JPH09104825A - シアニンと他の蛍光色素とをカップリングさせることにより形成される共鳴エネルギー伝達が可能な大きなストークスシフトを有する蛍光標識用複合体 - Google Patents

シアニンと他の蛍光色素とをカップリングさせることにより形成される共鳴エネルギー伝達が可能な大きなストークスシフトを有する蛍光標識用複合体

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JPH09104825A
JPH09104825A JP8146333A JP14633396A JPH09104825A JP H09104825 A JPH09104825 A JP H09104825A JP 8146333 A JP8146333 A JP 8146333A JP 14633396 A JP14633396 A JP 14633396A JP H09104825 A JPH09104825 A JP H09104825A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、複合体中の１つの染料の吸収と複合
体中の別の染料からの放出との間に大きな波長シフトを
有する低分子量蛍光標識複合体を提供することを目的と
する。 【解決手段】i） 第１の吸収および発光スペクトルを
有する第１の蛍光色素； ii） 第２の吸収および発光スペクトルを有する第２の
蛍光色素、ここで前記第２の蛍光色素の発光スペクトル
の波長は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルの波長
より長く、かつ前記第２の蛍光色素の吸収スペクトルの
一部は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルの一部と
重複しており、 iii） 前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素との
間に共鳴エネルギーを移動させるために前記第１および
第２の蛍光色素を共有結合により結合する少なくとも１
つのリンカー； iv） 標的化合物と共有結合を形成しうる少なくとも１
つの標的結合基；を含む複合体であって、前記第１およ
び第２の蛍光色素および前記リンカーの分子量の合計が
約２０，０００ダルトン未満である複合体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は蛍光標識用複合体に
関し、より具体的には大きなストークスシフトを伴う低
分子量蛍光複合体および標的物質の蛍光誘導体の製造に
おけるそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光標識は生物学的分子を検出するため
の重要な技術である。例えば、抗体を蛍光染料で標識す
ることが可能である。その後、抗体のそれらの特異標的
分子への結合を蛍光シグナルを基にモニターすることが
可能であり、その蛍光シグナルは、スペクトロメータ
ー、免疫蛍光装置、フローサイトメーター、もしくは蛍
光顕微鏡で検出されることができる。類似方法で、ＤＮ
Ａを予め蛍光染料で標識してある相補的ＤＮＡ配列とハ
イブリダイズさせた後に、ＤＮＡ配列を蛍光検出装置で
検出することが可能である。
【０００３】共有結合により連結されたドナーおよびア
クセプター分子を含むエネルギー伝達複合体が知られて
いる。例えば、シングレット−シングレットエネルギー
伝達の距離依存性の調査のためのあるモデル系がＳｔｒ
ｙｅｒおよびＨａｕｇｌａｎｄにより開発されている
（Ｓｔｒｙｅｒ，ＬおよびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．
Ｐ，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｖｏ
ｌ．５８、ｐｐ．７２０−２６、（１９６７）。シアニ
ン染料およびポルフィリンを含む新規の光化学モデル化
合物の合成および特性が報告されている（Ｌｉｎｄｓｅ
ｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．
１５、ｐｐ．４８４５−６６（１９８９））。蛍光ドナ
ーおよびアクセプター発色団を含む複合体が、加水分解
酵素の速度研究およびアッセイ用の基質として記載され
ている（Ｃａｒｍｅｌら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、
Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．１、ｐ１１、（１９７３））。
【０００４】欧州特許出願第６０９８９４号は、一般式
（Ｉ）
【化１】 ［式中、Ｘa、Ｘb、およびＸcは独立に、１〜３の複素
原子を含む置換もしくは非置換複素環であり、そしてＬ
aおよびＬbは共役メチン鎖である］により表される三核
染料を含む標識用複合体を開示している。ＬaおよびＬb
の一つが省略されて複素環が直接連結してもよい。構造
（Ｉ）の化合物は、三核染料と生物学的物質との間に共
有結合を形成するための反応基を含むことが可能であ
る。このような式の化合物は大きなストークシフト（５
０〜１００ｎｍ）を有することが報告されている。しか
しながら、これらの染料を用いる蛍光プロセスに共鳴エ
ネルギー伝達が関与しているとは考えられない。
【０００５】顕著に異なる発光波長を有する蛍光標識を
用いる多重パラメーター分析は、個々の細胞中の複数の
抗原性もしくは遺伝的パラメーターを関連づけるための
強力な道具を提供することによりこの技術の重要性を一
層増大させる。表面蛍光顕微鏡では、様々なセットの励
起および発光フィルターが装着された連続光源を、各蛍
光種を励起および検出するのに用いる。この研究方法
は、各発蛍光団の吸収および発光波長が比較的互いに近
接している場合（例えば、１５〜３０ｎｍのストークス
シフト）には特に良好に作動する。蛍光性が強くかつ低
分子量の発蛍光団の大部分のもの（例えば、シアニンお
よびキサンテンのようなもの）は、狭い吸収および発光
ピークを持ち、かつストークシフトも小さい。ＤｅＢｉ
ａｓｉｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．１６１３−１６２２
（１９８７）により記載されるように、最高で５つまで
の蛍光標識が、表面蛍光フィルターセットを用いる顕微
鏡により同一標本上で分析されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】特定のレーザー波長で
効果的に励起することが可能な単一の発蛍光団を見いだ
すことは容易ではあるが、その第一発蛍光団の発光から
よく分離した発光を提供するだけの十分大きなストーク
シフトを伴う別の蛍光標識を見いだすのは困難である。
天然に存在するフィコビリプロテインは、大きな波長シ
フトを有するある種の多重発色団性蛍光ホトシステム蛋
白質である（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．、Ｇｌａｚｅｒ，Ａ．
Ｎ．、およびＳｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９３、ｐｐ．９
８１−９８６（１９８２）、を参照せよ）。これらは抗
体に共有結合によりカップリングさせることが可能であ
り、かつ２色白血球サブセット分析用のフローサイトメ
トリーにおいて広く用いられている。Ｒ−フィコエリス
リン（Ｒ−ＰＥ）は広く利用可能なアルゴンイオンレー
ザーを用いて４８８ｎｍで励起させることが可能な３４
ビリンの発蛍光団を含むホトシステム蛋白質であり、こ
れは特に有用である。これは５７５ｎｍで極大の蛍光を
呈する。Ｒ−ＰＥおよびフルオレセインは両者共４８８
ｎｍで励起させることが可能であるが、Ｒ−ＰＥは、５
２５ｎｍに出現するフルオレセインシグナルからは光帯
域干渉フィルターセットを用いて容易に識別することが
可能である。最近では、４８８ｎｍで励起され６１３ｎ
ｍで蛍光を発する反応性蛍光染料を含む縦列コンジュゲ
ート標識剤の開発を通して、フローサイトメトリーによ
る３色免疫蛍光が可能となっており、かつＤｕｏｃｈｒ
ｏｍｅという名称で商品として市販されている。米国特
許第４８７６１９０を参照せよ。他の縦列発蛍光団を用
いると、励起されたＲ−ＰＥからのＣｙ−５として知ら
れる連結化シアニン占領へのエネルギー伝達により６７
０ｎｍの蛍光が得られる（Ｗａｇｇｏｎｅｒら、Ａｎ
ｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，、Ｖｏｌ．６７７、ｐ
ｐ．１８５−１９３（１９９３））。
【０００７】フィコビリプロテイン系標識は非常に蛍光
性が高く、かつ細胞表面抗原の検出用の２−および３−
パラメーター実験において優れたシグナルを提供する。
しかしながらこれらの試薬は、細胞質性抗原の測定、も
しくは蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによ
る染色体マーカーの検出のためには広く用いられておら
ず、それはそれらのサイズが大きいために（ＭＷ ２１
０，０００ダルトン）密度の高い細胞構造内への侵入が
制限されるためである。
【０００８】先の事柄にもかかわらず、標的分子の共有
結合標識のための標識として用いることが可能であり、
かつ単一波長励起を用いる多色蛍光検出を提供するであ
ろう低分子蛍光化合物は依然として不足している。更に
その各々がある特定のレーザー波長で最大に励起される
が、有意に異なる発光波長で蛍光を呈することが可能で
ある、数種のこのような蛍光標識に対する必要性も存在
する。我々は今回、単一波長励起を用いる多色蛍光検出
法を提供するであろう、ある種の低分子蛍光標識を見い
だした。
【０００９】
【課題を解決するための手段】従って本発明は： − 第一吸収および励起スペクトルを有する第一すなわ
ちドナー蛍光色素； − 第二吸収および励起スペクトルを有する第二すなわ
ちアクセプター蛍光色素（前記第二蛍光色素の極大発光
波長は前記第一蛍光色素の極大発光波長よりも長く、か
つ前記第二蛍光色素の吸収スペクトルの一部が前記第一
蛍光色素の発光スペクトルの一部と重複する）； − 前記第一および第二蛍光色素との間の共鳴エネルギ
ー伝達のために前記第一および第二蛍光色素を共有結合
により連結させるための少なくとも一つのリンカー； − 標的化合物と共有結合を形成しうる標的結合基；を
含み、ここで、前記第一および第二蛍光色素と前記リン
カーの合計分子量は約２０，０００ダルトン未満である
を含む低分子量蛍光標識用複合体に関する。
【００１０】前記第一もしくは第二蛍光色素の内の少な
くとも一つがシアニン染料であることが好ましい。
【００１１】リンカーは、ドナーおよびアクセプター発
色団の遷移モーメントを配向させるために、剛性（ｒｉ
ｇｉｄ）でも柔軟性でもよい。最適エネルギー伝達が生
じるためには、第一および第二蛍光色素の遷移モーメン
トは相対的には互いに非垂直方向に配向されている（例
