JPH0899897A - インターロイキン−２吸着型脂質小球体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インターロイキン−２（ＩＬ−２）および脂
質小球体を含み、ＩＬ−２保持率の高いＩＬ−２吸着型
脂質小球体製剤を容易に調製するためのキット、および
該キットを用いて製造されるＩＬ−２吸着型脂質小球体
製剤、さらに該製剤の製造方法を提供する。 【効果】 脂質小球体とＩＬ−２とを、脂質小球体の荷
電に関係なく、水性媒体中で接触させることにより、保
持率の高いＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤を調製し得
る。このため、製剤化が容易である点で優れている。ま
た、本発明により提供されるＩＬ−２吸着型脂質小球体
製剤は、持続放出性であるため、ＩＬ−２の血中濃度半
減期を延長して、ＩＬ−２の薬効を持続し、副作用を軽
減し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
−２（ＩＬ−２）を水性媒体中で脂質小球体と接触させ
て、インターロイキン−２吸着型脂質小球体製剤を調製
するための調製用キット、該キットによりＩＬ−２吸着
型脂質小球体製剤を調製する方法、およびそれにより調
製されるＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、
Ｔ細胞由来の分子量約15,000の糖タンパク質分子であ
り、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
単球、マクロファージなどに対して増殖、分化、または
機能活性化を促すなど、多様な作用を有することが知ら
れている。現在では、ＩＬ−２は遺伝子工学を用いて大
量生産され、抗腫瘍免疫療法などの臨床応用が行われて
いる。しかし、その高用量の全身投与により、重篤な副
作用を引き起こすという問題点がある。

【０００３】これを解決するために、持続放出性にして
血中濃度半減期を延長するなど、ＩＬ−２の分布および
吸収を変化させることにより全身毒性を軽減するという
目的で、ＩＬ−２をリポソーム膜に内包させる方法が考
案された。Andersonらは、リポソーム調製時にＩＬ−２
を内包させる方法として、凍結融解や音波処理を数回繰
り返す方法を開示したが、これらの工程は繁雑であるた
め工業化には適していない（Cancer Res., 50, 1853-18
56(1990)）。また、Bergersらにより、ＩＬ−２の内包
率を高める方法として、リポソーム膜脂質の電荷および
調製液のｐＨが検討されているが、ＩＬ−２の内包率は
81％にすぎない（Pharm. Res., 10(12),1715-1721(199
3)）。

【０００４】上記の内包型リポソーム製剤とは別に、荷
電リポソームを調製後、反対荷電の薬物を膜表面に吸着
させる吸着型リポソーム製剤の製造方法が報告されてい
る（特開平4-82839号公報、および特開平4-103527号公
報）。これらの吸着型リポソーム製剤では、適用薬物の
種類が反対荷電の薬物に限定されるため、膜脂質の種類
および調製法が限定される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的は、ＩＬ−２吸着
型脂質小球体製剤を高い保持率で容易に調製するための
キット、それにより製造されるＩＬ−２吸着型脂質小球
体製剤、および該製剤の製造方法を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々の検
討を行った結果、脂質小球体とインターロイキン−２
（ＩＬ−２）とを、荷電に関係なく、水性媒体中で接触
させることにより、保持率の高いＩＬ−２吸着型脂質小
球体製剤を調製し得ることを見いだした。

【０００７】本発明のインターロイキン−２吸着型脂質
小球体製剤の調製用キットは、インターロイキン−２を
水性媒体中で脂質小球体と接触させる工程によりインタ
ーロイキン−２吸着型脂質小球体製剤を調製するため
の、インターロイキン−２および脂質小球体を含み、イ
ンターロイキン−２が脂質小球体の脂質１００重量部に
対して１〜０．０００１重量部の割合で含有される。

【０００８】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体は、リポソームまたはリピッドマイクロスフェアーで
ある。

【０００９】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体の脂質の主成分は、中性リン脂質である。

【００１０】好ましい実施態様によれば、上記中性リン
脂質は、合成または天然ホスファチジルコリン、スフィ
ンゴミエリン、またはそれらの混合物である。

【００１１】好ましい実施態様によれば、上記中性リン
脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスフ
ァチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコリン、
ジリグノセロイルホスファチジルコリン、スフィンゴミ
エリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチ
ン、および水添大豆レシチンからなる群より選択される
少なくとも１種の脂質である。

【００１２】好ましい実施態様によれば、上記ホスファ
チジルコリンは、合成ホスファチジルコリンである。

【００１３】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体は荷電脂質を含む。

【００１４】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体は非荷電脂質からなる。

【００１５】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体は、インターロイキン−２と同じ極性の荷電であるか
または非荷電である。

