JPH09135687A - Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 - Google Patents
Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法Info
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- JPH09135687A JPH09135687A JP8241695A JP24169596A JPH09135687A JP H09135687 A JPH09135687 A JP H09135687A JP 8241695 A JP8241695 A JP 8241695A JP 24169596 A JP24169596 A JP 24169596A JP H09135687 A JPH09135687 A JP H09135687A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸およびそれ
らの塩の工業的に有利な効率的製造法の提供。 【解決手段】 パントテン酸生合成遺伝子領域(または
その一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(ま
たはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミド
で形質転換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸または
その塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
Ｄ−パント酸またはその塩の製造法。
らの塩の工業的に有利な効率的製造法の提供。 【解決手段】 パントテン酸生合成遺伝子領域(または
その一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(ま
たはその一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミド
で形質転換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸または
その塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
Ｄ−パント酸またはその塩の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤ−パント酸および
／またはＤ−パントテン酸またはそれらの塩の新規な製
造法に関する。パントテン酸はビタミンとして有用な物
質であり、Ｄ−パント酸はパントテン酸やＣoＡの重要
な合成中間体として有用な物質である。
／またはＤ−パントテン酸またはそれらの塩の新規な製
造法に関する。パントテン酸はビタミンとして有用な物
質であり、Ｄ−パント酸はパントテン酸やＣoＡの重要
な合成中間体として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ−パントテン酸はビタミンとして有用
な物質であるが、従来の製造法としては(１)ＤＬ−パン
トラクトンを光学分割してＤ−パントラクトンと、β−
アラニンまたはその塩をメタノール中で化学的に縮合さ
せる方法や、(２)微生物あるいは酵素を用いてＤ−パン
トテン酸エステルを加水分解してＤ−パントテン酸を得
る方法や、ＤＬ−パントテン酸エステルのＤ−体のみを
選択的に加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法(特
開平１−２２８４８７号、特開平１−２２８４８８
号)、(３)微生物の休止菌体またはその酵素にＤ−パン
ト酸カリウム塩とβ−アラニンとＡＴＰをトリス緩衝液
中で接触させて得る方法[ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Ｊournal of Ｂiological Ｃ
hemistry)、第１９８巻２３頁(１９５２)と第１７６回
アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・ナショナル・
ミーティング要旨集(Ａbstracts of Ｐapers １７６
th Ａmerican Ｃhemical Ｓociety Ｎational Ｍe
eting)、マイクロバイアル・アンド、バイオケミカル・
テクノロジー部門(Ｄivision of Ｍicrobial and
Ｂiochemical Ｔechnology)、４８番(１９７８)などに
記載]、(４)特定の微生物をＤＬ−パント酸とβ−アラ
ニンの存在下で培養し、Ｄ−パント酸を特異的にβ−ア
ラニンと縮合させることによってＤ−パントテン酸を得
る方法(特開平５−２３１９１号)、(５)特定の微生物を
β−アラニンの存在下で培養し、Ｄ−パントテン酸を得
る方法(特開平６−２６１７７２号)などが知られてい
る。
な物質であるが、従来の製造法としては(１)ＤＬ−パン
トラクトンを光学分割してＤ−パントラクトンと、β−
アラニンまたはその塩をメタノール中で化学的に縮合さ
せる方法や、(２)微生物あるいは酵素を用いてＤ−パン
トテン酸エステルを加水分解してＤ−パントテン酸を得
る方法や、ＤＬ−パントテン酸エステルのＤ−体のみを
選択的に加水分解してＤ−パントテン酸を得る方法(特
開平１−２２８４８７号、特開平１−２２８４８８
号)、(３)微生物の休止菌体またはその酵素にＤ−パン
ト酸カリウム塩とβ−アラニンとＡＴＰをトリス緩衝液
中で接触させて得る方法[ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Ｊournal of Ｂiological Ｃ
hemistry)、第１９８巻２３頁(１９５２)と第１７６回
アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・ナショナル・
ミーティング要旨集(Ａbstracts of Ｐapers １７６
th Ａmerican Ｃhemical Ｓociety Ｎational Ｍe
eting)、マイクロバイアル・アンド、バイオケミカル・
テクノロジー部門(Ｄivision of Ｍicrobial and
Ｂiochemical Ｔechnology)、４８番(１９７８)などに
記載]、(４)特定の微生物をＤＬ−パント酸とβ−アラ
ニンの存在下で培養し、Ｄ−パント酸を特異的にβ−ア
ラニンと縮合させることによってＤ−パントテン酸を得
る方法(特開平５−２３１９１号)、(５)特定の微生物を
β−アラニンの存在下で培養し、Ｄ−パントテン酸を得
る方法(特開平６−２６１７７２号)などが知られてい
る。
【０００３】Ｄ−パント酸および／またはＤ−パントラ
クトンの製造法としては、(６)化学的に合成されたＤＬ
−パントラクトンをキニーネ、ブルシンなどの分割剤を
使用して光学分割する方法、(７)特定の微生物を用いて
ＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンのみを分
解し、Ｄ−パントラクトンのみを取得する方法、(８)特
定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パン
トラクトンのみを酸化してケトパントラクトンに導き、
さらにこのものを不斉還元することによってＤ−パント
ラクトンを得る方法、(特開昭４７−１９７４５号)、
(９)化学的に合成されたケトパントラクトンを特定の微
生物を用いて不斉還元し、Ｄ−パントラクトンを得る方
法(特公昭６１−１４７９７号)、(１０)特定の微生物を
用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを
