、また、上記で定義された形質転換株によって産
生されたキシラナーゼに関する。本発明は、また、好気
的条件下炭素源及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養
培地中でキシラナーゼを産生することができる好気性菌
の培養及び得られたキシラナーゼの回収を含むキシラナ
ーゼの生産方法に関する。その培養基は、固体又は液体
とすることができる。培養基は、液体であることが好ま
しい。好気性菌は、バシラス株又はキシラナーゼを産生
することができるその菌株の誘導体であることが好まし
い。本発明は、また、バシラス種７２０／１株又は好気
的条件下炭素源及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養
培地中でキシラナーゼを産生することができるその菌株
の誘導体の培養及び得られたキシラナーゼの回収を含む
キシラナーゼの生産方法に関する。

【００２０】本発明は、キシラナーゼの組換え生物から
の調製方法であって、キシラナーゼをコードするＤＮＡ
断片の分離、そのＤＮＡ断片の適切なベクターへの挿
入、そのベクターの適切な宿主への導入又はそのＤＮＡ
断片の適切な宿主の染色体への導入、その宿主の培養、
キシラナーゼの発現及びキシラナーゼの回収を含む方法
に関する。一般に、適切な宿主は、エシェリキア・コリ
(Escherichia coli)、バシラス又はアスペルギルス(Asp
ergillus) 微生物からなる群より選ばれる。通常、宿主
はバシラス種より選ばれる。好ましくは、宿主は、バシ
ラス属（好気性）の微生物より選ばれる。特に好ましく
は、宿主は、微生物バシラス・サチリス(Bacillus subt
ilis) 、バシラス・リケニホルミス、バシラス・アルカ
フィルス、バシラス・ピュミルス、バシラス・レンタス
(Bacillus lentus) 、バシラス・アミロリクェファシエ
ンス(Bacillus amyloliquefaciens)又はバシラス種７２
０／１より選ばれる。良好な結果は、本発明によるキシ
ラナーゼの発現のための宿主がバシラスリケニホルミ
ス、好ましくはバシラス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅ
ｌａｐ１及びバシラス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌ
ａｐ６由来の組換え株である場合に得られた。バシラス
・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ１及びバシラス・
リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６は欧州特許出願第
0,634,490号に記載されており、これを参考として本明
細書に引用する。

【００２１】本発明は、また、バシラス属の微生物によ
って異種生産されたキシラナーゼに関する。通常、バシ
ラス属の微生物は、野生型状態にある場合にアルカリ性
プロテアーゼをコードする遺伝子を含んでいる。好まし
くは、その微生物は、バシラス種７２０／１キシラナー
ゼをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含
むバシラスリケニホルミス株である。特に好ましくは、
アルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子は、そのバ
シラス株から欠失により除去された。その菌株は、バシ
ラス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ１又はバシラ
ス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６であることが
好ましい。異種生産は、天然微生物、即ち、野生型状態
においてキシラナーゼをコードする遺伝子を含む微生物
によって行われない生産を意味すると理解されるもので
ある。それらの細菌の培養条件、例えば、栄養培地の成
分、培養パラメーター、温度、ｐＨ、通気及び攪拌は当
業者に周知である。その手法の例は、特に Ullmann'sEn
cyclopedia of Industrial Chemistry, 1987, 5th Edi
t., Vol.A9, p.363-390 に記載されている。

【００２２】キシラナーゼを回収する手法は、当業者に
周知であり、キシラナーゼに予想された使用に従って選
ばれる。通常、遠心、ろ過、限外ろ過、蒸発、精密ろ
過、結晶又はそれらの手法の１つ又は他の組合わせ（例
えば、遠心後に限外ろ過する）が用いられる。その手法
の例は、特に R. scriban, Biotechnology, (Technique
et Documentation Lavoisier), 1982, p.267-276 及び
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 19
87, 5th Edit., Vol.A9, p.363-390 に記載されてい
る。キシラナーゼは、次に、必要があれば及び予想され
た使用に従って精製することができる。酵素精製法、例
えば、硫酸アンモニウムのような塩を用いるか又はアセ
トン又はアルコールのような溶媒を用いる沈降が当業者
に周知である。その手法の例は、特に R. Scriban, Bio
technology, (Technique et DocumentationLavoisier),
1982, p.267-276 に記載されている。また、キシラナ
ーゼは噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥される。その
手法の例は、特に R. scriban, Biotechnology, (Techn
ique et Documentation Lavoisier), 1982, p.267-276
及びUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr
y, 1987, 5th Edit., Vol.A9, p.363-390に記載されて
いる。

【００２３】本発明は、また、本発明のキシラナーゼ及
び少なくとも１種の添加剤を含む酵素組成物に関する。
これらの添加剤は、当業者に既知であり、組成物に予想
された使用に従って選ばれる。キシラナーゼと適合しな
ければならず、キシラナーゼの酵素活性にほとんどある
いは全く影響してはならない。通常、これらの添加剤
は、酵素安定剤、保存剤及び処方薬品である。本発明の
キシラナーゼを含む組成物は、固体又は液体として用い
られる。キシラナーゼは、予想された使用に従って処方
される。安定剤又は保存剤は、また、本発明のキシラナ
ーゼを含む酵素組成物に添加される。例えば、プロピレ
ングリコール、エチレングリコール、グリセロール、デ
ンプン、キシラン、糖、例えば、グルコース及びソルビ
トール、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウ
ム、ソルビン酸カリウム及び安息香酸ナトリウム又はこ
れらの生成物の２種以上の混合物を加えることによりキ
シラナーゼを安定化することが可能である。良好な結果
はプロピレングリコールで得られた。良好な結果はソル
ビトールで得られた。

【００２４】本発明のキシラナーゼは、種々の工業、例
えば、食品工業、医薬品工業又は化学工業において多く
の用途がある。キシラナーゼは、特にパン製造において
用いられる。パン製造におけるキシラナーゼの使用の例
は、特に国際出願第94/04664号に記載されている。キシ
ラナーゼは、特に紙パルプ処理に用いることができる。
紙パルプ処理のためのキシラナーゼの使用の例は、特に
欧州特許出願第 0,634,490号に記載されている。本発明
の記載は、特に、本明細書の実施例１３に示されている
ようにユーカリの木に由来するパルプに効果的である。
キシラナーゼは、特に動物飼料に用いることができる。
動物飼料におけるキシラナーゼの使用の例は、特に欧州
特許出願第 0,507,723号に記載されている。図１及び図
２は、成熟キシラナーゼをコードするヌクレオチド配列
（配列番号２）をそのアミノ酸への翻訳と共に示すもの
である。図３及び図４は、キシラナーゼをコードする遺
伝子のヌクレオチド配列（配列番号１１）をそのアミノ
酸への翻訳と共に示すものである。図５は、プラスミド
ｐＵＢＲ２００２の制限地図を示すものである。

【００２５】図６は、プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１
の制限地図を示すものである。図７は、プラスミドｐＵ
ＢＲ−７２０Ｘ１１の制限地図を示すものである。図８
は、プラスミドｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１の制限地図を
示すものである。図９は、プラスミドｐＵＢＣ２００１
の制限地図を示すものである。図１０は、プラスミドｐ
Ｃ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３の制限地図を示すもので
ある。図１１は、プラスミドｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７
２０Ｘの制限地図を示すものである。図１２は、プラス
ミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘの制限地図を示すも
のである。図１３は、バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ
１２キシラナーゼをコードする遺伝子由来のプロモータ
ー（配列番号２６）を示すものである。図１４は、バシ
ラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナ
ルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２８）を示
すものである。これらの図面に用いた略号及び記号の意
味を下記表に纏める。

【００２６】記号略号意味 ──────────────────────────────────── OricEC E.coli における複製起原 REP バシラスにおける複製に要するタンパク質 Ori+ バシラスにおける＋鎖の複製起原 Ori- バシラスにおける−鎖の複製起原 AmpR アンピシリン耐性を付与する遺伝子 KmR カナマイシン耐性を付与する遺伝子 BlmR ブレオマイシン耐性を付与する遺伝子 5′720XYL バシラス種７２０／１キシラナーゼをコードする配列の上流に位置する 5′配列 3′720XYL バシラス種７２０／１キシラナーゼをコードする配列の下流に位置する 5′配列 720XYL バシラス種７２０／１キシラナーゼ前駆体をコードする配列 5′BPUXYL-PRE バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのプロモーターとリボソーム結合部位の後ろにあるバシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのプレ配列 720XYL-MAT バシラス種７２０／１キシラナーゼの成熟部分をコードする配列 ──────────────────────────────────── 本発明を下記実施例によって具体的に説明する。

【００２７】

【実施例】実施例１バシラス種７２０／１株の分離及び確認アルゼンチンで入手した土壌試料から栄養寒天培地上で
バシラス種７２０／１株を分離し、商品名 AZCL-キシラ
ンとして知られ Megazyme 社で販売されている着色キシ
ラン誘導体の分解能を選択した。この菌株を、組成が次
の通りであるＬＢＳ／Ｃ増殖培地中３７℃で培養した：
ふすま１０ｇ／リットル、トリプトン(Difco) １０ｇ／
リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ１０ｇ
／リットル、Ｎａ₂ＣＯ₃5.３ｇ／リットル、ＮａＨＣ
Ｏ₃4.２ｇ／リットル。炭酸ナトリウム及び重炭酸ナト
リウムを別々に滅菌した後、無菌培地の他の成分に無菌
的に加える。寒天培地は、更に２０ｇ／リットルの寒天
を含む。本発明の菌株を、その生化学的特徴：内生胞子
を形成する桿状菌の形を取る好気性グラム陽性菌により
同定した。従って、これはバシラス属に属する。

【００２８】３７℃のＬＢＳ／Ｃ寒天培地上での培養に
おけるこの菌株の栄養細胞は、サイズが0.８×3.０〜3.
５μm の桿菌の形態をもつ。栄養細胞の運動性は陽性で
ある。ＴＳＡ寒天培地上３７℃で１３日間増殖した後、
顕微鏡観察により胞子嚢の存在がわかる。ＴＳＡ寒天培
地は、１５ｇ／リットルのトリプトン(Difco) 、５ｇ／
リットルのダイズペプトン、５ｇ／リットルのＮａＣｌ
及び１５ｇ／リットルの寒天を含む。菌株は、胞子形成
が弱い。カタラーゼ試験は、１０％(v/v) の過酸化水素
の存在下に陽性である。オキシダーゼ試験は、１％(w/
w) のテトラメチル−1,４−フェニレンジアミン二塩酸
塩の存在下に陽性である。本菌株は、好気性、即ち、好
気的条件下で発育する。嫌気的条件下、即ち、８４％(v
/v) Ｎ₂、８％(v/v) のＣＯ₂、８％(v/v) のＨ₂の雰
囲気下３７℃で発育しない。略号％(v/v) は、容量／容
量として表される％を示す。