【００１６】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体およびインターロイキン−２の少なくとも一方は非荷
電である。

【００１７】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体には、インターロイキン−２以外の薬物が内包、分
配、または吸着されている。

【００１８】好ましい実施態様によれば、上記脂質小球
体の平均粒子径は５００ｎｍ以下である。

【００１９】好ましい実施態様によれば、上記水性媒体
のｐＨは約３〜９である。

【００２０】好ましい実施態様によれば、上記水性媒体
のｐＨは、インターロイキン−２の等電点付近である。

【００２１】好ましい実施態様によれば、上記キット
は、上記脂質小球体および／またはインターロイキン−
２の凍結乾燥物を含む。

【００２２】好ましい実施態様によれば、上記キット
は、水性媒体をさらに含む。

【００２３】好ましい実施態様によれば、上記キット
は、脂質小球体水分散液および凍結乾燥されたインター
ロイキン−２水溶液を含有する。

【００２４】本発明のインターロイキン−２吸着型脂質
小球体製剤の調製方法は、インターロイキン−２を水性
媒体中で脂質小球体と接触させる工程を包含する。

【００２５】好ましい実施態様では、上記方法は、上記
いずれかに記載のキットを用いる。本発明のインターロ
イキン−２吸着型脂質小球体製剤は、好ましくは上記い
ずれかに記載の方法により調製される。

【００２６】好ましい実施態様によれば、上記製剤は、
ゲル濾過において、インターロイキン−２の脂質小球体
への吸着保持量が８０〜１００％である。

【００２７】好ましい実施態様によれば、上記製剤は、
脂質小球体の脂質を１００重量部、そしてインターロイ
キン−２を１〜０．０００１重量部の割合で含む。

【００２８】好ましい実施態様によれば、上記製剤は、
凍結乾燥されている。

【００２９】

【発明の実施の形態】本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球
体製剤の調製用キットは、少なくともＩＬ−２と脂質小
球体を、１つの投与体系として組合せた構成を有してい
ればよく、その組合せの形態は問わない。すなわち、そ
の定義には、組合せ製剤に相当するものも含まれる。注
射筒のような医療器具などがさらにセットされていても
よい。この脂質小球体は、リポソームおよびリピッドマ
イクロスフェアーのうち少なくとも１種である。ＩＬ−
２吸着型脂質小球体製剤は、キット中のＩＬ−２を水性
媒体中で脂質小球体と接触させる工程により調製され得
る。ＩＬ−２と脂質小球体とを接触させるための工程は
特に限定されない。例えば、本発明のキットが、ＩＬ−
２と脂質小球体とを混合して乾燥（例えば、凍結乾燥）
したものを含む場合、この乾燥物に用時に水性媒体を加
えて再生し、ＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤を調製する
ことができる。本発明のキットが、例えば、ＩＬ−２と
脂質小球体とを別々に、両方とも乾燥物、あるいはいず
れか一方が乾燥物であり他方が水溶液または分散液であ
るものを含む場合、用時に、必要に応じて水性媒体を加
えてこれらを混合することにより調製し得る。これらの
場合、本発明のキットは、適切なｐＨに調製された水性
媒体を含んでいてもよい。本発明のキットは、脂質小球
体分散液とＩＬ−２水溶液とを含んでいてもよい。さら
に、脂質小球体とＩＬ−２とを含む水性媒体を調製し
て、一旦ＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤を形成させた
後、凍結乾燥して製造されるキットも包含する。このよ
うなキットは、単に水性媒体中にもどすだけで容易に吸
着型脂質小球体製剤が再生される。本発明のＩＬ−２吸
着型脂質小球体製剤の調製用キットに含まれる脂質小球
体は、以下で述べるように水分散液として調製されたも
のでも、あるいは、通常の方法により凍結乾燥製剤また
は噴霧乾燥製剤などとして調製されたものでもよい。

【００３０】本発明に用いる脂質小球体とは、上記のよ
うに、リポソームおよびリピッドマイクロスフェアーを
包含する。リポソームの粒子径は、約２０ｎｍ〜数μ
ｍ、好ましくは、約５００ｎｍ以下、さらに好ましく
は、約２００ｎｍ以下である。また、リピッドマイクロ
スフェアーとは、例えば、大豆油などの植物油をリン脂
質（レシチンなど）とともに水に懸濁して得られる小さ
な脂肪粒子をいう。一般に、リピッドマイクロスフェア
ーの平均粒子径は、約２００ｎｍである。

