JPH0892303A - 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤 - Google Patents
新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤Info
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- JPH0892303A JPH0892303A JP6251275A JP25127594A JPH0892303A JP H0892303 A JPH0892303 A JP H0892303A JP 6251275 A JP6251275 A JP 6251275A JP 25127594 A JP25127594 A JP 25127594A JP H0892303 A JPH0892303 A JP H0892303A
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- galactose
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- acidic
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 構成単糖がＡとＢであり、ＡはＬ−ガラクト
ース−６−硫酸もしくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースでＢはＤ−ガラクトースもしくは６−Ｏ−メチ
ル−Ｄ−ガラクトースであり、ＡとＢが交互に配列して
おり、Ａ→Ｂの結合様式がα１→３であり、Ｂ→Ａの結
合様式がβ１→４であり、非還元末端を構成する単糖が
Ｌ−ガラクトース−６−硫酸であり、構成単糖としてＬ
−ガラクトース−６−硫酸を１分子中に２以上含有し、
構成単糖の数が４〜 500の偶数である酸性糖、その製造
方法およびそれを有効成分とする免疫賦活剤。 【効果】 紅藻粘質多糖に由来する該酸性糖は優れた免
疫賦活活性を有し、またこの免疫賦活活性は腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）誘導能も含むので、該酸性糖は抗腫瘍活性
をも有するものと期待される。
ース−６−硫酸もしくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースでＢはＤ−ガラクトースもしくは６−Ｏ−メチ
ル−Ｄ−ガラクトースであり、ＡとＢが交互に配列して
おり、Ａ→Ｂの結合様式がα１→３であり、Ｂ→Ａの結
合様式がβ１→４であり、非還元末端を構成する単糖が
Ｌ−ガラクトース−６−硫酸であり、構成単糖としてＬ
−ガラクトース−６−硫酸を１分子中に２以上含有し、
構成単糖の数が４〜 500の偶数である酸性糖、その製造
方法およびそれを有効成分とする免疫賦活剤。 【効果】 紅藻粘質多糖に由来する該酸性糖は優れた免
疫賦活活性を有し、またこの免疫賦活活性は腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）誘導能も含むので、該酸性糖は抗腫瘍活性
をも有するものと期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は紅藻類から得ることがで
きる新規な酸性糖、その製造方法およびそれを有効成分
として含有する免疫賦活剤に関する。
きる新規な酸性糖、その製造方法およびそれを有効成分
として含有する免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】海藻類は日本では古くから食用として、
また民間薬として用いられてきた。近年、その生理活性
に注目した研究開発が行われるようになってきた。例え
ば、特開昭63-316732 号公報および特開平5-271306号に
は紅藻類由来の抗ウィルス剤が、また特開昭64-66126号
公報には紅藻類由来の抗腫瘍剤が、それぞれ開示されて
いる。さらに、特開平3-284626号公報および特開平5-13
9988号公報には、いずれも紅藻類であるアマノリ属およ
びオゴノリ属の海藻から水性溶媒で抽出される物質を有
効成分とする免疫賦活剤がそれぞれ開示されている。オ
ゴノリ属やアマノリ属に属する海藻から抽出される物質
は、主としてアガロースを基本骨格に持つ高分子の酸性
多糖を主成分とするものであることが知られている。こ
れらの酸性多糖は粘性が高く、時によっては強いゲルを
形成するため、食品や飼料に混合したり、これ自体を経
口、非経口投与に適するような剤形に製剤することは極
めて困難である。しかも製造工程での取扱いも難しく、
操作が煩雑となるなどの大きな問題点があった。
また民間薬として用いられてきた。近年、その生理活性
に注目した研究開発が行われるようになってきた。例え
ば、特開昭63-316732 号公報および特開平5-271306号に
は紅藻類由来の抗ウィルス剤が、また特開昭64-66126号
公報には紅藻類由来の抗腫瘍剤が、それぞれ開示されて
いる。さらに、特開平3-284626号公報および特開平5-13
9988号公報には、いずれも紅藻類であるアマノリ属およ
びオゴノリ属の海藻から水性溶媒で抽出される物質を有
効成分とする免疫賦活剤がそれぞれ開示されている。オ
ゴノリ属やアマノリ属に属する海藻から抽出される物質
は、主としてアガロースを基本骨格に持つ高分子の酸性
多糖を主成分とするものであることが知られている。こ
れらの酸性多糖は粘性が高く、時によっては強いゲルを
形成するため、食品や飼料に混合したり、これ自体を経
口、非経口投与に適するような剤形に製剤することは極
めて困難である。しかも製造工程での取扱いも難しく、
操作が煩雑となるなどの大きな問題点があった。
【０００３】かかる粘質酸性多糖を加水分解する酵素と
して、シュードモナス・アトランティカ（Pseudomonus
atlantica)、サイトファーガ・エスピー（Cytophaga
sp.）、ビブリオ・エスピー AP-2(Vibrio sp. AP-2)等
が、該粘質酸性多糖中のβ−１，４結合を加水分解する
能力を有するβ−アガラーゼを生産することが報告され
ている（Biochem., 105, 317-321(1967)、Chin.J.Ocean
ol.Limnol., 8 (2)135-149(1990)、Eur.J.Biochem., 13
3, 673-684(1983)、Eur.J.Biochem., 187, 461-465(199
0)等）。また、アガラーゼ（β−またはα−アガラー
ゼ）を利用して寒天含有物質（オゴノリ、テングサ等の
原藻、寒天製造過程の中間産物、寒天、アガロース等）
からオリゴ糖を製造する方法が特開平2-65788 号公報に
記載されているが、製造されるオリゴ糖については単に
２糖、４糖、６糖以上のオリゴ糖が反応液中に存在する
ことが高速液体クロマトグラフィーにより確認されてい
るにすぎない。また、紅藻類アマノリ属に属する海藻に
ビブリオ属に属する微生物の産生する多糖類分解酵素を
作用させてオリゴ糖を製造する方法が特開平4-271791号
公報に記載されているが、製造されるオリゴ糖について
はゲル濾過分画範囲 100〜1800ダルトンであると記載さ
れているにすぎない。
して、シュードモナス・アトランティカ（Pseudomonus
atlantica)、サイトファーガ・エスピー（Cytophaga
sp.）、ビブリオ・エスピー AP-2(Vibrio sp. AP-2)等
が、該粘質酸性多糖中のβ−１，４結合を加水分解する
能力を有するβ−アガラーゼを生産することが報告され
ている（Biochem., 105, 317-321(1967)、Chin.J.Ocean
ol.Limnol., 8 (2)135-149(1990)、Eur.J.Biochem., 13
3, 673-684(1983)、Eur.J.Biochem., 187, 461-465(199
0)等）。また、アガラーゼ（β−またはα−アガラー
ゼ）を利用して寒天含有物質（オゴノリ、テングサ等の
原藻、寒天製造過程の中間産物、寒天、アガロース等）
からオリゴ糖を製造する方法が特開平2-65788 号公報に
記載されているが、製造されるオリゴ糖については単に
２糖、４糖、６糖以上のオリゴ糖が反応液中に存在する
ことが高速液体クロマトグラフィーにより確認されてい
るにすぎない。また、紅藻類アマノリ属に属する海藻に
ビブリオ属に属する微生物の産生する多糖類分解酵素を
作用させてオリゴ糖を製造する方法が特開平4-271791号
公報に記載されているが、製造されるオリゴ糖について
はゲル濾過分画範囲 100〜1800ダルトンであると記載さ
れているにすぎない。
【０００４】原始紅藻綱のアマノリ属の海藻から得られ
る多糖としてポルフィラン型多糖類が知られている。ア
マノリ属に属するマルバチシマクロノリ（Porphyra um
bilicalis)から得られるポルフィランは、非還元末端側
でα１→３結合をしたＤ−ガラクトースまたは６−Ｏ−
メチル−Ｄ−ガラクトースと、非還元末端でβ１→４結
合をした３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースまたは
Ｌ−ガラクトース−６−硫酸が交互に結合した構造をも
つ（総合多糖類科学（下）、講談社サイエンティフィッ
ク、306 頁(1973)）。ポルフィランをβ−アガラーゼで
加水分解することにより、６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ
−ガラクトピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−３，６−アンヒドロ−α−Ｌ
−ガラクトピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトピラ
ノース（後述の表記法によると式
る多糖としてポルフィラン型多糖類が知られている。ア
マノリ属に属するマルバチシマクロノリ（Porphyra um
bilicalis)から得られるポルフィランは、非還元末端側
でα１→３結合をしたＤ−ガラクトースまたは６−Ｏ−
メチル−Ｄ−ガラクトースと、非還元末端でβ１→４結
合をした３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースまたは
Ｌ−ガラクトース−６−硫酸が交互に結合した構造をも
つ（総合多糖類科学（下）、講談社サイエンティフィッ
ク、306 頁(1973)）。ポルフィランをβ−アガラーゼで
加水分解することにより、６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ
−ガラクトピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−３，６−アンヒドロ−α−Ｌ
−ガラクトピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトピラ
ノース（後述の表記法によると式
【０００５】
【化２】
【０００６】で表される）等のオリゴ糖が得られる（Eu
r.J.Biochem.133,673-684(1983))。真正紅藻綱では細胞
間隙を構成する粘質多糖類の主成分は寒天である。寒天
はテングサ属、ムカデノリ属、オゴノリ属、イバラノリ
属、スギノリ属などに属する紅藻から得られ、中性のア
ガロース、ピルビン酸を含むアガロース骨格をもつ多糖
類、硫酸エステルを多く含むアガロース骨格をもつ多糖
類の３種の混合物である。寒天の成分量及び特徴は、紅
藻の成長段階の相違とともに、また紅藻の種類によって
大きく異なる。アガロースは中性多糖で非還元末端側で
α１→３結合をしたＤ−ガラクトースまたは６−Ｏ−メ
チル−Ｄ−ガラクトースと、非還元末端側でβ１→４結
合をした３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互
に結合した構造をもつ。硫酸エステルを含む多糖は、ア
ガロースの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基
がガラクトース−６−硫酸残基に一部置換された構造を
もつ（前出の総合多糖類科学（下）、298-304 頁）。
r.J.Biochem.133,673-684(1983))。真正紅藻綱では細胞
間隙を構成する粘質多糖類の主成分は寒天である。寒天
はテングサ属、ムカデノリ属、オゴノリ属、イバラノリ
属、スギノリ属などに属する紅藻から得られ、中性のア
ガロース、ピルビン酸を含むアガロース骨格をもつ多糖
類、硫酸エステルを多く含むアガロース骨格をもつ多糖
類の３種の混合物である。寒天の成分量及び特徴は、紅
藻の成長段階の相違とともに、また紅藻の種類によって
大きく異なる。アガロースは中性多糖で非還元末端側で
α１→３結合をしたＤ−ガラクトースまたは６−Ｏ−メ
チル−Ｄ−ガラクトースと、非還元末端側でβ１→４結
合をした３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互
に結合した構造をもつ。硫酸エステルを含む多糖は、ア
ガロースの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基
がガラクトース−６−硫酸残基に一部置換された構造を
もつ（前出の総合多糖類科学（下）、298-304 頁）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは紅藻類に
属する海藻から粘質多糖（粘質酸性多糖）を水性溶媒で
抽出し、固液分離して得られる抽出液に、β−アガラー
ゼを作用させて得られる低粘性酸性糖が免疫賦活剤作用
を有することを見い出した（特願平5-67479 、平成５年
３月３日出願）。一方、本発明者らはシュードモナス・
エスピーＯ−１４８（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６７）が
「紅藻粘質多糖をエンド型に加水分解し、重合度４を主
体とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する」新規な紅
藻粘質多糖分解酵素を生成することを見い出した（特願
平6-57469)。
属する海藻から粘質多糖（粘質酸性多糖）を水性溶媒で
抽出し、固液分離して得られる抽出液に、β−アガラー
ゼを作用させて得られる低粘性酸性糖が免疫賦活剤作用
を有することを見い出した（特願平5-67479 、平成５年
３月３日出願）。一方、本発明者らはシュードモナス・
エスピーＯ−１４８（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７６７）が
「紅藻粘質多糖をエンド型に加水分解し、重合度４を主
体とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する」新規な紅
藻粘質多糖分解酵素を生成することを見い出した（特願
平6-57469)。
【０００８】本発明者らは上記菌株の培養液中に上記酵
素とは異なるが、β１→４ガラクトシド結合を加水分解
する酵素がさらに存在することを見い出した。本発明者
らは上記粘質多糖をこれらの酵素で加水分解することに
より、免疫賦活作用が大巾に向上した低粘性酸性糖が得
られ、この低粘性酸性糖を分画することにより、免疫賦
活活性がさらに大巾に向上した酸性糖が得られることを
見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成され
たものであり、その目的とするところは免疫賦活活性に
優れた新規物質、その製造方法およびそれを有効成分と
して含有する新規免疫賦活剤の提供である。
素とは異なるが、β１→４ガラクトシド結合を加水分解
する酵素がさらに存在することを見い出した。本発明者
らは上記粘質多糖をこれらの酵素で加水分解することに
より、免疫賦活作用が大巾に向上した低粘性酸性糖が得
られ、この低粘性酸性糖を分画することにより、免疫賦
活活性がさらに大巾に向上した酸性糖が得られることを
見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成され
たものであり、その目的とするところは免疫賦活活性に
優れた新規物質、その製造方法およびそれを有効成分と
して含有する新規免疫賦活剤の提供である。
【０００９】
【発明を解決するための手段】本発明は構成単糖がＡと
Ｂであり、ＡはＬ−ガラクトース−６−硫酸もしくは
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースでＢはＤ−ガラ
クトースもしくは６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースで
あり、ＡとＢが交互に配列しており、Ａ→Ｂの結合様式
がα１→３であり、Ｂ→Ａの結合様式がβ１→４であ
り、非還元末端を構成する単糖がＬ−ガラクトース−６
−硫酸であり、構成単糖としてＬ−ガラクトース−６−
硫酸を１分子中に２以上含有し、構成単糖の数が４〜50
0 の偶数である酸性糖；紅藻類に属する海藻中に含ま