【００２９】本菌株は、好熱性でない。ＬＢＳ／Ｃ寒天
培地中２０℃、３０℃、３７℃及び４５℃でインキュベ
ートした後、正常な発育を示すが、一方５０℃及び５５
℃又は１０℃では発育しない。ＬＢＳ／Ｃ寒天培地中2.
０％(w/v) 及び3.５％(w/v) の濃度のＮａＣｌの存在下
にインキュベートした後、正常な発育を示し、5.０％(w
/v) 及び7.０％(w/v)ＮａＣｌの存在下では発育が弱
い。略号％(w/v) は、重量／容量として表される％を示
す。バシラス種７２０／１株は、グルコースを酸性にし
ない。バシラス種７２０／１株を、製造業者(APIシステ
ム、フランス）の使用説明書に従いＡＰＩ５０ＣＨＢス
トリップ及びＡＰＩ２０Ｅストリップによって同定し
た。バシラス種７２０／１株は、グリセロール、Ｎ−ア
セチルグリコサミン、アルブチン、クエン酸塩、ガラク
トース、アミグダリン及びメリビオースを利用し、ゼラ
チンを加水分解する。これらの特徴は、バシラス種７２
０／１株とバシラスピュミルス株と明らかに区別する。
要するに、バシラスピュミルス株はこれらの特性をいず
れも示さない。

【００３０】更に、バシラス種７２０／１株を Biolog
系（米国）によって同定した。この系の結果を分析する
データバンクは、バシラス・コアギュランス(Bacillus
coagulans)の評点0.５６４、バシラス・サチリス0.０９
７、バシラス・リケニホルミス0.０５７及びバシラス・
ピュミルス0.００を示す。これらの特徴は、バシラス種
７２０／１株とバシラス・コアギュランス株、バシラス
・サチリス株、バシラス・リケニホルミス株及びバシラ
ス・ピュミルス株とを明らかに区別する。従って、分離
した細菌はバシラス属に属し、既知の種を決定すること
ことができなかった。バシラス種７２０／１株を、Belg
ian Coordinated Collections of Microorganisms(ＬＭ
Ｇカルチュアコレクション）と呼ばれるコレクションに
ＬＭＧ番号Ｐ−１４７９８として寄託した。

【００３１】実施例２バシラス種７２０／１株によるキシラナーゼの生産バシラス種７２０／１株を、ＬＢＳ／Ｃ寒天培地を含む
ペトリ皿上３７℃で４８時間培養する（培養物Ａ）。次
いで、培養物Ａを、組成がふすまを含まないほかはＬＢ
Ｓ／Ｃ培地と同じＬＢ／Ｃ液体培地中３７℃で２４時間
２５０ rpmの速度で最大振幅約2.５４cmによって旋回振
盪しつつ培養する（培養物Ｂ）。次いで、５００mlの培
養物Ｂを１４リットルのＬＢＳ／Ｃ培地を含む２０リッ
トルの発酵槽に移す。ｐＨの自然値を調べ、攪拌速度と
発酵槽に吹き込まれる空気の流速は培養基に溶解される
酸素の分圧が飽和値の３０％よりも小さくないようにす
る。３７℃で７２時間培養した後、キシラナーゼと細胞
バイオマスを8,０００ rpmで３０分間遠心することによ
り（ベックマン J21, JA10ローター）分離する。バシラ
ス種７２０／１株によって産生されるキシラナーゼは細
胞外である。次いで、遠心上清の残留不溶物質を精密ろ
過(KROS FLOII カートリッジ、多孔性0.２μ、Microgan
社）によりキシラナーゼから分離する。

【００３２】精密ろ過保持物質を１リットルの脱イオン
水で洗浄する。その洗浄を３回行う。次いで、その精密
ろ過の浸透物を、区分閾値６ｋＤを有する Pall MICROZ
A SIP 1013ポリスルホンカートリッジ (Pall社) に限外
ろ過することにより約２０倍に濃縮する。得られた限外
ろ過保持物質（生産物Ｒ）及び浸透物（生産物Ｐ）の酵
素活性を測定する。キシラナーゼ酵素１単位（ＩＵ）
は、ｐＨ8.０、５０℃の温度及びキシランの存在下に毎
分１μモルのグルコースの速度（μモル／分）でグルコ
ース等価物の遊離を触媒する酵素量として定義される。
クエン酸塩−リン酸塩バッファーを５０mMトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
8.０）に置き換えた以外は、Bailey, Biely &Poutanen,
J. Biotechnology, 1992, 23, p.257-270 に記載され
ているプロトコールに従ってキシラナーゼ酵素活性を測
定する。限外ろ過保持物質（生産物Ｒ）に十分量のポリ
エチレングリコール（メルクポリエチレングリコール基
準 807490)を加えて４０％(w/w) の濃度を得る。ポリエ
チレングリコールを可溶化した後、得られた溶液を２５
℃で３０分間インキュベートする。

【００３３】次いで、ポリエチレングリコールとキシラ
ナーゼを含む溶液を8,０００ rpmで１０分間遠心する
（ベックマン J21遠心機, JA10ローター）。上清を遠心
分離により除去する。遠心分離沈降物に十分量のＮａＣ
ｌ溶液（0.９％v/v)を加えて用いた保持物質の開始量を
回収する（生産物Ｒ）。次いで、キシラナーゼとＮａＣ
ｌを含むその懸濁液に十分量のアセトンを加えて４０％
(v/v) の濃度を得る。そのアセトン懸濁液を４℃で４５
分間インキュベートする。インキュベートした後、その
アセトン懸濁液を8,０００ rpmで１０分間遠心する（ベ
ックマン J21, JA10ローター）。遠心分離上清を保持す
る。その遠心分離上清にアセトンを８０％(v/v) まで加
える。そのアセトン懸濁液を４℃で４５分間インキュベ
ートする。インキュベートした後、そのアセトン懸濁液
を8,０００ rpmで１０分間遠心する（ベックマン J21,
JA10ローター）。遠心分離沈降物を保持する。それを可
溶化されるべき十分量の0.９％(v/v) ＮａＣｌ溶液に懸
濁する（生産物Ｎ）。

【００３４】実施例３キシラナーゼの精製実施例２で得られた限外ろ過保持物質（生産物Ｎ）の画
分を、２０mMビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）バッフ
ァー、ｐＨ6.２（バッファーＡ）で平衡にしたゲル浸透
クロマトグラフィーカラム(Bio-Rad Econopac 10DGカラ
ム）を通過させることにより調整する。それにより生産
物Ｘと称する溶液が得られる。次いで、１mlの生産物Ｘ
溶液を、バッファーＡで予め平衡にしたＳセファロース
HP 16/10(ファーマシア）カチオン交換カラムに加え
る。流速は、無勾配溶離１０分、次にＮａＣｌ濃度勾配
（１０〜５０分；ＮａＣｌ含量は０から0.７M まで上が
る）について毎分2.５mlである。勾配中にキシラナーゼ
の溶離に対応する１本のピークが検出される。キシラナ
ーゼ活性を含む画分（溶液Ａ）を収集する。キシランを
含む寒天培地（0.５ｇ／リットルの AZCL-キシラン、５
０mMトリスバッファー（ｐＨ8.０）及び１５ｇ／リット
ルの寒天を含む培地）に１０μl の各画分を加えること
により、これらの画分がキシラナーゼを含んでいること
が実証される。キシラナーゼを含む画分の回りにハロが
形成する。

【００３５】実施例４アミノ酸配列本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列は、実施例１４に
記載されるように得られるそのキシラナーゼをコードす
る遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）から間接
的に求められる。これは、米国 IntelliGenetics社のコ
ンピュータプログラム分子生物学のインテリジェネチク
ススウィートソフトウエア（リリース#5.4) を用いて行
われる。図３及び図４は、キシラナーゼをコードする遺
伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）をそのアミノ
酸への翻訳（配列番号１１）と共に示すものである。キ
シラナーゼは、前駆体として合成される。キシラナーゼ
前駆体は、２４８個のアミノ酸を含む（配列番号６）。
キシラナーゼ前駆体をコードするヌクレオチド配列（配
列番号４）及びそのアミノ酸への翻訳（配列番号５）が
同定される。前駆体として合成されたキシラナーゼのプ
レ配列が同定される。それは、２７個のアミノ酸の配列
である（配列番号９）。対応するヌクレオチド配列（配
列番号７）が同定される。次いで、成熟キシラナーゼの
アミノ酸配列が同定される。成熟キシラナーゼは、２２
１個のアミノ酸を含む（配列番号３）。図１及び図２
は、成熟キシラナーゼをコードするヌクレオチド配列
（配列番号１）をそのアミノ酸への翻訳（配列番号２）
と共に示すものである。

【００３６】実施例５アミノ酸分布キシラナーゼ（実施例４）のアミノ酸配列（配列番号
３）から求めた成熟キシラナーゼのアミノ酸分布を表１
に纏める。

【００３７】

【表１】表１記号アミノ酸数 % (分子量による) ──────────────────────────────────── N アスパラギン 25 11.6 Y チロシン 13 8.6 T トレオニン 18 7.4 S セリン 19 6.7 I イソロイシン 14 6.4 V バリン 14 5.6 G グリシン 24 5.5 W トリプトファン 7 5.3 K リシン 10 5.2 R アルギニン 8 5.1 Q グルタミン 9 4.7 D アスパラギン酸 10 4.7 L ロイシン 10 4.6 E グルタミン酸 8 4.2 F フェニルアラニン 7 4.2 P プロリン 7 2.8 M メチオニン 5 2.7 A アラニン 8 2.3 H ヒスチジン 4 2.2 C システイン 1 0.4 B アスパラギン酸／アスパラギン 0 0.0 X 未知 0 0.0 Z グルタミングルタミン酸 0 0.0 ────────────────────────────────────

【００３８】実施例６分子量の推定キシラナーゼの分子量を、実施例４に記載されるキシラ
ナーゼの成熟形態のアミノ酸配列から計算して推定す
る。分子量２４６９8.６１ダルトンが計算により推定さ
れる。