【００３１】本発明に用いるリポソームまたはリピッド
マイクロスフェアーのリン脂質の主成分としては、中性
リン脂質が用いられ得る。中性リン脂質としては、分子
全体として中性領域で電荷を有していない脂質であれ
ば、特に限定されない。例えば、合成または天然ホスフ
ァチジルコリン、スフィンゴミエリンなど、またはそれ
らの混合物が用いられ得る。天然ホスファチジルコリン
には、各種レシチンも包含され得、不飽和型でも飽和型
（水素添加型）であってもよい。例えば、ジステアロイ
ルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジベ
ヘノイルホスファチジルコリン、ジリグノセロイルホス
ファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチ
ン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチ
ンなどが挙げられ、これらからなる群より選択される１
種または２種以上の脂質が用いられ得るが、相転移温度
の高いものが好ましい。２種以上の脂質を用いる場合、
その混合割合は特に限定されない。

【００３２】本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤の
調製に用いられるリポソームまたはリピッドマイクロス
フェアーのリン脂質は、主として上記の非荷電脂質から
なり、必要に応じて、荷電脂質が含有される。正荷電脂
質としては、毒性を有さない正荷電物質であれば特に限
定されない。例えば、ステアリルアミン、オレイルアミ
ンなどの塩基性脂質、Ｎ^a−アシル−Ｌ−アルギニンな
どの塩基性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。負
荷電脂質としては、毒性を有さない負荷電物質であれば
特に限定されない。例えば、ホスファチジルセリン、天
然由来のホスファチジルグリセロール、ジミリストイル
ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファ
チジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグ
リセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシト
ール、ホスファチジン酸などの酸性リン脂質、ガングリ
オシドＧＭ₁、ガングリオシドＧＭ₃などのシアル酸を有
するガングリオシド類、ジセチルリン酸などの酸性脂
質、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸などの酸性アミノ酸
系界面活性剤、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸
が挙げられる。

【００３３】上記脂質小球体に荷電脂質を含む場合、例
えば、脂質小球体に用いた脂質の重量の合計を１００％
として、０〜１００％、好ましくは０〜約３０％の割合
で含有される。

【００３４】本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤の
調製に用いられるリピッドマイクロスフェアーの、上記
リン脂質と併用して用いられる主な脂質としては、植物
油（例えば、大豆油、ゴマ油、サフラワー油）または合
成もしくは半合成の中鎖脂肪酸トリグリセリド（例え
ば、ミグリオール、ＯＤＯ（登録商標））が用いられ得
る。植物油または中鎖脂肪酸トリグリセリドに対するリ
ン脂質の割合は、植物油または中鎖脂肪酸トリグリセリ
ドを１００重量部とした場合、５〜５０重量部、好まし
くは１０〜２５重量部である。

【００３５】上記脂質小球体の脂質成分としては、上記
の種々のリン脂質および荷電脂質以外に、さらにホスフ
ァチジルエタノールアミン、膜安定化剤としてコレステ
ロールなどのステロール類、抗酸化剤としてα−トコフ
ェロールなどが加えられていてもよい。このような添加
物質の添加割合は、例えば、脂質の合計を１００重量部
とすると、ホスファチジルエタノールアミンは０〜３０
重量部、安定化剤として用いられるステロール類は０〜
１００重量部、好ましくは２０〜５５重量部、抗酸化剤
として用いられるα−トコフェロールなどは０〜２０重
量部、好ましくは１重量部前後である。

【００３６】本発明に用いる脂質小球体の調製方法は特
に限定されず、種々の公知の方法により調製され得る。
例えば、リポソームの調製方法についていえば、超音波
調製法、ボルテックス法、界面活性剤法、エタノール注
入法、エーテル注入法、フレンチプレス法、逆相蒸発法
などが挙げられる。これらの調製法により得られるリポ
ソームの構造としては、多重層リポソーム（ＭＬＶ）、
小さな１枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな１枚膜リポ
ソーム（ＬＵＶ）、逆相法リポソーム（ＲＥＶ）などが
挙げられる。一方、リピッドマイクロスフェアーの調製
の場合は、リポソームの調製の場合とは異なり、リン脂
質以外に、大豆油、ゴマ油などの植物油あるいは合成ま
たは半合成の中鎖脂肪酸トリグリセリドを用いる。その
調製方法は、特に限定されないが、例えば、水に対して
植物油または中鎖脂肪酸トリグリセリドを２〜２０％、
そしてリン脂質をその１２％加えたものを、高圧乳化機
にかけることにより、リピッドマイクロスフェアーを調
製し得る。本発明に用いるリピッドマイクロスフェアー
の粒子径は、特に限定されないが、一般的には平均２０
０nmである。さらに、これらの脂質小球体の表面は、例
えば、ガラクトース、マンノース、ラクトース、モノク
ローナル抗体、アミノ酸などの組織親和性または臓器親
和性を有する分子、または、例えば、ポリエチレングリ
コール、プルラン、マンナン、ポリアミノ酸などの親水
性ポリマーで化学的または物理的に修飾されていてもよ
い。