れ、水性溶媒で抽出される粘質多糖を、下記紅藻粘質多
糖分解酵素ＩおよびIIの少なくとも１つを含有する酵素
源で加水分解するか、下記紅藻粘質多糖分解酵素III と
ＩおよびIIの少なくとも１つとを含有する酵素源で加水
分解して得られる低粘性酸性糖中の構成単糖の数が５０
０より大の画分を除去し、かつ１分子中の硫酸基数がそ
れぞれ２以上である酸性糖混合物を分取するか、または
該酸性糖混合物をさらに適宜分離することを特徴とす
る、上記酸性糖の製造方法： 紅藻粘質多糖分解酵素Ｉ：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、６−Ｏ−メチル−Ｄ−
ガラクトースおよびＬ−ガラクトース−６−硫酸をそれ
ぞれＡ−Ｌ−Ｇａｌ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌお
よびＬ−ＧａｌＳで表すと、該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−
Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解
する特異性を有する酵素 紅藻粘質多糖分解酵素II：該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−Ｇ
ａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基、
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａ
ｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解する特異
性を有するエンド型酵素
Ｂであり、ＡはＬ−ガラクトース−６−硫酸もしくは
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースでＢはＤ−ガラ
クトースもしくは６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースで
あり、ＡとＢが交互に配列しており、Ａ→Ｂの結合様式
がα１→３であり、Ｂ→Ａの結合様式がβ１→４であ
り、非還元末端を構成する単糖がＬ−ガラクトース−６
−硫酸であり、構成単糖としてＬ−ガラクトース−６−
硫酸を１分子中に２以上含有し、構成単糖の数が４〜50
0 の偶数である酸性糖；紅藻類に属する海藻中に含ま
れ、水性溶媒で抽出される粘質多糖を、下記紅藻粘質多
糖分解酵素ＩおよびIIの少なくとも１つを含有する酵素
源で加水分解するか、下記紅藻粘質多糖分解酵素III と
ＩおよびIIの少なくとも１つとを含有する酵素源で加水
分解して得られる低粘性酸性糖中の構成単糖の数が５０
０より大の画分を除去し、かつ１分子中の硫酸基数がそ
れぞれ２以上である酸性糖混合物を分取するか、または
該酸性糖混合物をさらに適宜分離することを特徴とす
る、上記酸性糖の製造方法： 紅藻粘質多糖分解酵素Ｉ：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、６−Ｏ−メチル−Ｄ−
ガラクトースおよびＬ−ガラクトース−６−硫酸をそれ
ぞれＡ−Ｌ−Ｇａｌ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌお
よびＬ−ＧａｌＳで表すと、該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−
Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解
する特異性を有する酵素 紅藻粘質多糖分解酵素II：該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−Ｇ
ａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基、
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａ
ｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解する特異
性を有するエンド型酵素
【００１０】紅藻粘質多糖分解酵素III ：該粘質多糖中
の、Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＬ−ＧａｌＳ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合
を、該還元末端側にＡ−Ｌ−Ｇａｌ─Ｄ−Ｇａｌ残基ま
たはＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在し、
さらに該Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−
ＧａｌＳ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基の非還元末端側にＡ−
Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基、Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基または
Ｌ−ＧａｌＳ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在する場合に
のみ、加水分解する特異性を有するエンド型酵素；上記
酸性糖の少なくとも１つを有効成分として含有する免疫
賦活剤（以下、免疫賦活剤１という場合がある）；およ
び紅藻類に属する海藻中に含まれ、水性溶媒で抽出され
る粘質多糖を、上記紅藻粘質多糖分解酵素ＩおよびIIの
少なくとも１つを含有する酵素源で加水分解するか、上
記紅藻粘質多糖分解酵素III とＩおよびIIの少なくとも
１つとを含有する酵素源で加水分解して得られる低粘性
酸性糖中のＧＰＣ法によって測定される分子量が 100,0
00より大の画分を除去して得られる酸性糖混合物であっ
て、分子中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混
合物を有効成分として含有する免疫賦活剤（以下、免疫
賦活剤２という場合がある）に関する。以下、上記紅藻
粘質多糖分解酵素Ｉ、II、III を総称して単に紅藻粘質
多糖分解酵素という場合がある。本発明を詳述するに先
立って、本発明において用いる糖単位の表記法について
説明する。本発明においては式
の、Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＬ−ＧａｌＳ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合
を、該還元末端側にＡ−Ｌ−Ｇａｌ─Ｄ−Ｇａｌ残基ま
たはＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在し、
さらに該Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−
ＧａｌＳ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基の非還元末端側にＡ−
Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基、Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基または
Ｌ−ＧａｌＳ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在する場合に
のみ、加水分解する特異性を有するエンド型酵素；上記
酸性糖の少なくとも１つを有効成分として含有する免疫
賦活剤（以下、免疫賦活剤１という場合がある）；およ
び紅藻類に属する海藻中に含まれ、水性溶媒で抽出され
る粘質多糖を、上記紅藻粘質多糖分解酵素ＩおよびIIの
少なくとも１つを含有する酵素源で加水分解するか、上
記紅藻粘質多糖分解酵素III とＩおよびIIの少なくとも
１つとを含有する酵素源で加水分解して得られる低粘性
酸性糖中のＧＰＣ法によって測定される分子量が 100,0
00より大の画分を除去して得られる酸性糖混合物であっ
て、分子中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混
合物を有効成分として含有する免疫賦活剤（以下、免疫
賦活剤２という場合がある）に関する。以下、上記紅藻
粘質多糖分解酵素Ｉ、II、III を総称して単に紅藻粘質
多糖分解酵素という場合がある。本発明を詳述するに先
立って、本発明において用いる糖単位の表記法について
説明する。本発明においては式
【００１１】
【化３】
【００１２】（式中、Ｒは水素原子またはメチル基であ
る）で表される６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ−ガラクト
ピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもし
くは６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル
−（１→３）−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノー
スを
る）で表される６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ−ガラクト
ピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもし
くは６−Ｏ−スルファト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル
−（１→３）−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノー
スを
【００１３】
【化４】
【００１４】と略記する。同様に式
【００１５】
【化５】
【００１６】（式中、Ｒは上記と同義である）で表され
る３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもしくは３，６−
アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）
−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノースを
る３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもしくは３，６−
アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）
−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノースを
【００１７】
【化６】
【００１８】と略記する。また、式
【００１９】
【化７】
【００２０】（式中、Ｒは上記と同義である）で表され
るβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−６−Ｏ−
スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−６
−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースを
るβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−６−Ｏ−
スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−６
−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースを
【００２１】
【化８】
【００２２】と略記する。同様に式
【００２３】
【化９】
【００２４】（式中、Ｒは上記と同義である）で表され
るβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノースを
るβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノースを
【００２５】
【化10】
【００２６】と略記する。この略記法に従えば式
【００２７】
【化11】
【００２８】（式中、Ｒは上記と同義である）で表され
る６−Ｏ−スルファルト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル
−（１→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）
−３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノース、６−Ｏ−スルフ
ァト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）−３，６−アンヒド
ロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−６−Ｏ
−メチル−Ｄ−ガラクトピラノース、６−Ｏ−スルファ
ト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−６−Ｏ
−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）−
３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
スルファト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）
−６−Ｏ−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→
４）−３，６−アンヒドロ−α−ガラクトピラノシル−
（１→３）−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノース
は
る６−Ｏ−スルファルト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル
−（１→３）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）
−３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノース、６−Ｏ−スルフ
ァト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）−３，６−アンヒド
ロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−６−Ｏ
−メチル−Ｄ−ガラクトピラノース、６−Ｏ−スルファ
ト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）−６−Ｏ
−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→４）−
３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−
（１→３）−Ｄ−ガラクトピラノースもしくは６−Ｏ−
スルファト−α−Ｌ−ガラクトピラノシル−（１→３）
−６−Ｏ−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→
４）−３，６−アンヒドロ−α−ガラクトピラノシル−
（１→３）−６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトピラノース
は
【００２９】
【化12】
【００３０】と略記される。上記略記法から理解される
ごとく、６−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノース
もしくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの還元
末端にＤ−ガラクトースもしくは６−Ｏ−メチル−Ｄ−
ガラクトースのＯＨ基が結合（グリコシド結合）する場
合には常にα１→３結合し、逆にＤ−ガラクトースもし
くは６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの還元末端に６
−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのＯＨ基が結合
（グリコシド結合）する場合には常にβ１→４結合して
いる。
ごとく、６−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノース
もしくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの還元
末端にＤ−ガラクトースもしくは６−Ｏ−メチル−Ｄ−
ガラクトースのＯＨ基が結合（グリコシド結合）する場
合には常にα１→３結合し、逆にＤ−ガラクトースもし
くは６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの還元末端に６