【００３９】実施例７分子量の決定実施例３で得られたキシラナーゼを含む溶液Ａを Centr
icon 10kD 装置(Amicon)で濃縮する。１００μl の濃縮
液を Superdex 75 HR 10/30(Pharmacia)ゲル浸透クロマ
トグラフィーカラムに加える。カラムは、Pharmacia の
ゲルろ過ＬＭＷ検定キット、コード17-0442-01、分子量
マーカーで予め検定した。溶離は、0.２M ＮａＣｌを添
加した２５mMＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミ
ノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）バッ
ファーｐＨ9.２によって0.２５ml／分で行った。得られ
たクロマトグラムは、キシラナーゼ活性に対応する１本
のピークを示す。これによりタンパク質の見掛け分子量
約１3.５ｋＤのが推定される。また、この１本のピーク
に由来する画分を、変性条件下ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかける。用いられるゲ
ル系は Pharmacia LKBBiotechnologyの PhastSystem系
であり、ゲルはポリアクリルアミド勾配１０−１５％(v
/v) を含む。電気泳動条件は、製造業者が指定したもの
である。Pharmacia ＬＭＷ（低分子量）分子量マーカ
ー、基準 17-0446-01 を対照として用いる。使用したマ
ーカーは、ホスホリラーゼｂ（９４ｋＤ）、アルブミン
（６７ｋＤ）、オボアルブミン（４３４ｋＤ）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤ）、トリプシンインヒ
ビター（２0.１ｋＤ）及びα−ラクトアルブミン（１4.
４ｋＤ）である。クーマシーブルーを用いて染色する
と、分子量約２5.７ｋＤのポリペプチドを示す。

【００４０】実施例８等電点の推定キシラナーゼの等電点を、実施例４に記載されるキシラ
ナーゼの成熟形態のアミノ酸配列から推定する。推定し
た等電点は、変性形態のタンパク質の実効電荷を示すも
のである。変性形態のキシラナーゼには等電点7.４６が
推定される。

【００４１】実施例９等電点の決定実施例３で得られた溶液Ａの画分を、２５mMジエタノー
ルアミンバッファー、ｐＨ9.９で予め平衡にした Mono
P 5/20クロマトフォーカシングカラム(Pharmacia) に製
造業者の推奨に従って加える。カラムを、脱イオン水で
１０倍に希釈したポリバッファー 96 両性電解質溶液(P
harmacia) によって溶離する。キシラナーゼ活性を含む
画分のｐＨは、9.５である。１０μl の画分をキシラン
（0.５ｇ／リットルの AZCL-キシラン、５０mMトリスバ
ッファー（ｐＨ8.０）及び１５ｇ／リットルの寒天を含
む培地）を含む寒天培地に加えることにより、その画分
がキシラナーゼを含むことが実証される。 AZCL-キシラ
ンの加水分解ゾーンの形を取るハロは、キシラナーゼを
含む画分の回りに形成する。実施例３で得られた溶液Ａ
の画分を等電点電気泳動にかける。これを行うために、
Pharmacia DryIEFゲルを２mlの脱イオン水、１５０μl
のBiolyte 8-10生産物(BioRad)及び７５μl のPharmaly
te 8-10.5 生産物(Pharmacia) からなる混合液で再び水
和する。約２００ナノグラムのタンパク質（溶液Ａの画
分）をゲルに加える。製造業者が記載したプロトコール
を行う。これにより、キシラナーゼが使用した最高等電
点を有するマーカーの等電点９9.６よりもわずかに高い
等電点を有することが推定される。実験的に測定された
等電点は、未変性形態のタンパク質の表面電荷を示す。

【００４２】実施例１０天然菌株（バシラス種７２０／１）によって産生された
キシラナーゼのｐＨに関する活性プロファイルキシラン (Roth、基準7500、樺木キシラン) の存在下所
望のｐＨを得るように選択された種々のバッファー中５
０℃の温度及び種々のｐＨ値（5.６〜１0.３５）で実施
例２に記載された方法に従って、キシラナーゼの酵素活
性を測定する。実施例２（生産物Ｎ）で得られたキシラ
ナーゼを含む溶液を用いる。結果を表２に纏める。この
種類の測定では約２５％の誤差が推定されることは留意
される。この分析の過程で、ｐＨ約6.２及び約５０℃の
温度に１５分間置いた試料の最大酵素活性を測定した。
従って、相対酵素活性１００％は当然本試料によるもの
とした。本実施例は、本発明のキシラナーゼが約5.６〜
約１０のｐＨ範囲にわたって著しい酵素活性を発現する
ことを示すものである。

【００４３】

【表２】表２ pH 使用バッファー(50 mM) 相対活性 % ──────────────────────────────────── 5.6 トリス−マレイン酸塩 85 6.2 トリス−マレイン酸塩 100 6.8 トリス−マレイン酸塩 96 7.5 トリス−マレイン酸塩／トリス^* 88 8.7 トリス／Capso ^* 92 9.5 Capso／Caps^* 76 10 Caps 50 10.35 Caps 19 ────────────────────────────────────

【００４４】トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタントリス−マレイン酸＝トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（５０mM）及びマレイン酸（５０mM）からなる
バッファー、成分間の比率は所望ｐＨによって選ばれ、
ｐＨはＮａＯＨ（１M ）によって調整されるＣａｐｓｏ＝３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒド
ロキシ−１−プロパンスルホン酸Ｃａｐｓ＝３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパ
ンスルホン酸記号^*は、得られた数値が同一ｐＨで測定されたが２つ
のバッファーで得られたものの平均であることを意味す
る。本実施例は、本発明のキシラナーゼが極めて広範囲
のｐＨで高酵素活性を発現することを示すものである。

【００４５】実施例１１針葉樹パルプの漂白に対する助剤としてバシラス種７２
０／１株によって産生されたキシラナーゼの活性に関す
るｐＨの影響コンシステンシー2.５％（乾燥物質重量として）及び初
期κ数１７を有する松材パルプ(SCA社から入手）の３水
性懸濁液を調製する。これらの懸濁液のｐＨをＨ₂ＳＯ
₄でｐＨ５に調整する。

【００４６】第１段階：酵素段階（段階Ｘ）実施例２で得られた生産物Ｎと称する溶液を、脱イオン
水で希釈して酵素活性２５ＩＵ／mlを有する酵素溶液(
実施例２に記載される）を得る。キシラナーゼを含むこ
の酵素溶液を、パルプ懸濁液が５ＩＵ／乾燥パルプのｇ
によって処理されるように松材パルプの１懸濁液に加え
る。松材パルプの他の２懸濁液には、酵素溶液の代わり
に脱イオン水を同じ割合で加える。次いで、この３懸濁
液を５０℃で２時間攪拌しつつインキュベートする。

【００４７】第２段階：塩素段階（段階Ｃ）次に、得られた各パルプ懸濁液を塩素水で塩化すること
からなる漂白処理に供する。この処理は、乾燥物質の重
量としてコンシステンシー３％を有するパルプについて
行われる。これを目的として、2.８９（＝0.１７×１
７）％（重量／乾燥パルプの重量）の塩素量を、酵素処
理パルプ懸濁液及び１つの非酵素処理パルプ懸濁液に加
える。3.４０（0.２０×１７）％（重量／重量）の塩素
量を、もう１つの非酵素処理パルプ懸濁液に加える。そ
の３懸濁液を室温で１時間インキュベートする。次いで
パルプを４０容量の脱イオン水で洗浄する。

【００４８】第３段階：水酸化ナトリウム段階（段階
Ｅ）次に、上記で得られ乾燥物質の重量として５％のコンシ
ステンシーを有する３懸濁液にＮａＯＨ２％（重量／乾
燥パルプの重量）を加えることからなるアルカリ抽出を
行う。その３懸濁液を６０℃の温度で１時間３０分イン
キュベートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン
水で洗浄し、約４５°ＩＳＯ（＋／−３°ＩＳＯ）の白
色を有するシートとして回収する。得られた３シートの
κ数を測定する。κ数は、パルプ中に有するリグニン量
の測定に関するものである。κ数は、指定された条件下
ＴＡＰＰＩ（紙パルプ工業会の技術委員会）規格 #T236
cm-85 (1985)に記載されている手順に従って１ｇの乾燥
パルプによって消費された0.１N過マンガン酸カリウム
（ＫＭｎＯ₄)溶液の容量（ミリリットルとして）を表す
数である。度ＩＳＯは、パルプから得られた紙の白色度
の測定に関するものである。この数値は、指定された条
件及び規格 #2470を補足する規格 #ＩＳＯ 2470-1977
（Ｆ）に発表されたＩＳＯ（国際標準化機構）規格 #24
69に記載されている手順に従って得られた紙の反射率で
ある。開始ｐＨをｐＨ５に調整した以外は同じである４
分析を行う。要するに、ｐＨ５の代わりにｐＨを各々ｐ
Ｈ６、ｐＨ７、ｐＨ８及びｐＨ９に調整した松材パルプ
の水性懸濁液で４分析が行われる。結果を表３に纏め
る。

【００４９】

【表３】表３酵素使用量(IU/g) 5 0 0 塩素使用量(%重量／乾燥パルプの重量） 2.89 2.89 3.40 ──────────────────────────────────── 開始 pH κ数 ──────────────────────────────────── 5 4.63 5.01 4.18 6 3.81 / 4.11 7 3.81 5.01 4.06 8 3.55 / 4.21 9 3.71 4.91 4.07 ────────────────────────────────────

【００５０】記号 /は、パルプ懸濁液を試験しなかった
ことを意味する。これらの結果は、本発明のキシラナー
ゼが４５°ＩＳＯまで漂白されたパルプの塩素量の約１
５〜２０％減少が可能であることを示すものである。更
に、これらの結果は、アルカリ性ｐＨ及び酸性ｐＨ双方
で得られる。これらの良好な結果は、ｐＨ約９でも得ら
れる。本実施例は、本発明のキシラナーゼが広範囲のｐ
Ｈで活性を表すことを示すものである。要するに、本発
明のキシラナーゼは、約５〜約１０のｐＨ範囲で活性で
ある。ｐＨ約６以上の場合特に活性である。ｐＨ約９以
下の場合特に活性である。

【００５１】実施例１２針葉樹パルプの漂白に対する助剤としてバシラス種７２
０／１株によって産生されたキシラナーゼの活性に関す
る温度の影響ｐＨ８の針葉樹の５懸濁液を用いて、実施例１１を繰り
返す。酵素処理段階はｐＨ８及び種々の温度（５５、６
０及び６５℃）で行われる。結果を表４に纏める。

【００５２】

【表４】表４酵素使用量(IU/g) 5 0 0 塩素使用量(%重量／乾燥パルプの重量） 2.89 2.89 3.40 ──────────────────────────────────── 温度℃ κ数 ──────────────────────────────────── 55 3.89 / / 60 3.64 4.77 4.09 65 3.49 / / ────────────────────────────────────