選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パントラクトンを得る方
法(特開昭５７−１５２８９５号および特開昭６２−２
９４０９２号)、(１１)特定の微生物を用いてＤＬ−パ
ントラクトン中のＤ−パントラクトンを選択的に不斉加
水分解し、Ｄ−パント酸を得る方法(特公平３−６５１
９８号)、(１２)特定の微生物を培養し、グルコースか
らＤ−パント酸を生合成させることによって得る方法
(特開平６−２６１７７２号)などが知られている。
クトンの製造法としては、(６)化学的に合成されたＤＬ
−パントラクトンをキニーネ、ブルシンなどの分割剤を
使用して光学分割する方法、(７)特定の微生物を用いて
ＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンのみを分
解し、Ｄ−パントラクトンのみを取得する方法、(８)特
定の微生物を用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パン
トラクトンのみを酸化してケトパントラクトンに導き、
さらにこのものを不斉還元することによってＤ−パント
ラクトンを得る方法、(特開昭４７−１９７４５号)、
(９)化学的に合成されたケトパントラクトンを特定の微
生物を用いて不斉還元し、Ｄ−パントラクトンを得る方
法(特公昭６１−１４７９７号)、(１０)特定の微生物を
用いてＤＬ−パントラクトン中のＬ−パントラクトンを
選択的に不斉加水分解し、Ｄ−パントラクトンを得る方
法(特開昭５７−１５２８９５号および特開昭６２−２
９４０９２号)、(１１)特定の微生物を用いてＤＬ−パ
ントラクトン中のＤ−パントラクトンを選択的に不斉加
水分解し、Ｄ−パント酸を得る方法(特公平３−６５１
９８号)、(１２)特定の微生物を培養し、グルコースか
らＤ−パント酸を生合成させることによって得る方法
(特開平６−２６１７７２号)などが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】工業的にＤ−パントテ
ン酸(以下、その塩も含む)を製造するに当たり、(１)の
方法は主原料となるＤＬ−パントラクトンの合成に煩雑
なる工程を要するのみならず、その光学分割には煩雑か
つ困難な工程を伴っている。(２)の方法はＤＬ−パント
ラクトンからＤ−パントテン酸エステルやＤＬ−パント
テン酸エステルを製造する工程を要するという欠点があ
る。(３)の方法は高価なＡＴＰやトリス緩衝液を使用す
る点で不利であり、生成したパントテン酸の量も微量で
しかも高価なＤ−パント酸を原料として用いた場合実用
的でない。(４)の方法は他の方法に比べてシンプルな製
造法であるが、ＤＬ−パント酸製造工程やラセミ化工程
が必要である。(５)の方法は(４)の方法をさらにシンプ
ルにしたものであるが、パントテン酸の生合成経路の上
流に位置するバリン生合成経路の活性が培養後期には消
失し、パントテン酸生成はバリンの枯渇に伴い止まって
しまうため、蓄積量に限界がある。
ン酸(以下、その塩も含む)を製造するに当たり、(１)の
方法は主原料となるＤＬ−パントラクトンの合成に煩雑
なる工程を要するのみならず、その光学分割には煩雑か
つ困難な工程を伴っている。(２)の方法はＤＬ−パント
ラクトンからＤ−パントテン酸エステルやＤＬ−パント
テン酸エステルを製造する工程を要するという欠点があ
る。(３)の方法は高価なＡＴＰやトリス緩衝液を使用す
る点で不利であり、生成したパントテン酸の量も微量で
しかも高価なＤ−パント酸を原料として用いた場合実用
的でない。(４)の方法は他の方法に比べてシンプルな製
造法であるが、ＤＬ−パント酸製造工程やラセミ化工程
が必要である。(５)の方法は(４)の方法をさらにシンプ
ルにしたものであるが、パントテン酸の生合成経路の上
流に位置するバリン生合成経路の活性が培養後期には消
失し、パントテン酸生成はバリンの枯渇に伴い止まって
しまうため、蓄積量に限界がある。
【０００５】また、Ｄ−パント酸および／またはＤ−パ
ントラクトンの製造法のほとんどは合成に煩雑な工程を
要するＤＬ−パントラクトンを出発原料としている欠点
を有するのみならず、(６)の方法は高価な分割剤を使用
し、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でないなどの欠点
を有し、(７)の方法はＤＬ−パントラクトンの半分量が
損失量となるという欠点を有している。(８)、(９)、
(１０)、(１１)の方法は使用する微生物の性質上、ある
いはパントラクトン(またはパント酸)の性質上、培養液
中に光学純度１００％でＤ−体のみを製造するのは非常
に困難である。また、(６)、(１０)、(１１)の方法は残
ったＬ−体を回収、再利用することを前提としているた
め、さらに煩雑な工程が増えることになる。また、(１
２)の方法はＤ−パントテン酸製造法での(５)と同様
に、Ｄ−パント酸蓄積量はバリン生合成活性に依存して
いる。
ントラクトンの製造法のほとんどは合成に煩雑な工程を
要するＤＬ−パントラクトンを出発原料としている欠点
を有するのみならず、(６)の方法は高価な分割剤を使用
し、Ｄ−パントラクトンの回収も容易でないなどの欠点
を有し、(７)の方法はＤＬ−パントラクトンの半分量が
損失量となるという欠点を有している。(８)、(９)、
(１０)、(１１)の方法は使用する微生物の性質上、ある
いはパントラクトン(またはパント酸)の性質上、培養液
中に光学純度１００％でＤ−体のみを製造するのは非常
に困難である。また、(６)、(１０)、(１１)の方法は残
ったＬ−体を回収、再利用することを前提としているた
め、さらに煩雑な工程が増えることになる。また、(１
２)の方法はＤ−パントテン酸製造法での(５)と同様
に、Ｄ−パント酸蓄積量はバリン生合成活性に依存して
いる。
【０００６】
【課題を解決しようとする手段】本発明者らは、Ｄ−パ
ントテン酸の工業的に有利な、より効率的な製造法につ
き鋭意検討した結果、微生物をβ−アラニンを添加した
培地にて培養し、Ｄ−パントテン酸を蓄積させる方法に
おいて分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子の組み込まれたプラ
スミドを用いて形質転換せしめた菌株が培地中にＤ−パ
ントテン酸またはＤ−パント酸(および／またはＤ−パ
ントラクトン)を、さらに高濃度蓄積することを見出し
た。本プラスミド導入により、培養前半でのバリン生成
活性が向上し、中後期にかけてその活性がさらに持続す
る。その結果パントテン酸生成もさらに長時間持続し、
最終蓄積量の増大が得られた。
ントテン酸の工業的に有利な、より効率的な製造法につ
き鋭意検討した結果、微生物をβ−アラニンを添加した
培地にて培養し、Ｄ−パントテン酸を蓄積させる方法に
おいて分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子の組み込まれたプラ
スミドを用いて形質転換せしめた菌株が培地中にＤ−パ
ントテン酸またはＤ−パント酸(および／またはＤ−パ
ントラクトン)を、さらに高濃度蓄積することを見出し
た。本プラスミド導入により、培養前半でのバリン生成
活性が向上し、中後期にかけてその活性がさらに持続す
る。その結果パントテン酸生成もさらに長時間持続し、
最終蓄積量の増大が得られた。
【０００７】すなわち本発明は、 （Ｉ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)
および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその
一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転