−Ｏ−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノースもしくは
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのＯＨ基が結合
（グリコシド結合）する場合には常にβ１→４結合して
いる。
【００３１】前記したごとく、本発明の酸性糖は（１）
構成単糖がＡとＢであり、ＡはＬ−ガラクトース−６−
硫酸（＝６−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノース）も
しくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（＝３，
６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノース）でＢはＤ−
ガラクトース（＝Ｄ−ガラクトピラノース）もしくは６
−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（＝６−Ｏ−メチル−
Ｄ−ガラクトピラノース）であり、ＡとＢが交互に配列
しており、Ａ→Ｂの結合様式がα１→３であり、Ｂ→Ａ
の結合様式がβ１→４であり、非還元末端を構成する単
糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸であり、構成単糖とし
てＬ−ガラクトース−６−硫酸を１分子中に２以上含有
し、構成単糖の数が４〜500 の偶数である酸性糖であ
る。上記（１）の酸性糖中、好ましいものは（２）構成
単糖の数が４〜200 の偶数である上記（１）の酸性糖で
あり、さらに好ましいものは（３）構成単糖の数が４〜
14の偶数である上記（１）の酸性糖である。また、本発
明の酸性糖中好ましいものは、（４）各単糖単位に、非
還元末端から還元末端へ向かって１、２、３、４…ｎ−
１、ｎと番号を付すとして、ｎ−１の構成単糖が３，６
−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであって、３、５…ｎ
−３の構成単糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸または
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであって、構成
単糖の数が６以上の偶数であるか、またはｎ−１の構成
単糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸であって、３、５…
ｎ−３の構成単位もＬ−ガラクトース−６−硫酸であっ
て、構成単糖の数が４以上の偶数である上記（１）、
（２）または（３）の酸性糖である。また、本発明の酸
性糖中さらに好ましいものは、（５）構成単糖の配列が
以下の式で表される上記（１）の酸性糖である：
構成単糖がＡとＢであり、ＡはＬ−ガラクトース−６−
硫酸（＝６−スルファト−Ｌ−ガラクトピラノース）も
しくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（＝３，
６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノース）でＢはＤ−
ガラクトース（＝Ｄ−ガラクトピラノース）もしくは６
−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（＝６−Ｏ−メチル−
Ｄ−ガラクトピラノース）であり、ＡとＢが交互に配列
しており、Ａ→Ｂの結合様式がα１→３であり、Ｂ→Ａ
の結合様式がβ１→４であり、非還元末端を構成する単
糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸であり、構成単糖とし
てＬ−ガラクトース−６−硫酸を１分子中に２以上含有
し、構成単糖の数が４〜500 の偶数である酸性糖であ
る。上記（１）の酸性糖中、好ましいものは（２）構成
単糖の数が４〜200 の偶数である上記（１）の酸性糖で
あり、さらに好ましいものは（３）構成単糖の数が４〜
14の偶数である上記（１）の酸性糖である。また、本発
明の酸性糖中好ましいものは、（４）各単糖単位に、非
還元末端から還元末端へ向かって１、２、３、４…ｎ−
１、ｎと番号を付すとして、ｎ−１の構成単糖が３，６
−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであって、３、５…ｎ
−３の構成単糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸または
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであって、構成
単糖の数が６以上の偶数であるか、またはｎ−１の構成
単糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸であって、３、５…
ｎ−３の構成単位もＬ−ガラクトース−６−硫酸であっ
て、構成単糖の数が４以上の偶数である上記（１）、
（２）または（３）の酸性糖である。また、本発明の酸
性糖中さらに好ましいものは、（５）構成単糖の配列が
以下の式で表される上記（１）の酸性糖である：
【００３２】
【化13】
【００３３】次に本発明の酸性糖の製法を以下の製法１
および２で分説する。酸性糖の製法１ 上記（１）〜（５）の本発明の酸性糖中、ｎ−１番目
の、すなわち還元末端から２番目の構成単糖が３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースである酸性糖は、紅藻類
に属する海藻中に含まれ、水性溶媒で抽出される粘質多
糖（粘質酸性多糖）を、上記で定義した紅藻粘質多糖分
解酵素ＩもしくはIIまたはこれらの混合物またはそれら
を含有する物質（培養濾液等）を用いて加水分解して得
られる低粘性酸性糖中の、分子量が 100,000より大、好
ましくは45,000より大、または3,000 から100,000 もし
くは45,000までの任意の値より大、例えば7,500 より大
の画分、または構成単糖の数が 500より大、好ましくは
200より大、または14から500 もしくは 200までの任意
の値より大、例えば36より大となるような分子量の画分
を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等によって
除去し、得られる比較的低分子量の画分を、物質をイオ
ン性の違いで分離する方法、例えば陰イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動、電気浸透膜処理等に付すか、
または分画分子量のさらに小さい限外濾過膜を用いる限
外濾過またはさらに小さい分子量の多糖類の分画に適し
たゲル粒子を用いるゲル濾過に付して、１分子中の硫酸
基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を分取するこ
とにより得ることができる。上記をはじめ本明細書にい
う分子量は、プルラン（Shodex standard P-82) 、ネオ
アガロビオース、ネオアガロテトラオースおよびネオア
ガロヘキサオースを標準とし、カラムとしてAsahipak G
SM-700(7.6×500mm)＋Asahipak GS-220 HQ(7.6×300mm)
( 旭化成工業（株）製）、溶離液として50mM NaCl を用
いるGPC 法によって決定される分子量である。
および２で分説する。酸性糖の製法１ 上記（１）〜（５）の本発明の酸性糖中、ｎ−１番目
の、すなわち還元末端から２番目の構成単糖が３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースである酸性糖は、紅藻類
に属する海藻中に含まれ、水性溶媒で抽出される粘質多
糖（粘質酸性多糖）を、上記で定義した紅藻粘質多糖分
解酵素ＩもしくはIIまたはこれらの混合物またはそれら
を含有する物質（培養濾液等）を用いて加水分解して得
られる低粘性酸性糖中の、分子量が 100,000より大、好
ましくは45,000より大、または3,000 から100,000 もし
くは45,000までの任意の値より大、例えば7,500 より大
の画分、または構成単糖の数が 500より大、好ましくは
200より大、または14から500 もしくは 200までの任意
の値より大、例えば36より大となるような分子量の画分
を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等によって
除去し、得られる比較的低分子量の画分を、物質をイオ
ン性の違いで分離する方法、例えば陰イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動、電気浸透膜処理等に付すか、
または分画分子量のさらに小さい限外濾過膜を用いる限
外濾過またはさらに小さい分子量の多糖類の分画に適し
たゲル粒子を用いるゲル濾過に付して、１分子中の硫酸
基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を分取するこ
とにより得ることができる。上記をはじめ本明細書にい
う分子量は、プルラン（Shodex standard P-82) 、ネオ
アガロビオース、ネオアガロテトラオースおよびネオア
ガロヘキサオースを標準とし、カラムとしてAsahipak G
SM-700(7.6×500mm)＋Asahipak GS-220 HQ(7.6×300mm)
( 旭化成工業（株）製）、溶離液として50mM NaCl を用
いるGPC 法によって決定される分子量である。
【００３４】本製法１は前記免疫賦活剤１及び２の有効
成分である酸性糖の製法でもある。本発明では、原材料
としてアガロースを基本骨格に持つ酸性多糖、またはポ
ルフィランを主成分の１つとして含有する紅藻類に属す
る海藻を用いる。好適に用い得る海藻としては、オゴノ
リ属に属する海藻、例えばオゴノリ、ツルシラモ、シラ
モ、オオオゴノリ、ミゾオゴノリ、カバノリ、アマノリ
属に属する海藻、例えばマルバアマノリ、ツクシアマノ
リ、オニアマノリ、コスジノリ、ウップルイノリ、アサ
クサノリ、スサビノリ、マルバチシマクロノリ、オオノ
ノリ、フイリタサを挙げることができる。この他ウシケ
ノリ属のウシケノリ、フノリノウシゲも本発明に使用で
き、またイトグサ属及びフノリ属に属する海藻のなかに
も本発明に使用できるものがある。これらの紅藻類に属
する海藻中、より好ましいものはオゴノリ属またはアマ
ノリ属に属する海藻である。
成分である酸性糖の製法でもある。本発明では、原材料
としてアガロースを基本骨格に持つ酸性多糖、またはポ
ルフィランを主成分の１つとして含有する紅藻類に属す
る海藻を用いる。好適に用い得る海藻としては、オゴノ
リ属に属する海藻、例えばオゴノリ、ツルシラモ、シラ
モ、オオオゴノリ、ミゾオゴノリ、カバノリ、アマノリ
属に属する海藻、例えばマルバアマノリ、ツクシアマノ
リ、オニアマノリ、コスジノリ、ウップルイノリ、アサ
クサノリ、スサビノリ、マルバチシマクロノリ、オオノ
ノリ、フイリタサを挙げることができる。この他ウシケ
ノリ属のウシケノリ、フノリノウシゲも本発明に使用で
き、またイトグサ属及びフノリ属に属する海藻のなかに
も本発明に使用できるものがある。これらの紅藻類に属
する海藻中、より好ましいものはオゴノリ属またはアマ
ノリ属に属する海藻である。
【００３５】これらの海藻は最初から水性溶液による抽
出に付しても活性成分を得ることもできるが、まず、異
物を除き、また組織に柔軟性を与えて後の処理を容易に
するため、水または温水（例えば80℃以下の温水）で短
時間洗浄する、あるいは油分、少糖類、油溶性色素を除
く意味でこれらを溶解し得る有機溶媒で海藻を処理する
等の操作を、各単独でまたは必要に応じて組み合わせて
行なうこともでき、その方が好ましい。かかる有機溶媒
としては例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノ
ール、イソプロパノール等の低級アルカノール、アセト
ン等の低級アルカノン等を用いることができる。また、
これらの溶媒と少量の水（80:20V/V程度まで）との混合
物であってもよい。メタノール、エタノール及びこれら
と水との混合溶媒が好ましい。かかる有機溶媒（水との
混合溶媒を含む）の使用量は特に制限はないが、海藻
（乾燥物基準）100gに対して0.5 〜10Ｌぐらいが適当で
ある。有機溶媒抽出の温度時間は特に制限はないが、室
温以上例えば30℃〜有機溶媒の沸点で５分以上例えば15
分〜１時間が適当である。
出に付しても活性成分を得ることもできるが、まず、異
物を除き、また組織に柔軟性を与えて後の処理を容易に
するため、水または温水（例えば80℃以下の温水）で短
時間洗浄する、あるいは油分、少糖類、油溶性色素を除
く意味でこれらを溶解し得る有機溶媒で海藻を処理する
等の操作を、各単独でまたは必要に応じて組み合わせて
行なうこともでき、その方が好ましい。かかる有機溶媒
としては例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノ
ール、イソプロパノール等の低級アルカノール、アセト
ン等の低級アルカノン等を用いることができる。また、
これらの溶媒と少量の水（80:20V/V程度まで）との混合
物であってもよい。メタノール、エタノール及びこれら
と水との混合溶媒が好ましい。かかる有機溶媒（水との
混合溶媒を含む）の使用量は特に制限はないが、海藻
（乾燥物基準）100gに対して0.5 〜10Ｌぐらいが適当で
ある。有機溶媒抽出の温度時間は特に制限はないが、室
温以上例えば30℃〜有機溶媒の沸点で５分以上例えば15
分〜１時間が適当である。
【００３６】次に有機溶媒をデカント、濾過、遠心分離
等で除去して得られる残渣を水性溶媒による抽出に付
す。水性溶媒としては水、酸性水溶液または塩基性水溶
液が用いられるが、少量の例えば10容量％以下の親水性
有機溶媒をさらに含有していてもよい。「酸性」及び
「塩基性」を与えるのは通常それぞれ酸及び塩基である
が、常用される緩衝剤であってもよい。酸としては特に
制限はないが、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、
プロピオン酸、クエン酸等の有機酸を用いることができ
る。塩基としては特に制限はないが、アンモニア、アル
カリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩もし
くは重炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウ
ム、重炭酸カリウム等を通常使用する。塩基としてはさ
らにピリジン等の親水性有機塩基であってもよい。緩衝
剤としてはトリス系、リン酸系、クエン酸系、ホウ酸系
等の常用の緩衝剤を用いることができる。
等で除去して得られる残渣を水性溶媒による抽出に付
す。水性溶媒としては水、酸性水溶液または塩基性水溶
液が用いられるが、少量の例えば10容量％以下の親水性
有機溶媒をさらに含有していてもよい。「酸性」及び
「塩基性」を与えるのは通常それぞれ酸及び塩基である
が、常用される緩衝剤であってもよい。酸としては特に
制限はないが、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、
プロピオン酸、クエン酸等の有機酸を用いることができ
る。塩基としては特に制限はないが、アンモニア、アル
カリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩もし
くは重炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウ
ム、重炭酸カリウム等を通常使用する。塩基としてはさ
らにピリジン等の親水性有機塩基であってもよい。緩衝
剤としてはトリス系、リン酸系、クエン酸系、ホウ酸系
等の常用の緩衝剤を用いることができる。
【００３７】水性溶媒のpHは特に制限はないが通常１〜
13、特に２〜12が適当である。水性溶媒の使用量は特に
制限はないが通常原海藻（乾燥物基準）100gに対して１
〜10Ｌぐらいが適当である。水性溶媒による抽出の温度
時間は特に制限はないが、４℃〜系の沸騰温度、通常室
温〜系の沸騰温度で通常５分以上、例えば30分〜20時間
が適当である。なお、水、酸性水溶液、塩基性水溶液に
よる抽出は２つ以上直列に組み合わせて行ってもよい
（例えば水抽出残渣を酸性水溶液で抽出する等）。
13、特に２〜12が適当である。水性溶媒の使用量は特に
制限はないが通常原海藻（乾燥物基準）100gに対して１
〜10Ｌぐらいが適当である。水性溶媒による抽出の温度
時間は特に制限はないが、４℃〜系の沸騰温度、通常室
温〜系の沸騰温度で通常５分以上、例えば30分〜20時間
が適当である。なお、水、酸性水溶液、塩基性水溶液に
よる抽出は２つ以上直列に組み合わせて行ってもよい
（例えば水抽出残渣を酸性水溶液で抽出する等）。
【００３８】抽出液を残渣から通常の固液分離手段（デ
カンテーション、濾過、遠心分離等）により分離して粘