【００５３】記号 /は、パルプ懸濁液を試験しなかった
ことを意味する。パルプは、約４５°ＩＳＯまで漂白さ
れることが見出される。これらの結果は、酵素処理パル
プ試料のκ数が非酵素処理試料数よりもかなり低いまま
であることを示すものである。本実施例は、本発明のキ
シラナーゼが広範囲の温度に活性であることを示すもの
である。約６５℃の温度で活性である。本実施例は、ま
た、本発明のキシラナーゼが約６０℃の温度で安定であ
ることを示すものである。

【００５４】実施例１３ＥＣＦ配列のユーカリパルプの漂白に対する助剤として
バシラス種７２０／１株によって産生されたキシラナー
ゼの活性本実施例のために、CEASA Mill社（スペイン）から入手
したユーカリパルプを用いる。このパルプをＥＣＦ
（『元素塩素を含まない』）順序に従って処理する。即
ち、その順序を構成する連続段階が元素塩素を利用しな
い。

【００５５】第１段階：酸素段階（段階Ｏ）パルプを、開始κ数１2.３及び開始度ＩＳＯを有するパ
ルプが得られるように米国特許第 4,462,864号に記載さ
れている酸素を用いる方法によって処理する。乾燥物質
の重量として４％のコンシステンシーを有するこの酸素
処理パルプから２水性懸濁液を調製する。これらの懸濁
液のｐＨをＨＣｌでｐＨ９に調整する。

【００５６】第２段階：酵素段階（段階Ｘ）実施例２で得られた生産物Ｎと称する溶液を脱イオン水
で希釈して酵素活性２５ＩＵ／mlを有する酵素溶液を得
る。キシラナーゼを含むその酵素溶液を、パルプ懸濁液
が１０ＩＵ／ｇ乾燥パルプによって処理されるようにユ
ーカリパルプの１懸濁液に加える。ユーカリパルプの他
の２懸濁液には、酵素溶液の代わりに脱イオン水を加え
る。次に、その３懸濁液を攪拌せずに５０℃で１時間３
０分インキュベートする。

【００５７】第３段階：二酸化塩素段階（段階Ｄ）次に、得られた各パルプ懸濁液を二酸化塩素による塩素
化からなる漂白処理に供する。この処理は、乾燥物質の
重量として３％のコンシステンシーを有するパルプで行
われる。これを目的として、0.６％（重量／乾燥パルプ
の重量）の二酸化塩素量を酵素処理パルプ懸濁液及び１
つの非酵素処理パルプ懸濁液に加える。１％（重量／重
量）の二酸化塩素量をもう１つの非酵素処理パルプ懸濁
液に加える。その３懸濁液を５０℃で３０分間インキュ
ベートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン水で
洗浄する。

【００５８】第４段階：水酸化ナトリウム／過酸化水素
段階（段階Ｅ／Ｐ）次に、上記で得られ乾燥物質の重量として１２％のコン
システンシーを有する３懸濁液にＮａＯＨ1.８％（重量
／乾燥パルプの重量）及び過酸化水素0.５％（重量／乾
燥パルプの重量）を加えることからなるアルカリ抽出を
行う。その３懸濁液を７０℃の温度で１時間３０分イン
キュベートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン
水で洗浄する。

【００５９】第５段階：二酸化塩素段階（段階Ｄ）次に、得られた各パルプ懸濁液を二酸化塩素による塩素
化からなる漂白処理に再び供する。この処理は、１２％
のコンシステンシーを有するパルプで行われる。0.５％
（重量／乾燥パルプの重量）の二酸化塩素量をこれらの
３懸濁液に加える。その３懸濁液を７５℃で２時間イン
キュベートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン
水で洗浄する。

【００６０】第６段階：水酸化ナトリウム／過酸化水素
段階（段階Ｅ／Ｐ）次に、上記で得られ乾燥物質の重量として１２％のコン
システンシーを有する３懸濁液にＮａＯＨ0.６％（重量
／乾燥パルプの重量）及び過酸化水素0.３％（重量／乾
燥パルプの重量）を加えることからなるアルカリ抽出を
行う。その３懸濁液を７０℃の温度で１時間３０分イン
キュベートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン
水で洗浄する。

【００６１】第７段階：二酸化塩素段階（段階Ｄ）次に、得られた各パルプ懸濁液を二酸化塩素による塩素
化からなる漂白処理に再び供する。この処理は、１２％
のコンシステンシーを有するパルプで行われる。0.３％
（重量／重量）の二酸化塩素量をこれらの３懸濁液に加
える。その３懸濁液を７５℃で２時間３０分インキュベ
ートする。次いで、パルプを４０容量の脱イオン水で洗
浄し、シートとして回収する。得られた３シートの度Ｉ
ＳＯを測定する。結果を表５に纏める。

【００６２】

【表５】表５段階２で使用した酵素量 IU/g 10 0 0 段階３で使用した二酸化塩素量 0.6 0.6 1.0 （重量／乾燥パルプの重量） °ISO 88.5 85.5 87.9

【００６３】本実施例は、本発明のキシラナーゼがユー
カリパルプに効果的であることを示すものである。更
に、パルプのｐＨ、即ち、ｐＨ約９で活性であるという
利点を有するので、ｐＨ調整を必要としない。本実施例
は、本発明のキシラナーゼがアルカリ性キシラナーゼで
あることを示すものである。また、本実施例は、キシラ
ナーゼを存在させずに得られたものと比べて、本発明の
キシラナーゼの使用が所定量のＣｌＯ₂の場合少なくと
も３°ＩＳＯの白色度の増大をもたらすことを示すもの
である。また、本実施例は、本発明のキシラナーゼの使
用がＣｌＯ₂量をＣｌＯ₂全必要量の約２５〜３０％を
示す約４〜５kg／パルプのメートルトンだけ減少させる
ことを可能にすることを示すものである。

【００６４】実施例１４バシラス種７２０／１キシラナーゼのヌクレオチド及び
タンパク質配列の決定１．染色体ＤＮＡのバシラス種７２０／１株からの抽出実施例２で得られた培養物Ｂから２００mlのバシラス種
７２０／１株を、ＬＢ／Ｃ培地中３７℃で１６時間培養
する。ＬＢ／Ｃ培地は、ふすまを添加しない以外は実施
例１に記載されたＬＢ／Ｃ培地と同じである。この培養
物が調製され定常期にあるとき、5,０００ rpmで１０分
間遠心する（ベックマン J 21, JA10 ローター）。得ら
れた遠心分離沈降物を９mlのトリス−ＨＣｌ（0.１M Ｈ
Ｃｌで酸性にしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン）バッファーｐＨ8.０、0.１M ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）、１８mgのリゾチームを含有する0.１
５M ＮａＣｌに溶解し、得られた懸濁液を３７℃で１５
分間インキュベートする。次いで、得られた溶菌液を２
００μl の１０ mg/mlＲＮＡｓｅ溶液で５０℃で２０分
間処理する。次いで、この溶菌液に１mlの１０％(v/v)
ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）溶液を加える。次い
で、この溶菌液を７０℃で３０分間インキュベートす
る。

【００６５】その後、溶菌液を約４５℃まで冷却し、こ
れに0.５mlの２０ mg/mlプロテイナーゼＫ(Boehringer
Mannheim製）溶液（用時調製）を加える。その溶菌液を
４５℃で攪拌しつつ透明な溶液が得られるまでインキュ
ベートする。この透明な溶液について、Molecular Clon
ing - a laboratory manual - Sambrook, Fritsch, Man
iatis - sec.edit.,1989, p.E.3 に記載されている条件
及び手順に従ってこれに記載されているようにすっきり
した界面が得られるまでフェノールで数回抽出する。２
０mlのエタノールでＤＮＡを沈降する。その沈降物を5,
０００ rpm（ベックマン J 21, JA10 ローター）で５分
間遠心して回収し、次に２mlのＴＥバッファー、ｐＨ8.
０（１０mMトリス−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、ｐＨ8.０）
に懸濁する。この懸濁液は染色体ＤＮＡを含有する。

【００６６】２．ベクターｐＵＢＲ２００２の構築 Biolabs社製(Clontech LaboratoriesカタログNo.6210-
1)のプラスミドｐＢＲ３２２とベクターｐＵＢ１３１か
ら、ベクターｐＵＢＲ２００２（大腸菌(E.coli)−バシ
ラス・サチリス）を得た。Beaucageら (1981), Tetrahe
dron Letters, 22, p.1859-1882 に記載されている手法
及びバイオサーチサイクロンシンセサイザーでβ−シア
ノエチルホスホルアミダイトを用いて、２つの合成オリ
ゴヌクレオチドを構築する。これらの２つのオリゴヌク
レオチドの配列は次の通りである。配列番号１４ 5′-CCCCCCTACGTAGCGGCCGCCCCGGCCGGTAACCTAGGAAGTCAGCGCCCTGCACC- 3′ 配列番号１５ 5′-CCCCCCTACGTAGGCCGGGGCGGCCGCGGTTACCTAGGGCCTCGTGATACGCCTAT- 3′ これらの２つのオリゴヌクレオチドを用いてMolecular
Cloning - a laboratory manual - Sambrookら, sec.ed
it., 1989, p.14.18-14.19に記載されている手法に従っ
てプラスミドｐＢＲ３２２上でＰＣＲ増幅する。

【００６７】ＰＣＲ増幅した断片は、両側にＡｖｒＩ
Ｉ、ＢｓｔＥＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＳｎａｂＩ制
限部位によって制限されたE.coliレプリコンを含有す
る。約2.８ｋｂｐ（ｋｂｐ＝1,０００塩基対）Ｓｎａｂ
Ｉ−ＳｎａｂＩ断片を、予めＳｎａｂＩで消化したベク
ターと連結する。ベクターｐＲＢ１３１の構築は、米国
特許第 5,352,603号（欧州特許出願第 0,415,296号）の
実施例１０及び図７に記載されており、これを参考とし
て引用する。連結法は、Sambrookら(p.1.68-1.69) に記
載されている。本明細書の実施例で行われる連結はすべ
てこの手法に従って行われた。得られた連結物を、エレ
クトロポレーション (Sambrookら, p.1.75-1.81)によっ
てE.coliＭＣ１０６１細胞[Clontech Laboratories, カ
タログNo.C-1070-1]に形質転換する。その形質転換細胞
を、ＬＢ寒天培地、１００μg/mlのアンピシリン及び１
０μg/mlのカナマイシンを含有するペトリ皿上で３７℃
で約１８時間培養する。プラスミドを、アルカリ溶解法
(Sambrookら, p.1.25-1.28)によって分離したコロニー
から抽出し、Molecular Cloning - a laboratory manua
l - Maniatisら, 1982, Cold Spring Harbor Laborator
y, p.374-379に記載されているように制限分析する。菌
株が得られ、ｐＵＢＲ２００２と称するベクターが抽出
される。