換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パン
ト酸またはその塩の製造法、 （ＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはそ
の一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質
転換させた微生物をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ
−パントテン酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の
製造法、 （ＩＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその
一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分
岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有
するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微
生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするＤ−パント酸また
はその塩の製造法、 （ＩＶ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)を有するプラスミドおよび分岐鎖アミノ酸生合成系
遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込ん
だプラスミドで形質転換させた微生物をβ−アラニンの
存在下に培養し、Ｄ−パントテン酸またはその塩を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パントテ
ン酸またはその塩の製造法、 （Ｖ）１）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその
一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(または
その一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドまた
は ２）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)を
有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分岐鎖アミ
ノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドで形質転換されたパント酸生
産能またはβ−アラニン存在下でパントテン酸生産能を
有する微生物、および （ＶＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはそ
の一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドに関す
る。 本発明により(５)、(１２)で問題となっていたバリン生
産性が高まり、より高濃度のパントテン酸の蓄積が可能
となる。
および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその
一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転
換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パン
ト酸またはその塩の製造法、 （ＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはそ
の一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質
転換させた微生物をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ
−パントテン酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の
製造法、 （ＩＩＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその
一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分
岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有
するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微
生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするＤ−パント酸また
はその塩の製造法、 （ＩＶ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)を有するプラスミドおよび分岐鎖アミノ酸生合成系
遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮＡを組み込ん
だプラスミドで形質転換させた微生物をβ−アラニンの
存在下に培養し、Ｄ−パントテン酸またはその塩を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パントテ
ン酸またはその塩の製造法、 （Ｖ）１）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその
一部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(または
その一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドまた
は ２）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一部)を
有するＤＮＡを組み込んだプラスミドおよび分岐鎖アミ
ノ酸生合成系遺伝子領域(またはその一部)を有するＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドで形質転換されたパント酸生
産能またはβ−アラニン存在下でパントテン酸生産能を
有する微生物、および （ＶＩ）パントテン酸生合成遺伝子領域(またはその一
部)および分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域(またはそ
の一部)を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドに関す
る。 本発明により(５)、(１２)で問題となっていたバリン生
産性が高まり、より高濃度のパントテン酸の蓄積が可能
となる。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。なお、本
発明において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸および
β−アラニンは、その塩であってもよく、本明細書の記
載において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸およびβ
−アラニンと称する場合、遊離体のみならずその塩も含
む。Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸、β−アラニンの
塩としてはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩が