【００３７】本発明に用いる脂質小球体は、ＩＬ−２以
外の他の薬物または生理活性物質、例えば、５−フルオ
ロウラシル、ドクソルビシン、γ−インターフェロン、
マイトマイシンＣ、白金錯体、シクロホスファミドなど
を内包、分配、または吸着したものであってもよい。

【００３８】本発明に用いられる水性媒体のｐＨは脂質
小球体の安定性から通常約３〜９程度であり、好ましく
は６〜９であり、さらに好ましくはＩＬ−２の等電点付
近の約７〜８である。ｐＨの調整に用い得る酸として
は、塩酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸、あるいは乳
酸、グリセリン酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、好ま
しくは、塩酸、酢酸、または乳酸である。塩基として
は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウ
ムなどの一価の水酸化物、あるいはトリエチルアミン、
トリメチルアミン、ジイソプロパノールアミン、ジエタ
ノールアミン、トリエタノールアミン、テトラメチルア
ミン、トリスアミノメタンなどのアミン類を、好ましく
は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムを挙げることが
でき、さらには第一リン酸カリウム、第二リン酸ナトリ
ウム、炭酸ナトリウムなども使用することができる。ま
た、上記水性媒体のイオン濃度は、例えば０〜５００ｍ
Ｍである。

【００３９】本発明に用いるＩＬ−２の由来は、どのよ
うなものであってもよいが、一般的には、市販の遺伝子
組換え型ＩＬ−２、好ましくは遺伝子組換え型ヒトＩＬ
−２が用いられる。ＩＬ−２は、脂質小球体の脂質の合
計を１００重量部とすると、１〜0.0001重量部、好まし
くは0.1〜0.001重量部の割合で調製時に混合される（Ｉ
Ｌ−２ １mg＝１０⁷国内標準単位(JRU)換算）。また
は、ＩＬ−２／脂質小球体の混合比（JRU/nmole）は、1
0.0〜0.01、好ましくは5.0〜0.05、さらに好ましくは1.
0〜0.1である。

【００４０】本発明に用いる水性媒体には、安定化剤と
して、糖（例えば、グルコース、ガラクトースなどの単
糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキスト
ランなどの多糖類）、グリセロール、マンニトール、ソ
ルビトール、キシリトールなどのポリオール類、タンパ
ク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、水溶性高分子
（例えば、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンな
ど）、界面活性剤などの添加物が含まれていてもよい。

【００４１】本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤で
は、（１）後述の実施例１〜１１で記載されているよう
に、ＩＬ−２と脂質小球体との混合系をゲル濾過する
と、ＩＬ−２単独の場合の溶出分画とは異なる脂質小球
体の溶出分画に、そのＩＬ−２の大部分、好ましくは８
０〜１００％、さらに好ましくは９０〜１００％が一緒
に溶出してくることから、また（２）実施例１５および
１６に記載されているようにＩＬ−２の血中濃度の持続
性を示すことから、単に脂質小球体とＩＬ−２とが水性
媒体中に混合しているのではなく、脂質小球体にＩＬ−
２が担持または吸着された形態であることがわかった。
本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤では、ＩＬ−２
が脂質小球体の中に内包されているのではなく、その外
側表面に吸着されている。