【００６８】３．バシラス種７２０／１遺伝子ライブラ
リーの構築それを含む懸濁液から、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩで部分的に切断する。制限酵素条件は、次の精製
工程用に十分量のＤＮＡ得るために１０倍だけ増大され
る以外はSambrookら(p.5.28-5.32) に記載されているも
のである。ＤＡＮ使用量の酵素量に対する割合は、サイ
ズが４〜７ｋｂｐ（ｋｂｐ：１０ ³塩基対）の最大断片
を得るために調整される。次いで、得られた１組の断片
をSambrookら, p.6.01-6.19 に記載されているアガロー
ス（0.８％w/w)ゲル電気泳動にかけ、サイズが４〜７ｋ
ｂｐの断片を分離し Zhuら, Bio/Technology 3, 1985,
p.1014-1016 に記載されている遠心分離によるろ過方法
によって精製する。次いで、このようにして精製したＤ
ＮＡ断片をＢａｍＨＩ部位で予め切断したプラスミドｐ
ＵＢＲ２００２（E.coli−バシラス・サチリス）と連結
（Sambrookら,(p.1.68-1.69)に記載されている方法によ
る）し、Sambrookら,(p.1.60-1.61)に記載されているよ
うに脱リン酸する。得られた連結物を用いてE.coliＭＣ
１０６１細胞をエレクトロポレーション（Sambrookら,
p.1.75-1.81)によって形質転換する。

【００６９】４．遺伝子ライブラリーのスクリーニング形質転換E.coli細胞を、0.８ｇ／リットルの AXCL-キシ
ラン及び１００μg/mlのアンピシリンを含むペトリ皿上
３７℃で約２４時間培養する。加水分解ゾーンを示すコ
ロニーを分離する。このコロニー中に存在するプラスミ
ドを、Sambrookら, p.1.25-1.28 に記載されているアル
カリ溶解法によって抽出及び分離する。制限分析 (Samb
rookら, p.1.85) する。この分析により、キシラナーゼ
遺伝子を含む得られたＤＮＡ断片のサイズが約3.５ｋｂ
ｐ（ｋｂｐ＝1.０００塩基対）であることが示される。
連結したベクターｐＵＢＲ２００２がそれを運搬する。
それにより、プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１（図６）
が得られる。

【００７０】５．キシラナーゼ遺伝子を含む染色体断片
のクローニングプラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１を、ＳｗａＩ及びＳｐ
ｅＩ部位において制限酵素で消化する。それにより、約
1.５ｋｂｐＳｗａＩ−ＳｐｅＩＤＮＡ断片上にキシラナ
ーゼ遺伝子が得られる。このＳｗａＩ−ＳｐｅＩＤＮＡ
断片を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで
処理する（Sambrookら, p.F.2-F.3)。得られたＤＮＡ調
製物を、ＥｃｏＲＶで予め消化したベクターｐＵＢＲ２
００２と連結し、脱リン酸する。次いで、この連結物を
エレクトロポレーションによってE.coliＭＣ１０６１細
胞に形質転換する。その形質転換株を、ＬＢ(Luria-Ber
tani) 寒天培地、0.８ｇ／リットルの AZCL-キシラン(M
egazyme)及び１００μg/mlのアンピシリンを含有するペ
トリ皿上に選択した後、３７℃で約２４時間増殖する。
加水分解ゾーンを示すコロニーを分離する。プラスミド
を、アルカリ溶解法（Sambrookら, p.1.25-1.28)によっ
て分離したコロニーから抽出し、制限分析 (Maniatis
ら, 1982, p.374-379)する。この制限分析により、分離
したプラスミド、ｐＵＢＲ−７２０Ｘ１１（図７）が約
1.５ｋｂｐ断片のバシラス種７２０／１染色体ＤＮＡ上
にキシラナーゼ遺伝子を含むことが示される。

【００７１】次いで、プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１
１を用いてＣａＣｌ₂法（Sambrookら, p.1.82-1.84)に
よりE.coliＪＭ１０９細胞 (Clontech Laboratories カ
タログNo.C1005-1) を形質転換する。この形質転換E.co
li細胞を、ＬＢ寒天培地、0.８ｇ／リットル AZCL-キシ
ラン及び１００μg/mlのアンピシリンを含有するペトリ
皿上で培養する。３７℃で約２４時間増殖した後、コロ
ニーの回りに加水分解ゾーンが見られる。これは、その
形質転換E.coli細胞がキシラナーゼを実際に表している
ことを示すものである。ＤＮＡ断片を脱リン酸したりベ
クターを線状にすることを可能にする方法は、Sambrook
ら,(p.1.60-1.61)に記載されている。加水分解ゾーンを
示すコロニーを分離する。このコロニー中に存在するプ
ラスミドをアルカリ溶解法により抽出及び分離する。Sa
mbrookら, p.13.15 & 13.17(図１3.３Ｂ）及び鋳型とし
てプラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１１を用いて、キシラ
ナーゼの配列を決定する。

【００７２】配列決定を開始するために、プラスミドｐ
ＵＢＲ２００２とハイブリッド形成する合成オリゴヌク
レオチドを調製する。これらの合成オリゴヌクレオチド
は、次の通りである。配列番号１６ 5′-ACGAGGAAAGATGCTGTTCTTGTAAATGAGT-3′ 及び配列番号１７ 5′-TACCTTGTCTACAAACCCC-3′ 残りの配列は、新たに決定された配列部分に基づいて選
ばれた他のオリゴヌクレオチドの使用により求める。そ
れにより、キシラナーゼをコードする完全な遺伝子のヌ
クレオチド配列（配列番号１０）が得られる。キシラナ
ーゼ遺伝子は、約1.５ｋｂｐ断片として得られる。

【００７３】実施例１５発現ベクターｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１の構築発現ベクターｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１（図８）は、E.
coliレプリコンを除去したプラスミドｐＵＢＲ−７２０
Ｘ１１由来のプラスミドである。プラスミドｐＵＢＲＤ
−７２０Ｘ１１の実施例１４で得られたプラスミドｐＵ
ＢＲ−７２０Ｘ１１からの構築を次に記載する。E.coli
の複製起原を除去するために、実施例１４に記載された
方法に従い、プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１１をＳｎ
ａＢＩ部位において制限酵素で消化する。それにより約
５ｋｂｐ断片が得られ、実施例１４に記載される方法に
従ってそれ自体と連結してプラスミドｐＵＢＲＤ−７２
０Ｘ１１を得る。得られた連結物を用いてバシラス・サ
チリスＳＥ３コンピテント細胞を DNA Cloning, vol.I
I, ed. Glover, D.M., IRL Press Oxford, 1985, p.9-1
1に記載されている方法に従って形質転換する。

【００７４】バシラス・サチリスＳＥ３を、1993年６月
21日にＬＭＧ番号Ｐ−１４０３５としてプダペスト条約
に基づく Belgian Coordinated Collections of Microo
rganisms (ＬＭＧカルチュアコレクション, ゲント、ベ
ルギー）と呼ばれるコレクションに寄託した。この形質
転換細胞を、ＬＢ(Luria-Bertani) 寒天培地、0.８ｇ／
リットルの AZCL-キシラン及び２５μg/mlのカナマイシ
ンを含有するペトリ皿上３７℃で約１８時間培養する。
増殖後、加水分解ゾーンを示すコロニーを分離する。こ
の分離したコロニーを、実施例１４に記載された方法に
従ってプラスミドの構築が正しいことを実証するために
酵素制限によりプラスミド分析する。菌株が得られ、ｐ
ＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１と称するベクターが分離され
る。

【００７５】実施例１６バシラス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株の発現
ベクターｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１による形質転換実施例１５に記載されたプラスミドｐＵＢＲＤ−７２０
Ｘ１１をその宿主から抽出し、分離及び精製する (Samb
rookら, 1989, p.1.25-1.28)。バシラス・リケニホルミ
スＳＥ２ｄｅｌａｐ６株の培養物を調製する。バシラス
・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株及びその培養は
欧州特許出願第 0,634,490号の実施例２７及び２８に記
載されており、これを参考として引用する。バシラス・
リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株をバシラス・リケ
ニホルミスＳＥ２株から調製し、1993年６月21日にＬＭ
Ｇ番号Ｐ−１４０３４としてプダペスト条約に基づく B
elgian Coordinated Collections of Microorganisms
(ＬＭＧカルチュアコレクション, ゲント、ベルギー）
と呼ばれるコレクションに寄託した。次いで、バシラス
・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株を、プロトプラ
スト法 (Maniatisら, p.150-151)に従ってプラスミドｐ
ＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１で形質転換する。形質転換株
[バシラス・リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６（ｐＵ
ＢＲＤ−７２０Ｘ１１)]を、ＬＢ寒天培地、0.８ｇ／リ
ットルの AZCL-キシラン及び２５μg/mlのカナマイシン
を含有するペトリ皿上に選択する。次いで、これをスク
リーニング、即ち、塗布し線状に接種してMolecular Cl
oning - Laboratory Manual(Sambrookら) に記載されて
いるＬＢ(Luria-Bertani) 寒天培地の表面に単一コロニ
ーを得ることにより分離及び精製する。

【００７６】実施例１７キシラナーゼのB.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６
（ｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１) による生産実施例１６で得られたプラスミドｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ
１１で形質転換されたB.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａ
ｐ６を、0.５％(w/v) のグルコース及び２０μg/mlのカ
ナマイシンで補足されたＬＢ培養基中３７℃で１７時間
培養する。この培養物を、２０μg/mlのカナマイシンで
補足された５０mlのＭ２培地に移す（５％ v/v) 。Ｍ２
培地は、３０ｇの大豆粉、７５ｇの可溶性デンプン、２
ｇの硫酸ナトリウム、５mgの塩化マグネシウム、３ｇの
ＮａＨ₂ＰＯ₄、0.２ｇのＣａＣｌ₂・Ｈ ₂Ｏ及び1,０
００mlの水を含有する。このＭ２培地のｐＨを１０N Ｎ
ａＯＨで5.８に調整した後、滅菌する。この培養物を、
約2.５４cmの振幅により２５０ rpm速度で軌道振盪しつ
つ３７℃で８０時間インキュベートする。８０時間後、
5,０００ rpmで１０分間遠心（ベックマン J21, JA10ロ
ーター）してバイオマスを除去する。遠心分離上清を保
持する。この上清について、酵素活性を実施例２に記載
される方法に従って測定し、キシラナーゼ活性の存在を
記録する。