挙げられる。いずれも、カルシウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩が好ましい。
発明において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸および
β−アラニンは、その塩であってもよく、本明細書の記
載において、Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸およびβ
−アラニンと称する場合、遊離体のみならずその塩も含
む。Ｄ−パント酸、Ｄ−パントテン酸、β−アラニンの
塩としてはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩が
挙げられる。いずれも、カルシウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩が好ましい。
【０００９】本発明者らは、エシェリヒア属等の微生物
を用いて糖類などの炭素源から、直接発酵法により、さ
らに効率的かつ経済的にＤ−パント酸を製造する方法を
開発すべく研究を行った結果、パントテン酸生合成経路
のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路を、
遺伝子組み換え技術を用いて強化した微生物の中に大量
のＤ−パント酸を生産する能力を有する菌株があること
を見いだし、さらにこの様な微生物を炭素源を含む培地
中でβ−アラニンと接触させることによって大量のＤ−
パントテン酸を蓄積せしめることが可能であることを見
いだした。すなわち、本発明におけるＤ−パント酸およ
びＤ−パントテン酸合成法は、１)微生物の有するパン
ト酸およびパントテン酸合成能を利用し、グルコースな
どの種々の炭素源からＤ−パント酸を生合成せしめ、こ
れを培地中に蓄積させるか、２)培地中にβ−アラニン
を添加する等してβ−アラニンと微生物とを接触させる
ことにより、β−アラニンと、生合成されたＤ−パント
酸とを微生物によって縮合せしめることによりＤ−パン
トテン酸を蓄積させるものであり、パントテン酸生合成
経路のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路
を遺伝子組み換え技術を用いて強化することにより、さ
らに高濃度のＤ−パント酸、Ｄ−パントテン酸を蓄積さ
せるものである。
を用いて糖類などの炭素源から、直接発酵法により、さ
らに効率的かつ経済的にＤ−パント酸を製造する方法を
開発すべく研究を行った結果、パントテン酸生合成経路
のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路を、
遺伝子組み換え技術を用いて強化した微生物の中に大量
のＤ−パント酸を生産する能力を有する菌株があること
を見いだし、さらにこの様な微生物を炭素源を含む培地
中でβ−アラニンと接触させることによって大量のＤ−
パントテン酸を蓄積せしめることが可能であることを見
いだした。すなわち、本発明におけるＤ−パント酸およ
びＤ−パントテン酸合成法は、１)微生物の有するパン
ト酸およびパントテン酸合成能を利用し、グルコースな
どの種々の炭素源からＤ−パント酸を生合成せしめ、こ
れを培地中に蓄積させるか、２)培地中にβ−アラニン
を添加する等してβ−アラニンと微生物とを接触させる
ことにより、β−アラニンと、生合成されたＤ−パント
酸とを微生物によって縮合せしめることによりＤ−パン
トテン酸を蓄積させるものであり、パントテン酸生合成
経路のみならず、その上流に位置するバリン生合成経路
を遺伝子組み換え技術を用いて強化することにより、さ
らに高濃度のＤ−パント酸、Ｄ−パントテン酸を蓄積さ
せるものである。
【００１０】本発明に用いられる微生物としては、β−
アラニンの存在下でＤ−パントテン酸合成能を有する微
生物や、Ｄ−パント酸合成能を有する微生物をそれぞれ
用いることができる。とりわけ、実用面からエンテロバ
クテリアシー科の微生物が好適であり、例えば、シトロ
バクター属、シゲラ属、クレブシエラ属、エンテロバク
ター属、サルモネラ属およびエシェリヒア属に属する菌
が挙げられる。本発明に用いられるより好ましい菌株の
具体例としては、エシェリヒア属菌が挙げられ、その具
体例としては、エシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７など
財団法人発酵研究所の「リスト・オブ・カルチャーズ(Ｌ
ist of Ｃultures)、第８版、１９８８」に掲載されて
いるようなエシェリヒア・コリの公知菌株およびこれら
に由来する菌株が挙げられる。具体的には、エシェリヒ
ア・コリＩＦＯ３５４７よりサリチル酸耐性、α−ケト
イソ吉草酸耐性、α−ケト酪酸耐性、β−ヒドロキシア
スパラギン酸耐性、o−メチルスレオニン耐性を付与す
ることによって得られたＦＶ５０６９株、パントテン酸
生合成遺伝子領域またはその一部および分岐鎖アミノ酸
生合成系遺伝子領域またはその一部を組み込んだプラス
ミドpＦＶ２０２で形質転換したエシェリヒア・コリＦ
Ｖ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭＢＰ−５２２
７）などが挙げられる。
アラニンの存在下でＤ−パントテン酸合成能を有する微
生物や、Ｄ−パント酸合成能を有する微生物をそれぞれ
用いることができる。とりわけ、実用面からエンテロバ
クテリアシー科の微生物が好適であり、例えば、シトロ
バクター属、シゲラ属、クレブシエラ属、エンテロバク
ター属、サルモネラ属およびエシェリヒア属に属する菌
が挙げられる。本発明に用いられるより好ましい菌株の
具体例としては、エシェリヒア属菌が挙げられ、その具
体例としては、エシェリヒア・コリＩＦＯ３５４７など
財団法人発酵研究所の「リスト・オブ・カルチャーズ(Ｌ
ist of Ｃultures)、第８版、１９８８」に掲載されて
いるようなエシェリヒア・コリの公知菌株およびこれら
に由来する菌株が挙げられる。具体的には、エシェリヒ
ア・コリＩＦＯ３５４７よりサリチル酸耐性、α−ケト
イソ吉草酸耐性、α−ケト酪酸耐性、β−ヒドロキシア
スパラギン酸耐性、o−メチルスレオニン耐性を付与す
ることによって得られたＦＶ５０６９株、パントテン酸
生合成遺伝子領域またはその一部および分岐鎖アミノ酸
生合成系遺伝子領域またはその一部を組み込んだプラス
ミドpＦＶ２０２で形質転換したエシェリヒア・コリＦ
Ｖ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭＢＰ−５２２
７）などが挙げられる。
【００１１】分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子を含む遺伝
子断片の調製法としては、例えば、エイチ・サイトーお
よびケイ・ミウラ、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ
・アクタ(Ｈ．Ｓaito and Ｋ．Ｍiura Ｂiochim．Ｂ
iophys．Ａcta)の方法またはそれに準ずる方法等の公知
方法によりまず、供与菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次
いで、これを制限酵素ＨindIIIを用いて切断する方法な
どが挙げられる。次に、この様にして得られた染色体Ｄ
ＮＡ断片はベクターＤＮＡに挿入される。本発明に使用
されるベクターＤＮＡは、受容菌で増殖しうるものの中
から適宜選択しうる。受容菌で増殖可能なプラスミドと
しては、例えば、pＳＣ１０１[プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci.，Ｕ.Ｓ.Ａ.)、７０、３２４０(１９７３)]、pＵ