質多糖含有水溶液を得る。通常この段階で酵素処理に付
すが、抽出を酸性水溶液または塩基性水溶液を用いて行
った場合には酵素処理に適したpHに調整した後酵素処理
に付すか、または好ましくは一旦抽出液を中和し（中和
に用いる塩基、酸はそれぞれ塩基性水溶液及び酸性水溶
液に用いる塩基、酸でよい）、ついで脱塩処理（有機溶
媒沈澱後に水に溶解、透析、限外濾過等）を行った後に
酵素処理に付す。また、量的関係を知りたい等の場合に
は上記で得られる酵素処理に適した液にエタノール、ま
たはエタノールおよび塩（塩化ナトリウム等）を加え、
生じた沈澱を回収し、凍結乾燥に付したものを酵素処理
に付してもよい。
カンテーション、濾過、遠心分離等）により分離して粘
質多糖含有水溶液を得る。通常この段階で酵素処理に付
すが、抽出を酸性水溶液または塩基性水溶液を用いて行
った場合には酵素処理に適したpHに調整した後酵素処理
に付すか、または好ましくは一旦抽出液を中和し（中和
に用いる塩基、酸はそれぞれ塩基性水溶液及び酸性水溶
液に用いる塩基、酸でよい）、ついで脱塩処理（有機溶
媒沈澱後に水に溶解、透析、限外濾過等）を行った後に
酵素処理に付す。また、量的関係を知りたい等の場合に
は上記で得られる酵素処理に適した液にエタノール、ま
たはエタノールおよび塩（塩化ナトリウム等）を加え、
生じた沈澱を回収し、凍結乾燥に付したものを酵素処理
に付してもよい。
【００３９】本製法１で使用し得る紅藻粘質多糖分解酵
素ＩおよびIIの例としてはβ−アガラーゼが挙げられ
る。なお、β−アガラーゼの定義は「アガロース中のＤ
−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトー
ス残基間のβ１→４ガラクトシド結合を加水分解する酵
素」である。本発明で使用し得るβ−アガラーゼとして
は、例えば、先に例示したシュードモナス・アトランテ
ィカ、サイトファーガ・エスピー、ビブリオ・エスピー
ＡＰ−２起源のβ−アガラーゼを挙げることができる。
このうちシュードモナス属の微生物を起源とするβ−ア
ガラーゼ製剤が市販されている（シグマ社；紅藻粘質多
糖分解酵素ＩおよびIIの混合物）。
素ＩおよびIIの例としてはβ−アガラーゼが挙げられ
る。なお、β−アガラーゼの定義は「アガロース中のＤ
−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトー
ス残基間のβ１→４ガラクトシド結合を加水分解する酵
素」である。本発明で使用し得るβ−アガラーゼとして
は、例えば、先に例示したシュードモナス・アトランテ
ィカ、サイトファーガ・エスピー、ビブリオ・エスピー
ＡＰ−２起源のβ−アガラーゼを挙げることができる。
このうちシュードモナス属の微生物を起源とするβ−ア
ガラーゼ製剤が市販されている（シグマ社；紅藻粘質多
糖分解酵素ＩおよびIIの混合物）。
【００４０】本製法１で使用し得る紅藻粘質多糖分解酵
素としては、また、前出の特願平6-57469 号の明細書に
記載された紅藻粘質多糖分解酵素（紅藻粘質多糖分解酵
素IIに該当する）が挙げられる。この酵素は、前記定義
の性質に加え、以下の性質を有する： １）作用 紅藻粘質多糖をエンド型に加水分解し、重合度４を主体
とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する； ２）基質特異性 β１→４ガラクトシド結合を有するガラクタン系の多糖
類並びにネオアガロヘキサオース以上の少糖に作用し、
カラギーナン、ネオアガロテトラオース、ネオアガロビ
オース、乳糖には作用しない； ３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 紅藻粘質多糖であるオゴノリ熱水抽出物を基質としたと
きの至適ｐＨは４．５〜５．５であり、２８℃、１６時
間、基質非存在の条件下では、ｐＨ５．５〜８．０で安
定である；
素としては、また、前出の特願平6-57469 号の明細書に
記載された紅藻粘質多糖分解酵素（紅藻粘質多糖分解酵
素IIに該当する）が挙げられる。この酵素は、前記定義
の性質に加え、以下の性質を有する： １）作用 紅藻粘質多糖をエンド型に加水分解し、重合度４を主体
とするオリゴ糖を生成する反応を触媒する； ２）基質特異性 β１→４ガラクトシド結合を有するガラクタン系の多糖
類並びにネオアガロヘキサオース以上の少糖に作用し、
カラギーナン、ネオアガロテトラオース、ネオアガロビ
オース、乳糖には作用しない； ３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 紅藻粘質多糖であるオゴノリ熱水抽出物を基質としたと
きの至適ｐＨは４．５〜５．５であり、２８℃、１６時
間、基質非存在の条件下では、ｐＨ５．５〜８．０で安
定である；
【００４１】４）至適温度および熱安定性 オゴノリ熱水抽出物を基質としたときの至適温度は５５
℃であり、ｐＨ７．５、１０分間、基質非存在の条件下
では、５０℃で安定、９５℃で約７２．５％の活性が残
存している； ５）失活の条件 ｐＨ６．０、１２０℃、１０分間、基質非存在の条件下
では、約１０％の活性が残存し、１２０℃、６０分間で
完全に失活する； ６）分子量 ４１０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）； ７）等電点 ４．７〜５．６（等電点電気泳動法）； ８）金属塩等の影響 ｐＨ６．０、２８℃、１ｍＭの金属塩等の塩濃度下、１
６時間の処理で、Ａｇ+ 、Ｎ−ブロモスクシンイミドが
５％以下、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+が１５〜５０％Ｆｅ2+、Ｈｇ
2+が７０〜８０％の残存活性を示し、Ｎａ+ 、Ｍｇ2+、
Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、Ｂａ2+、Ｐ
ｂ2+、Ａｌ3+では安定である。 この紅藻粘質多糖分解酵素の製造例を参考例２に示す。
℃であり、ｐＨ７．５、１０分間、基質非存在の条件下
では、５０℃で安定、９５℃で約７２．５％の活性が残
存している； ５）失活の条件 ｐＨ６．０、１２０℃、１０分間、基質非存在の条件下
では、約１０％の活性が残存し、１２０℃、６０分間で
完全に失活する； ６）分子量 ４１０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）； ７）等電点 ４．７〜５．６（等電点電気泳動法）； ８）金属塩等の影響 ｐＨ６．０、２８℃、１ｍＭの金属塩等の塩濃度下、１
６時間の処理で、Ａｇ+ 、Ｎ−ブロモスクシンイミドが
５％以下、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+が１５〜５０％Ｆｅ2+、Ｈｇ
2+が７０〜８０％の残存活性を示し、Ｎａ+ 、Ｍｇ2+、
Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、Ｂａ2+、Ｐ
ｂ2+、Ａｌ3+では安定である。 この紅藻粘質多糖分解酵素の製造例を参考例２に示す。
【００４２】紅藻粘質多糖分解酵素ＩおよびIIの少なく
とも1 つを含有する酵素源としては各酵素単品、酵素Ｉ
およびIIの混合物、酵素Ｉおよび／またはIIと目的物の
取得に悪影響を及ぼさない他の酵素等を含有する粗酵
素、酵素Ｉおよび／またはIIを含有する、生産菌の培養
液もしくは培養濾液、または酵素Ｉおよび／またはIIの
生産菌の懸濁液等が挙げられる。前記水性溶媒抽出粘質
酸性多糖の本発明でいう紅藻粘質多糖分解酵素Ｉおよび
IIの少なくとも1 つを含有する酵素源による酵素処理
は、多糖１ｇあたり該酵素（全体として）0.01〜10,000
ｕ、より好ましくは0.1 〜1000ｕを、pH４〜９、温度１
５〜９５℃で0.5 〜７２時間、より好ましくはpH４〜
６、温度３０〜７０℃で４〜４８時間作用させることに
より行うことができる。ここで該酵素１ｕとはpH 6.0、
温度37℃の条件下で、オゴノリ由来の粘質酸性多糖を基
質として作用させたときに、１分間に１μmol のガラク
トースに相当する還元糖を生成する酵素量を意味する。
なお反応媒体としては前記した、必要に応じpH調整、脱
塩処理等を行った後の水性溶媒抽出液、または水、緩衝
液等を用いることができる。反応は静置状態で進行させ
ることも、攪拌し、さらにはpHを常に酵素反応が最も効
率的に行える値に調整しながら行うこともできる。酵素
反応後、通常酵素を加熱等により失活させる。
とも1 つを含有する酵素源としては各酵素単品、酵素Ｉ
およびIIの混合物、酵素Ｉおよび／またはIIと目的物の
取得に悪影響を及ぼさない他の酵素等を含有する粗酵
素、酵素Ｉおよび／またはIIを含有する、生産菌の培養
液もしくは培養濾液、または酵素Ｉおよび／またはIIの
生産菌の懸濁液等が挙げられる。前記水性溶媒抽出粘質
酸性多糖の本発明でいう紅藻粘質多糖分解酵素Ｉおよび
IIの少なくとも1 つを含有する酵素源による酵素処理
は、多糖１ｇあたり該酵素（全体として）0.01〜10,000
ｕ、より好ましくは0.1 〜1000ｕを、pH４〜９、温度１
５〜９５℃で0.5 〜７２時間、より好ましくはpH４〜
６、温度３０〜７０℃で４〜４８時間作用させることに
より行うことができる。ここで該酵素１ｕとはpH 6.0、
温度37℃の条件下で、オゴノリ由来の粘質酸性多糖を基
質として作用させたときに、１分間に１μmol のガラク
トースに相当する還元糖を生成する酵素量を意味する。
なお反応媒体としては前記した、必要に応じpH調整、脱
塩処理等を行った後の水性溶媒抽出液、または水、緩衝
液等を用いることができる。反応は静置状態で進行させ
ることも、攪拌し、さらにはpHを常に酵素反応が最も効
率的に行える値に調整しながら行うこともできる。酵素
反応後、通常酵素を加熱等により失活させる。
【００４３】上記酵素処理によって粘性多糖はそのβ１
→４結合が、通常部分的に、加水分解されて低粘性の酸
性糖（酸性多糖＋酸性オリゴ糖）になる。該酸性糖の分
子量は通常約 300〜約 1,400,000程度である。なお、酵
素処理は、上記においては水性溶媒抽出液に対して行っ
ているが、水性溶媒抽出と同時に、すなわち紅藻粘質多
糖分解酵素含有水性溶媒を用いて抽出を行うことにより
行うこともできる。この場合には酵素反応条件は上記と
同様でよいが、抽出条件は酵素反応条件による制約を受
ける。
→４結合が、通常部分的に、加水分解されて低粘性の酸
性糖（酸性多糖＋酸性オリゴ糖）になる。該酸性糖の分
子量は通常約 300〜約 1,400,000程度である。なお、酵
素処理は、上記においては水性溶媒抽出液に対して行っ
ているが、水性溶媒抽出と同時に、すなわち紅藻粘質多
糖分解酵素含有水性溶媒を用いて抽出を行うことにより
行うこともできる。この場合には酵素反応条件は上記と
同様でよいが、抽出条件は酵素反応条件による制約を受
ける。
【００４４】酵素処理液から分子量 100,000より大、好
ましくは45,000より大、または3,000 から 100,000もし
くは45,000までの任意の値より大、例えば7,500 より大
の多糖画分、または構成単糖の数が 500より大、好まし
くは 200より大、または14から500 もしくは 200までの
任意の値より大、例えば36より大となるような分子量の
多糖画分を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等
によって除去する。溶媒沈澱または塩析は比較的高分子
量の固形分画分を沈澱画分とし、比較的低分子量の固形
分画分を溶存画分とすることにより行なう。
ましくは45,000より大、または3,000 から 100,000もし
くは45,000までの任意の値より大、例えば7,500 より大
の多糖画分、または構成単糖の数が 500より大、好まし
くは 200より大、または14から500 もしくは 200までの
任意の値より大、例えば36より大となるような分子量の
多糖画分を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等
によって除去する。溶媒沈澱または塩析は比較的高分子
量の固形分画分を沈澱画分とし、比較的低分子量の固形
分画分を溶存画分とすることにより行なう。
【００４５】溶媒沈澱および塩析は常法により行うこと
ができ、溶媒沈澱における溶媒としては親水性有機溶
媒、例えばエタノール、メタノール、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノール等の低級アルカノールおよびアセ
トン等の低級アルカノン、特にエタノールを、塩析にお
ける塩としてはリン酸イオンや硫酸イオン等の多価の陰
イオンを含む塩、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム等、および塩化ナトリウム、塩化
カリウム、炭酸バリウム、塩化セチルピリジウム等、特
に硫酸アンモニウムを用いることができる。上記のごと
き分子量画分の多糖を沈澱させる溶媒や塩の酵素処理液
に対する添加量は溶媒の酵素処理液に対する割合または
塩の飽和度を徐々に例えば５〜15％刻みで上げていくこ
とにより、簡単に見い出すことができる。例えばエタノ
ールによる溶媒沈澱の場合、エタノールを酵素溶液に対
し50〜90容量％となるように添加すればよい。溶媒沈澱
や塩析に際し、温度、pHは特に調整しないでよいが、例
えば温度０〜２０℃程度、pH４〜９程度に調整してもよ
い。溶媒沈澱や塩析による沈澱の除去は遠心分離、濾過
等により行うことができる。
ができ、溶媒沈澱における溶媒としては親水性有機溶
媒、例えばエタノール、メタノール、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノール等の低級アルカノールおよびアセ
トン等の低級アルカノン、特にエタノールを、塩析にお
ける塩としてはリン酸イオンや硫酸イオン等の多価の陰
イオンを含む塩、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム等、および塩化ナトリウム、塩化
カリウム、炭酸バリウム、塩化セチルピリジウム等、特
に硫酸アンモニウムを用いることができる。上記のごと
き分子量画分の多糖を沈澱させる溶媒や塩の酵素処理液
に対する添加量は溶媒の酵素処理液に対する割合または
塩の飽和度を徐々に例えば５〜15％刻みで上げていくこ
とにより、簡単に見い出すことができる。例えばエタノ
ールによる溶媒沈澱の場合、エタノールを酵素溶液に対
し50〜90容量％となるように添加すればよい。溶媒沈澱
や塩析に際し、温度、pHは特に調整しないでよいが、例
えば温度０〜２０℃程度、pH４〜９程度に調整してもよ
い。溶媒沈澱や塩析による沈澱の除去は遠心分離、濾過
等により行うことができる。
【００４６】限外濾過に際しては、上記分子量以上の多
糖の除去に適した分画分子量の限外濾過膜を用いて限外
濾過を行う。限外濾過膜は市販のものを用いることがで
き、適当なものとして、例えばウルトラフィルターＱ０
１００、Ｐ０２００（東洋濾紙）、ダイアフローメンブ
レンＹＭ５、ＹＭ10、ＰＭ10、ＹＭ30、ＸＭ50（アミコ
ン）、タイプＰＬＧＣ、タイプＰＬＣＣ、タイプＰＬＴ
Ｋ（ミリポア）等を用いることができる。さらに逆浸透
膜、イオン交換膜、透析膜等も、場合により、使用可能
である。ゲル濾過に際しては、上記分子量以上の多糖の
分画に適したゲル粒子を用いてゲル濾過を行う。ゲル粒
子は市販のものを用いることができ、適当なものとし
て、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ、Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌＳ−２００；セファデクスＧ−２５、Ｇ−５
０、Ｇ−７５（ファルマシア）；ＴＳＫｇｅｌトヨパー
ルＨＷ−40、ＨＷ−50（東ソー）；セルロファインＧＣ
Ｌ−90、300(生化学工業）等を用いることができる。溶
出剤としては特に制限されないが、例えば0.05ＭNaCl水
溶液等を用いることができる。限外濾過、ゲル濾過にお
ける他の条件は通常の限外濾過、ゲル濾過における多糖
の分画の場合と同様でよく、特に制限されない。
糖の除去に適した分画分子量の限外濾過膜を用いて限外
濾過を行う。限外濾過膜は市販のものを用いることがで
き、適当なものとして、例えばウルトラフィルターＱ０
１００、Ｐ０２００（東洋濾紙）、ダイアフローメンブ
レンＹＭ５、ＹＭ10、ＰＭ10、ＹＭ30、ＸＭ50（アミコ
ン）、タイプＰＬＧＣ、タイプＰＬＣＣ、タイプＰＬＴ
Ｋ（ミリポア）等を用いることができる。さらに逆浸透
膜、イオン交換膜、透析膜等も、場合により、使用可能
である。ゲル濾過に際しては、上記分子量以上の多糖の
分画に適したゲル粒子を用いてゲル濾過を行う。ゲル粒
子は市販のものを用いることができ、適当なものとし
て、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ、Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌＳ−２００；セファデクスＧ−２５、Ｇ−５