えば、一般的には互いに平行もしくは縦列に置かれてい
る）。柔軟性様式で連結されている蛍光色素の遷移モー
メントはリンカーが曲がるために変化するであろうが、
ドナーとアクセプターの遷移モーメントがそのドナーの
励起状態寿命中に非垂直である場合、エネルギー伝達が
生じるであろう。本明細書で製造および記載される複合
体は、５０％〜９９％の効率の範囲にわたるエネルギー
伝達を示す。エネルギー伝達効率は数々の因子、例え
ば、スペクトル重複、ドナーとアクセプターとの間の空
間的隔離度、ドナー分子とアクセプター分子との相対的
配向、ドナーの量子収量、およびドナーの励起状態寿命
などに依存する。好ましい態様では、蛍光色素は、効率
的なエネルギー伝達、好ましくは７５％よりも良好なエ
ネルギー伝達を提供する距離で隔離される。
【００１２】ドナーおよびアクセプター発蛍光団どうし
がより近接しているとエネルギー伝達が亢進されるであ
ろうが、それはエネルギー伝達の効率が、フォースター
（Ｆｏｒｓｔｅｒ）の式：
【化２】 ［式中、ＥＴはエネルギー伝達係数であり、Ｋ2はドナ
ーおよびアクセプターの遷移モーメントの相対的配向で
あり、ФDはドナー分子の量子収量であり、Ｒはドナー
およびアクセプター蛍光色素の中心間の距離であり、Ｊ
はドナー蛍光色素の発光スペクトルとアクセプター蛍光
色素の吸収スペルトルとの間の重複であり、τDはドナ
ー分子の励起状態寿命である］に従い、発色団の中心の
距離の−６乗として変化するためである。Ｆｏｓｔｅ
ｒ，Ｔ．「Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｌｕｌａｒ Ｅｎｅｒｇ
ｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ」、Ａｎｎ．Ｐｈｙｓｉｋ．、Ｖｏｌ．２、ｐ．５
５、（１９４８）、を参照せよ。ドナーおよびアクセプ
ター蛍光色素間の距離Ｒは、好ましくは１０〜８０オン
グストロームである。リンカーはこれらの蛍光色素間の
共鳴エネルギー伝達を可能とする。これらの蛍光色素
は、化学的相互作用を行ったり、あるいは互いに二次結
合を生じてはならない。
【００１３】リンカーは好ましくは２〜２０結合分の長
さである。例えば、リンカーがアルキル鎖−（ＣＨ2）n
−を含む場合には、炭素数「ｎ」は１〜約１５である。
リンカーはその蛍光色素から延長する構成物の一部分を
含んでいてもよい。言い換えると、リンカーは染料発色
団に連結されているが、その一部ではない。表２に示さ
れるリンカーを参照すると、あるものは、１つのシアニ
ン内の環窒素から他のシアニンのベンゼン環内の官能基
へと伸長している。また、あるリンカーは連結された染
料のベンゼン環上の官能基間に伸長している。しかしな
がらこれらの例では、いずれのリンカーも、ドナーとア
クセプターのコンジュゲーションを可能にさせる二重結
合のネットワークを含んではいない。比較的に短いリン
カーでありかつ最適配向である場合には、スペクトル重
複が小さくなったとしても効果的な共鳴エネルギー伝達
が行われるであろう。従って、２つの発色団のみがその
複合体中で使用される場合であっても、大きな波長のシ
フトを得ることが可能である。
【００１４】適切なリンカーは、１〜２０個の炭素原子
を含むアルキル鎖（これらのアルキル鎖は任意に１〜８
個の酸素原子をポリエーテル結合として含むか、もしく
は１〜８個の窒素原子をポリアミン結合として含むか、
もしくは１〜４個のＣＯ−ＮＨ基をポリアミン結合とし
て含有してもよい）、２個以下のビシクロ［２．２．
２］オクチル基、１０個以下のヌクレオチド単位からな
る群から選択される。
【００１５】本発明の複合体は、標的化合物と共有結合
を形成して、その複合体が標的（例えば、担体物質もし
くは生物学的化合物）を標識することを可能にさせうる
標的結合基を含む。この標的結合基は、標的物質上の官
能基と反応するための反応基でありうる。あるいは、複
合体は官能基を含んでいてもよく、標的は反応性構成物
を含んでいてもよい。
【００１６】反応性基は、スクシンイミジルエステル、
イソチオシアン酸エステル、ジクロロトリアジン、イソ
シアン酸エステル、ハロアセトアミド、マレイミド、ハ
ロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルキルイミド
エステル、アリールイミドエステル、置換化ヒドラジ
ン、置換化ヒドロキシルアミン、カルボジイミド、およ
びホスホルアミダイトからなる群より選択されることが
適切である。
【００１７】官能基は、アミノ、スルフヒドリル、カル
ボキシル、ヒドロキシル、カルボニル、チオリン酸エス
テルからなる群より選択されることが適切である。
【００１８】ハロ−およびハロゲン化物が、クロロ、ブ
ロモ、およびヨード、もしくは塩化物およびヨウ化物か
ら選択されることが適切である。
【００１９】適切な標的物質としては、抗体、抗原、蛋
白質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド（アミノ、ヒドロ
キシル、スルフヒドリル、カルボキシル、もしくはカル
ボニル基の内の一つを含むように誘導化されている）、
およびオキシもしくはデオキシポリ核酸（アミノ、ヒド
ロキシル、チオホスホリル、スルフヒドリル、カルボキ
シル、もしくはカルボニル基の内の一つを含むように誘
導化されている）、細胞、ポリマー粒子、あるいはガラ
スビーズが挙げられる。別の態様では、標的は先に同定
される反応基を含むように誘導化されて、その複合体上
の官能基と共有結合を形成してもよい。
【００２０】第二態様では本発明の蛍光複合体は、複合
体を含むポリマーの形成に適する重合可能な基を含んで
いてもよい。適切な重合可能基は、アクリレート、メタ
クリレート、およびアクリルアミドから選択される。重
合は、本発明の適切な誘導化複合体を、第二の重合可能
なモノマー出発物質（例えばスチレンもしくはビニルト
ルエン）とともに用いて実施し、蛍光複合体を含むコポ
リマーを形成させることができる。
【００２１】別法では本発明の蛍光複合体は、他の物質
に非共有結合により結合させるのに用いられる場合に
は、反応基を有する必要がない。例えば、複合体は、重
合もしくは粒子形成中に取り込ませてもよく、またはポ
リマー粒子内もしくはその上に吸収させてもよい。
【００２２】複合体は、その複合体に親水性特性を付与
するためにその複合体に連結された水溶性化用構成物を
含んでいてもよい。これらはシアニン蛍光色素の芳香族
環系に連結されることが好ましい。このシアニン染料が
水溶性化用構成物を含まない場合には、他の染料もしく
はリンカー部分がその水溶性化基を含むことが可能であ
る。この水溶性化用構成物は、複合体の標的結合基とは
非反応性である必要がある。適切な可溶化用構成物は、
アミド、スルホン酸エステル、硫酸エステル、リン酸エ
ステル、第四級アンモニウム、ヒドロキシル、グアニジ
ニウム、およびホスホン酸エステルからなる群より選択
される。シアニン蛍光染料の芳香族環に直接連結された
スルホン酸エステルもしくはスルホン酸基が特に好まし
い。水への溶解度は、アミノ基もしくはスルフヒドリル
基で誘導化された蛋白質ならびにオキシおよびデオキシ
核酸を水溶液中で標識する場合に必要である。別法で
は、親水性が低い極性形態のエネルギー伝達化合物を、
塩基対間のインターカレーションによるか、もしくはＤ
ＮＡの小溝内の相互作用によりＤＮＡに非共有結合的に
結合することができる。このような化合物はＤＮＡの定
量化もしくは位置決定に有用である。
【００２３】単一のドナーおよび単一のアクセプター蛍
光色素を含む本発明の態様に加えて、蛍光標識用複合体
は更に別の蛍光色素を含んでいてもよい。この更に別の
蛍光色素は、エネルギー伝達を生じさせる吸収スペクト
ルもしくは発光スペクトルを有しなければならない。例
えば、第三蛍光色素を第二蛍光色素に連結することがで
きる。この例では、第三蛍光色素の発光スペクトルの波
長は第二蛍光色素の発光波長よりも長く、かつその第二
蛍光色素の発光スペクトルの一部が第三蛍光色素の吸収
スペクトルの一部と重複し、第一蛍光色素から第二蛍光
色素へ吸収されたエネルギーが第三蛍光色素へと伝達さ
れる。
【００２４】本発明の別の態様では、複合体は複数の第
一蛍光色素を含んでいてもよく、その各々は第二蛍光色
素にリンカー部分により共有結合的に連結されており、
かつその各々は光で励起されたとき第二蛍光色素にエネ
ルギーを伝達することが可能である。本発明の更に別の
態様では、複合体は複数の第二蛍光色素を含んでいても
よく、その各々は第一蛍光色素にリンカー部分により共
有結合的に連結されており、かつ第一蛍光色素が光によ
り励起されたときその各々は第一蛍光色素からエネルギ
ーを受け取ることが可能である。複数の第一蛍光色素お
よび複数の第二蛍光色素は同一分子であってもよく、異
なる分子であってもよい。例えば、各々が異なる波長で
励起可能ないくつかのドナー蛍光色素が存在して異なる
励起光源に適応することができる。
【００２５】本発明の更に別の態様では、複合体は一つ
もしくは複数の第二蛍光色素を含んでいてもよく、その
各々は一つもしくは複数の第一蛍光色素にリンカー部分
により共有結合的に連結され、かつその各々は第三の蛍
光色素にリンカー部分により共有結合的に連結される。
エネルギー伝達はこれらの態様では平行に進行する。
【００２６】第一蛍光色素が２０，０００リットル／モ
ル・ｃｍを上回る吸光係数を有することが好ましく、そ
して５０，０００リットル／モル・ｃｍを上回る吸光係
数を有することが一層好ましい。第二蛍光色素は約０．
０５を上回るかもしくはそれに等しい蛍光量子収量を有
する。量子収量は一般的には分子の剛性もしくはプラナ
リティー（ｐｌａｎａｒｉｔｙ）に関与し、かつその分
子の蛍光に対するプロペンシティー（ｐｒｏｐｅｎｃｉ
ｔｙ）を示し、これはすなわち、エネルギーがその分子
に提供された場合には、熱としてよりはむしろ光として
エネルギーを放出するということである。
【００２７】本発明の複合体は少なくとも一つのシアニ
ン蛍光色素を含むことが好ましく、かつ少なくとも一つ
のポリメチンシアニン染料を含むことが好ましい。シア
ニンは、メチン架橋内の炭素原子の数、および複素原
子、もしくはシアニン染料の他の構成物を変化させるこ
とにより得られる広範囲の構造変種およびスペクトル特
性が利用可能であるため特に有用である。特定の励起源
（例えば、レーザー（一例では、ＨｅＮｅレーザーもし
くはダイオードレーザー））に相当する特定の励起波長
を有する染料を合成することが可能である。従って、可
視領域のスペクトル中のほとんどの波長で効率よく吸収
および発光を行うエネルギー伝達標識を作製することが
可能である。一般的に用いられる励起源はレーザー線４
８８ｎｍで励起する。この励起波長が本発明の記載の目
的で用いられるであろうが、当業者には、本発明の範囲
から逸脱することなく、特異的な励起源のために他のエ
ネルギー伝達標識を作製し得ることが理解されるべきで
ある。
【００２８】本発明の蛍光標識用複合体中にドナーおよ