Ｃ１８[ジーン(Ｇene)、３３、１０３(１９８５)]など
が挙げられるが、特に限定されるものではなく、新たに
分離されたり、合成されたりしたベクターＤＮＡであっ
ても本発明の目的を達成しうるものであれば用いること
ができる。これらのプラスミド・ベクターに遺伝子断片
を挿入するには、ティー・マニアティスら「モレキュラ
ー・クローニング」(Ｔ．Ｍaniatis et al.，Ｍolecul
ar Ｃloning Ａ Ｌaboratory Ｍannual，Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor Ｌaboratory、東大出版会、１９８２
年)などに記載された公知の方法またはそれに準じた方
法に従い行うことができる。遺伝子断片を挿入したプラ
スミドを受容菌へ導入する場合には例えば[ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂio
l.)、５３、１５９(１９７２)]などに記載されている様
な公知の形質転換法またはそれに準じた方法が使用でき
る。該受容菌の具体例としては、エシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９株[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.)、１６６(１９８３)]などの
公知菌株が挙げられる。
子断片の調製法としては、例えば、エイチ・サイトーお
よびケイ・ミウラ、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ
・アクタ(Ｈ．Ｓaito and Ｋ．Ｍiura Ｂiochim．Ｂ
iophys．Ａcta)の方法またはそれに準ずる方法等の公知
方法によりまず、供与菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次
いで、これを制限酵素ＨindIIIを用いて切断する方法な
どが挙げられる。次に、この様にして得られた染色体Ｄ
ＮＡ断片はベクターＤＮＡに挿入される。本発明に使用
されるベクターＤＮＡは、受容菌で増殖しうるものの中
から適宜選択しうる。受容菌で増殖可能なプラスミドと
しては、例えば、pＳＣ１０１[プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci.，Ｕ.Ｓ.Ａ.)、７０、３２４０(１９７３)]、pＵ
Ｃ１８[ジーン(Ｇene)、３３、１０３(１９８５)]など
が挙げられるが、特に限定されるものではなく、新たに
分離されたり、合成されたりしたベクターＤＮＡであっ
ても本発明の目的を達成しうるものであれば用いること
ができる。これらのプラスミド・ベクターに遺伝子断片
を挿入するには、ティー・マニアティスら「モレキュラ
ー・クローニング」(Ｔ．Ｍaniatis et al.，Ｍolecul
ar Ｃloning Ａ Ｌaboratory Ｍannual，Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor Ｌaboratory、東大出版会、１９８２
年)などに記載された公知の方法またはそれに準じた方
法に従い行うことができる。遺伝子断片を挿入したプラ
スミドを受容菌へ導入する場合には例えば[ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂio
l.)、５３、１５９(１９７２)]などに記載されている様
な公知の形質転換法またはそれに準じた方法が使用でき
る。該受容菌の具体例としては、エシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９株[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.)、１６６(１９８３)]などの
公知菌株が挙げられる。
【００１２】形質転換株の中から分岐鎖アミノ酸生合成
遺伝子が挿入されているプラスミドが導入された菌株を
選択するには、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ. col
i）Ｋ−１２株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子
の配列の一部をプローブとしてコロニーハイブリダイゼ
ーションなどの方法によって選択すればよい。このよう
にして得られた分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子が組み込
まれたプラスミドＤＮＡは、その保有株から抽出し、他
の受容菌に導入したり、あるいは抽出されたプラスミド
ＤＮＡから分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子を含むＤＮＡ断
片を調製後、これを他のベクターに連結して用いること
ができる。
遺伝子が挿入されているプラスミドが導入された菌株を
選択するには、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ. col
i）Ｋ−１２株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子
の配列の一部をプローブとしてコロニーハイブリダイゼ
ーションなどの方法によって選択すればよい。このよう
にして得られた分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子が組み込
まれたプラスミドＤＮＡは、その保有株から抽出し、他
の受容菌に導入したり、あるいは抽出されたプラスミド
ＤＮＡから分岐鎖アミノ酸生合成遺伝子を含むＤＮＡ断
片を調製後、これを他のベクターに連結して用いること
ができる。
【００１３】この様にして得られた形質転換株の例とし
て、エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株
(ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７、ＩＦＯ １５８５７)が挙
げられる。pＦＶ２０２はエシェリヒア・コリＦＶ５２
５株由来のパントテン酸生合成遺伝子およびエシェリヒ
ア・コリＦＶ５０６９株由来の分岐鎖アミノ酸生合成遺
伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ
遺伝子)を導入したプラスミドであり、エシェリヒア・
コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭＢＰ−５
２２７）はpＦＶ２０２をエシェリヒア・コリＦＶ５０
６９株に導入した株である。なお、本明細書においてＩ
ＦＯ番号は財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町
２丁目１７番５号）への寄託番号を、また、ＦＥＲＭ
ＢＰ−番号はブタペスト条約の下での工業技術院生命工
学工業技術研究所(茨城県つくば市東１丁目１番３号)へ
の寄託番号を表し、特に、エシェリヒア・コリＦＶ５０
６９／pＦＶ２０２株は、平成７年９月７日に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７で工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。
て、エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株
(ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７、ＩＦＯ １５８５７)が挙
げられる。pＦＶ２０２はエシェリヒア・コリＦＶ５２