０、Ｇ−７５（ファルマシア）；ＴＳＫｇｅｌトヨパー
ルＨＷ−40、ＨＷ−50（東ソー）；セルロファインＧＣ
Ｌ−90、300(生化学工業）等を用いることができる。溶
出剤としては特に制限されないが、例えば0.05ＭNaCl水
溶液等を用いることができる。限外濾過、ゲル濾過にお
ける他の条件は通常の限外濾過、ゲル濾過における多糖
の分画の場合と同様でよく、特に制限されない。
【００４７】上記種々の方法によって特定分子量以上の
比較的高分子量の多糖画分を除去して得られる、比較的
低分子量の糖画分（オリゴ糖＋多糖）含有液を、ついで
物質をイオン性の違いで分離する方法、またはさらに限
外濾過、ゲル濾過に付して中性糖および／または分子中
の硫酸基数が１の酸性糖等を除いて、分子中の硫酸基数
が２以上の酸性糖混合物を得る。物質をイオン性の違い
で分離する方法としては、例えば陰イオン交換樹脂によ
る陰イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、または
電気浸透膜処理等を用いることができ、上記の比較的低
分子量の糖画分含有液をこれに付すことにより、溶存固
形分中の中性糖画分と酸性糖画分とを分画し、かつ酸性
糖画分を分画する。これらの酸性糖画分分画から１分子
中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物より
なる画分を取得する。かかる画分の取得はまた物質の吸
着性の差を利用し、親水性基の結合した、シリカゲル系
等の担体を用いた順相分配クロマトグラフィーによって
も行うことができる。
比較的高分子量の多糖画分を除去して得られる、比較的
低分子量の糖画分（オリゴ糖＋多糖）含有液を、ついで
物質をイオン性の違いで分離する方法、またはさらに限
外濾過、ゲル濾過に付して中性糖および／または分子中
の硫酸基数が１の酸性糖等を除いて、分子中の硫酸基数
が２以上の酸性糖混合物を得る。物質をイオン性の違い
で分離する方法としては、例えば陰イオン交換樹脂によ
る陰イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、または
電気浸透膜処理等を用いることができ、上記の比較的低
分子量の糖画分含有液をこれに付すことにより、溶存固
形分中の中性糖画分と酸性糖画分とを分画し、かつ酸性
糖画分を分画する。これらの酸性糖画分分画から１分子
中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物より
なる画分を取得する。かかる画分の取得はまた物質の吸
着性の差を利用し、親水性基の結合した、シリカゲル系
等の担体を用いた順相分配クロマトグラフィーによって
も行うことができる。
【００４８】陰イオン交換クロマトグラフィー、電気泳
動、電気浸透膜処理等、および順相分配クロマトグラフ
ィーは上記沈澱除去液から中性糖画分や１分子中の硫酸
基数がそれぞれ１である酸性糖混合物を除去し、１分子
中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖を与えるこ
とができる限り、常法により行うことができる。例えば
陰イオン交換クロマトグラフィーの場合、使用するイオ
ン交換樹脂は強陰イオンタイプのものでも弱陰イオンタ
イプのものでもよいが、強陰イオンタイプのものが好ま
しい。具体的にはダイヤイオンＨＰＡ−７５（三菱化成
製）、Ｑセファロース、ＱＡＥセファデックス（ファル
マシア）、ＴＳＫgel Super Ｑ−トヨパール、ＤＥＡＥ
−トヨパール 650（東ソー）、ＤＥＡＥ−セルロファイ
ン（生化学工業）等を用いることができる。
動、電気浸透膜処理等、および順相分配クロマトグラフ
ィーは上記沈澱除去液から中性糖画分や１分子中の硫酸
基数がそれぞれ１である酸性糖混合物を除去し、１分子
中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖を与えるこ
とができる限り、常法により行うことができる。例えば
陰イオン交換クロマトグラフィーの場合、使用するイオ
ン交換樹脂は強陰イオンタイプのものでも弱陰イオンタ
イプのものでもよいが、強陰イオンタイプのものが好ま
しい。具体的にはダイヤイオンＨＰＡ−７５（三菱化成
製）、Ｑセファロース、ＱＡＥセファデックス（ファル
マシア）、ＴＳＫgel Super Ｑ−トヨパール、ＤＥＡＥ
−トヨパール 650（東ソー）、ＤＥＡＥ−セルロファイ
ン（生化学工業）等を用いることができる。
【００４９】前述の高分子糖画分除去液を、通常、イオ
ン交換カラムに乗せ、通常、水→塩水溶液を用いる段階
的溶出法または濃度勾配溶出法により溶出する。これに
より中性糖混合物、１分子中の硫酸基数が１の酸性糖の
混合物、１分子中の硫酸基数が２の酸性糖の混合物、１
分子中の硫酸基数が３の酸性糖の混合物…の順に溶出さ
れる。塩水溶液の塩としては強酸−強塩基からなる塩、
例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用いることが
できる。最終塩濃度は目的分画物のイオン性によって変
化するが、一般に0.05〜２Ｍが適当である。溶出液は適
当な量ずつ分取する。
ン交換カラムに乗せ、通常、水→塩水溶液を用いる段階
的溶出法または濃度勾配溶出法により溶出する。これに
より中性糖混合物、１分子中の硫酸基数が１の酸性糖の
混合物、１分子中の硫酸基数が２の酸性糖の混合物、１
分子中の硫酸基数が３の酸性糖の混合物…の順に溶出さ
れる。塩水溶液の塩としては強酸−強塩基からなる塩、
例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用いることが
できる。最終塩濃度は目的分画物のイオン性によって変
化するが、一般に0.05〜２Ｍが適当である。溶出液は適
当な量ずつ分取する。
【００５０】比較的低分子量の糖画分含有液から分子中
の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を取得
するのに、限外濾過またはゲル濾過を用いることも可能
である。可能な理由は、酵素の特異性から硫酸基数が１
の酸性糖と２以上の酸性糖との間で明確な分子量の差が
あることと、中性糖画分は酵素分解されて硫酸基数が２
以上の酸性糖との間で明確な分子量の差が生じるからで
ある。この限外濾過、ゲル濾過は分画を意図する分子量
域が前記と異なるだけで既述と同様にして行うことがで
きる。すなわち、中性糖または硫酸基数が１の酸性糖の
分子量の上限はおおよそ1,000 で硫酸基数が２ヶ以上の
酸性糖はより大きな分子量を持つため、1,000 以上の分
子量の多糖を分画するのに適した限外濾過膜、ゲル粒子
を用いればよい。具体的な限外濾過膜として例えばダイ
アフローメンブレンＹＭ５（アミコン）、タイプＰＬＣ
Ｃ（ミリポア）等、ゲル粒子として例えばSuperdex 75p
g、セファデックスＧ−１５、セファデックスＧ−２５
（ファルマシア）、TSKgelトヨパールＨＷ−４０（東ソ
ー）等を用いることができる。取得した目的物含有液の
同定は例えば前記ＧＰＣ法により行うことができる。
の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を取得
するのに、限外濾過またはゲル濾過を用いることも可能
である。可能な理由は、酵素の特異性から硫酸基数が１
の酸性糖と２以上の酸性糖との間で明確な分子量の差が
あることと、中性糖画分は酵素分解されて硫酸基数が２
以上の酸性糖との間で明確な分子量の差が生じるからで
ある。この限外濾過、ゲル濾過は分画を意図する分子量
域が前記と異なるだけで既述と同様にして行うことがで
きる。すなわち、中性糖または硫酸基数が１の酸性糖の
分子量の上限はおおよそ1,000 で硫酸基数が２ヶ以上の
酸性糖はより大きな分子量を持つため、1,000 以上の分
子量の多糖を分画するのに適した限外濾過膜、ゲル粒子
を用いればよい。具体的な限外濾過膜として例えばダイ
アフローメンブレンＹＭ５（アミコン）、タイプＰＬＣ
Ｃ（ミリポア）等、ゲル粒子として例えばSuperdex 75p
g、セファデックスＧ−１５、セファデックスＧ−２５
（ファルマシア）、TSKgelトヨパールＨＷ−４０（東ソ
ー）等を用いることができる。取得した目的物含有液の
同定は例えば前記ＧＰＣ法により行うことができる。
【００５１】酸性糖の製法２ 上記（１）〜（５）の本発明の酸性糖中、ｎ−１番目
の、すなわち還元末端から２番目の構成単糖がＬ−ガラ
クトース−６−硫酸である酸性糖は、紅藻類に属する海
藻中に含まれ、水性溶媒で抽出される粘質多糖（粘質酸
性多糖）を、前記紅藻粘質多糖分解酵素中III と、Ｉお
よびIIの少なくとも１つとを含有する酵素源で、加水分
解して得られる低粘性酸性糖中の、分子量 100,000より
大、好ましくは45,000より大、または 3,000から 100,0
00もしくは45,000までの任意の値より大、例えば7,500
より大の画分、または構成単糖の数が 500より大、好ま
しくは 200より大、または14から 500もしくは 200まで
の任意の値より大、例えば36より大となるような分子量
の画分を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等に
よって除去し、得られる比較的低分子量の画分を、物質
をイオン性の違いで分離する方法、例えば陰イオン交換
クロマトグラフィー、電気泳動、電気浸透膜処理等に付
すか、または分画分子量のさらに小さい限外濾過膜を用
いる限外濾過またはさらに小さい分子量の多糖類の分画
に適したゲル粒子を用いるゲル濾過に付して、１分子中
の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を分取
することにより得ることができる。
の、すなわち還元末端から２番目の構成単糖がＬ−ガラ
クトース−６−硫酸である酸性糖は、紅藻類に属する海
藻中に含まれ、水性溶媒で抽出される粘質多糖（粘質酸
性多糖）を、前記紅藻粘質多糖分解酵素中III と、Ｉお
よびIIの少なくとも１つとを含有する酵素源で、加水分
解して得られる低粘性酸性糖中の、分子量 100,000より
大、好ましくは45,000より大、または 3,000から 100,0
00もしくは45,000までの任意の値より大、例えば7,500
より大の画分、または構成単糖の数が 500より大、好ま
しくは 200より大、または14から 500もしくは 200まで
の任意の値より大、例えば36より大となるような分子量
の画分を溶媒沈澱、塩析、限外濾過またはゲル濾過等に
よって除去し、得られる比較的低分子量の画分を、物質
をイオン性の違いで分離する方法、例えば陰イオン交換
クロマトグラフィー、電気泳動、電気浸透膜処理等に付
すか、または分画分子量のさらに小さい限外濾過膜を用
いる限外濾過またはさらに小さい分子量の多糖類の分画
に適したゲル粒子を用いるゲル濾過に付して、１分子中
の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を分取
することにより得ることができる。
【００５２】紅藻粘質多糖分解酵素III と、ＩおよびII
の少なくとも１つを含有する酵素源としては紅藻粘質多
糖分解酵素III と、ＩおよびIIの少なくとも１つを含有
する酵素混合物、これらと目的物の取得に悪影響を及ぼ
さない他の酵素等を含有する粗酵素、酵素III と酵素Ｉ
およびIIの少なくとも１つとを含有する、生産菌の培養
液もしくは培養濾液、または酵素III と酵素Ｉおよび／
またはIIの少なくとも１つとを生産する菌の懸濁液等が
挙げられる。前出の特願平６−５７４６９号の明細書に
記載されたシュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ
Ｐ−13767)の培養濾液には、紅藻粘質多糖分解酵素
Ｉ、IIおよびIII のすべてが存在することが本発明者ら
によって見出された。該培養液からの紅藻粘質多糖分解
酵素III （またはＩもしくはII）の単離は該酵素の性質
を利用して常法により行うことができる。酵素処理され
る酸性多糖に対する酵素液の割合は酵素処理開始時の酵
素の合計量が0.01〜10,000u/g 好ましくは0.1 〜1000u/
g であって、III と、ＩおよびIIの少なくとも１つとの
使用割合が前者の酵素活性１に対して後者の酵素活性が
１〜10,000、好ましくは10〜50であるようにすればよ
い、ここで１ｕは紅藻粘質多糖分解酵素Ｉおよび／また
はIIにおける１ｕと同義である。
の少なくとも１つを含有する酵素源としては紅藻粘質多
糖分解酵素III と、ＩおよびIIの少なくとも１つを含有
する酵素混合物、これらと目的物の取得に悪影響を及ぼ
さない他の酵素等を含有する粗酵素、酵素III と酵素Ｉ
およびIIの少なくとも１つとを含有する、生産菌の培養
液もしくは培養濾液、または酵素III と酵素Ｉおよび／
またはIIの少なくとも１つとを生産する菌の懸濁液等が
挙げられる。前出の特願平６−５７４６９号の明細書に
記載されたシュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ
Ｐ−13767)の培養濾液には、紅藻粘質多糖分解酵素
Ｉ、IIおよびIII のすべてが存在することが本発明者ら
によって見出された。該培養液からの紅藻粘質多糖分解
酵素III （またはＩもしくはII）の単離は該酵素の性質
を利用して常法により行うことができる。酵素処理され
る酸性多糖に対する酵素液の割合は酵素処理開始時の酵
素の合計量が0.01〜10,000u/g 好ましくは0.1 〜1000u/
g であって、III と、ＩおよびIIの少なくとも１つとの
使用割合が前者の酵素活性１に対して後者の酵素活性が
１〜10,000、好ましくは10〜50であるようにすればよ
い、ここで１ｕは紅藻粘質多糖分解酵素Ｉおよび／また
はIIにおける１ｕと同義である。
【００５３】物質をイオン性の違いにより分離する方法
がイオン交換クロマトグラフィーである場合には、中性
糖混合物、１分子中の硫酸基数が１の酸性糖の混合物、
１分子中の硫酸基数がそれぞれ２である酸性糖混合物、
１分子中の硫酸基数がそれぞれ３である酸性糖混合物、
……の順に溶出されるので、必要画分を分取すればよ
い。この場合の塩濃度は、酸性糖混合物が１分子中の硫
酸基数がそれぞれ２である酸性糖混合物である場合には
0.2 〜0.5 Ｍ程度が適当であり、硫酸基数が３以上のも
のについては２の場合を参考に塩濃度を適宜上げること
により分取し得る。製法２における他の操作は、酵素処
理の前操作も含め、製法１におけると同様でよい。
がイオン交換クロマトグラフィーである場合には、中性
糖混合物、１分子中の硫酸基数が１の酸性糖の混合物、
１分子中の硫酸基数がそれぞれ２である酸性糖混合物、
１分子中の硫酸基数がそれぞれ３である酸性糖混合物、
……の順に溶出されるので、必要画分を分取すればよ
い。この場合の塩濃度は、酸性糖混合物が１分子中の硫
酸基数がそれぞれ２である酸性糖混合物である場合には
0.2 〜0.5 Ｍ程度が適当であり、硫酸基数が３以上のも
のについては２の場合を参考に塩濃度を適宜上げること
により分取し得る。製法２における他の操作は、酵素処
理の前操作も含め、製法１におけると同様でよい。
【００５４】上記製法１および２のいずれにおいても、
工程に入る前、工程のいずれかの段階、または工程終了
後に除蛋白、脱塩等の精製操作を行うことができる。除
蛋白はトリクロロ酢酸等により蛋白質、ポリペプチド等
を沈澱させる等の手段により行うことができる。脱塩は
透析、限外濾過（脱塩のための限外濾過）、逆浸透膜処
理またはイオン交換処理（脱塩のためのイオン交換処
理）により行うのが適当である。
工程に入る前、工程のいずれかの段階、または工程終了
後に除蛋白、脱塩等の精製操作を行うことができる。除
蛋白はトリクロロ酢酸等により蛋白質、ポリペプチド等
を沈澱させる等の手段により行うことができる。脱塩は
透析、限外濾過（脱塩のための限外濾過）、逆浸透膜処
理またはイオン交換処理（脱塩のためのイオン交換処
理）により行うのが適当である。
【００５５】上記製法１および２のいずれかまたはさら
にその後の処理によって得られる酸性糖混合物含有液
は、通常、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱風乾燥等から適宜選
ばれる方法で乾燥して酸性糖混合物を得る。前記製法
（１）及び（２）で得られる酸性糖混合物が前記（１）
〜（５）に示したような構造を有することは、後述する
ごとく、紅藻粘質多糖の構造についての既知の知見、酵
素の特異性、成分分析値、薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）で求めた分子の重合度等から推定される。これら
の酸性糖混合物は例えばイオン交換カラムクロマトグラ
フィーで再精製することによって個々の酸性糖に単離す
ることができる。
にその後の処理によって得られる酸性糖混合物含有液
は、通常、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱風乾燥等から適宜選
ばれる方法で乾燥して酸性糖混合物を得る。前記製法