びアクセプター蛍光色素として用いることが可能な染料
の例を式２（カスケードブルー）および式３（ＦＩＴ
Ｃ）：
【化３】 ならびに式（４）
【化４】 ［式中、Ｘは、Ｃ（ＣＨ3）2、硫黄、および酸素から選
択され、Ｒ1およびＲ2は独立に、ＣＨ2ＮＨ2、ＳＯ3 -、
ＣＨ2ＣＯＯＨ、およびＮＣＳからなる群より選択さ
れ、Ｐは、ＳＯ3 -、ＮＨ2、およびＣＯＯＨから選択さ
れ、かつｎは１〜５の整数である］に示す。
【００２９】本発明の複合体に使用するための別のシア
ニンは、「剛性モノメチンシアニン（Ｒｉｇｉｄｉｚｅ
ｄ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｉｎｅ Ｃｙａｎｉｎｅｓ）」と
題され、本明細書と同一日に出願されたＷａｇｇｏｎｅ
ｒらの同時係属出願において開示される剛性モノメチン
シアニンである。このモノメチン剛性染料は以下の一般
式（５）：
【化５】 を有し、任意に１〜６個の基Ｒ2〜Ｒ7により置換されて
いてもよい：［式中、Ｔは
【化６】 が６員環もしくは７員環であるような連結基であり、Ｘ
およびＹは、ビス−置換化炭素、酸素、硫黄、セレン、
−ＣＨ＝ＣＨ−、および−Ｎ−Ｗから選択され、式中、
Ｎは窒素であり、かつＷは、水素および基−（ＣＨ2）n
Ｒ8から選択され、ここで、ｎは１〜２６の整数であ
り、Ｒ8は、水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、
ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、
ヒドロキシル、スルホン酸エステル、硫酸エステル、カ
ルボン酸エステル、置換化アミノ、第四級アミノ、ニト
ロ、第一級アミド、置換化アミド、ならびに、アミノ、
ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、もしくはスル
フヒドリル基と反応性である基から選択され；基Ｚ1お
よびＺ2は、１つの、２つ、または３つの融合した芳香
族環を完成するのに必要な原子を表し、各環は、炭素原
子、および場合によっては２以下の酸素、窒素、および
硫黄原子から選択される５もしくは６個の原子を含み；
かつＲ2およびＲ3は、Ｔが炭素原子を含む場合にはＴの
炭素に連結されている］。
【００３０】剛性モノメチンシアニン染料はシャープで
顕著な吸収シグナルおよび発光シグナルを有し、これら
は光安定性を示す。所定の剛性モノメチンシアニン染料
は３００ｎｍと５００ｎｍとの間の波長に吸収極大およ
び発光極大を有する。
【００３１】シアニン蛍光色素に加えて、他の低分子蛍
光色素を、フルオレセイン、ピレントリスルホン酸エス
テル（これは、「カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ
Ｂｌｕｅ）」の商標で販売されている）、ローダミン、
およびビス−ピロメチン二フッ化ホウ素染料の誘導体
（例えば、３，３’，５，５’−テトラメチル−２，
２’−ピロロメテン−１，１’−二フッ化ホウ素（これ
は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．社によ
りＢＯＤＩＰＹの商標で販売されている）から選択する
ことができる。ＢＯＤＩＰＹアナログが、米国特許第４
７７４３３９号、第５１８７２２３号、第５２４８７８
２号、および第５２７４１１３号（Ｈａｕｇｌａｎｄお
よびＫａｎｇ）、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ Ｉｎｃ．社により発行されている「Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」に
おいて開示されている。
【００３２】非常に大きな励起−発光波長シフトを取得
するためには、この複合体内での連続的エネルギー伝達
段階を用いることが可能である。例えば、３つの発色団
を連結させることで、シアニン染料であるヘプタメチン
シアニンＣＹ７（化合物４、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ3）2、Ｒ1、
Ｒ2＝−ＳＯ3 -、Ｐ＝ＣＯＯＨ、ｎ＝５、ｍ＝３）の波
長での極大発光、すなわち４８８ｎｍでの励起に関して
７８０ｎｍ以上が得られている。最初のドナーはイソチ
オシアン酸フルオレセインであり、そしてこの複合体中
の中間発蛍光団はＣＹ３と表示されるトリメチンシアニ
ン染料（化合物４、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ3）2、Ｒ1＝Ｒ2＝ＣＨ
2ＮＨ2、Ｐ＝ＳＯ3 -、ｎ＝４、ｍ＝１）であった。フル
オレセインを４８８ｎｍで励起させ、かつその励起状態
エネルギーのほぼ１００％をトリメチンシアニンに伝達
させ、次にこれはその励起状態エネルギーの約９０％を
ＣＹ７に伝達し、７８２ｎｍでの蛍光を呈した。ペンタ
メチンシアニンＣＹ５をＣＹ７の代わりに用いた場合に
同一の効率が観察され、６６７ｎｍでの蛍光を生じた。
このような多重発色団複合体は多色検出系にとって特に
有用である。
【００３３】幾つかの複合体が効率のよいエネルギー伝
達を示すものの、これらの標識用複合体の総計量子収量
は更に改善することができる。例えば、ＣＹ５のものよ
りも高い量子収量を有するアクセプター染料の使用によ
りその複合体の総合的な明度が改善されるであろう。
【００３４】本発明の蛍光標識用複合体は低分子量を有
し、かつ抗体、他の蛋白質、およびＤＮＡプローブと容
易にコンジュゲートすることができる。本明細書におい
て用いられる際には、低分子量は、複合体の蛍光色素お
よびリンカーの合計分子量が好ましくは約５００ダルト
ンと１０００ダルトンとの間であり、そして２蛍光色素
複合体に関しては好ましくは１０００〜２５００ダルト
ンの範囲であることを意味する。従ってこれらの標識種
は、現在用いられている大きなフィコビリプロテイン標
識が可能であるよりも、細胞間環境内への浸透性がかな
り大きくなるであろう。本発明の低分子量蛍光複合体
は、フローサイトメトリーのみならず、レーザー共焦顕
微鏡、および単一波長励起での多色検出を必要とする他
の検出系にも有用である。
【００３５】本発明は、試薬、ならびに既述の蛍光水溶
性標識用複合体を担体物質とともにインキュベートする
ことを含む、その試薬を作製するための方法を含む。
【００３６】本発明は更に、蛍光標識用複合体の製造の
ための方法も提供し、この方法はエネルギー伝達ドナー
−アクセプター複合体を形成するための当業者に知られ
る方法によりシアニンもしくは他の蛍光色素に蛍光色素
（例えば、シアニン蛍光色素）を共有結合的に連結させ
ることを含む。
【００３７】例えば、連結部がアミドもしくはエステル
を含む本発明の複合体は、式（６）の化合物を式（７）
の化合物と反応させることにより製造することができ
る： Ｒ−（Ｍ）−ＣＯＡ （６） Ｂ−（Ｎ）−Ｒ’ （７） ［式中、ＲおよびＲ’は異なる蛍光色素であり；ＣＯＡ
は活性化されたもしくは活性化可能ななカルボキシル基
であり；ＢはＮＨ2もしくはＯＨであり；かつＭおよび
Ｎは独立に、Ｃ1-12アルキルを含み、任意に一つもしく
は複数の連結用フェニル、ナフチル、アミド、エステ
ル、もしくはエーテル官能基を含む脂肪族部分であ
る］。例えば、Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．
４、ｐｐ．１０５−１１１、（１９９３）；Ｗａｇｇｏ
ｎｅｒらの米国特許第５２６８４８６（この開示は引用
により本明細書に取り込まれる）、を参照せよ。適切な
基Ａには、ハロ（例えば、クロロもしくはブロモ）、パ
ラ−ニトロフェノキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、あるいはＯＣＯＲ”（式中、Ｒ”はＣ1-6アルキル
である）が含まれる。
【００３８】連結部がアミノ、エーテルもしくはチオエ
ーテル基を含む本発明の複合体は、式（８）の化合物を
式（９）の化合物と反応させることにより製造すること
ができる： Ｒ−（Ｍ）−Ｂ’ （８） Ｃ−（Ｎ）−Ｒ’ （９） ［式中、Ｒ、Ｒ’、Ｍ、およびＮは先に定義したとおり
であり；Ｂ’は、ＯＨ、ＮＨ2、もしくはＳＨであり；
かつＣは置換可能な基（例えば、ヨウ素もしくはパラ−
トルエンスルホン酸エステル）である］。反応は塩基の
存在下で適切に実施される。
【００３９】別法では、本発明の複合体は、最初に、コ
ンジュゲートされていないリンカーを用いて２つの染料
前駆体を一緒にカップリングさせて、構造（１０）： Ｘａ−（Ｌ）−Ｘｂ （１０） ［式中、ＸａおよびＸｂは独立に、置換されたもしくは
置換されていない複素環式前駆体であり、（Ｌ）はコン
ジュゲートされていないリンカー基であり、任意に一つ
もしくは複数の連結用フェニル、ナフチル、ビシクロ
［２．２．２］オクチル、エーテル、アミン、エステ
ル、もしくはアミド基、あるいはそれらの組み合わせを
含むＣ1-12アルキルを含む］により表される中間体を得
ることにより製造することができる。適切な複素環式前
駆体ＸａおよびＸｂを表１、化合物ＩおよびＩＩ、に示
す。一例を挙げると、リンカーが２つのインドレニン単
位の窒素原子に連結されたアルキル鎖からなる中間体
（１０）の合成は、一段階もしくは二段階反応方法のい
ずれかにより、α，ω−ジハロアルカン（例えば、１，
６−ジブロモヘキサン）との反応により行うことができ
る。好ましくは、反応は高温（例えば、約１００〜１１
０℃）で、不活性溶媒（例えば、キシレン）中で実施さ
れる。例えば、Ｈａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．、「Ｔｈｅ Ｃｙ
ａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍ
ｐｏｕｎｄｓ」、ｐ６７６、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ（１９６４）（この開示は引用により本明
細書に取り込まれる）、を参照せよ。
【００４０】中間体（１０）は次に、当業者に知られる
方法により、リンカーにより連結される２つの異なる発
蛍光団を含む複合体の形成において中間体として用いる
ことができる。例えば、Ｈａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．、「Ｔｈ
ｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅ
ｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、ｐ．１１８−１１９、Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９６４）（この
開示は引用により本明細書に取り込まれる）、を参照せ
よ。
【００４１】以下の実施例は、本発明の複合体の製造法
およびそれらのスペクトル特性を説明する。
【００４２】
【実施例】