【００４２】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説
明する。

【００４３】（実施例１）中性リン脂質であるジステア
ロイルホスファチジルコリン（DSPC）100mgを含むクロ
ロホルム溶液５mlを300ml用ナス型フラスコに入れて、
ロータリーエバポレーターにより溶媒を減圧下で留去し
て、ナス型フラスコの内壁に脂質（DSPC）の薄い皮膜を
形成させた。これをさらにデシケーターに移して減圧下
で一晩、残留溶媒の除去を行った。次いで、この脂質皮
膜にリン酸緩衝生理食塩水２mlを加えて、60℃の湯浴上
で手で振とうを行うことにより乳濁化させ、リポソーム
（ＭＬＶ）の粗分散液を得た。次に、孔径が0.4μmのnu
clepore membrane（Nucrepore Corporation）を装着し
たエクストルーダー（Lipex Biomembranes, Inc.）を用
いて、このリポソーム粗分散液を加圧濾過した。さら
に、この濾液を孔径0.1μmのnuclepore membrane（Nucr
epore Corporation）を用いて加圧濾過することによ
り、粒子直径が約100nmのDSPC-リポソーム分散液を得
た。次に、このようにして得られた粒子直径が約100nm
のDSPC-リポソーム分散液（脂質濃度：50μmol/ml）１m
lに対して、遺伝子組換え型インターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）の50mM酢酸水溶液（840万国内標準単位(JRU)/m
l）42μlを加え、Sephadex G-75でゲル濾過（Pharmaci
a、カラム：径×長さ＝1.0cm×25cm、展開溶媒：１％BS
Aを含むリン酸緩衝生理食塩液、試料：0.1ml）を行っ
た。分取した各分画中に含まれるＩＬ−２を酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）（森ら、基礎と臨床、22(17)、5955 (19
88)）で定量し、リポソーム分画に含まれるＩＬ−２の
含量から、リポソームに吸着しているＩＬ−２の割合
（保持率）を求めた。この結果を他の実施例の結果とと
もに表１に示す。なお、リポソームに保持されなかった
フリーのＩＬ−２は、別の分画に分離して溶出した。

【００４４】（実施例２）ＩＬ−２の酢酸水溶液42μl
の代わりに、21μlを用いたこと以外は、実施例１と同
様である。

【００４５】（実施例３）DSPC 100mgの代わりに、DSPC
100mgと負荷電脂質であるジステアロイルホスファチジ
ルグリセロール（DSPG）10mgとの混合物を用いたこと以
外は、実施例１と同様である。

【００４６】（実施例４）ＩＬ−２の酢酸水溶液42μl
の代わりに、1.2μlを用いたこと以外は、実施例３と同
様である。

【００４７】（実施例５）DSPCの代わりに、中性リン脂
質であるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）
を用いたこと以外は、実施例１と同様である。

【００４８】（実施例６）ＩＬ−２の酢酸水溶液42μl
の代わりに、1.2μlを用いたこと以外は、実施例５と同
様である。

【００４９】（実施例７）DPPC 100mgの代わりに、DPPC
100mgと負荷電脂質であるジパルミトイルホスファチジ
ルグリセロール（DPPG）10mgとの混合物を用いたこと以
外は、実施例５と同様である。

【００５０】（実施例８）ＩＬ−２の酢酸水溶液42μl
の代わりに、1.2μlを用いたこと以外は、実施例７と同
様である。

【００５１】

【表１】

【００５２】（実施例９）実施例１と同様の方法で、DS
PCおよびDSPG（モル比10:1）からなるリポソーム（ＭＬ
Ｖ）の粗分散液（脂質濃度：50μmol/ml）を調製した
後、この調製液の20mlを高圧乳化機（Nanomizer LA-10
H: SAYAMA TRADING CO. LTD.）にかけて粉砕し、平均粒
径が約20nmの微粒子とした。この微細化したリポソーム
の分散液５mlで遺伝子組換え型インターロイキン−２の
製剤であるイムネース注35（35万国内標準単位(JRU)／
バイアル、塩野義製薬）の2.5バイアル分を溶解し、そ
の一部を実施例１に記載の方法でゲル濾過を行った。そ
の結果、リポソーム分画に含まれるＩＬ−２の含量か
ら、リポソームのＩＬ−２保持率が97.6％と算出され
た。

【００５３】実施例１から実施例９までの結果は、いず
れも脂質濃度を一定にした場合の結果であり、脂質組成
または脂質とＩＬ−２との混合比の適切な選択により、
90％以上の保持率を示すＩＬ−２吸着型リポソーム製剤
が得られることを示している。いずれの脂質組成につい
ても、脂質に対するＩＬ−２の混合比が低くなるほど吸
着保持率が高くなっている。また、荷電脂質の有無に関
係なく高い保持率を示すこと、およびこの実験がＩＬ−
２の等電点付近のｐＨ（約7.4）で行われたことから、
この高い保持率をもたらす主な原因が、ＩＬ−２とリポ
ソームとの疎水性相互作用による吸着であると考えられ
る。