（１）及び（２）で得られる酸性糖混合物が前記（１）
〜（５）に示したような構造を有することは、後述する
ごとく、紅藻粘質多糖の構造についての既知の知見、酵
素の特異性、成分分析値、薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）で求めた分子の重合度等から推定される。これら
の酸性糖混合物は例えばイオン交換カラムクロマトグラ
フィーで再精製することによって個々の酸性糖に単離す
ることができる。
【００５６】本発明の酸性糖（混合物）は免疫賦活活性
を有する。免疫賦活活性としては、例えば、マクロファ
ージ活性化作用の他に、免疫担当細胞が作る腫瘍壊死因
子の誘導能を有する。この後者の活性は、これらの酸性
糖（混合物）が免疫系の活性化を介しての抗腫瘍活性を
有することを示唆するものである。従って以下に述べる
本発明の免疫賦活剤は抗腫瘍剤としての使用を包含する
ものである。前記製法１および２のいずれかまたはその
後の精製操作を経て得られる酸性糖混合物、または個々
の酸性糖を含有する溶液は、そのまま免疫賦活剤として
用いることもできるが、通常、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱
風乾燥等から適宜選ばれる方法で乾燥し、それ自体とし
てまたは製薬上許容される種々の担体と混合した剤型で
免疫賦活剤として用いる。
を有する。免疫賦活活性としては、例えば、マクロファ
ージ活性化作用の他に、免疫担当細胞が作る腫瘍壊死因
子の誘導能を有する。この後者の活性は、これらの酸性
糖（混合物）が免疫系の活性化を介しての抗腫瘍活性を
有することを示唆するものである。従って以下に述べる
本発明の免疫賦活剤は抗腫瘍剤としての使用を包含する
ものである。前記製法１および２のいずれかまたはその
後の精製操作を経て得られる酸性糖混合物、または個々
の酸性糖を含有する溶液は、そのまま免疫賦活剤として
用いることもできるが、通常、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱
風乾燥等から適宜選ばれる方法で乾燥し、それ自体とし
てまたは製薬上許容される種々の担体と混合した剤型で
免疫賦活剤として用いる。
【００５７】経口投与の場合には、それに適用される錠
剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などは、通常それらの組
成物中に製剤上一般に使用される結合剤、滑沢剤、賦形
剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有する。また経
口用液体剤として用いる場合は、内用水剤、振盪合剤、
懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であっても良く、ま
た使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であって
もよい。さらに、このような液体製剤は通常用いられる
添加剤、保存剤のいずれを含有していても良い。 注射
用の場合には、その組成物は通常安定剤、緩衝剤、保存
剤、等張化剤などの添加剤を含有し、通常単位投与量ア
ンプルまたは多投与量容器の形態で提供される。なお、
上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ビ
ヒクル中の乳液のような形態であっても良く、一方活性
成分は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質不
含の滅菌した水で再溶解させる粉末であっても良い。
剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などは、通常それらの組
成物中に製剤上一般に使用される結合剤、滑沢剤、賦形
剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有する。また経
口用液体剤として用いる場合は、内用水剤、振盪合剤、
懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であっても良く、ま
た使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であって
もよい。さらに、このような液体製剤は通常用いられる
添加剤、保存剤のいずれを含有していても良い。 注射
用の場合には、その組成物は通常安定剤、緩衝剤、保存
剤、等張化剤などの添加剤を含有し、通常単位投与量ア
ンプルまたは多投与量容器の形態で提供される。なお、
上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ビ
ヒクル中の乳液のような形態であっても良く、一方活性
成分は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質不
含の滅菌した水で再溶解させる粉末であっても良い。
【００５８】本発明の免疫賦活剤はヒトまたは動物、例
えば免疫力が低下している人、特に高齢や疾病等により
免疫機能が低下している人に経口または非経口的に投与
される。経口投与は舌下投与を包含する。非経口投与は
注射たとえば皮下、筋肉、静脈注射、点滴を含む。本発
明の免疫賦活剤中の有効成分固形物の量は種々変えるこ
とができるが、通常５〜100%(w/w）、特に10〜60%(w/w)
が適当である。本発明の免疫賦活剤の投与量はヒトや動
物により、また年齢、個人差、病状などに影響されるの
で、場合によって下記範囲外の量を投与する場合も生ず
るが、一般にヒトを対象とする場合の経口投与量は活性
成分固形物量として大人１日体重１kg当たり0.5 〜1,00
0mg 、好ましくは１〜300mg であり、１回または２もし
くは３回に分けて投与する。
えば免疫力が低下している人、特に高齢や疾病等により
免疫機能が低下している人に経口または非経口的に投与
される。経口投与は舌下投与を包含する。非経口投与は
注射たとえば皮下、筋肉、静脈注射、点滴を含む。本発
明の免疫賦活剤中の有効成分固形物の量は種々変えるこ
とができるが、通常５〜100%(w/w）、特に10〜60%(w/w)
が適当である。本発明の免疫賦活剤の投与量はヒトや動
物により、また年齢、個人差、病状などに影響されるの
で、場合によって下記範囲外の量を投与する場合も生ず
るが、一般にヒトを対象とする場合の経口投与量は活性
成分固形物量として大人１日体重１kg当たり0.5 〜1,00
0mg 、好ましくは１〜300mg であり、１回または２もし
くは３回に分けて投与する。
【００５９】なお本免疫賦活剤活性成分（具体的には各
実施例で得られる乾燥物）の急性毒性はいずれもＬＤ50
（ＩＣＲ系マウス、経口投与）＞3g/kg であった。ま
た、本免疫賦活剤活性成分は多量に摂取しても生体に悪
影響を与えない利点を有することから、そのまま、また
は種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有せ
しめて免疫賦活作用の機能をもたせた機能性食品、健康
食品として食してもよい。すなわち、例えば各種ビタミ
ン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば栄養ドリ
ンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食
品、さらには粉末状としてそのままあるいは各種食品へ
添加して用いることもできる。かかる機能性食品、健康
食品としての本免疫賦活剤中の有効成分の含有量、摂取
量はそれぞれ上記製薬における含有量、投与量と同様で
よい。
実施例で得られる乾燥物）の急性毒性はいずれもＬＤ50
（ＩＣＲ系マウス、経口投与）＞3g/kg であった。ま
た、本免疫賦活剤活性成分は多量に摂取しても生体に悪
影響を与えない利点を有することから、そのまま、また
は種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有せ
しめて免疫賦活作用の機能をもたせた機能性食品、健康
食品として食してもよい。すなわち、例えば各種ビタミ
ン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば栄養ドリ
ンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食
品、さらには粉末状としてそのままあるいは各種食品へ
添加して用いることもできる。かかる機能性食品、健康
食品としての本免疫賦活剤中の有効成分の含有量、摂取
量はそれぞれ上記製薬における含有量、投与量と同様で
よい。
【００６０】
参考例１粘質酸性多糖の水抽出 オゴノリ原藻20ｇを十分量の水で洗浄後、500mＬの蒸留
水を加え40℃で30分処理して温水洗浄を行った。洗液を
完全に除去した後、エタノール500mＬを加え45℃で15分
処理し同様に洗浄を行った。次に蒸留水２Ｌを加え沸騰
水浴中で３時間、適宜攪拌しながら抽出を行い、得られ
た抽出液を合わせヌッチェで吸引濾過して固形成分を完
全に除去した。得られた濾液に４倍量のエタノールを加
え、沈澱を回収し、凍結乾燥により乾燥物（粘質酸性多
糖）2.6gを得た。
水を加え40℃で30分処理して温水洗浄を行った。洗液を
完全に除去した後、エタノール500mＬを加え45℃で15分
処理し同様に洗浄を行った。次に蒸留水２Ｌを加え沸騰
水浴中で３時間、適宜攪拌しながら抽出を行い、得られ
た抽出液を合わせヌッチェで吸引濾過して固形成分を完
全に除去した。得られた濾液に４倍量のエタノールを加
え、沈澱を回収し、凍結乾燥により乾燥物（粘質酸性多
糖）2.6gを得た。
【００６１】参考例２紅藻粘質多糖分解酵素の調製 シュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ Ｐ−1376
7)を寒天0.1g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL 、Ｋ2 ＨＰＯ
4 0.1g/dL、ＮａＣｌ 0.1g/dL およびＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ 0.05g/dLよりなるpH７．０の前培養培地におい
て培養せしめた。ついで、この得られた前培養液３００
mLを、オゴノリ粉末1.5g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL 、
酵母エキス0.1g/dL 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ O.25g/d
L、ＮａＣｌ 0.1g/dL 、ＣａＣｌ2 0.01g/dL、消泡
剤としてのアデカノールＬＧ１２６（旭電化工業株式会
社） 0.03g/dL の組成を有するpH 6.0の培地１５Ｌを入
れた３０Ｌのジャーファーメンター（菌培養基）に植菌
し、２８℃の温度で、３日間培養した。培養は、通気量
０．５ＶＶＭ（空塔速度）、攪拌速度２００ｒｐｍで行
った。
7)を寒天0.1g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL 、Ｋ2 ＨＰＯ
4 0.1g/dL、ＮａＣｌ 0.1g/dL およびＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ 0.05g/dLよりなるpH７．０の前培養培地におい
て培養せしめた。ついで、この得られた前培養液３００
mLを、オゴノリ粉末1.5g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL 、
酵母エキス0.1g/dL 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ O.25g/d
L、ＮａＣｌ 0.1g/dL 、ＣａＣｌ2 0.01g/dL、消泡
剤としてのアデカノールＬＧ１２６（旭電化工業株式会
社） 0.03g/dL の組成を有するpH 6.0の培地１５Ｌを入
れた３０Ｌのジャーファーメンター（菌培養基）に植菌
し、２８℃の温度で、３日間培養した。培養は、通気量
０．５ＶＶＭ（空塔速度）、攪拌速度２００ｒｐｍで行
った。
【００６２】培養終了後、菌体を濾過により取り除き、
培養濾液１２．７Ｌを得た。この培養濾液の酵素活性は
０．５ｕ／ｍＬであった。また、かかる培養濾液を限外
濾過濃縮装置：ザルトコンミニ（ドイツ国ザルトリウス
社）で約１５倍濃縮し、８６０ｍＬの濃縮液（活性：
７．７ｕ／ｍＬ）を得、さらにこの濃縮液をアガロース
ゲル：セファロースＣＬ−６Ｂ（スウェーデン国ファル
マシア社）の５００ｍＬのカラムに吸着させ、７５０ｍ
Ｌ／ｈｒの流速で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、pH
６．０（４℃）で洗浄した後、さらに１２５０ｍＬ／ｈ
ｒの流速で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にて、
pH８．０（３５℃）で溶出せしめて、活性区分を取得し
た。この得られた区分をゲル濾過用樹脂トヨパールＨＷ
６５Ｓ（東ソー株式会社）５００ｍＬのカラムに吸着さ
せ、１，０００ｍＬ／ｈｒの流速にて、４ＭのＮａＣｌ
／２０ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液（pH６．０）で洗浄した
後、１５００ｍＬ／ｈｒの流速にて、２ＭのＮａＣｌ／
２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で溶出し
て、ほぼ純品に近い精製酵素活性区分（４６．７ｕ／ｍ
ｇ蛋白質）２６０ｍＬを得た。この活性収率は、約２
７．６％であった。
培養濾液１２．７Ｌを得た。この培養濾液の酵素活性は
０．５ｕ／ｍＬであった。また、かかる培養濾液を限外
濾過濃縮装置：ザルトコンミニ（ドイツ国ザルトリウス
社）で約１５倍濃縮し、８６０ｍＬの濃縮液（活性：
７．７ｕ／ｍＬ）を得、さらにこの濃縮液をアガロース
ゲル：セファロースＣＬ−６Ｂ（スウェーデン国ファル
マシア社）の５００ｍＬのカラムに吸着させ、７５０ｍ
Ｌ／ｈｒの流速で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、pH
６．０（４℃）で洗浄した後、さらに１２５０ｍＬ／ｈ
ｒの流速で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にて、
pH８．０（３５℃）で溶出せしめて、活性区分を取得し
た。この得られた区分をゲル濾過用樹脂トヨパールＨＷ
６５Ｓ（東ソー株式会社）５００ｍＬのカラムに吸着さ
せ、１，０００ｍＬ／ｈｒの流速にて、４ＭのＮａＣｌ
／２０ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液（pH６．０）で洗浄した
後、１５００ｍＬ／ｈｒの流速にて、２ＭのＮａＣｌ／
２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で溶出し
て、ほぼ純品に近い精製酵素活性区分（４６．７ｕ／ｍ
ｇ蛋白質）２６０ｍＬを得た。この活性収率は、約２
７．６％であった。
【００６３】参考例３紅藻粘質多糖分解酵素による粘質酸性多糖の加水分解 参考例１で得られた乾燥物（粘質酸性多糖）１．５ｇを
１５０ｍＬ蒸留水に溶解し、参考例２で得られた紅藻粘
質多糖分解酵素３ｕを３７℃で４８時間作用させて加水
分解し、低粘性酸性糖含有水溶液を得、これを凍結乾燥
して乾燥物（試料Ａ 1.48 ｇを得た。
１５０ｍＬ蒸留水に溶解し、参考例２で得られた紅藻粘
質多糖分解酵素３ｕを３７℃で４８時間作用させて加水
分解し、低粘性酸性糖含有水溶液を得、これを凍結乾燥
して乾燥物（試料Ａ 1.48 ｇを得た。
【００６４】実施例１低粘性酸性糖の溶媒沈澱および陰イオン交換樹脂クロマ
トグラフィーによる分画による本発明酸性糖の製造 参考例３で得られた低粘性酸性糖含有水溶液を４分の１
に濃縮後、４倍量のエタノールを加え難溶解性の高分子
物質を沈澱させ、遠心分離（5000ｒｐｍ）により除去し
た。上澄液を凍結乾燥し、乾燥物を得た。この凍結乾燥
物を少量の蒸留水に溶解し、強陰イオン交換樹脂ダイヤ
イオンＨＰＡ−７５（三菱化成株式会社）を充填したカ
ラム（2.3 φ×20cm）に乗せ、水、0.02Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび0.50Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（０〜80mL：Ｈ2 Ｏ，80〜480mL:0.02MNaCl,480 〜880m
L:0.02〜0.50MNaCl)で流速40ｍL/hrで溶出を行い、溶出
液は８ｍＬずつ分取した。各画分について含有糖をフェ
ノール硫酸法で比色定量し（410nm)、画分No.3〜10、画
分No.30 〜40および画分No.75 〜85をそれぞれ凍結乾燥
して、乾燥物として試料Ｂ（中性糖）0.840 ｇ、試料Ｃ
（酸性糖）0.170 ｇおよび試料Ｄ（本発明の酸性糖）0.