（実施例１） ＣＹ５−ＣＹ７複合体の製造
【化７】 塩化シアヌル（トリクロロトリアジン）（５ｍｇ）、炭
酸水素ナトリウム（２ｍｇ）、および精製したジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）（０．２５ｍｌ）を０℃で混合
した。この溶液に、アミノシアニン染料（Ｍｕｊｕｍｄ
ａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１
０，ｐｐ．１１−１９，（１９８９），上述のＣＹ５を
含むボックスにより示される）５ｍｇを加え、混合物を
０℃で１０分間撹拌した。室温で一夜撹拌を続けた。薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、１つのメジャース
ポットおよび２つのマイナースポットを示した。後者の
スポットは、不純物であると判定された。
【００４３】反応混合物は、エーテルで析出させること
により後処理した。濃青色粉末が得られた。ＤＭＦ
（０．３ｍｌ）を加えて、粉末を溶解した。この溶液
に、炭酸水素ナトリウム（２ｍｇ）およびＣＹ７を含む
ボックスにより示されるアミノＣＹ７染料４．７ｍｇを
加えた。混合物を室温で２４時間撹拌した。生成物を析
出させ、エーテルで数回洗浄し、濃色粉末を得た。複合
体は、６５０ｎｍ（ＣＹ５）および７６１ｎｍ（ＣＹ
７）にピークを有する、個々の蛍光色素の吸収スペクト
ルを示し、このことは、新規の発色団が生成されなかっ
たことを示した。
【００４４】（実施例２） 複合体１および関連化合物
の合成（表２を参照） i） 一般的方法 ａ） 染料の精製 蛍光色素の精製は、Ｃ８−ＲＰカラムを備えたＳｐｅｃ
ｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ ｍｏｄｅｌ ＳＰ８７００
分析ＨＰＬＣユニットで実施した。精製はまた、慣用法
すなわち市販のＣ１８−ＲＰ粉末上のフラッシュカラム
クロマトグラフィーによっても行うことができる。すべ
ての実験において、溶出には水／メタノール混合物を用
いた。染料は、６０−７０℃における回転蒸留により画
分から回収し、ほとんど損失はなかった。さらに精製す
るためには、未検出のカウンターイオン組成物を含む蛍
光色素を、Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗカラム（水素形）に通し
た。
【００４５】ｂ） 分光測定および分析的判定 紫外線／可視スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋ
ａｒｄ ＨＰ８４５２ダイオードアレイ分光分析機で測
定した。プロトンＮＭＲスペクトルは、溶媒としてＤ2
Ｏ，ＣＤ3ＯＤまたはＤＭＳＯ−ｄ６を用いて、ＩＢＭ
３００ ＦＴ−ＮＭＲ分析機で得た。ＮＭＲシグナル
は、シングレットについてはｓ、ダブレットについては
ｄ、トリプレットについてはｔ、カルテットについては
ｑ、およびマルチプレットについてはｍを用いて、δで
記載される。蛍光測定は、ＳＰＥＸＦｌｕｏｒｏｌｏｇ
２ システムを用いて行った。量子収量は、Ｍｕｊｕ
ｍｄａｒ Ｒ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ，”Ｃｙａｎｉｎｅ
Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｃｏ
ｎｔａｉｎｉｎｇ ＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅＧｒ
ｏｕｐｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐ
ｐ．１１−１９（１９８９）に記載されるような既知の
技術を用いて判定した。
【００４６】ｃ） 細胞の調製およびフローサイトメト
リ 単核白血球は、健康なボランティアから分離したヒスト
パーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）密度１．０７７から得
た。リンパ球の集団を、前および横のスキャッター特性
に基づいてフローサイトメトリで選択した。特異的モノ
クローナル抗体（ＣＤ４（Ｔ−ヘルパー細胞を染色）お
よびＣＤ３（ｐａｎ Ｔ細胞集団を染色）を用いてサブ
集団を同定した。複合体１を付けた抗体の光学濃度は、
希釈列の結果の分析により判定した。直接免疫蛍光法
は、推奨される量の標識抗体を１−２×１０6個の細胞
とともに、４℃において４５分間インキュベートするこ
とにより実施した。次に、２％ウシ胎児結成および０．
１％アジ化ナトリウムを含むハンク（Ｈａｎｋ）の平衡
塩溶液（ＨＢＳＳ）で試料を２回洗浄した。最後の洗浄
の後、細胞を、１％パラホルムアルデヒドを含む１ｍｌ
のＨＢＳＳに再懸濁し、１週間以内に分析した。フロー
サイトメトリ測定は、Ｃｏｎｓｏｒｔ ４０データ分析
システムを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＦＡＣＳ ４４０デュアルレーザーフローサイトメータ
で実施した。アルゴンイオンレーザーは、４８８ｎｍの
励起光４００ｍＷを与えた。複合体１およびＲ−フィコ
エリスリンからの蛍光シグナルは、それぞれ６７０／１
３．５ｎｍおよび５７５／２６ｎｍのバンドパスフィル
ターを用いて集めた。
【００４７】ｄ） ドナー消光効率（ＤＯＥ）の計算 共鳴エネルギー伝達効率は、ドナーの蛍光強度の消光か
ら概算した。蛍光実験におけるそれぞれの相対濃度を決
定するために、ドナー（単独）および蛍光標識複合体の
の吸収および蛍光スペクトルを得た。ドナー励起を用い
て両方の化合物の発光スペクトルを得た。次に、 ＤＱＥ％ ＝ （１ − ＦETＡ／ＦＡET） × １００ ［式中、Ｆはドナー単独の蛍光強度であり、ＦETはドナ
ー波長における複合体の蛍光強度であり、Ａは励起波長
におけるドナー単独の吸収であり、ＡETは励起波長にお
ける蛍光標識複合体の吸収である］を用いてＤＱＥを計
算した。
【００４８】ｅ） 蛍光色素の合成 エネルギー伝達蛍光色素のための前駆体として必要なア
ミノシアニン（ＣＹ３ＮＨ2，ＣＹ３（ＮＨ2）2および
ＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3）およびカルボキシアルキルシアニン
（ＣＹ５ＣＯＯＨ，ＣＹ３Ｏ（ＳＯ3）2，ＣＹ５（ＳＯ
3）2およびＣＹ７（ＳＯ3）2）は、以前に記載された方
法により合成した（Ｅｒｎｓｔ， Ｌ．Ａ．ｅｔ ａ
ｌ，”Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ
Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ Ｇ
ｒｏｕｐｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐ
ｐ．３−１０，（１９８９），Ｈａｍｍｅｒ，Ｆ．
Ｍ．，”Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ
Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，（Ｗｉｌｅ
ｙ，ｐｕｂ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９６４），Ｍｕｊｕ
ｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，”Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄ
ｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｇｒｏｕｐｓ”，Ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１１−１９，（１９
８９）；Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，”Ｃ
ｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ ＬａｂｅｌｌｉｎｇＲｅａｇｅ
ｎｔｓ：Ｓｕｌｐｈｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．１
０５−１１１，（１９９３）；Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ，
Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，”Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａ
ｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ： Ｃａｒｂｏｘｙ
ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ．１１，ｐｐ．４１８−４３０，（１９９０））。
以下に、１つのアミノ−シアニン蛍光色素であるＣＹ３
ＮＨ2ＳＯ3の合成および性質、ならびにこれをＣＹ５
（ＳＯ3）2のスクシンイミジルエステルとコンジュゲー
トさせることによる複合体１の形成を記載する。すべて
の蛍光色素のスペクトル特性は、表３および表４に示さ
れる。非対称トリメチンカルボシアニンであるＣＹ３Ｎ
Ｈ2ＳＯ3は、４段階で合成した。構造（I）〜（VI）に
ついては表１を参照されたい。
【００４９】表１
【化８】 １．５．１ ５−フタルイミドメチル−１−（ε−カル
ボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドール
（III）の合成 Ｇａｌｅ ａｎｄ Ｗｉｌｓｈｉｒｅ，”Ｔｈｅ Ａｍ
ｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｏｍｉｎ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ Ｂａｓｅ．Ｔ
ｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｎｅ
ｗ Ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎｅ Ｄｙｅｓ”，Ａｕｓｔ．
Ｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．６８９−６９
４，（１９７７）の方法にしたがって、５−フタルイミ
ドメチル−２，３，３−トリメチルインドレニン（II）
を合成した。濃硫酸（３６０ｍｌ）中の２，３，３−ト
リメチル−（３Ｈ）−インドレニン（I）（７０ｇ，
０．４４ｍｏｌ）の撹拌溶液に、粉末Ｎ−ヒドロキシメ
チルフタルイミド（７０ｇ，０．４ｍｏｌ）を、室温で
４５分間かけて少しずつ加えた。溶液を室温で７０時間
撹拌し、氷水中に注いだ。濃水酸化アンモニウムにより