【００７７】実施例１８ベクターｐＵＢＣ２００１の構築ベクターｐＵＢＣ２００１（E.coli−バシラス)(図９）
は、唯一の違いとして２つの制限部位：ＢｓｔＥＩＩ及
びＰａｃＩの存在を含むプラスミドｐＵＢＣ１３１由来
のプラスミドである。ベクターｐＵＢＣ１３１の構築
は、米国特許第 5,352,603号（欧州特許第 0,415,296
号）の実施例１１及び図８に記載されており、これを参
考として引用する。このプラスミドの構築を次に記載す
る。実施例１４に記載された方法に従って、４種の合成
オリゴヌクレオチドを構築する。これら４種のオリゴヌ
クレオチドの配列は次の通りである。

【００７８】配列番号１８ 5′-CGGTCGCCGCATACACTA- 3′ 配列番号１９ 5′-CCCCCCCCCGGTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAA- 3′ 配列番号２０ 5′-CCCCCCCCCGGTTACCGTATTTATTAACTTCTCCTAGTA- 3 ′ 配列番号２１ 5′-CCCCCCTCTAGATTAATTAACCAAGCTTGGGATCCGTCGACCTGCAGATC- 3′ 配列番号１８及び１９を有する２つのオリゴヌクレオチ
ドを用いて、実施例１４に記載されたＰＣＲ法に従って
ベクターｐＵＢＣ１３１上でＰＣＲ増幅する。アンピシ
リン耐性遺伝子の一部及びE.coli中の複製に要する機能
を含むＰＣＲ増幅した断片をＳｃａＩ及びＢｓｔＥＩＩ
で制限し、約1.５〜1.６ｋｂｐ断片を作成する。

【００７９】配列番号２０及び２１を有するオリゴヌク
レオチドを用い実施例１４に記載された方法に従ってベ
クターｐＵＢＣ１３１上で第２ＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ
増幅した断片は、ベクターｐＵＢＣ１３１の一部を含
む。この断片をＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩで制限し、
約1.４〜1.５ｋｂｐ断片を作成する。得られた２つの断
片を、実施例１４に記載された手法に従ってＥｃｏＲＩ
及びＳｃａＩで予め二重に消化したベクターｐＵＢＣ１
３１と共に実施例１４に記載された手法に従って連結す
る。得られた連結物を用い、実施例１４に記載された手
法に従ってエレクトロポレーションによりE.coliＭＣ１
０６１細胞を形質転換する。この形質転換された細胞
を、ＬＢ寒天培地、１００μg/mlのアンピシリン及び１
０μg/mlのカナマイシンを含有するペトリ皿上３７℃で
約１８時間培養する。増殖後、分離したコロニーを実施
例１４に記載される手法に従って酵素制限によりプラス
ミド分析する。菌株が得られ、ｐＵＢＣ２００１と称す
るベクターが抽出される。

【００８０】実施例１９発現ベクターｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３の構築発現ベクターｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３（E.coli
−バシラス)(図１０）は、プラスミドｐＵＢＣ２００１
由来の発現ベクターである。これは、バシラスピュミル
スＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子由来
のプロモーター及びバシラスピュミルスＰＲＬＢ１２
キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプレ配列
を含む。バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナー
ゼをコードする遺伝子由来のプロモーター及びバシラス
ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナルペプ
チドをコードするプレ配列の調製及び達成方法は、欧州
特許出願第 0,634,490号の実施例１７及び図１に記載さ
れており、これを本明細書に参考として引用する。バシ
ラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードす
る遺伝子由来のプロモーター配列は、配列番号２６とし
て本明細書に記載される。バシラスピュミルスＰＲＬ
Ｂ１２キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプ
レ配列の配列は、配列番号２７として本明細書に記載さ
れる。プラスミドｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３の構
築を次に記載する。２種類の合成オリゴヌクレオチド
を、実施例１４に記載される手法に従って構築する。

【００８１】これらの２つのオリゴヌクレオチドの配列
は次の通りである。配列番号２２ 5′-CCCCCCTGAAATCAGCTGGACTAAAAGG G ATGCAATTTC-3′ 配列番号２３ 5′-CCCCCCGTCGACCGCATGCGCCGGCACAGC- 3′ これらの２つのオリゴヌクレオチドを用い、実施例１４
に記載された手法に従ってプラスミドｐＵＢ−ＢＰＸ１
２上でＰＣＲ増幅する。プラスミドｐＵＢ−ＢＰＸ１２
の構築は、欧州特許出願第 0,634,490号の実施例１７及
び図４に記載されており、これを参考として引用する。
配列番号２２を有するオリゴヌクレオチドを使用する
と、１つのヌクレオチドを変えることによりｐＵＢＣ２
００１に通常存在する約5.５ｋｂｐに位置したB.ピュミ
ルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼプロモーターの上流の
ＳｐｈＩ制限部位を除去することを可能にする。そのヌ
クレオチドの変化は、上記配列番号２２で下線を引いた
ヌクレオチドで示され、ＳｐｈＩ制限部位のＣをＧに置
き換えることに関する（ＳｐｈＩ＝ GCATGC)。配列番号
２３は、Ａｌａコドン [２５] の１つのヌクレオチドを
変えることにより、即ち、ＧＣＧをＧＣＴに変えること
により、B.ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシ
グナルペプチドをコードするプレ配列の終わりに新しい
ＳｐｈＩ部位を作成することを可能にする。

【００８２】B.ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
をコードする遺伝子由来のプロモーター及びB.ピュミル
スＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナルペプチドをコ
ードするプレ配列を含むＰＣＲ増幅した断片を、実施例
１４に記載された手法に従ってＰｖｕＩＩ及びＳｐｈＩ
で制限して約0.７ｋｂｐ断片を作成する。約0.７ｋｂｐ
ＰｖｕＩＩ−ＳｐｈＩ断片を、実施例１４に記載された
手法に従ってＰｖｕＩＩ及びＳｐｈＩで予め二重消化し
たベクターｐＵＢＣ２００１と連結する。得られた連結
を用いて、実施例１４に記載された手法に従ってエレク
トロポレーションによりE.coliＭＣ１０６１細胞を形質
転換する。この形質転換された細胞をＬＢ寒天培地、１
００μg/mlのアンピシリンを含むペトリ皿上３７℃で約
１８時間培養する。増殖後、分離したコロニーを、実施
例１４に記載された手法に従って酵素制限によりプラス
ミド分析する。菌株が得られ、ｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−
２００３と称するベクターが抽出される。

【００８３】実施例２０発現ベクターｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７２０Ｘの構築発現ベクターｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７２０Ｘ（E.coli
−バシラス)(図１１）は、バシラスピュミルスＰＲＬ
Ｂ１２キシラナーゼをコードする遺伝子由来のプロモー
ター及びバシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナー
ゼのシグナルペプチドをコードするプレ配列及びバシラ
ス種７２０／１キシラナーゼの成熟部分をコードする遺
伝子の配列を含む発現ベクターである。発現ベクターｐ
Ｃ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７２０Ｘは、配列番号１の配列、
バシラス種７２０／１キシラナーゼの成熟部分をコード
する遺伝子のヌクレオチド配列を含む。プラスミドｐＣ
−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７２０Ｘの構築を次に記載する。２
種類の合成オリゴヌクレオチドを、実施例１４に記載さ
れる手法に従って構築する。

【００８４】これらの２つのオリゴヌクレオチドの配列
は次の通りである。配列番号２４ 5′-CCCCCCGCATGCGCAAATCGTCACCGACAATTCCATTGG-3′ 配列番号２５ 5′-TACCTTGTCTACAAACCCC-3′ これらの２つのオリゴヌクレオチドを用い、実施例１４
に記載された手法に従ってプラスミドｐＵＢ−ＢＰＸ１
１によるＰＣＲ増幅を行う。バシラス種７２０／１キシ
ラナーゼの成熟部分をコードする遺伝子配列を含むＰＣ
Ｒ増幅した断片を、実施例１４に記載された手法に従っ
てＳｐｈＩ及びＳａｃＩで制限して約0.８ｋｂｐ断片を
作成する。このＳｐｈＩ−ＳａｃＩ断片を、実施例１４
に記載された手法に従ってＳｐｈＩ及びＳａｃＩで予め
二重消化したベクターｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３
と連結する。ＳｐｈＩ制限部位での連結は、B.ピュミル
スＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子のシ
グナル配列とバシラス種７２０／１キシラナーゼの成熟
部分をコードする遺伝子配列との翻訳融合を作成するこ
とを可能にする。

【００８５】得られた連結物を用いて、実施例１４に記
載された手法に従ってエレクトロポレーションによりE.
coliＭＣ１０６１細胞を形質転換する。この形質転換さ
れた細胞をＬＢ寒天培地、0.８ｇ／リットルのAZCL−キ
シラン及び１００μg/mlのアンピシリンを含むペトリ皿
上３７℃で約１８時間培養する。加水分解ゾーンを示す
コロニーを分離する。増殖後、分離したコロニーを、実
施例１４に記載された手法に従って酵素制限によりプラ
スミド分析する。菌株が得られ、ｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ
−７２０Ｘと称するベクターが抽出される。

【００８６】実施例２１ベクターｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘの構築ベクターｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘ（バシラス)(図
１２）は、プラスミドｐＵＢ１３１由来の発現ベクター
である。これは、B.ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナ
ーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター及びB.ピュ
ミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナルペプチドを
コードするプレ配列及びバシラス種７２０／１キシラナ
ーゼの成熟部分をコードする遺伝子配列を含む。プラス
ミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘの構築を次に記載す
る。実施例２０で得られたプラスミドｐＣ−ＢＰＸ−Ｐ
ＲＥ−７２０Ｘを、実施例１４に記載された手法に従っ
てＰｖｕＩＩ及びＥｃｏＲＩで制限して約1.５ｋｂｐ断
片を作成する。

【００８７】この約1.５ｋｂｐ断片を、実施例１４に記
載された手法に従ってＰｖｕＩＩ及びＥｃｏＲＩで予め
二重消化したベクターｐＵＢ１３１と連結する。得られ
た連結を用いて、実施例１４に記載されたエレクトロポ
レーション手法に従ってB.サチリスＳＥ３を形質転換す
る。この形質転換された細胞をＬＢ寒天培地、0.８ｇ／
リットルのAZCL−キシラン及び２５μg/mlのカナマイシ
ンを含むペトリ皿上３７℃で約１８時間培養する。幅の
広い加水分解ゾーンを示すコロニーを分離する。増殖
後、分離したコロニーを、実施例１４に記載された手法
に従って酵素制限によりプラスミド分析する。それによ
り菌株が得られ、ｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘと称す
るベクターが抽出される。