115 ｇを得た。
トグラフィーによる分画による本発明酸性糖の製造 参考例３で得られた低粘性酸性糖含有水溶液を４分の１
に濃縮後、４倍量のエタノールを加え難溶解性の高分子
物質を沈澱させ、遠心分離（5000ｒｐｍ）により除去し
た。上澄液を凍結乾燥し、乾燥物を得た。この凍結乾燥
物を少量の蒸留水に溶解し、強陰イオン交換樹脂ダイヤ
イオンＨＰＡ−７５（三菱化成株式会社）を充填したカ
ラム（2.3 φ×20cm）に乗せ、水、0.02Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび0.50Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（０〜80mL：Ｈ2 Ｏ，80〜480mL:0.02MNaCl,480 〜880m
L:0.02〜0.50MNaCl)で流速40ｍL/hrで溶出を行い、溶出
液は８ｍＬずつ分取した。各画分について含有糖をフェ
ノール硫酸法で比色定量し（410nm)、画分No.3〜10、画
分No.30 〜40および画分No.75 〜85をそれぞれ凍結乾燥
して、乾燥物として試料Ｂ（中性糖）0.840 ｇ、試料Ｃ
（酸性糖）0.170 ｇおよび試料Ｄ（本発明の酸性糖）0.
115 ｇを得た。
【００６５】参考例４シュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ Ｐ−1376
7)の培養濾液（酵素液）の調製 シュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ Ｐ−1376
7)を寒天0.1g/dL ポリペプトン0.1g/dL 、Ｋ2 ＨＰＯ4
0.1g/dL 、ＮａＣｌ 0.1g/dL およびＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ 0.05g/dLよりなるpH７．０の前培養培地におい
て培養せしめた。ついで、この得られた前培養液３００
ｍＬを、オゴノリ粉末1.5g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL
、酵母エキス0.1g/dL 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.25g
/dL、ＮａＣｌ 0.1g/dL 、ＣａＣｌ2 0.01g/dLおよ
び消泡剤としてのアデカノールＬＧ１２６（旭電化工業
株式会社）0.03g/dLの組成を有するpH6.0 の培地１５Ｌ
を入れた３０Ｌのジャーファーメンターに植菌し、２８
℃の温度で、３日間培養した。培養は、通気量０．５Ｖ
ＶＭ、攪拌速度２００ｒｐｍで行った。培養終了後、菌
体を濾過により取り除き、培養濾液１２．７Ｌを得た。
この培養濾液の酵素活性は、０．５ｕ／ｍＬであった。
7)の培養濾液（酵素液）の調製 シュードモナス・エスピーＯ−148(ＦＥＲＭ Ｐ−1376
7)を寒天0.1g/dL ポリペプトン0.1g/dL 、Ｋ2 ＨＰＯ4
0.1g/dL 、ＮａＣｌ 0.1g/dL およびＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ 0.05g/dLよりなるpH７．０の前培養培地におい
て培養せしめた。ついで、この得られた前培養液３００
ｍＬを、オゴノリ粉末1.5g/dL 、ポリペプトン0.1g/dL
、酵母エキス0.1g/dL 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.25g
/dL、ＮａＣｌ 0.1g/dL 、ＣａＣｌ2 0.01g/dLおよ
び消泡剤としてのアデカノールＬＧ１２６（旭電化工業
株式会社）0.03g/dLの組成を有するpH6.0 の培地１５Ｌ
を入れた３０Ｌのジャーファーメンターに植菌し、２８
℃の温度で、３日間培養した。培養は、通気量０．５Ｖ
ＶＭ、攪拌速度２００ｒｐｍで行った。培養終了後、菌
体を濾過により取り除き、培養濾液１２．７Ｌを得た。
この培養濾液の酵素活性は、０．５ｕ／ｍＬであった。
【００６６】実施例２低粘性酸性糖の溶媒沈澱および陰イオン交換樹脂クロマ
トグラフィーによる分画による本発明酸性糖の製造 参考例１で得られた乾燥物（粘質酸性多糖）1.5 ｇを蒸
留水 150ｍＬに溶解し、参考例４で得られた培養濾液濃
縮液を２ｕ／ｇになるように加え、３７℃で４８時間作
用させて加水分解し、低粘性酸性糖含有水溶液を得た。
この水溶液を４分の１に濃縮後、４倍量のエタノールを
加え難溶解性の高分子物質を沈澱させ、遠心分離(5,000
ｒｐｍ）により除去した。上澄液を凍結乾燥し、乾燥物
を得た。この凍結乾燥物を少量の蒸留水に溶解し、強陰
イオン交換樹脂ダイヤイオンＨＰＡ−７５を充填したカ
ラム（2.3 φ×20cm）に乗せ、水、０．０２Ｍ塩化ナト
リウムおよび０．５０Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジ
エント（０〜80ｍＬ：Ｈ2Ｏ，80〜880 ｍＬ：0.02M Ｎ
ａＣｌ，880 〜1680ｍＬ：0.02〜0.50M ＮａＣｌ）で流
速40ｍＬ／ｈｒで溶出を行い、溶出液は８ｍＬずつ分取
した。各画分について含有量をフェノール硫酸法で比色
定量し（410nm)、それぞれ別個の成分を含む５つの画
分、中性糖画分、酸性糖画分１、酸性糖画分２、酸性糖
画分３および酸性糖画分４を溶出順に得、これら５つの
うち最後の溶出画分４（画分No.120〜130)を凍結乾燥し
て乾燥物（試料Ｅ：本発明の酸性糖）45mgを得た。
トグラフィーによる分画による本発明酸性糖の製造 参考例１で得られた乾燥物（粘質酸性多糖）1.5 ｇを蒸
留水 150ｍＬに溶解し、参考例４で得られた培養濾液濃
縮液を２ｕ／ｇになるように加え、３７℃で４８時間作
用させて加水分解し、低粘性酸性糖含有水溶液を得た。
この水溶液を４分の１に濃縮後、４倍量のエタノールを
加え難溶解性の高分子物質を沈澱させ、遠心分離(5,000
ｒｐｍ）により除去した。上澄液を凍結乾燥し、乾燥物
を得た。この凍結乾燥物を少量の蒸留水に溶解し、強陰
イオン交換樹脂ダイヤイオンＨＰＡ−７５を充填したカ
ラム（2.3 φ×20cm）に乗せ、水、０．０２Ｍ塩化ナト
リウムおよび０．５０Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジ
エント（０〜80ｍＬ：Ｈ2Ｏ，80〜880 ｍＬ：0.02M Ｎ
ａＣｌ，880 〜1680ｍＬ：0.02〜0.50M ＮａＣｌ）で流
速40ｍＬ／ｈｒで溶出を行い、溶出液は８ｍＬずつ分取
した。各画分について含有量をフェノール硫酸法で比色
定量し（410nm)、それぞれ別個の成分を含む５つの画
分、中性糖画分、酸性糖画分１、酸性糖画分２、酸性糖
画分３および酸性糖画分４を溶出順に得、これら５つの
うち最後の溶出画分４（画分No.120〜130)を凍結乾燥し
て乾燥物（試料Ｅ：本発明の酸性糖）45mgを得た。
【００６７】実施例３低粘性酸性糖の限外濾過による分画による酸性糖の製造 参考例１で得られた乾燥物（粘質酸性多糖）1.5 ｇを蒸
留水150 ｍＬに溶解し、シュードモナス属由来のβ−ア
ガラーゼ（シグマ社）1,000 ｕを加えて30℃で48時間反
応させて加水分解し、反応終了後沸騰水浴中に10分間保
持して酵素を失活させ、低粘性酸性糖含有水溶液を得
た。この水溶液を凍結乾燥して乾燥物を得た。この0.5g
を10mlの蒸留水に溶解し、モルカットＬ（ＬＴＫ24、公
称分画分子量30,000、ミリポア製) ２ヶに分注して透過
液を得た。さらに得られた透過液をモルカットＬ（ＬＣ
Ｃ24、公称分画分子量5,000 、ミリポア製）２ヶで処理
し、５倍に濃縮した後さらに５倍量の蒸留水を加えて同
様に濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥物
（試料Ｆ：本発明の酸性糖）32ｇを得た。試料Ｆの分子
量を測定したところ、4,000 〜45,000に分布していた。
留水150 ｍＬに溶解し、シュードモナス属由来のβ−ア
ガラーゼ（シグマ社）1,000 ｕを加えて30℃で48時間反
応させて加水分解し、反応終了後沸騰水浴中に10分間保
持して酵素を失活させ、低粘性酸性糖含有水溶液を得
た。この水溶液を凍結乾燥して乾燥物を得た。この0.5g
を10mlの蒸留水に溶解し、モルカットＬ（ＬＴＫ24、公
称分画分子量30,000、ミリポア製) ２ヶに分注して透過
液を得た。さらに得られた透過液をモルカットＬ（ＬＣ
Ｃ24、公称分画分子量5,000 、ミリポア製）２ヶで処理
し、５倍に濃縮した後さらに５倍量の蒸留水を加えて同
様に濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥物
（試料Ｆ：本発明の酸性糖）32ｇを得た。試料Ｆの分子
量を測定したところ、4,000 〜45,000に分布していた。
【００６８】実施例４得られた試料の各種分析値および構造の推定 参考例３および実施例１および２で得られた乾燥物（試
料Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）について各種分析を行った結果
を表１に示す。分析項目中３，６−アンヒドロガラクト
ースはネオアガロビオースをスタンダードとしてW.Yaph
e らの方法〔Yaphe W. et al., Anal. Biochem. 13，14
3-148(1965）〕で測定し、全糖値に対する重量％として
算出した。ここで全糖値はフェノール硫酸法〔Dubois
M. et al., Anal. Chem.,28, 350-356(1956) 〕により
ガラクタンとして算出し、３，６−アンヒドロガラクト
ースの含量を補正して求めた。硫酸基含量はIN HCl、10
5 ℃で８時間加水分解後、遊離した硫酸イオンをイオン
クロマトグラフィーシステムで測定し、硫酸エステル
（−ＳＯ3 Ｈ）に換算し、全糖値に対する重量％として
算出した。また重合度はアルカリ処理により硫酸基を脱
離した後に薄層クロマトグラフィーによって求めた。
料Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）について各種分析を行った結果
を表１に示す。分析項目中３，６−アンヒドロガラクト
ースはネオアガロビオースをスタンダードとしてW.Yaph
e らの方法〔Yaphe W. et al., Anal. Biochem. 13，14
3-148(1965）〕で測定し、全糖値に対する重量％として
算出した。ここで全糖値はフェノール硫酸法〔Dubois
M. et al., Anal. Chem.,28, 350-356(1956) 〕により
ガラクタンとして算出し、３，６−アンヒドロガラクト
ースの含量を補正して求めた。硫酸基含量はIN HCl、10
5 ℃で８時間加水分解後、遊離した硫酸イオンをイオン
クロマトグラフィーシステムで測定し、硫酸エステル
（−ＳＯ3 Ｈ）に換算し、全糖値に対する重量％として
算出した。また重合度はアルカリ処理により硫酸基を脱
離した後に薄層クロマトグラフィーによって求めた。
【００６９】
【表１】
【００７０】紅藻粘質多糖類の化学構造についての既知
の知見と表１の結果から、分子の基本骨格と重合度、１
分子中に結合している硫酸エステル基数が明かとなり、
さらにその硫酸エステル基の結合位置は、用いる酵素の
基質特異性より決定される。その結果、試料Ｂ、Ｃ、Ｄ
およびＥは以下の構造の糖を主成分とすると推定され
る。
の知見と表１の結果から、分子の基本骨格と重合度、１
分子中に結合している硫酸エステル基数が明かとなり、
さらにその硫酸エステル基の結合位置は、用いる酵素の
基質特異性より決定される。その結果、試料Ｂ、Ｃ、Ｄ
およびＥは以下の構造の糖を主成分とすると推定され
る。
【００７１】
【化14】
【００７２】実施例５試料Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＦの免疫賦活活性の測定 免疫賦活活性の指標としてマクロファージ活性化作用を
調べた。常法「マクロファージの機能と機能測定法」菜
根出版、72頁(1985)によりプロテオースペプトンで誘導
したマウスの腹腔細胞を採取し、４×105/ウェルとなる
よう96穴プレートに分注し、１時間培養してマクロファ
ージを付着させた。浮遊細胞を除去した後試料を加え10
g/dL牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地中で72時間培養し、培養上清
中の残存グルコースおよび分泌された亜硝酸イオン濃度
を測定し、マクロファージ活性化の指標とした。すなわ
ち、グルコース消費量と亜硝酸イオン産生量は、いずれ
も値の大きい程マクロファージ活性化作用が大きいこと
を示す。対照として既知のマクロファージ活性化物質で
あるコンブ由来のラミナリンを用いた。結果を表２に示
した。
調べた。常法「マクロファージの機能と機能測定法」菜
根出版、72頁(1985)によりプロテオースペプトンで誘導
したマウスの腹腔細胞を採取し、４×105/ウェルとなる
よう96穴プレートに分注し、１時間培養してマクロファ
ージを付着させた。浮遊細胞を除去した後試料を加え10
g/dL牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地中で72時間培養し、培養上清
中の残存グルコースおよび分泌された亜硝酸イオン濃度
を測定し、マクロファージ活性化の指標とした。すなわ
ち、グルコース消費量と亜硝酸イオン産生量は、いずれ
も値の大きい程マクロファージ活性化作用が大きいこと
を示す。対照として既知のマクロファージ活性化物質で
あるコンブ由来のラミナリンを用いた。結果を表２に示
した。
【００７３】
【表２】
【００７４】表２から明らかなように、オゴノリ由来の
酸性多糖の酵素処理物をエタノール沈澱および陰イオン
交換樹脂で処理するか、または酵素処理物をゲル濾過で
処理することにより、マクロファージのグルコース消費
量および亜硝酸産生能とも著しく増大した。このことは
これらの処理により免疫賦活活性が大巾に増強されるこ
とを如実に示すものである。 実施例６試料Ａ、Ｃ、ＤおよびＦの抗腫瘍免疫賦活活性の測定 抗腫瘍免疫賦活活性の指標として、マウスの血中ＴＮＦ
（腫瘍壊死因子）誘導能を測定した。マウス（Ｃ３Ｈ／
ＨｅＮ、７週齢、雄性）に、濾過滅菌したＰＢＳ（生理
的リン酸緩衝液）に溶解した試料を静脈投与し、３時間
後にさらにＯＫ−432 ( 中外製薬「ピシバニール」１Ｋ
Ｅ／匹をＴＮＦの引き金剤として投与し、その２時間後
に採血して血清を分離した。血清中のＴＮＦ濃度はマウ
スＴＮＦα用酵素免疫測定キットFactor-Test m ＴＮＦ
−α（ゼンザイム）を用いて測定した。結果を図１に示
す。図１から明らかなごとく、試料Ｄ、Ｆは試料Ａ、Ｃ
に比べ飛躍的なＴＮＦ誘導能を示した。
酸性多糖の酵素処理物をエタノール沈澱および陰イオン
交換樹脂で処理するか、または酵素処理物をゲル濾過で
処理することにより、マクロファージのグルコース消費
量および亜硝酸産生能とも著しく増大した。このことは
これらの処理により免疫賦活活性が大巾に増強されるこ