溶液を塩基性として黄色粉末を得、これを濾過し、乾燥
した。（１１１ｇ，収率８０％，ｍｐ．１８０−１８２
℃）。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6），δ，７．８−
７．９５（ｍ，４Ｈ，フタルイミド），７．４（ｓ，１
Ｈ，４−Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．ＯＨｚ，
６−Ｈ），７．２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，７−
Ｈ），４．７（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ2），２．２（ｓ，３
Ｈ，ＣＨ3），１．２（ｓ，６Ｈ，−（ＣＨ3）2）。
【００５０】この乾燥粉末（１０ｇ，０．０３ｍｏｌ）
および６−ブロモヘキサン酸（９．１ｇ，０．０５ｍｏ
ｌ）を１，２−ジクロロベンゼン（２５ｍｌ）中で混合
し、窒素雰囲気下で１２５℃において１２時間加熱し
た。混合物を冷却した。１，２−ジクロロベンゼンをデ
カントし、固体物質ををイソプロパノール中で砕いて、
遊離粉末を得た。（１１ｇ，収率８０％，ｍｐ．１２４
−１２６℃）。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6），δ，
７．８−７．９５（ｍ，４Ｈ，フタルイミド），７．４
（ｓ，１Ｈ，４−Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．
０Ｈｚ，６−Ｈ），７．２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ，７−Ｈ），４．７（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ2），４．５
（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，α−ＣＨ2），２．３
（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ，ε−ＣＨ2），１．９９
（ｍ，２Ｈ，β−ＣＨ2），２．３−１．７（ｍ，４
Ｈ，γ−ＣＨ2および６Ｈ−（ＣＨ3）2のｓと融合した
δ−ＣＨ2）。
【００５１】１．５．２ １−（ε−カルボキシペンチ
ル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−
スルホネート（IV）の合成 化合物（IV）は、Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
（１９９３）（上掲）に記載される方法にしたがって合
成した。２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５
−スルホネートのカリウム塩（１１ｇ，０．０４ｍｏ
ｌ）および６−ブロモヘキサン酸（９．８ｇ， ０．０
５ｍｏｌ）を１，２−ジクロロベンゼン（１００ｍｌ）
中で混合し、窒素雰囲気下で１１０℃において１２時間
加熱した。混合物を冷却した。１，２−ジクロロベンゼ
ンをデカントし、固体物質をイソプロパノール中で砕い
て、遊離粉末を得た。（１１ｇ，収率８０％）。λｍａ
ｘ（水）２７５ｎｍ：1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ），δ，８．
１３（ｓ，１Ｈ，４−Ｈ），８．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ
＝９．０，１．１Ｈｚ，６−Ｈ），７．２（ｄ，１Ｈ，
Ｊ＝９．０Ｈｚ，７−Ｈ），４．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝
７．５Ｈｚ，α−ＣＨ2），２．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝
７．５Ｈｚ，γ−ＣＨ2），１．９９（ｍ，２Ｈ，β−
ＣＨ2），１．３５−１．６６（ｍ，４Ｈ，δ−ＣＨ2，
１γ−ＣＨ2），１．６１（ｓ，６Ｈ，−（ＣＨ3）2。
Ｒｆ＝０．５５（Ｃ−１８，水−メタノール２５％）。
【００５２】１．５．３ 中間体（V）の合成 酢酸（２０ｍｌ）中の１−（ε−カルボキシペンチル）
−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スル
ホネート（IV）（１０ｇ，０．０３ｍｏｌ）およびＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．２ｇ，０．０４ｍｏ
ｌ）を１時間加熱還流した。回転蒸溜器で酢酸を除去
し、生成物を酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で洗浄して、
暗褐色固体を得た。λｍａｘ（水）４１５ｎｍ。Ｒｆ＝
０．３２（Ｃ−１８，水中２５％メタノール）。このよ
うにして得られた粗生成物を、さらに精製することなく
次の反応で用いた。固体（３．８ｇ）を無水酢酸（１０
ｍｌ）およびピリジン（５ｍｌ）の混合物に溶解した。
５−フタルイミドメチル−１−（ε−カルボキシペンチ
ル）−２，３，３−トリメチルインドール（III）
（２．５ｇ，６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１１０
℃において１時間加熱した。溶液を冷却し、ジエチルエ
ーテル（５００ｍｌ）で希釈した。生成物は赤色粉末の
形で分離し、上清液体をデカントによりこれから分離し
た。これを最小用量のメタノールに溶解し、２−プロパ
ノールから再析出させた。生成物を濾紙上に回収し、乾
燥して、化合物（V）５．３ｇを得た。これを、溶出液
として水とメタノールの混合物を用いて、逆相Ｃ−１８
でフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した
（１．６ｇ，収率３０％）。λｍａｘ（水）５５４ｎ
ｍ，ε１．３×ｌ０5Ｌ／ｍｏｌ．ｃｍ．1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤ3ＯＤ），δ，８．５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１４Ｈ
ｚ，架橋のβ−プロトン），７．８−８．０（ｍ，６
Ｈ，フタルイミド基の４つのプロトンおよびスルホイン
ドール環の４−Ｈおよび６−Ｈ），７．５５（ｓ，２
Ｈ，４’−Ｈ），７．６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ，
６’−Ｈ），７．３（２つのｄ，２Ｈ，７−Ｈおよび
７’−Ｈ），６．１−６．３（ｔ，２Ｈ，架橋のα，
α’−プロトン），４．１（ｍ，４Ｈ，α，α’−ＣＨ
2−），２．９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＯ
Ｈ），１．４−２．０（ｍ，２１Ｈ，３つの−ＣＨ2，
１つの−ＣＨ3，および２つの−（ＣＨ3）2，フタルイ
ミドメチル基のメチルプロトンは、４．８における水の
シグナルと融合した。
【００５３】１．５．４ （V）の加水分解による（V
I）の製造 化合物（V）（１．ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を濃塩酸（５
ｍｌ）に溶解し、１２時間加熱還流した。冷却した後、
結晶質フタル酸を濾別した。回転蒸溜器で濾液を濃縮
し、次に温度を３０℃以下に維持しながら濃水酸化アン
モニウムでゆっくり中和した。溶出液として水−メタノ
ール混合物を用いる逆相カラムクロマトグラフィーによ
り純粋な蛍光色素ＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3（VI）を得た。λｍ
ａｘ（メタノール）５５２ｎｍ。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ6），δ，８．４５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１
Ｈ，９−Ｈ），７．３−７．９（ｍ，６Ｈ，芳香族性プ
ロトン），６．５５（ｄｄ，２Ｈ，８および８’−
Ｈ），４．５（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），４．１（ｓ，
２Ｈ，ＣＨ2ＮＨ2），２．１５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ
ＯＨ，架橋のα，α’−プロトン），４．１（ｍ，４
Ｈ，α，α’−ＣＨ2−），２．９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７
Ｈｚ，−ＣＨ2ＣＯＯＨ），１．２５−１．８（ブロー
ドｍ，２４Ｈ，２つの−（ＣＨ2）2および６−Ｃ−（Ｃ
Ｈ3）2）。Ｒｆ＝０．４１５（ＲＰＣ−１８，水中６０
％メタノール）。
【００５４】１．５．５ 複合体１の合成 Ｍｕｊｕｍｄａｒｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．１０５−１１
１，（１９９３）の方法により製造したＣＹ５（Ｓ
Ｏ3）2スクシンイミジルエステルの乾燥粉末（４２５ｍ
ｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液
（０．１Ｍ，ｐＨ９．４）１０ｍｌ中のよく撹拌したＣ
Ｙ３ＮＨ2ＳＯ3（２００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）の溶
液に少しずつ加えた。さらに３０分間撹拌を続け、その
後に、反応系を、溶出液として水−メタノール（６．
３：３．７）を用いるＣ−１８逆相粉末上のフラッシュ
カラムクロマトグラフィーにより精製した。５ｍｌずつ
の分画を回収し、ＴＬＣでモニターした。ＣＹ５（ＳＯ
3）2酸およびＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3を含む画分は廃棄した。
紫色の画分を、メタノール中で紫外光で検査し、複合体
１蛍光色素（表２）を含む画分を回収した。溶媒を蒸発
させて、複合体１を紫色粉末として得た（収率３７
％）。Ｒｆ＝０．４５（ＲＰ ３７％メタノール−
水）。Ｄ2Ｏで記録された1ＨＮＭＲスペクトルは、ブロ
ードなシグナルを示し、帰属は困難であった。蛍光色素
を強酸イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ５０，Ｈ+形）で
精製した。高解像度ＦＡＢ質量分析は、１３９１．８３
に（Ｍ＋Ｈ）+イオンを示した（Ｃ73Ｈ91Ｎ5Ｏ16Ｓ3＋
Ｈは１３９１．７３を要する）。
【００５５】１．５．６ エネルギー伝達シアニン染料
のスクシンイミジルエステル 複合体１（６０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ
（１ｍｌ）および乾燥ピリジン（０．０５ｍｌ）の混合
物に溶解した。ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳ
Ｃ）（４６ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，１．５等量／カル
ボキシル基）を加え、混合物を窒素雰囲気下で５５−６
０℃で９０分間撹拌した。混合物を乾燥ジエチルエーテ
ル（２０ｍｌ）で希釈した後、上清をデカントした。生
成物をエーテルで繰り返し洗浄し、濾過し、真空下で乾
燥した。活性スクシンイミジルエステルの形成は、これ
をＤＭＦ中でベンジルアミンと反応させるかまたはｐＨ
９．４の炭酸水素緩衝液中でタウリンと反応させること
により確認した。比較のために、コンジュゲート、スク
シンイミジルエステルおよびカルボキシレートの加水分
解生成物をスポットした逆相Ｃ−１８ＴＬＣを、水−メ
タノール（１：１）混合物で展開した。Ｒｆ＝０．７８
（酸），０．３（ベンジルアミン付加物）。
【００５６】１．５．７ スクシンイミジルエステルと
抗体およびストレプトアビジンとの反応 複合体１蛍光色素スクシンイミジル活性エステルの保存
溶液を乾燥ＤＭＦ中に作成した（１ｍｇ／１００μ
ｌ）。１つの試料においては、ヒツジγ−グロブリン１
ｍｇを炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（約６．４５ｎｍｏｌ
／０．２５ｍｌ）０．２５ｍｌに溶解した。別の試料に
おいては、ストレプトアビジン（１ｍｇ）を炭酸塩−炭
酸水素塩緩衝液０．２５ｍｌに溶解した。適当な容量の
蛍光色素保存溶液をそれぞれの蛋白質溶液０．２５ｍｌ
に加えて、所望の出発蛍光色素対抗体比を作成し、それ
ぞれの反応混合物を室温で３０分間撹拌した。蛋白質コ
ンジュゲートは、アジド０．１％を含むＰＢＳ（ｐＨ
７．４）を用いるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（０．７
×２０ｃｍカラム)ゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、それぞれの試料中の未反応蛍光色素から分離した。
染料コンジュゲート蛋白質は、着色バンドとして、未反
応蛍光色素からよく分離して溶出された。ＰＢＳ中の複
合体１−ストレプトアビジンコンジュゲートの規準化し
た励起スペクトルを図５に示す。ＰＢＳ中の複合体１−
ヒツジＩｇＩの吸収スペクトルは図６に示される。図７
は、ＣＤ３抗体を検出するために用いた複合体１−スト
レプトアビジンのフローサイトメトリ分析を示す。
【００５７】本発明にしたがう別のエネルギー伝達ドナ
ーアクセプター複合体を、そのような化合物のエネルギ
ー伝達効率を調べるためにシアニン蛍光色素から製造し
た。これらの類似体の構造を表２に示す。
【００５８】前駆体シアニンのスペクトル特性は表３
に、複合体のスペクトル特性は表４に示される。
【００５９】表２ 複合体１
【化９】 複合体２
【化１０】 複合体３
【化１１】 複合体４
【化１２】 複合体５
【化１３】 複合体６
【化１４】 Ａは、エネルギーアクセプターとして作用する蛍光色素
を示し、Ｄはエネルギードナーとして作用する蛍光色素
を示す。
【００６０】表２に示されるエネルギー伝達複合体は次
のものである： 複合体１：ＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3（ドナー）＋ＣＹ５（ＳＯ
3）2（アクセプター）； 複合体２：ＣＹ３−Ｏ（ＳＯ3）2（ドナー）＋ＣＹ３Ｎ
Ｈ2（アクセプター）； 複合体３：ＣＹ３ＮＨ2（ドナー）＋ＣＹ５ＣＯＯＨ
（アクセプター）； 複合体４：ＣＹ３ＮＨ2（ドナー）＋ＣＹ５（ＳＯ3）2
（アクセプター）； 複合体５：ＣＹ３（ＮＨ2）2（ドナー）＋ＣＹ７（ＳＯ
3）2（アクセプター）； 複合体６：２ＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3（ドナー）＋ＣＹ５（Ｓ
Ｏ3）2（アクセプター）。
【００６１】
【表１】表３ 本発明の蛍光エネルギー伝達複合体の前駆体として用いられるシアニン染料のス ペクトル特性 染料 溶媒 極大吸収 極大放出 量子収量 （ｎｍ） （ｎｍ） （Ф） アミン含有シアニン染料 ＣＹ３ＮＨ2 メタノール ５５２ ５６９ ０．０５ ＰＢＳ ５４８ ５６３ ０．０５ ＣＹ３（ＮＨ2）2 メタノール ５５２ ５６９ ０．０５ ＰＢＳ ５４８ ６５３ ０．０５ ＣＹ３ＮＨ2ＳＯ3 メタノール ５５６ ５７３ ０．０８ ＰＢＳ ５４８ ６５３ ０．０９ カルボキシ含有シアニン染料 ＣＹ５ＣＯＯＨ メタノール ６５８ ６８５ ０．２２ ＰＢＳ ６４８ ６６７ ０．１３ ＣＹ５（ＳＯ3）2 メタノール ６５８ ６７７ ０．４ ＰＢＳ ６５０ ６６７ ０．２７ ＣＹ３−Ｏ（ＳＯ3）2 メタノール ４９２ ５０６ ０．２ ＰＢＳ ４８６ ５００ ０．０９ ＣＹ７（ＳＯ3）2 メタノール ７５８ ７８９ ＮＤa ＰＢＳ ７５０ ７７７ ＮＤa a ＮＤは決定していないことを意味する。 ＰＢＳはリン酸緩衝食塩水を意味する。
【００６２】エネルギー伝達の効率は、アクセプターが
結合したときに生ずるドナー蛍光の消光量（ＤＱＥ）を
計算することにより概算した。アクセプターが結合した
ときに共鳴エネルギー伝達以外の経路によりいくぶんか
の消光が生じる可能性がある。しかし、本発明の蛍光標
識複合体にとって好ましいシアニンドナーは、それらの
分子環境には比較的非感受性である。さらに、トリメチ
ンシアニンに大きな置換基を付加することは、通常はそ
の蛍光を減少ではなく増加させる。したがって、ＤＱＥ
は、エネルギー伝達効率と等しいであろう。ＤＱＥ測定
値に基づいて概算されたエネルギー伝達効率は、５０％
から９９％の範囲であり、ドナーの極大吸収と末端アク
セプターの極大発光の間の波長のシフト（ＤＩ）は、８
３ｎｍから２９４ｎｍの間でさまざまである。
【００６３】２つの複合体１および６は、アルゴンレー
ザー波長である４８８ｎｍで光を吸収することができ
る。複合体１は、単一のドナーおよび単一のアクセプタ
ーを含み、複合体６は１つのアクセプターに対して２つ
のドナーを含む。複合体１は３つのカルボキシル基を有
し、複合体６は４つのカルボキシル基を有する。これら
は、活性化によりスクシンイミジル活性エステルに変換
される。図２は、複合体１および複合体６のメタノール
中における吸収スペクトルを示す。
【００６４】複合体１を以降の研究用に選択した。図３
（ａ）および３（ｂ）に示されるように、複合体１の吸
収（実線）は、リン酸緩衝食塩水中（図３（ｂ））およ
びメタノール中（図３（ａ））でわずかに変化するが、
蛍光は変化しない。エネルギー伝達が有効である場合に
予測されるように、ドナー成分の５７２ｎｍにおける発
光は、アクセプターの６７５ｎｍにおける発光と比較し
て非常に弱い。
【００６５】図５は、活性化複合体１でヒツジ抗体を容
易に標識しうることを示す。種々の染料：蛋白質比でヒ
ツジＩｇＧとコンジュゲートさせた複合体１から作成し
たコンジュゲートを試験した。最も低い染料：蛋白質比
は、０．８の第１のピーク（およそ２７０ｎｍ）を有す
る線により表され、最も高い染料：蛋白質比は、０．４
よりわずかに小さい第１のピーク（およそ２７０ｎｍ）
を有する線により表される。染料：蛋白質比を増加させ
たとき、ドナーまたはアクセプターのいずれの蛍光色素
に関してもダイマーの形成は認められなかった。それぞ
れの複合体１は、最大３個の反応性基を含む。架橋が生
じなければ、より多い反応性基を用いることもできる。
蛍光を消光させる蛋白質架橋を回避する標識条件を用い
ることが重要である。二重に活性化されたシアニンによ
る架橋は、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａ
ｌ，”Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ
Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｎｄ
ｏｃｙａｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔ
ｅｒｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ４
１８−４３０，（１９９０）により観察されており、標
識すべき蛋白質の濃度を約１ｍｇ／ｍｌに制限すること
により最小にすることができる。
【００６６】表４に示されるように、抗体と結合したと
きに、複合体の量子収量は３倍増強された。これは、蛋
白質の表面に結合したときに移動性が制限されるため
に、複合体１のＣＹ３成分およびＣＹ５成分の両方の非
照射不活性化経路が減少するためであると考えられる。
Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，”Ｃｙａｎｉ
ｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ
ｓ： Ｓｕｌｐｈｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．１０
５−１１１，（１９９３）に記載されるように、コンフ
ォメーション的な移動性を制限する他の手段は、シアニ
ン蛍光色素の蛍光効率を増加させることが知られてい
る。実際、表４に示されるように、複合体１をグリセリ
ンに溶解したとき、量子収量は数倍増加する。
【００６７】
【表２】表４ エネルギー伝達複合体のスペクトル特性 染料 極大 励起 極大 量子 伝達された 波長 Ａｂｓ 波長 Ｅｍ 収量 エネルギー シフト （ｎｍ） （ｎｍ） （ｎｍ） （Ф） （％） （ｎｍ） 複合体１a 556 (9.5), 488 675 0.32 91 119 652 (14.3) 514 676 0.37 92 120 600 673 0.49 - - 複合体１b 536 (16), 488 675 0.03 89 139 658 (16) 514 673 0.04 89 137 600 668 0.21 - - 複合体１c 558, 658 488 674 0.11 95 116 (PBS) 514 673 0.13 95 116 600 676 0.14 - - 複合体１d 562, 658 488 674 0.19 ND ND 514 674 0.32 ND ND 600 674 0.39 ND ND 複合体２a 490 (13), 466 571 0.15 89 81 554 (9.5) 複合体３a 545 (9.5), 514 679 0.08 83 133 658 (14.3) 複合体４a 550 (9.4), 514 674 0.2 96 124 656 (14.2) 複合体５a 445 (9.5), 520 782 ND 99 226 754 (14.4) 複合体６a 556 (9.5), 488 674 0.23 49 118 652 (14.4) 514 674 0.24 50 118 600 674 0.34 - - 複合体６b 548 20.0), 488 566 0.05 43 118 652 (15.0) 514 564 0.05 38 116 600 668 0.23 - -a ＝メタノール中；b＝ＰＢＳ中；c ＝ストレプトアビジン上の複合体１，ｄ／ｐ＝４d ＝グリセリン中；e＝Ｅｍmax（Ａ）−Ａｂmax（Ｄ）の差異 ＮＤは、決定していないことを意味する。