【００８８】実施例２２バシラスリケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６の発現ベク
ターｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘによる形質転換実施例２１に記載されたプラスミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ
−７２０Ｘ（図１２）を、その宿主から抽出、分離及び
精製する。B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株の培
養物を、実施例１６に記載された手法に従って調製す
る。次いで、この菌株を、実施例１６に記載されたプロ
トプラスト法に従ってそのプラスミドで形質転換する。
ＬＢ寒天培地、0.８ｇ／リットルのAZCL−キシラン及び
２５μg/mlのカナマイシンを含むペトリ皿から形質転換
株 [B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６（ｐＢＰＸＤ
−ＰＲＥ−７２０Ｘ)]を選択する。実施例１６に記載さ
れた手法に従ってスクリーンによりその菌株を分離及び
精製する。

【００８９】実施例２３キシラナーゼのB.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６
（ｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘ）による生産実施例２２で得られたプラスミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−
７２０Ｘによって形質転換されたB.リケニホルミスＳＥ
２ｄｅｌａｐ６株を用いて、実施例１７に記載されたも
のと同じ分析を行う。得られた上清について実施例２に
記載された手法に従って酵素活性を測定し、キシラナー
ゼ活性の存在を記録する。

【００９０】実施例２４ B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株（ｐＢＰＸＤ−
ＰＲＥ−７２０Ｘ）によって産生されたキシラナーゼの
調製及び分離実施例２２で得られたプラスミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−
７２０Ｘで形質転換されたB.リケニホルミスＳＥ２ｄｅ
ｌａｐ６株によって産生されたキシラナーゼを分離及び
精製する。この菌株を、実施例２３に記載されたプロト
コールに従って培養する。得られたキシラナーゼは、欧
州特許出願第 0,634,490号の実施例３に記載されたプロ
トコールに従って分離及び精製され、これを本明細書に
参考として引用する。

【００９１】実施例２５ B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株（ｐＢＰＸＤ−
ＰＲＥ−７２０Ｘ）によって産生されたキシラナーゼの
アミノ酸配列 B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株（ｐＢＰＸＤ−
ＰＲＥ−７２０Ｘ）によって産生されたキシラナーゼの
最初の５０個のアミノ酸配列を、配列決定装置(HP G100
0A, Hewlett-Packard)を用いその装置の説明書に従って
決定する。実施例２４に記載されたように分離及び精製
されたキシラナーゼを用いる。得られた配列は、バシラ
ス種７２０／１株によって産生されたキシラナーゼとし
て実施例４に記載されたものと同じである。

【００９２】実施例２６ B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株（ｐＢＰＸＤ−
ＰＲＥ−７２０Ｘ）によって産生されたキシラナーゼの
分子量の決定 B.リケニホルミスＳＥ２ｄｅｌａｐ６株（ｐＢＰＸＤ−
ＰＲＥ−７２０Ｘ）によって産生されたキシラナーゼの
分子量を、実施例７に記載されたプロトコールに従い実
施例２４に記載されたように分離及び精製されたキシラ
ナーゼを用いて決定する。クーマシーブルーで染色する
と分子量２５〜２６ｋＤのポリペプチドが示され、これ
はバシラス種７２０／１株によって産生されたキシラナ
ーゼと同じのものである。

【００９３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６６３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス (Bacillus) 配列 CAAATCGTCA CCGACAATTC CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA 60 GATAGCGGTG GCTCTGGGAC AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG 120 AACAATGTTA ACAACATATT ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC 180 CAACAAGTTG GTAACATGTC CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG 240 TATTTATGCG TCTATGGTTG GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT 300 TGGGGCAACT GGCGTCCACC AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA 360 ACATATGATA TCTACGAGAC TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA 420 TTTAAACAAT ATTGGAGTGT TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC 480 AACCACTTTA GAGCGTGGGA AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG 540 CTTACTGTAG AAGGCTATCA AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA 600 ATTAACGGTA ACCCTCTCTC AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT GGATAAAAAC 660 AAT 663

【００９４】配列番号：２配列の長さ：６６３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス（Bacillus）配列の特徴特徴を表す記号：mat ＿peptide 存在位置：1..663 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..663 配列 CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 48 Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 96 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His 20 25 30 GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC 144 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe 35 40 45 CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 192 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 240 Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 288 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 336 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 384 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu 115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 432 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr 130 135 140 TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 480 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 528 Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 576 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 AAT GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 624 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 663 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220

【００９５】配列番号：３配列の長さ：２２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His 20 25 30 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe 35 40 45 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly 50 55 60 Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu 115 120 125 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr 130 135 140 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220

【００９６】配列番号：４配列の長さ：７４４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス（Bacillus）配列 ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC ACAAATCGTC ACCGACAATT CCATTGGCAA CCACGATGGC 120 TATGATTATG AATTTTGGAA AGATAGCGGT GGCTCTGGGA CAATGATTCT CAATCATGGC 180 GGTACGTTCA GTGCCCAATG GAACAATGTT AACAACATAT TATTCCGTAA AGGTAAAAAA 240 TTCAATGAAA CACAAACACA CCAACAAGTT GGTAACATGT CCATAAACTA CGGAGCCAAC 300 TTCCAACCAA ATGGTAATGC GTATTTATGC GTCTATGGTT GGACTGTTGA CCCTCTTGTC 360 GAATATTATA TTGTCGACAG TTGGGGCAAC TGGCGTCCAC CAGGAGCAAC GCCTAAGGGG 420 ACCATCACTG TTGATGGAGG AACATATGAT ATCTACGAGA CTCTTAGAGT CAATCAACCC 480 TCCATTAAGG GGATTGCCAC ATTTAAACAA TATTGGAGTG TTCGAAGATC GAAACGCACG 540 AGTGGCACGA TTTCTGTCAG CAACCACTTT AGAGCGTGGG AAAACTTAGG GATGAATATG 600 GGGAAAATGT ATGAAGTCGC GCTTACTGTA GAAGGCTATC AAAGTAGCGG AAGTGCTAAT 660 GTATATAGCA ATACACTAAG AATTAACGGT AACCCTCTCT CAACTATTAG TAATGACGAG 720 AGCATAACTT TGGATAAAAA CAAT 744

【００９７】配列番号：５配列の長さ：７４４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス（Bacillus）配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..744 特徴を表す記号：mat ＿peptide 存在位置：82..744 特徴を表す記号： sig ＿peptide 存在位置：1..81 配列 ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 48 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe -27 -25 -20 -15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA CAA ATC GTC ACC GAC 96 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala Gln Ile Val Thr Asp -10 -5 1 5 AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT GAA TTT TGG AAA GAT 144 Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp 10 15 20 AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT GGC GGT ACG TTC AGT 192 Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser 25 30 35 GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC CGT AAA GGT AAA AAA 240 Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys 40 45 50 TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT AAC ATG TCC ATA AAC 288 Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly Asn Met Ser Ile Asn 55 60 65 TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG TAT TTA TGC GTC TAT 336 Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr 70 75 80 85 GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT ATT GTC GAC AGT TGG 384 Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp 90 95 100 GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG GGG ACC ATC ACT GTT 432 Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr Ile Thr Val 105 110 115 GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT AGA GTC AAT CAA CCC 480 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gln Pro 120 125 130 TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT TGG AGT GTT CGA AGA 528 Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg 135 140 145 TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC AAC CAC TTT AGA GCG 576 Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala 150 155 160 165 TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG TAT GAA GTC GCG CTT 624 Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Leu 170 175 180 ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT AAT GTA TAT AGC AAT 672 Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn 185 190 195 ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT ATT AGT AAT GAC GAG 720 Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr Ile Ser Asn Asp Glu 200 205 210 AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 744 Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn 215 220

【００９８】配列番号：６配列の長さ：２４８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の型：タンパク質配列 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe -27 -25 -20 -15 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala Gln Ile Val Thr Asp -10 -5 1 5 Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp 10 15 20 Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser 25 30 35 Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys 40 45 50 Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly Asn Met Ser Ile Asn 55 60 65 Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr 70 75 80 85 Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp 90 95 100 Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr Ile Thr Val 105 110 115 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gln Pro 120 125 130 Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg 135 140 145 Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala 150 155 160 165 Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Leu 170 175 180 Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn 185 190 195 Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr Ile Ser Asn Asp Glu 200 205 210 Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn 215 220

【００９９】配列番号：７配列の長さ：８１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC A 81

【０１００】配列番号：８配列の長さ：８１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..81 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..81 配列 ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 48 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe 1 5 10 15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 81 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala 20 25

【０１０１】配列番号：９配列の長さ：２７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe 1 5 10 15 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala 20 25

【０１０２】配列番号：１０配列の長さ：１５１３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス（Bacillus）配列 AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTAA TGAGACAAAA GAAATTGACG TTGATTTTAG CCTTTTTAGT 660 TTGTTTTGCA CTAACCTTAC CTGCAGAAAT AATTCAGGCA CAAATCGTCA CCGACAATTC 720 CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA GATAGCGGTG GCTCTGGGAC 780 AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG AACAATGTTA ACAACATATT 840 ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC CAACAAGTTG GTAACATGTC 900 CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG TATTTATGCG TCTATGGTTG 960 GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT TGGGGCAACT GGCGTCCACC 1020 AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA ACATATGATA TCTACGAGAC 1080 TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA TTTAAACAAT ATTGGAGTGT 1140 TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC AACCACTTTA GAGCGTGGGA 1200 AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG CTTACTGTAG AAGGCTATCA 1260 AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA ATTAACGGTA ACCCTCTCTC 1320 AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT GGATAAAAAC AATTAAAAAT CCTTATCTCT 1380 TTCGGTTCAG TTCTCATTAT TTTCAAATAA CCTCCCGGTT GGATCTTTTC CAACGGGAGG 1440 TTTTATTGGA AAGGTTAAGT ATAGTATACT CCGATTCCAT CCAGAGGAAT GCTTGAAACA 1500 CCTCCGTCAC TAG 1513