５株由来のパントテン酸生合成遺伝子およびエシェリヒ
ア・コリＦＶ５０６９株由来の分岐鎖アミノ酸生合成遺
伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ
遺伝子)を導入したプラスミドであり、エシェリヒア・
コリＦＶ５０６９／pＦＶ２０２株（ＦＥＲＭＢＰ−５
２２７）はpＦＶ２０２をエシェリヒア・コリＦＶ５０
６９株に導入した株である。なお、本明細書においてＩ
ＦＯ番号は財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町
２丁目１７番５号）への寄託番号を、また、ＦＥＲＭ
ＢＰ−番号はブタペスト条約の下での工業技術院生命工
学工業技術研究所(茨城県つくば市東１丁目１番３号)へ
の寄託番号を表し、特に、エシェリヒア・コリＦＶ５０
６９／pＦＶ２０２株は、平成７年９月７日に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７で工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。
【００１４】以上の様にして得られた菌株を培養するに
は、通常の振とう培養法(回転振とう培養法)、静置培養
法あるいは通気撹拌培養法などにより連続的あるいは間
欠的に行うことができる。用いる培地は使用する微生物
の生育しうる通常の組成のものでよく、炭素源には炭水
化物、油脂、脂肪酸、有機酸またはアルコール類の中か
ら資化しうるものを適宜選択し、単独または混合して使
用される。また、窒素源には、例えば、ペプトン、大豆
粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、酵母エキ
ス、肉エキス、麦芽エキス、尿素などの有機窒素源の他
に、硫安、塩安、硝安、リン安などの無機窒素源が必要
に応じて適宜混合してまたは単独で用いられる。また、
リン源としてリン酸１カリウム、リン酸２カリウムを用
いるのが好都合である。培地には、炭素源、窒素源、リ
ン源の他に、生育に必要な金属塩(例、硫酸マグネシウ
ム)、アミノ酸、ビタミンなどの生育必須因子や生育促
進物質を添加しても良い。培養中のpＨの管理の目的で
塩基性物質、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸カルシウムなどを適宜添加するこ
とができ、また、泡の管理のため、消泡剤の添加も有効
である。これらは、培養途上に適宜添加してもよい。さ
らに環境を好気状態にする目的で酸素を通気するのも有
効である。培養の温度は通常１５℃から４５℃、好まし
くは２５℃から４０℃で培養するのが有利である。ま
た、培養の時間はパントテン酸および／またはパント酸
の蓄積量が最大になるまで行われるが、通常、６時間か
ら１２０時間の培養で目的を達することができる。本発
明によりＤ−パントテン酸を製造する際に、原料物質で
あるβ−アラニンを当該菌体に接触させる方法として菌
株の培養開始前や培養途上の適当な時期に原料物質を添
加する方法、あるいは菌体処理物に原料物質を添加する
方法を用いることができる。菌体処理物とは、菌を培養
して得られる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー、ポ
リアクリルアミドゲルまたはk−カラギーナン包括固定
化菌体などをいう。原料物質は、水などの適当な溶剤の
溶液または懸濁液として、あるいは粉末状として、一時
的あるいは一定時間にわたり連続的にまたは間欠的に添
加される。
は、通常の振とう培養法(回転振とう培養法)、静置培養
法あるいは通気撹拌培養法などにより連続的あるいは間
欠的に行うことができる。用いる培地は使用する微生物
の生育しうる通常の組成のものでよく、炭素源には炭水
化物、油脂、脂肪酸、有機酸またはアルコール類の中か
ら資化しうるものを適宜選択し、単独または混合して使
用される。また、窒素源には、例えば、ペプトン、大豆
粉、綿実粉、コーン・スティープ・リカー、酵母エキ
ス、肉エキス、麦芽エキス、尿素などの有機窒素源の他
に、硫安、塩安、硝安、リン安などの無機窒素源が必要
に応じて適宜混合してまたは単独で用いられる。また、
リン源としてリン酸１カリウム、リン酸２カリウムを用
いるのが好都合である。培地には、炭素源、窒素源、リ
ン源の他に、生育に必要な金属塩(例、硫酸マグネシウ
ム)、アミノ酸、ビタミンなどの生育必須因子や生育促
進物質を添加しても良い。培養中のpＨの管理の目的で
塩基性物質、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、炭酸カルシウムなどを適宜添加するこ
とができ、また、泡の管理のため、消泡剤の添加も有効
である。これらは、培養途上に適宜添加してもよい。さ
らに環境を好気状態にする目的で酸素を通気するのも有
効である。培養の温度は通常１５℃から４５℃、好まし
くは２５℃から４０℃で培養するのが有利である。ま
た、培養の時間はパントテン酸および／またはパント酸
の蓄積量が最大になるまで行われるが、通常、６時間か
ら１２０時間の培養で目的を達することができる。本発
明によりＤ−パントテン酸を製造する際に、原料物質で
あるβ−アラニンを当該菌体に接触させる方法として菌
株の培養開始前や培養途上の適当な時期に原料物質を添
加する方法、あるいは菌体処理物に原料物質を添加する
方法を用いることができる。菌体処理物とは、菌を培養
して得られる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー、ポ
リアクリルアミドゲルまたはk−カラギーナン包括固定
化菌体などをいう。原料物質は、水などの適当な溶剤の
溶液または懸濁液として、あるいは粉末状として、一時
的あるいは一定時間にわたり連続的にまたは間欠的に添
加される。
【００１５】添加するβ−アラニンの濃度としては、培
地に添加する場合、微生物の生産能力に応じて添加する
のが好ましいが、経済性を考慮すれば、通常、０.１〜
６w／v％、より好ましくは０.５〜４w／v％の濃度で添
加するのが良い。上記のような培養物あるいは反応物か
らＤ−パントテン酸またはその塩を単離する場合の採取
方法は、慣用方法に従って行うことができる。例えば、
培養液から菌体を除いた後、イオン交換樹脂処理、活性
炭・合成吸着剤などを用いる吸着処理、濃縮処理、晶析
処理などの公知操作を単独または適宜組み合わせてＤ−
パントテン酸またはその塩を単離することができる。な
お、晶析方法は、特公昭４０−２３３０号に記載の方法
に準ずれば、濾過が容易な結晶が高収率で得ることがで
き、工業的生産に有利である。この晶析方法に従えば、
パントテン酸カルシウム１モルに対しメタノール４モル
と水１モルを含む溶媒水和物(パントテン酸カルシウム
・４メタノール・１水塩)が晶析結晶として得られ、乾
燥することで結晶中のメタノールおよび水は結晶中から
除去することができ、結果としてパントテン酸カルシウ
ムが得られることが、エム・イナガキ（Ｍ．Ｉnagaki）
らの報告(ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・ブレチン(Ｃhem．Ｐharm．Ｂull.)，２４，３０９７
−３１０２(１９７６))に記載されている。
地に添加する場合、微生物の生産能力に応じて添加する
のが好ましいが、経済性を考慮すれば、通常、０.１〜
６w／v％、より好ましくは０.５〜４w／v％の濃度で添
加するのが良い。上記のような培養物あるいは反応物か
らＤ−パントテン酸またはその塩を単離する場合の採取
方法は、慣用方法に従って行うことができる。例えば、
培養液から菌体を除いた後、イオン交換樹脂処理、活性
炭・合成吸着剤などを用いる吸着処理、濃縮処理、晶析
処理などの公知操作を単独または適宜組み合わせてＤ−