【００６８】活性化複合体１は、４８８ｎｍでの励起に
よる２色フローサイトメトリ実験のための蛍光標識とし
て用いることができる。スキャッタープロットは図６に
示される。ヒトＴ−リンパ球を用いて、複合体１標識と
別の２色試薬であるＲ−フィコエリスリン（これもまた
４８８ｎｍで励起し５７５ｎｍで発光する）とを比較し
た。複合体１標識したストレプトアビジン（蛍光色素／
蛋白質−４）を用いて、ビオチニル化ＣＤ３抗体（すべ
てのＴ細胞をマークする）を検出した。同一のリンパ球
試料において、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ４
を用いてＴ細胞のヘルパー細胞サブセットをマークし
た。したがって、リンパ球の全集団において、ＣＤ３も
ＣＤ４も含まない細胞集団（すなわち、図６の二次元ス
キャッタープロットの左下集団に示されるＣＤ３
（−）、ＣＤ４（−））、フィコエリスリンのシグナル
を有しない複合体１標識ＣＤ３（＋）細胞のサブセット
（すなわち、図６の左上集団に示されるＣＤ３（＋），
ＣＤ４（−））、およびフィコエリスリン染色される複
合体１標識細胞を含む第３のサブセット（すなわち、図
６の右上集団に示されるＣＤ３（＋），ＣＤ４（＋））
が存在する。複合体１が（＋）および（−）の細胞集団
のベースライン分離を与えること、および複合体１蛍光
のフィコエリスリンチャネルへの溢出が最小であること
が明らかである。複合体１蛍光色素は、蛍光色素を５１
４ｎｍで励起したときに３倍明るいシグナルを与えた。
【００６９】（実施例３）次の式（１０）に一般構造が
示されるいくつかの別の複合体を合成した。表５は、メ
タノール中の溶液におけるこれらのスペクトル特性を示
す。
【００７０】
【化１５】
【００７１】表５
【表３】
【００７２】これらの一連のスペクトルは、長いストー
クスシフトを有する有効なエネルギー伝達を示す。それ
ぞれの発光スペクトルは、実質的にすべての発光がそれ
ぞれのシリーズの最終アクセプター蛍光色素からのもの
であり、ドナーフルオレセインまたは中間体シアニンの
いずれからも発光が最小であったことを示す。
【００７３】標的生物学的化合物の存在を検出するため
に、多くの試料の多重パラメータ分析を行うことができ
る。それぞれの試料を、よく知られた標識方法により異
なる複合体で標識する。例えば、標的生物学的化合物を
含むと疑われる１つの試料を、単一の蛍光色素（例え
ば、フルオレセイン、カスケードブルー、ＢＯＤＩＰＹ
染料、またはモノメチン剛性染料またはＣＹ３Ｏ（ＳＯ
3）2またはＣＹ３（ＳＯ3）2；これらはすべて５００−
５７５ｎｍの波長範囲（緑またはオレンジ）で発光す
る）とともにインキュベートする。標的生物学的化合物
を含むと疑われる第２の試料（試料１と同一の化合物ま
たは異なる化合物）を、本発明の複合体（例えば、フル
オレセイン−ＣＹ３ＮＨ2；４８８ｎｍで光を吸収し、
５７４ｎｍ（オレンジ）で蛍光を放出する）とともにイ
ンキュベートする。別の標的化合物を含む別の試料を、
本発明の他の標識複合体（例えば、フルオレセイン−Ｃ
Ｙ３−ＣＹ５およびフルオレセイン−ＣＹ３−ＣＹ７：
いずれも４８８ｎｍで光を吸収し、それぞれ６７２ｎｍ
および７８２ｎｍ（赤から近赤外）で蛍光を放出する）
とともにインキュベートする。蛍光標識が標的化合物と
結合するための適当な時間の後、洗浄により非結合標識
を除去し、標識された試料を混合する。検出は、単一波
長の励起源、すなわちレーザー光４８８ｎｍで行うこと
ができる。それぞれの、別々に標識した試料は、その特
定の標識の発光波長において異なる色の蛍光を発するで
あろう。当業者は、本発明の蛍光標識複合体を、種々の
免疫蛍光技術（例えば直接および間接イムノアッセイ）
および他の既知の蛍光検出方法に用いることができるこ
とを理解するであろう。それぞれのインキュベーション
の条件、例えば、ｐＨ、温度および時間は、当該技術分
野において知られているが、一般に室温が好ましい。ア
ミンと反応させる場合には、ｐＨ９．４が好ましい。ｐ
Ｈは、特定の反応基の最適反応条件にしたがって、既知
の方法により調節する。
【００７４】蛍光標識複合体は、担体物質（例えば、ポ
リマー粒子、細胞、ガラスビーズ、抗体、蛋白質、酵
素、炭水化物、脂質およびヌクレオチドもしくは核酸
（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびに標識複合体上の官能
基（または、上述のように、複合体上の反応性基と共有
結合を形成しうる官能基）と共有結合を形成しうる少な
くとも１つの第１の反応性基および少なくとも１つの第
２の反応性基（または場合によっては官能基）を含むよ
うに誘導化されているその類似体）に、複合体を共有結
合により結合させることにより、標的生物学的化合物
（例えば抗体、細胞、薬剤、抗原、細菌、ウイルスおよ
び他の微生物）に特異性を有し、これと共有結合を形成
しうる試薬を形成するために用いることができる。担体
が官能基を有する場合には、これは、それぞれ抗原また
は相補的ＤＮＡ配列に結合させるのに適した抗体または
ＤＮＡでありうる。担体材料がその上に反応性基を有す
る場合、担体は、例えばＤＮＡまたは抗体に結合させる
のに適したポリマー粒子または抗原でありうる。上述し
たような、蛍光色素を担体分子に共有結合させるための
技術は、当該技術分野においてよく知られており、文献
から容易に入手可能である。担体はさらに、アミノ、ス
ルフヒドリル、カルボキシル、カルボニルまたはヒドロ
キシル基の１つを含むように誘導化されたヌクレオチ
ド、およびアミノ、チオホスホリル、スルフヒドリル、
カルボキシル、カルボニルまたはヒドロキシル基の１つ
を含むように誘導化されたオキシもしくはデオキシポリ
核酸を含むことができる。本発明の標識複合体に相補的
な（すなわちそれと共有結合を形成する）担体材料上の
官能基としては、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ
ル、カルボニルおよびヒドロキシル基が挙げられる。
【００７５】本発明のエネルギー伝達複合体と慣用のＲ
−フィコエリスリン染料との比較を以下の表６に示す。
【００７６】
【表４】表６ 複合体２ 対 Ｒ−フィコエリスリン R-フィコエリスリン 複合体２ 励起波長（ｎｍ） ４８８ ４８８ 発光波長（ｎｍ） ５８０ ５７８ ４８８−レーザー光 ＰＥ蛍光は、ｐＨ８．５ シグナルは、すべての フローサイトメーター で大きく減少し、ｐＨ ｐＨ範囲で安定であった ９．５で消失した ＭＷ ２４００００ １６６７ 染色 容易には細胞内組織に侵 標識抗体は細胞内組織に 入して標的抗原に到達し 侵入して標的抗原に到達 ない する 結合速度 抗原への結合速度は遅い 迅速な結合
【００７７】本発明のエネルギー伝達複合体は、多重パ
ラメータ分析において特に有用であり、かつ重要なこと
には分子量が十分に低いため蛍光複合体で標識した物質
がすべての構造に侵入しうる、蛍光標識の有用なセット
を提供する。複合体はそれ自体ＤＮＡプローブとしての
使用に非常に適している。本発明の複合体およびこれか
ら作成しうる試薬は、大きいストークスシフトを有する
広範な種類の蛍光標識を提供する。当業者は、本発明の
複合体を、広範な可視スペクトルにわたる種々の蛍光用
途に使用しうることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のエネルギー伝達標識複合体
において用いることができる４つのシアニン蛍光色素の
重複する吸収および発光スペクトルを図示したものであ
る。
【図２】 図２は、２つの蛍光標識複合体の吸収スペク
トルを図示したものである：メタノール中の、１つのシ
アニンドナーおよび１つのシアニンアクセプターからな
る複合体１（実線）、およびメタノール中の、２つのシ
アニンドナーおよび１つのシアニンアクセプターからな
る複合体６（破線）。
【図３】 図３（ａ）および（ｂ）は、メタノール
（ａ）およびＰＢＳ（ｂ）中の、トリメチンおよびペン
タメチンシアニン染料から作成した本発明の複合体１の
吸収（実線）および発光（破線）スペクトルを図示した
ものである。
【図４】 図４は、ＰＢＳ中（実線）、メタノール中
（−・・・−）、グリセロール中（−・−）の複合体
１、およびＰＢＳ中の複合体１−ストレプトアビジンコ
ンジュゲート（−−−）の、規準化した励起スペクトル
を図示したものである。
【図５】 図５は、種々の染料分子：蛋白質比（１−
４：１）における、ヒツジＩｇＧ−複合体１コンジュゲ
ートのＰＢＳ中の吸収スペクトルを図示したものであ
り、染料：蛋白質比を増加させても、ドナーまたはアク
セプターのいずれに関してもダイマーの形成が認められ
なかったことを示す。
【図６】 図６は、Ｔ細胞のヘルパー細胞サブセットお
よび全Ｔ細胞サブセットをそれぞれマークする抗ＣＤ４
−ＰＥおよび抗ＣＤ３−ストレプトアビジン−複合体１
で標識したヒトリンパ球の２色フローサイトメトリ分析
を図示したものである。ＰＥシグナルを有しない複合体
１標識細胞のサブセットおよびＰＥ染色される複合体１
標識細胞の第２のサブセットが示される。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年８月９日
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のエネルギー伝達標識複合体
において用いることができる４つのシアニン蛍光色素の
重複する吸収および発光スペクトルを図示したものであ
る。
【図２】 図２は、２つの蛍光標識複合体の吸収スペク
トルを図示したものである：メタノール中の、１つのシ
アニンドナーおよび１つのシアニンアクセプターからな
る複合体１（実線）、およびメタノール中の、２つのシ
アニンドナーおよび１つのシアニンアクセプターからな
る複合体６（破線）。
【図３】 図３は、メタノール（ａ）およびＰＢＳ
（ｂ）中の、トリメチンおよびペンタメチンシアニン染
料から作成した本発明の複合体１の吸収（実線）および
発光（破線）スペクトルを図示したものである。
【図４】 図４は、ＰＢＳ中（実線）、メタノール中
（−・・・−）、グリセロール中（−・−）の複合体
１、およびＰＢＳ中の複合体１−ストレプトアビジンコ
ンジュゲート（−−−）の、規準化した励起スペクトル
を図示したものである。
【図５】 図５は、種々の染料分子：蛋白質比（１−
４：１）における、ヒツジＩｇＧ−複合体１コンジュゲ
ートのＰＢＳ中の吸収スペクトルを図示したものであ
り、染料：蛋白質比を増加させても、ドナーまたはアク
セプターのいずれに関してもダイマーの形成が認められ