【０１０３】配列番号：１１配列の長さ：１５１３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源株名：バシラス（Bacillus）配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：620..1363 特徴を表す記号：mat ＿peptide 存在位置：701..1363 特徴を表す記号：sig ＿peptide 存在位置：620..700 配列 AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC 652 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala -27 -25 -20 TTT TTA GTT TGT TTT GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 700 Phe Leu Val Cys Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala -15 -10 -5 CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 748 Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 796 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His 20 25 30 GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC 844 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe 35 40 45 CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 892 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 940 Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 988 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 1036 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 1084 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu 115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 1132 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr 130 135 140 TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 1180 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 1228 Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 1276 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 AAT GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 1324 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT TAAAAATCCT 1373 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220 TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA TCTTTTCCAA 1433 CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA GAGGAATGCT 1493 TGAAACACCT CCGTCACTAG 1513

【０１０４】配列番号：１２配列の長さ：６１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA 619

【０１０５】配列番号：１３配列の長さ：１５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TAAAAATCCT TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA 60 TCTTTTCCAA CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA 120 GAGGAATGCT TGAAACACCT CCGTCACTAG 150

【０１０６】配列番号：１４配列の長さ：５６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCTACG TAGCGGCCGC CCCGGCCGGT AACCTAGGAA GTCAGCGCCC TGCACC 56

【０１０７】配列番号：１５配列の長さ：５６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCTACG TAGGCCGGGG CGGCCGCGGT TACCTAGGGC CTCGTGATAC GCCTAT 56

【０１０８】配列番号：１６配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 ACGAGGAAAG ATGCTGTTCT TGTAAATGAG T 31

【０１０９】配列番号：１７配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 TACCTTGTCT ACAAACCCC 19

【０１１０】配列番号：１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CGGTCGCCGC ATACACTA 18

【０１１１】配列番号：１９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCCCCG GTAACCTGCA TTAATGAATC GGCCAA 36

【０１１２】配列番号：２０配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCCCCG GTTACCGTAT TTATTAACTT CTCCTAGTA 39

【０１１３】配列番号：２１配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCTCTA GATTAATTAA CCAAGCTTGG GATCCGTCGA CCTGCAGATC 50

【０１１４】配列番号：２２配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCTGAA ATCAGCTGGA CTAAAAGGGA TGCAATTTC 39

【０１１５】配列番号：２３配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCGTCG ACCGCATGCG CCGGCACAGC 30

【０１１６】配列番号：２４配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCCCCCGCAT GCGCAAATCG TCACCGACAA TTCCATTGG 39

【０１１７】配列番号：２５配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 TACCTTGTCT ACAAACCCC 19

【０１１８】配列番号：２６配列の長さ：１８５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TCATGTAACT CGCCTTGATC TATTTCATTT GTATCAAAGG ATTTATACAC AAACAAGAGA 60 CATCCATGCC GGGTTAAAGC AGTATCGTTC CATCTAACAG AGAAGGNCTG CATGAAAGGA 120 GGTGATGGGT TTTTCATCTT AGGGATGACA GAACAATACG GATGAAAAAA GGAGAGGGAT 180 GGAAA 185

【０１１９】配列番号：２７配列の長さ：８１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGAATTTGA AAAGATTGAG GCTGTTGTTT GTGATGTGTA TTGGATTTGT GCTGACACTG 60 ACGGCTGTGC CGGCTCATGC G 81

【０１２０】配列番号：２８配列の長さ：８１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..81 配列 ATG AAT TTG AAA AGA TTG AGG CTG TTG TTT GTG ATG TGT ATT GGA TTT 48 Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Phe 1 5 10 15 GTG CTG ACA CTG ACG GCT GTG CCG GCT CAT GCG 81 Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala 20 25

【０１２１】配列番号：２９配列の長さ：２７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Phe 1 5 10 15 Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】成熟キシラナーゼをコードするヌクレオチド配
列（配列番号２）をそのアミノ酸への翻訳と共に示す。

【図２】成熟キシラナーゼをコードするヌクレオチド配
列（配列番号２）をそのアミノ酸への翻訳と共に示し、
図１のつづきである。

【図３】キシラナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列（配列番号１１）をそのアミノ酸への翻訳と共に
示す。

【図４】キシラナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列（配列番号１１）をそのアミノ酸への翻訳と共に
示し、図３のつづきである。

【図５】プラスミドｐＵＢＲ２００２の制限地図を示
す。

【図６】プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１の制限地図を
示す。

【図７】プラスミドｐＵＢＲ−７２０Ｘ１１の制限地図
を示す。

【図８】プラスミドｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１１の制限地
図を示す。

【図９】プラスミドｐＵＢＣ２００１の制限地図を示
す。

【図１０】プラスミドｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−２００３
の制限地図を示す。

【図１１】プラスミドｐＣ−ＢＰＸ−ＰＲＥ−７２０Ｘ
の制限地図を示す。

【図１２】プラスミドｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７２０Ｘの
制限地図を示す。

【図１３】バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナ
ーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター（配列番号
２６）を示す。

【図１４】バシラスピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナ
ーゼのシグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番
号２８）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 9/26 Ｚ 15/09 ＺＮＡＤ２１Ｃ 9/10 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/26 ＺＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/26 ＺＣ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者ピエールレドゥーベルギーベー1200 ブリュッセルアベニュードディクスアルパント 100 (72)発明者ルネデトロベルギーベー1328 ラスヌショーセドルーヴァーン 534

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キシラナーゼであって、バシラス(Bacil
lus)株に由来し、ｐＨ約５〜１０の範囲及び約５０〜８
０℃の温度範囲にわたって活性であることを特徴とする
キシラナーゼ。
【請求項２】バシラス種７２０／１株（ＬＭＧＰ−
１４７９８）又はその菌株の誘導体又は変異株に由来す
ることを特徴とするキシラナーゼ。
【請求項３】１〜２２１のアミノ酸のアミノ酸配列
（配列番号３）又はその配列由来の修飾配列を含むこと
を特徴とする分離及び精製キシラナーゼ。
【請求項４】２４８個のアミノ酸を含む前駆体として
合成されることを特徴とする請求項３記載のキシラナー
ゼ。
【請求項５】分子量約２５ｋＤａを有する単一ポリペ
プチドからなり、実験的等電点約9.５〜約9.７を有する
ことを特徴とするキシラナーゼ。
【請求項６】バシラス属の微生物によって異種生産さ
れることを特徴とするキシラナーゼ。
【請求項７】バシラス種７２０／１（ＬＭＧＰ−１
４７９８）及びその培養物に由来するか又は突然変異し
た培養物の分離及び精製培養物。
【請求項８】バシラス種７２０／１（ＬＭＧＰ−１
４７９８）の成熟キシラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１）又はその配列由来の修飾配列を含
むＤＮＡ分子。
【請求項９】バシラス種７２０／１キシラナーゼ前駆
体をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）又はそ
の配列由来の修飾配列を含むことを特徴とする請求項８
記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】バシラス種７２０／１キシラナーゼ全
遺伝子（配列番号１０）を含むことを特徴とする請求項
８又は９記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】バシラス・ピュミルス(Bacillus pumi
lus)ＰＲＬＢ１２キシラナーゼをコードする遺伝子由
来のプロモーター（配列番号２６）、バシラス・ピュミ
ルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼのシグナルペプチドを
コードするプレ配列（配列番号２７）及びバシラス種７
２０／１キシラナーゼをコードするヌクレオチド配列
（配列番号１）を含むことを特徴とする請求項８記載の
ＤＮＡ分子。
【請求項１２】請求項８〜１１のいずれか１項に記載
のＤＮＡ分子を含む発現ベクター又は染色体組込みベク
ター。
【請求項１３】発現ベクターｐＵＢＲＤ−７２０Ｘ１
１。
【請求項１４】発現ベクターｐＢＰＸＤ−ＰＲＥ−７
２０Ｘ。
【請求項１５】請求項８〜１１のいずれか１項に記載
のＤＮＡ分子を含む形質転換株。
【請求項１６】請求項１２〜１４のいずれか１項に記
載の発現ベクター又は染色体組込みベクターを含む形質
転換株。
【請求項１７】バシラス株であることを特徴とする請
求項１５又は１６記載の形質転換株。
【請求項１８】バシラス・リケニホルミス(Bacillus
licheniformis)株又はバシラス・ピュミルス株であるこ
とを特徴とする請求項１７記載の形質転換株。
【請求項１９】請求項１５〜１８のいずれか１項に記
載の形質転換株によて産生されたキシラナーゼ。
【請求項２０】請求項１〜６のいずれか１項又は請求
項１９記載のキシラナーゼの生産方法であって、好気的
条件下炭素源及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培
地中でキシラナーゼを産生することができる菌株の培養
及び得られたキシラナーゼの回収を含むことを特徴とす
る方法。
【請求項２１】請求項１〜６のいずれか１項に記載の
キシラナーゼの調製方法であって、キシラナーゼをコー
ドするＤＮＡ断片の分離、そのＤＮＡ断片の適切なベク
ターへの挿入、そのベクターの適切な宿主への導入又は
そのＤＮＡ分子の適切な宿主の染色体への導入、その宿
主の培養、該キシラナーゼの発現及び該キシラナーゼの
回収を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】紙パルプ処理のための請求項１〜６の
いずれか１項又は請求項１９記載のキシラナーゼの使
用。
【請求項２３】動物飼料における請求項１〜６のいず
れか１項又は請求項１９記載のキシラナーゼの使用。
【請求項２４】請求項１〜６のいずれか１項又は請求
項１９記載のキシラナーゼ及び少なくとも１種の添加剤
を含む酵素組成物。
【請求項２５】バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２
キシラナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター
（配列番号２６）。
【請求項２６】バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２
キシラナーゼのシグナルペプチドをコードするプレ配列
（配列番号２７）。
【請求項２７】ポリペプチドの生産に用いられる発現
系であって、 − バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
をコードする遺伝子由来のプロモーター配列（配列番号
２６）、 − シグナルペプチドをコードする配列、及び − 問題のポリペプチド配列、を含むことを特徴とする発現系。
【請求項２８】ポリペプチドの生産に用いられる発現
系であって、 − プロモーター配列、 − バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
のシグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２
７）、及び − 問題のポリペプチド配列、を含むことを特徴とする発現系。
【請求項２９】ポリペプチドの生産に用いられる発現
系であって、 − バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
をコードする遺伝子由来のプロモーター（配列番号２
６）配列、 − バシラス・ピュミルスＰＲＬＢ１２キシラナーゼ
のシグナルペプチドをコードするプレ配列（配列番号２
７）、 − 問題のポリペプチド配列、及び − ターミネーター配列、を含むことを特徴とする発現系。
【請求項３０】請求項２７〜２９のいずれか１項に記
載の発現系であって、問題のポリペプチド配列がバシラ
ス種７２０／１キシラナーゼをコードするヌクレオチド
配列（配列番号１）に相当することを特徴とする発現
系。