とを如実に示すものである。 実施例６試料Ａ、Ｃ、ＤおよびＦの抗腫瘍免疫賦活活性の測定 抗腫瘍免疫賦活活性の指標として、マウスの血中ＴＮＦ
（腫瘍壊死因子）誘導能を測定した。マウス（Ｃ３Ｈ／
ＨｅＮ、７週齢、雄性）に、濾過滅菌したＰＢＳ（生理
的リン酸緩衝液）に溶解した試料を静脈投与し、３時間
後にさらにＯＫ−432 ( 中外製薬「ピシバニール」１Ｋ
Ｅ／匹をＴＮＦの引き金剤として投与し、その２時間後
に採血して血清を分離した。血清中のＴＮＦ濃度はマウ
スＴＮＦα用酵素免疫測定キットFactor-Test m ＴＮＦ
−α（ゼンザイム）を用いて測定した。結果を図１に示
す。図１から明らかなごとく、試料Ｄ、Ｆは試料Ａ、Ｃ
に比べ飛躍的なＴＮＦ誘導能を示した。
【００７５】 実施例７ 注射剤 試料Ｄ ６００ｇ ポリエキシエチレン硬化ヒマシ油 ５００ｇ 局方蒸留水 １０リットル 上記成分を用い常法により注射剤を調製し、１アンプル
に５ｍＬずつ充填する。 実施例８ カプセル剤 試料Ｆ ２００ｇ コーンスターチ １５０ｇ タルク ８０ｇ ステアリン酸マグネシウム ３０ｇ 上記成分を十分混和し、60メッシュの金網を通過させて
粒度を調整した後、1,000 個のゼラチンカプセルに充填
する。
に５ｍＬずつ充填する。 実施例８ カプセル剤 試料Ｆ ２００ｇ コーンスターチ １５０ｇ タルク ８０ｇ ステアリン酸マグネシウム ３０ｇ 上記成分を十分混和し、60メッシュの金網を通過させて
粒度を調整した後、1,000 個のゼラチンカプセルに充填
する。
【００７６】
【発明の効果】本発明のまたは本発明の免疫賦活剤の有
効成分である、紅藻粘質多糖より得られる酸性糖は優れ
た免疫賦活活性を有する。
効成分である、紅藻粘質多糖より得られる酸性糖は優れ
た免疫賦活活性を有する。
【図１】本発明に係る酸性糖のＴＮＦ（腫瘍壊死因子）
誘導能を示す。
誘導能を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 山本 綽 愛知県安城市昭和町19−10 新日本化学工 業株式会社内 (72)発明者 伊藤 昌雄 愛知県安城市昭和町19−10 新日本化学工 業株式会社内 (72)発明者 野村 和代 愛知県安城市昭和町19−10 新日本化学工 業株式会社内
Claims (9)
- 【請求項１】 構成単糖がＡとＢであり、ＡはＬ−ガラ
クトース−６−硫酸もしくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−
ガラクトースでＢはＤ−ガラクトースもしくは６−Ｏ−
メチル−Ｄ−ガラクトースであり、ＡとＢが交互に配列
しており、Ａ→Ｂの結合様式がα１→３であり、Ｂ→Ａ
の結合様式がβ１→４であり、非還元末端を構成する単
糖がＬ−ガラクトース−６−硫酸であり、構成単糖とし
てＬ−ガラクトース−６−硫酸を１分子中に２以上含有
し、構成単糖の数が４〜500 の偶数である酸性糖。 - 【請求項２】 構成単糖の数が４〜 200の偶数である請
求項１記載の酸性糖。 - 【請求項３】 構成単糖の数が４〜１４の偶数である請
求項１記載の酸性糖。 - 【請求項４】 各単糖単位に、非還元末端から還元末端
へ向かって１、２、３、４…ｎ−１、ｎと番号を付すと
して、ｎ−１の構成単糖が３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトースであって、３、５…ｎ−３の構成単糖がＬ−
ガラクトース−６−硫酸または３，６−アンヒドロ−Ｌ
−ガラクトースであって、構成単糖の数が６以上の偶数
であるか、またはｎ−１の構成単糖がＬ−ガラクトース
−６−硫酸であって、３、５…ｎ−３の構成単糖もＬ−
ガラクトース−６−硫酸であって、構成単糖の数が４以
上の偶数である請求項１記載の酸性糖。 - 【請求項５】 構成単糖の配列が以下の式で表される請
求項１記載の酸性糖。 【化１】 - 【請求項６】 紅藻類に属する海藻中に含まれ、水性溶
媒で抽出される粘質多糖を、下記紅藻粘質多糖分解酵素
ＩおよびIIの少なくとも１つを含有する酵素源で加水分
解するか、下記紅藻粘質多糖分解酵素III とＩおよびII
の少なくとも１つとを含有する酵素源で加水分解して得
られる低粘性酸性糖中の構成単糖の数が５００より大の
画分を除去し、かつ１分子中の硫酸基数がそれぞれ２以
上である酸性糖混合物を分取するか、または該酸性糖混
合物をさらに適宜分離することを特徴とする、請求項１
記載の酸性糖の製造方法： 紅藻粘質多糖分解酵素Ｉ：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、６−Ｏ−メチル−Ｄ−
ガラクトースおよびＬ−ガラクトース−６−硫酸をそれ
ぞれＡ−Ｌ−Ｇａｌ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌお
よびＬ−ＧａｌＳで表すと、該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−
Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解
する特異性を有する酵素 紅藻粘質多糖分解酵素II：該粘質多糖中の、Ａ−Ｌ−Ｇ
ａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基、
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−
Ｄ−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−
Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇａｌ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ−Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａ
ｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を加水分解する特異
性を有するエンド型酵素 紅藻粘質多糖分解酵素III ：該粘質多糖中の、Ｌ−Ｇａ
ｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＬ−ＧａｌＳ−Ｍｅ−Ｄ−
Ｇａｌ残基の還元末端側のβ１→４結合を、該還元末端
側にＡ−Ｌ−Ｇａｌ─Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−Ｇ
ａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在し、さらに該Ｌ−Ｇ
ａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＡ−Ｌ−ＧａｌＳ−Ｍｅ
−Ｄ−Ｇａｌ残基の非還元末端側にＡ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｄ
−Ｇａｌ残基、Ａ−Ｌ−Ｇａｌ−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残
基、Ｌ−ＧａｌＳ−Ｄ−Ｇａｌ残基またはＬ−ＧａｌＳ
−Ｍｅ−Ｄ−Ｇａｌ残基が存在する場合にのみ、加水分
解する特異性を有するエンド型酵素。 - 【請求項７】 請求項１、２、３、４または５記載の酸
性糖の少なくとも１つを有効成分として含有する免疫賦
活剤。 - 【請求項８】 紅藻類に属する海藻中に含まれ、水性溶
媒で抽出される粘質多糖を、請求項６記載の紅藻粘質多
糖分解酵素ＩおよびIIの少なくとも１つを含有する酵素
源で加水分解するか、請求項６記載の紅藻粘質多糖分解
酵素III とＩおよびIIの少なくとも１つとを含有する酵
素源で加水分解して得られる低粘性酸性糖中のＧＰＣ法
によって測定される分子量が 100,000より大の画分を除
去して得られる酸性糖混合物であって、分子中の硫酸基
数がそれぞれ２以上である酸性糖混合物を有効成分とし
て含有する免疫賦活剤。 - 【請求項９】 酸性糖混合物が該低粘性酸性糖の分子量
が45,000より大の画分を除去して得られる酸性糖混合物
であって、分子中の硫酸基数がそれぞれ２以上である酸
性糖混合物である請求項８記載の免疫賦活剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6251275A JPH0892303A (ja) | 1994-09-20 | 1994-09-20 | 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6251275A JPH0892303A (ja) | 1994-09-20 | 1994-09-20 | 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0892303A true JPH0892303A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=17220378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6251275A Pending JPH0892303A (ja) | 1994-09-20 | 1994-09-20 | 新規な糖、その製造方法および免疫賦活剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0892303A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999024447A1 (en) * | 1997-11-11 | 1999-05-20 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances |
| WO1999041288A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Sulfated saccharides |
| WO2000043018A1 (en) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Medicinal compositions |
| WO2000043407A1 (en) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Remedies |
| KR100358903B1 (ko) * | 2000-03-31 | 2002-10-31 | 학교법인고려중앙학원 | 돌김으로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및그 제조방법 |
| WO2005039597A3 (en) * | 2003-10-24 | 2005-07-14 | Nutricia Nv | Immunemodulating oligosaccharides |
| JP2020114932A (ja) * | 2015-07-13 | 2020-07-30 | 有限会社エイミー | ポルフィランの製造方法及びポルフィラン溶液 |
-
1994
- 1994-09-20 JP JP6251275A patent/JPH0892303A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999024447A1 (en) * | 1997-11-11 | 1999-05-20 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Drugs, foods or drinks with the use of algae-derived physiologically active substances |
| KR100544856B1 (ko) * | 1997-11-11 | 2006-01-24 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 조류 유래의 생리활성물질을 이용한 의약, 식품 또는 음료 |
| WO1999041288A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Sulfated saccharides |
| US6518302B1 (en) | 1999-01-20 | 2003-02-11 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Remedies |
| EP1146050A4 (en) * | 1999-01-20 | 2002-07-24 | DRUGS | |
| WO2000043407A1 (en) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Remedies |
| WO2000043018A1 (en) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Medicinal compositions |
| CN1304008C (zh) * | 1999-01-20 | 2007-03-14 | 宝生物工程株式会社 | 医药组合物 |
| KR100358903B1 (ko) * | 2000-03-31 | 2002-10-31 | 학교법인고려중앙학원 | 돌김으로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및그 제조방법 |
| WO2005039597A3 (en) * | 2003-10-24 | 2005-07-14 | Nutricia Nv | Immunemodulating oligosaccharides |
| EP1721612A3 (en) * | 2003-10-24 | 2007-05-09 | N.V. Nutricia | Immunemodulating oligosaccharides |
| EP2123282A3 (en) * | 2003-10-24 | 2010-01-20 | N.V. Nutricia | Immunemodulating oligosaccharides |
| EP2305269A3 (en) * | 2003-10-24 | 2011-07-13 | N.V. Nutricia | Immunemodulating oligosaccharides |
| US8557794B2 (en) | 2003-10-24 | 2013-10-15 | N.V. Nutricia | Immunemodulating oligosaccharides |
| JP2020114932A (ja) * | 2015-07-13 | 2020-07-30 | 有限会社エイミー | ポルフィランの製造方法及びポルフィラン溶液 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050301 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050726 |