なかったことを示す。
【図６】 図６は、Ｔ細胞のヘルパー細胞サブセットお
よび全Ｔ細胞サブセットをそれぞれマークする抗ＣＤ４
−ＰＥおよび抗ＣＤ３−ストレプトアビジン−複合体１
で標識したヒトリンパ球の２色フローサイトメトリ分析
を図示したものである。ＰＥシグナルを有しない複合体
１標識細胞のサブセットおよびＰＥ染色される複合体１
標識細胞の第２のサブセットが示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スワティ・アール・ムジュムダル アメリカ合衆国ぺンシルバニア州15116, グレンショー，ノートヘブン・サークル 624 (72)発明者 ラトナカル・ビー・ムジュムダル アメリカ合衆国ぺンシルバニア州15116, グレンショー，ノートヘブン・サークル 624

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 i） 第１の吸収および発光スペクトル
    を有する第１の蛍光色素； ii） 第２の吸収および発光スペクトルを有する第２の
    蛍光色素、ここで前記第２の蛍光色素の発光スペクトル
    の波長は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルの波長
    より長く、かつ前記第２の蛍光色素の吸収スペクトルの
    一部は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルの一部と
    重複しており、 iii） 前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素との
    間に共鳴エネルギーを移動させるために前記第１および
    第２の蛍光色素を共有結合により結合する少なくとも１
    つのリンカー； iv） 標的化合物と共有結合を形成しうる少なくとも１
    つの標的結合基；を含む複合体であって、前記第１およ
    び第２の蛍光色素および前記リンカーの分子量の合計が
    約２０，０００ダルトン未満である複合体。
  2. 【請求項２】 前記第１および第２の蛍光色素の少なく
    とも１つがシアニン染料である、請求項１記載の複合
    体。
  3. 【請求項３】 さらに、そこに結合した水可溶化構成物
    を含み、前記水可溶化構成物は前記標的結合基と非反応
    性である、請求項１または２に記載の複合体。
  4. 【請求項４】 前記水可溶化構成物が、アミド、スルホ
    ネート、サルフェート、ホスフェート、４級アンモニウ
    ム、ヒドロキシ、グアニジニウムおよびホスホネートか
    ら選択される、請求項３記載の複合体。
  5. 【請求項５】 前記標的結合基が、スクシンイミジルエ
    ステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ハロア
    セトアミド、ジクロロトリアジン、マレイミド、ハロゲ
    ン化スロホニル、アルキルイミドエステル、アリールイ
    ミドエステル、置換ヒドラジン、置換ヒドロキシルアミ
    ン、カルボジイミド、ハロゲン化アシル、無水物、ホス
    ホルアミダイト、アクリレートおよびアクリルアミドか
    らなる群より選択される反応性基である、請求項１また
    は２に記載の複合体。
  6. 【請求項６】 前記第１および第２の蛍光色素および前
    記リンカーの分子量の合計が、約５００から約１０，０
    ００ダルトンの範囲内である、請求項１〜３のいずれか
    に記載の複合体。
  7. 【請求項７】 さらに、第３の吸収および発光スペクト
    ルを有し、かつ前記第２の蛍光色素に共有結合により結
    合している第３の蛍光色素を含み、前記第３の蛍光色素
    の極大発光の波長は、前記第２の蛍光色素の極大発光の
    波長より長く、かつ前記第２の蛍光色素の発光スペクト
    ルの一部は、前記第１の蛍光色素の励起が前記第３の蛍
    光色素からの蛍光を生ずるように前記第３の蛍光色素の
    吸収スペクトルの一部と重複している、請求項１記載の
    複合体。
  8. 【請求項８】 さらに、そこに結合した水可溶化構成物
    を含み、前記水可溶化構成物は前記標的結合基と非反応
    性である、請求項７記載の複合体。
  9. 【請求項９】 前記第１の蛍光色素が、モノメチン、剛
    性シアニン染料、トリメチンシアニン染料、フルオレセ
    イン、ピレントリスルホネート、二フッ化ビスピロメチ
    ンホウ素染料からなる群より選択され、かつ前記第２お
    よび第３の蛍光色素がポリメチンシアニン染料である、
    請求項７または８に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】 さらに、 i） それぞれがリンカーを介して前記第２の蛍光色素
    に共有結合により結合している複数の前記第１の蛍光色
    素であって、前記第１の蛍光色素のそれぞれは光による
    励起により前記第２の蛍光色素にエネルギーを伝達する
    ことができる；または ii） それぞれがリンカーを介して前記第１の蛍光色素
    に共有結合により結合している複数の前記第２の蛍光色
    素であって、前記第２の蛍光色素のそれぞれは前記第１
    の蛍光色素が光により励起されたときに、前記第１の蛍
    光色素からエネルギーを受け取ることができるにより前
    記第２の蛍光色素にエネルギーを伝達することができ
    る；のいずれか、および標的化合物と共有結合を形成し
    うる少なくとも１つの標的結合基を含む、請求項１記載
    の複合体。
  11. 【請求項１１】 さらに、そこに結合した水可溶化構成
    物を含み、前記水可溶化構成物は前記標的結合基と非反
    応性である、請求項１０記載の複合体。
  12. 【請求項１２】 前記水可溶化構成物が、アミド、スル
    ホネート、サルフェート、ホスフェート、４級アンモニ
    ウム、ヒドロキシ、グアニジニウムおよびホスホネート
    から選択される、請求項１１記載の複合体。
  13. 【請求項１３】 前記標的結合基が、スクシンイミジル
    エステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ハロ
    アセトアミド、ジクロロトリアジン、マレイミド、ハロ
    ゲン化スロホニル、アルキルイミドエステル、アリール
    イミドエステル、置換ヒドラジン、置換ヒドロキシルア
    ミン、カルボジイミド、ハロゲン化アシル、無水物、ホ
    スホルアミダイト、アクリレートおよびアクリルアミド
    からなる群より選択される反応性基である、請求項１０
    または１１に記載の複合体。
  14. 【請求項１４】 Ａ） i） １つまたはそれ以上の低分子量の第１の蛍光色素
    であって、それぞれが第１の吸収および発光スペクトル
    を有し、リンカーを介して、それぞれが第２の吸収およ
    び発光スペクトルを有する１つまたはそれ以上の低分子
    量の第２の蛍光色素に共有結合により結合しており、こ
    こで、少なくとも１つの前記第２の蛍光色素の極大発光
    の波長は、少なくとも１つの前記第１の蛍光色素の極大
    発光の波長より長く、少なくとも１つの前記第２の蛍光
    色素の吸収スペクトルの一部は、光で励起されたときに
    前記第１の蛍光色素により吸収されたエネルギーを前記
    第２の蛍光色素に伝達するために、少なくとも１つの前
    記第１の蛍光色素の発光スペクトルの一部と重複してお
    り； ii） 担体物質と共有結合を形成しうる少なくとも１つ
    の結合基；および iii） 前記複合体に結合している少なくとも１つの水
    可溶化構成物であって、前記水可溶化構成物は前記少な
    くとも１つの結合基と非反応性である；からなる水可溶
    性蛍光標識複合体および Ｂ） 前記複合体の前記結合基と反応し、前記複合体に
    共有結合している担体物質； を含む試薬。
  15. 【請求項１５】 少なくとも１つの前記第１および第２
    の蛍光色素がシアニン染料である、請求項１４記載の試
    薬。
  16. 【請求項１６】 前記担体物質が、アミノ、スルフヒド
    リル、カルボニル、ヒドロキシおよびカルボキシからな
    る群より選択される官能基を有し、前記担体物質が、ア
    ミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシおよび
    カルボキシ、ホスフェートおよびチオホスフェート基、
    およびオキシの１つを含むように誘導化されている抗
    体、脂質、蛋白質、炭水化物、ヌクレオチド、またはア
    ミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシおよび
    カルボキシ、ホスフェートおよびチオホスフェート基の
    １つを含むように誘導かされているデオキシポリ核酸か
    らなる群より選択される、請求項１４記載の試薬。
  17. 【請求項１７】 担体物質を標識する方法であって、担
    体物質を含む水性試料を、 i） 第２の吸収および発光スペクトルを有する第２の
    蛍光色素に共有結合により結合している、第１の吸収お
    よび発光スペクトルを有する第１の蛍光色素であって、
    前記第２の蛍光色素の発光スペクトルの波長は、前記第
    １の蛍光色素の発光スペクトルの波長より長く、かつ前
    記第２の蛍光色素の吸収スペクトルは、光により励起さ
    れたときに前記第１の含むクロムにより吸収されたエネ
    ルギーを前記第２の含むクロムに移動させるために、前
    記第１の蛍光色素の発光スペクトルと重複しており； ii） 前記担体物質の相補基と共有結合を形成しうる結
    合基；および iii） 前記複合体に極性性質を与えるための水可溶化
    構成物であって、前記水可溶化構成物は、前記複合体の
    前記結合基を前記担体物質の前記相補基に共有結合させ
    るのに十分な時間前記結合基と非反応性である；からな
    る低分子量の水可溶性蛍光標識複合体とともにインキュ
    ベートすることを含む方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜１６のいずれかに記載の複
    合体の、分析または検出用の試薬としての使用。
JP8146333A 1995-06-07 1996-06-07 シアニンと他の蛍光色素とをカップリングさせることにより形成される共鳴エネルギー伝達が可能な大きなストークスシフトを有する蛍光標識用複合体 Expired - Lifetime JP2843296B2 (ja)

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