【００５４】（実施例１０）ＩＬ−２濃度（4.2×10⁵JR
U/ml）および脂質組成（DPPC/DPPG＝10/1）を一定に
し、ＩＬ−２とリポソームとの混合比を変化させた以外
は、実施例１と同様に行った。Sephadex G-75でのゲル
濾過によるＩＬ−２の溶出プロフィルを図１に、ゲル濾
過の結果より算出したＩＬ−２の保持率を表２に示す。
この結果から、上記実施例１〜９の結果と同様に、脂質
に対するＩＬ−２の混合比が低くなるほど、ＩＬ−２の
吸着保持率が高くなることがわかった。

【００５５】

【表２】

【００５６】（実施例１１）脂質組成が卵黄PC/DPPG＝3
/1、DSPC/DPPG＝10/1、およびDPPC/DPPG＝10/1のＩＬ−
２吸着型リポソーム分散液（ＩＬ−２濃度：4×10⁵JRU/
ml、脂質濃度：47μmol/ml）を、それぞれ実施例１と同
様の方法で得、そしてSephadex G-75でゲル濾過を行っ
た。ゲル濾過によるＩＬ−２の溶出プロフィルを図２
に、ゲル濾過の結果より算出したＩＬ−２の保持率を表
３に示す。この結果から、天然ホスファチジルコリンよ
りも合成ホスファチジルコリンの方がＩＬ−２の吸着力
が強いことがわかった。

【００５７】

【表３】

【００５８】（実施例１２）リポソームの粗分散液を、
種々の孔径（1.0μm、0.4μm、0.2μm、および0.1μm）
のnucleopore membrane（Nucrepore Corporation）で加
圧濾過して、粒子径がそれぞれ1000nm、400nm、200nm、
および100nmのリポソームを得、30nmのリポソームは、
実施例９で用いた高圧乳化機にて調製した以外は、実施
例３と同様である。脂質濃度は、50μmole/mlである
が、リポソームの粒子径が30nmの場合のみ、30μmole/m
lで行った。結果を表４に示す。リポソームの粒子径が1
000nmの場合はＩＬ−２の保持率がやや低かったが、そ
れ以外の場合においては、いずれも90％以上の保持率で
あった。

【００５９】

【表４】

【００６０】（実施例１３）上記実施例の結果より、Ｉ
Ｌ−２の脂質に対する混合比を少なくし、粒子径を小さ
くした方がＩＬ−２の吸着力を高めることができると考
えられる。そこで、市販のＩＬ−２製剤であるイムネー
スを用いた場合について、実施例９と同様の方法で、混
合比と粒子径との関係を検討した。ただし、粒子径が30
nmの場合の脂質濃度は30μmole/mlで行った。その結果
を表５に示す。ＩＬ−２と脂質との混合比およびリポソ
ームの粒子径を適切に選択することにより、９０％以上
の保持率のＩＬ−２吸着型リポソーム製剤を得られ得る
ことが示された。これは、イムネース35（3.5×10⁵JR
U）の１バイアルを１〜２mlのリポソーム分散液（脂質
濃度：50μmole/ml）に溶解することにより、ＩＬ−２
吸着型リポソーム製剤を容易に得られることを示してい
る。

【００６１】

【表５】

【００６２】（実施例１４）DSPC 216mg、DSPG 24mg、
グリセリン500mg、および注射用蒸留水20mlを混合し、
ホモジナイザー（ポリトロン（登録商標））により分散
し、大豆油２gを加えてさらにホモジナイザーにより処
理することにより、粗エマルジョンを得た。これを高圧
乳化機（Nanomizer LA-10H: SAYAMA TRADING CO. LT
D.）にかけて粉砕し、平均粒径が約200nmのリピッドマ
イクロスフェアーを得た。このリピッドマイクロスフェ
アー120μlに、注射用蒸留水１ml/バイアルで溶解した
イムネース注120μlを加え、この200μlについてSephad
ex G-75でゲル濾過を行った。このときの条件および保
持率の算出法は実施例１と同様である。この結果、ＩＬ
−２の保持率は８９％であった。

【００６３】（実施例１５）実施例３と同様の方法で得
られた、脂質組成がDSPC/DSPG＝10/1のＩＬ−２吸着型
リポソーム製剤（平均粒子径：約100nm、ＩＬ−２濃
度：9.1×10⁴JRU/ml、脂質濃度：50μmol/ml）の0.2ml
を、マウス（Jcl-BDF1、４週齢、約20g）の背部皮下に
投与して、経時的に採血を行った。ＩＬ−２の血中濃度
はＥＩＡによって測定した。これと並行してＩＬ−２単
独（1.9×10⁵JRU/ml、0.2ml）の投与を行い、ＩＬ−２
の血中濃度推移を比較した。その結果を図３に示す。Ｉ
Ｌ−２単独の場合（図中の●）は、血中濃度の立ち上が
りが速く、消失も速いのに対して、ＩＬ−２吸着型リポ
ソーム製剤の場合（図中の○）は、血中濃度の持続性を
示した。