パントテン酸またはその塩を単離することができる。な
お、晶析方法は、特公昭４０−２３３０号に記載の方法
に準ずれば、濾過が容易な結晶が高収率で得ることがで
き、工業的生産に有利である。この晶析方法に従えば、
パントテン酸カルシウム１モルに対しメタノール４モル
と水１モルを含む溶媒水和物(パントテン酸カルシウム
・４メタノール・１水塩)が晶析結晶として得られ、乾
燥することで結晶中のメタノールおよび水は結晶中から
除去することができ、結果としてパントテン酸カルシウ
ムが得られることが、エム・イナガキ（Ｍ．Ｉnagaki）
らの報告(ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・ブレチン(Ｃhem．Ｐharm．Ｂull.)，２４，３０９７
−３１０２(１９７６))に記載されている。
【００１６】例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウムは、
以下の方法によって培養液から単離することができる。
パントテン酸またはその塩を含有する培養液から菌体を
除いた液を、カチオンを除去する目的でカチオン交換樹
脂(例えば、ダイヤイオンＰＫ−２１６(Ｈ型)、ＰＫ−
２２８(Ｈ型)(三菱化成製）)のカラムに通し、次に無機
アニオンおよびパントテン酸より酸性度の強い有機酸を
除去する目的でアニオン交換樹脂(例えば、ＰＡ−４１
２(ＯＨ型)、ＷＡ−３０(ＯＨ型)(三菱化成製）)のカラ
ムに通す。この遊離体のパントテン酸を含むカラム通過
処理液(pＨ約２.６)に水酸化カルシウムを添加し、pＨ
を約５.０に調整した後、パントテン酸として約２５％
(w／v)になるまで濃縮する。次に、この濃縮液に水酸化
カルシウムを添加し、pＨを約７.０に調整した後、活性
炭(例えば、白鷺Ａ(武田薬品製))を添加し脱色処理を行
う。活性炭を濾過により除去した後、パントテン酸カル
シウムとして約４５％から５５％(w／w)になるように濃
縮し、次にメタノールを適当量添加し、この液の水分含
有率が５％から１５％になるようにする。次にこの液を
２℃付近にまで冷却し、種晶を添加し、パントテン酸カ
ルシウムの溶媒水和物の結晶を晶出させる。この結晶を
分離、乾燥することにより、高純度のＤ−パントテン酸
カルシウムを高収率で得ることができる。
以下の方法によって培養液から単離することができる。
パントテン酸またはその塩を含有する培養液から菌体を
除いた液を、カチオンを除去する目的でカチオン交換樹
脂(例えば、ダイヤイオンＰＫ−２１６(Ｈ型)、ＰＫ−
２２８(Ｈ型)(三菱化成製）)のカラムに通し、次に無機
アニオンおよびパントテン酸より酸性度の強い有機酸を
除去する目的でアニオン交換樹脂(例えば、ＰＡ−４１
２(ＯＨ型)、ＷＡ−３０(ＯＨ型)(三菱化成製）)のカラ
ムに通す。この遊離体のパントテン酸を含むカラム通過
処理液(pＨ約２.６)に水酸化カルシウムを添加し、pＨ
を約５.０に調整した後、パントテン酸として約２５％
(w／v)になるまで濃縮する。次に、この濃縮液に水酸化
カルシウムを添加し、pＨを約７.０に調整した後、活性
炭(例えば、白鷺Ａ(武田薬品製))を添加し脱色処理を行
う。活性炭を濾過により除去した後、パントテン酸カル
シウムとして約４５％から５５％(w／w)になるように濃
縮し、次にメタノールを適当量添加し、この液の水分含
有率が５％から１５％になるようにする。次にこの液を
２℃付近にまで冷却し、種晶を添加し、パントテン酸カ
ルシウムの溶媒水和物の結晶を晶出させる。この結晶を
分離、乾燥することにより、高純度のＤ−パントテン酸
カルシウムを高収率で得ることができる。
【００１７】
【実施例】以下に実施例をもって本発明の内容をより具
体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内容を例
示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、Ｄ−パントテン酸の定量は高速液体クロマ
トグラフィー法[カラム：島津ＳＣＲ１０１Ｈ(７.９mm
Ｉ.Ｄ.×３０cm；移動相：０.００８Ｎ硫酸；流量：０.
８ml／min.；検出：示差屈折計]および／または微生物
学的定量法(Ｂioassay)[被検菌：ラクトバチルス・プラ
ンタラム(Ｌactobacillus plantarum)ＩＦＯ３０７
０；培地：市販パントテン酸定量用培地(ＤＩＦＣＯ
製)]で行った。さらに、培養液中のバリンの定量は高速
液体クロマトグラフィー法[カラム：三菱化成ＭＣＩ Ｇ
ＥＬ ＣＲＳ １０Ｗ(４.６mmＩ.Ｄ.×５cm；移動相：１
mＭ−ＣuＳＯ4／ＣＨ3ＣＮ＝７／１；流量：０.７ml／m
in.；検出：ＵＶフォトメーター]で行った。
体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内容を例
示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、Ｄ−パントテン酸の定量は高速液体クロマ
トグラフィー法[カラム：島津ＳＣＲ１０１Ｈ(７.９mm
Ｉ.Ｄ.×３０cm；移動相：０.００８Ｎ硫酸；流量：０.
８ml／min.；検出：示差屈折計]および／または微生物
学的定量法(Ｂioassay)[被検菌：ラクトバチルス・プラ
ンタラム(Ｌactobacillus plantarum)ＩＦＯ３０７
０；培地：市販パントテン酸定量用培地(ＤＩＦＣＯ
製)]で行った。さらに、培養液中のバリンの定量は高速
液体クロマトグラフィー法[カラム：三菱化成ＭＣＩ Ｇ
ＥＬ ＣＲＳ １０Ｗ(４.６mmＩ.Ｄ.×５cm；移動相：１
mＭ−ＣuＳＯ4／ＣＨ3ＣＮ＝７／１；流量：０.７ml／m
in.；検出：ＵＶフォトメーター]で行った。
【００１８】実施例１ (１)染色体ＤＮＡの調製 エシェリヒア・コリＦＶ５０６９を１リットルのＬ培地
(バクトトリプトン１.０％、酵母エキス０.５％、塩化
ナトリウム０.５％)に接種し、３７℃で一夜培養し、得
られた菌体からフェノールを用いるサイトー等の方法
(バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Ｂiochi
m.Ｂiophys.Ａcta.)７２,６１９(１９６３))によって最
終３.３mgの染色体ＤＮＡを得た。 (２)染色体ＤＮＡのベクタープラスミドpＵＣ１８への
挿入 上記(１)項で得た染色体ＤＮＡ１０μgとpＵＣ１８(ニ
ッポンジーン製)を制限酵素ＨindIII(ニッポンジーン
製)を用いてそれぞれ切断した後、両者を混合してＴ４
ファージ由来のＤＮＡリガーゼ(ニッポンジーン製)によ
って連結させた。 (３)染色体ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの
選択 上記(２)で得られた各種プラスミドの混合物をエシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９株にコンピテント・セル法を用い
て形質転換した。次にこの形質転換株を含む懸濁液をア
ンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／ml、ＩＰＴＧを
０.５mＭ、Ｘ−galを１００μg／ml含むＬ寒天培地の平
板培地上に塗布して３７℃にて１夜培養した。得られた
コロニーのうち白色のものを染色体ＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドＤＮＡの形質転換体として選択した。
(バクトトリプトン１.０％、酵母エキス０.５％、塩化
ナトリウム０.５％)に接種し、３７℃で一夜培養し、得
られた菌体からフェノールを用いるサイトー等の方法
(バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Ｂiochi