【００６４】（実施例１６）脂質組成がDSPC/DPPG＝10/
1のリポソーム（平均粒子径：約100nm）を、DSPGの代わ
りにDPPGを用いた以外は実施例３と同様の方法で調製し
た。ＩＬ−２とリポソームとの混合溶液（ＩＬ−２：7.
5×10⁴JRU、脂質濃度：50μmol/ml）の0.2mlを、マウス
（slc-BDF1、４週齢、約20g）の尾静脈に投与して、投
与後のＩＬ−２の各臓器における濃度をＥＩＡにより測
定した。

【００６５】図４に、ＩＬ−２／リポソーム混合物ある
いはＩＬ−２単独（ＩＬ−２：0.955×10⁴JRU／マウ
ス）の投与におけるＩＬ−２の血中濃度の推移を比較し
た結果を示す。ＩＬ−２とリポソームとを混合してＩＬ
−２吸着型リポソーム製剤（図中の○）として投与する
ことにより、ＩＬ−２単独投与（図中の●）と比較して
血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）が増加しており、
血中濃度の持続性を示した。図５に、ＩＬ−２／リポソ
ーム混合物あるいはＩＬ−２単独を投与した場合の、各
臓器のＩＬ−２の投与後４時間までのＡＵＣを比較した
結果を示す。この投与条件下では、ＩＬ−２／リポソー
ム混合物は、肝臓および脾臓への分布が高いことがわか
った。特に脾臓への集積が顕著であった。これまで腎癌
およびメラノーマ癌患者に対して、ＩＬ−２の高投与量
が有効であることが報告されているが、ＩＬ−２の高投
与量による副作用の問題があった。しかし、本発明のＩ
Ｌ−２吸着型リポソーム製剤のＡＵＣの増加、血中濃度
の持続、特定臓器への集積などの特性は、ＩＬ−２の投
与量の低下および副作用の軽減の可能性を示し、ＩＬ−
２の適用の拡大の可能性をも示すものである。

【００６６】（実施例１７）脂質組成（DSPC/DSPG＝10/
1）、平均粒子径約20nmのリポソームを、水分散液とし
て調製した。別に、ＩＬ−２の凍結乾燥品をバイアルと
して調製し、リポソーム分散液とセットにして、ＩＬ−
２吸着型リポソーム調製用のキットを製造した。ＩＬ−
２は、リポソームの脂質１００重量部に対して０．０１
重量部含まれる。このキットに含まれるＩＬ−２を、実
施例９と同様にリポソーム分散液に溶解すれば、ＩＬ−
２吸着型脂質小球体製剤が調製される。

【００６７】

【発明の効果】本発明のキットを用いれば、脂質小球体
とＩＬ−２を水性媒体中で接触させるだけで、高い保持
率のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤を調製し得る。特
に、本発明のキットを用いる方法は、脂質小球体の荷電
とは関係なく、単に混合するだけでＩＬ−２吸着型脂質
小球体製剤を得ることができるため、従来の方法と比べ
て非常に簡便である。また、容易に製剤化できることか
ら、用時調製が可能であり、製剤の安定性の面でも優れ
ている。得られたＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤は、Ｉ
Ｌ−２単独投与の場合と比べて、持続放出性であるた
め、ＩＬ−２の血中濃度半減期を延長して、ＩＬ−２の
薬効を持続し、副作用を軽減し得る。さらに、本発明の
製剤を静脈内あるいは動脈内投与することにより、標的
組織への選択的な送達も可能であり、ＩＬ−２を局所で
効果的に働かせ得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】Sephadex G-75でのゲル濾過による、本発明の
ＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤またはＩＬ−２単独の溶
出プロフィルを示す図である。

【図２】Sephadex G-75でのゲル濾過による、本発明の
ＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤またはＩＬ−２単独の溶
出プロフィルを示す図である。

【図３】本発明のＩＬ−２吸着型脂質小球体製剤または
ＩＬ−２単独を、それぞれマウスに皮下投与した場合
の、ＩＬ−２の血中濃度の推移を示す図である。

【図４】本発明のＩＬ−２吸着型リポソーム製剤または
ＩＬ−２単独をマウスの尾静脈に投与した場合の、ＩＬ
−２の血中濃度の推移を示す図である。

【図５】本発明のＩＬ−２吸着型リポソーム製剤または
ＩＬ−２単独をマウスの尾静脈に投与した場合の、各臓
器のＩＬ−２の投与後４時間までのＡＵＣ比を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/55 8318−4Ｈ (72)発明者 平野 耕一郎 兵庫県川辺郡猪名川町松尾台３−２−５ (72)発明者 川上 亘作 大阪府柏原市旭ケ丘３−１−76−306

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン−２を水性媒体中で脂
   質小球体と接触させる工程によりインターロイキン−２
   吸着型脂質小球体製剤を調製するための、インターロイ
   キン−２および脂質小球体を含み、インターロイキン−
   ２が脂質小球体の脂質１００重量部に対して１〜０．０
   ００１重量部の割合で含有される、インターロイキン−
   ２吸着型脂質小球体製剤の調製用キット。
2. 【請求項２】 前記脂質小球体がリポソームまたはリピ
   ッドマイクロスフェアーである、請求項１に記載のキッ
   ト。
3. 【請求項３】 前記脂質小球体の脂質の主成分が中性リ
   ン脂質である、請求項１に記載のキット。
4. 【請求項４】 前記中性リン脂質が、合成または天然ホ
   スファチジルコリン、スフィンゴミエリン、またはそれ
   らの混合物である、請求項３に記載のキット。
5. 【請求項５】 前記中性リン脂質が、ジステアロイルホ
   スファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコ
   リン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジベヘノ
   イルホスファチジルコリン、ジリグノセロイルホスファ
   チジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大
   豆レシチン、水添卵黄レシチン、および水添大豆レシチ
   ンからなる群より選択される少なくとも１種の脂質であ
   る、請求項３記載のキット。
6. 【請求項６】 前記ホスファチジルコリンが合成ホスフ
   ァチジルコリンである、請求項４または５に記載のキッ
   ト。
7. 【請求項７】 前記脂質小球体が荷電脂質を含む、請求
   項１に記載のキット。
8. 【請求項８】 前記脂質小球体が非荷電脂質からなる、
   請求項１に記載のキット。
9. 【請求項９】 前記脂質小球体が、インターロイキン−
   ２と同じ極性の荷電であるかまたは非荷電である、請求
   項１に記載のキット。
10. 【請求項１０】 前記脂質小球体およびインターロイキ
    ン−２の少なくとも一方が非荷電である、請求項１に記
    載のキット。
11. 【請求項１１】 前記脂質小球体にインターロイキン−
    ２以外の薬物が内包、分配、または吸着されている、請
    求項１に記載のキット。
12. 【請求項１２】 前記脂質小球体の平均粒子径が５００
    ｎｍ以下である、請求項１に記載のキット。
13. 【請求項１３】 前記水性媒体のｐＨが約３〜９であ
    る、請求項１に記載のキット。
14. 【請求項１４】 前記水性媒体のｐＨが、インターロイ
    キン−２の等電点付近である、請求項１に記載のキッ
    ト。
15. 【請求項１５】 前記脂質小球体および／またはインタ
    ーロイキン−２の凍結乾燥物を含む、請求項１に記載の
    キット。
16. 【請求項１６】 前記水性媒体をさらに含む、請求項１
    に記載のキット。
17. 【請求項１７】 脂質小球体水分散液および凍結乾燥さ
    れたインターロイキン−２を含有する、請求項１に記載
    のキット。
18. 【請求項１８】 インターロイキン−２を水性媒体中で
    脂質小球体と接触させる工程を包含する、インターロイ
    キン−２吸着型脂質小球体製剤の調製方法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１７のいずれかに記載のキ
    ットを用いる、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 インターロイキン−２吸着型脂質小球
    体製剤。
21. 【請求項２１】 請求項１８または１９に記載の方法に
    より調製される、請求項２０に記載の製剤。
22. 【請求項２２】 ゲル濾過において、インターロイキン
    −２の脂質小球体への吸着保持量が８０〜１００％であ
    る、請求項２０に記載の製剤。
23. 【請求項２３】 脂質小球体の脂質を１００重量部、そ
    してインターロイキン−２を１〜０．０００１重量部の
    割合で含む、請求項２０に記載の製剤。
24. 【請求項２４】 凍結乾燥されている、請求項２０に記
    載の製剤。