m.Ｂiophys.Ａcta.)７２,６１９(１９６３))によって最
終３.３mgの染色体ＤＮＡを得た。 (２)染色体ＤＮＡのベクタープラスミドpＵＣ１８への
挿入 上記(１)項で得た染色体ＤＮＡ１０μgとpＵＣ１８(ニ
ッポンジーン製)を制限酵素ＨindIII(ニッポンジーン
製)を用いてそれぞれ切断した後、両者を混合してＴ４
ファージ由来のＤＮＡリガーゼ(ニッポンジーン製)によ
って連結させた。 (３)染色体ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの
選択 上記(２)で得られた各種プラスミドの混合物をエシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９株にコンピテント・セル法を用い
て形質転換した。次にこの形質転換株を含む懸濁液をア
ンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／ml、ＩＰＴＧを
０.５mＭ、Ｘ−galを１００μg／ml含むＬ寒天培地の平
板培地上に塗布して３７℃にて１夜培養した。得られた
コロニーのうち白色のものを染色体ＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドＤＮＡの形質転換体として選択した。
【００１９】(４)プローブの調製 ローサー等により決定されたＥ.coli Ｋ−１２株ilvＧ
遺伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ
Ｉラージサブユニット遺伝子、ヌクリーク・アシッド・
リサーチ（Nucleic Ａcids Ｒesearch）２１３７、１
５(１９８７))内約６００bpの配列をＰＣＲ法を用いて
増幅した。これを、ランダムプライム法を用いて32Ｐで
ラベルし、プローブとして用いた。 (５)アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺
伝子のクローニング アンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／mlを含んだＬ
寒天平板培地上にナイロンメンブレンを置き、その上に
上記(３)で得た白色コロニーをストリークし、３７℃で
１夜培養した。このメンブレンをアルカリ処理した後中
和し、さらに８０℃、２時間ベーキングして菌体内ＤＮ
Ａをメンブレンに固定した。このメンブレンを(４)のプ
ローブを用いてハイブリダイゼーション反応に供した結
果、他より明らかに強力にシグナルを発するコロニーを
一株得た。
遺伝子(アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ
Ｉラージサブユニット遺伝子、ヌクリーク・アシッド・
リサーチ（Nucleic Ａcids Ｒesearch）２１３７、１
５(１９８７))内約６００bpの配列をＰＣＲ法を用いて
増幅した。これを、ランダムプライム法を用いて32Ｐで
ラベルし、プローブとして用いた。 (５)アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺
伝子のクローニング アンピシリン・ナトリウム塩を５０μg／mlを含んだＬ
寒天平板培地上にナイロンメンブレンを置き、その上に
上記(３)で得た白色コロニーをストリークし、３７℃で
１夜培養した。このメンブレンをアルカリ処理した後中
和し、さらに８０℃、２時間ベーキングして菌体内ＤＮ
Ａをメンブレンに固定した。このメンブレンを(４)のプ
ローブを用いてハイブリダイゼーション反応に供した結
果、他より明らかに強力にシグナルを発するコロニーを
一株得た。
【００２０】(６)サザンハイブリダイゼーション法によ
る確認 上記コロニーよりプラスミド１０μgを抽出し、ＨindII
Iで切断後、電気泳動し、サザンハイブリダイゼーショ
ン法で挿入断片の解析を行った。その結果、この断片は
４.７kbの長さを有しており(Ｋ−１２のアセトヒドロキ
シ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺伝子を含むＨindIII
断片の長さも４.７kb)、また(４)で取得したプローブと
強くハイブリダイズした。 (７)発現プラスミドの構築 上記４.７kb挿入断片をプラスミドベクターpＭＷ１１８
のＨindIIIサイトに挿入した後、さらにＥcoＲＩサイト
にエシェリヒア・コリＦＶ５２５のパントテン酸生合成
遺伝子２.５kbを挿入し、pＦＶ２０２と命名した。これ
を用いてパントテン酸生産株ＦＶ５０６９を形質転換し
てＦＶ５０６９／pＦＶ２０２と命名し、本菌株とパン
トテン酸生合成遺伝子のみを挿入したpＦＶ３１形質転
換株ＦＶ５０６９／pＦＶ３１およびプラスミドを持た
ない親株（宿主）であるＦＶ５０６９についてアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ活性を比較し
た。
る確認 上記コロニーよりプラスミド１０μgを抽出し、ＨindII
Iで切断後、電気泳動し、サザンハイブリダイゼーショ
ン法で挿入断片の解析を行った。その結果、この断片は
４.７kbの長さを有しており(Ｋ−１２のアセトヒドロキ
シ酸シンターゼアイソザイムＩＩ遺伝子を含むＨindIII
断片の長さも４.７kb)、また(４)で取得したプローブと
強くハイブリダイズした。 (７)発現プラスミドの構築 上記４.７kb挿入断片をプラスミドベクターpＭＷ１１８
のＨindIIIサイトに挿入した後、さらにＥcoＲＩサイト
にエシェリヒア・コリＦＶ５２５のパントテン酸生合成
遺伝子２.５kbを挿入し、pＦＶ２０２と命名した。これ
を用いてパントテン酸生産株ＦＶ５０６９を形質転換し
てＦＶ５０６９／pＦＶ２０２と命名し、本菌株とパン
トテン酸生合成遺伝子のみを挿入したpＦＶ３１形質転
換株ＦＶ５０６９／pＦＶ３１およびプラスミドを持た
ない親株（宿主）であるＦＶ５０６９についてアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ活性を比較し
た。
【００２１】(８)形質転換株のアセトヒドロキシ酸シン
ターゼ活性の測定 被検菌を生産培地(Ａ)で約４８時間培養した菌体から超
音波処理により溶菌液を調製し、これを２０,０００rp
m、１時間遠心して上清を得た。この上清を粗酵素液と
して用い、ジャクソン等の方法(Ｍethods Ｅnzymol.１
９８８)に従い、生成アセト乳酸をアセトインに変換し
た後、２−ナフトールで発色させて波長５３０nmで定量
した。表１にその測定結果を示す。表１の結果から、p
ＦＶ２０２に挿入された４.７kbのＨindIII断片にアセ
トヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩをコードす
るilvＧＭ遺伝子が含まれていることが明らかである。
ターゼ活性の測定 被検菌を生産培地(Ａ)で約４８時間培養した菌体から超
音波処理により溶菌液を調製し、これを２０,０００rp
m、１時間遠心して上清を得た。この上清を粗酵素液と
して用い、ジャクソン等の方法(Ｍethods Ｅnzymol.１
９８８)に従い、生成アセト乳酸をアセトインに変換し
た後、２−ナフトールで発色させて波長５３０nmで定量
した。表１にその測定結果を示す。表１の結果から、p
ＦＶ２０２に挿入された４.７kbのＨindIII断片にアセ
トヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩをコードす
るilvＧＭ遺伝子が含まれていることが明らかである。
【００２２】
【表１】
【００２３】(９)ilvＧＭを含む４.７kb断片の制限酵素
地図 pＦＶ２０２内に挿入された４.７kbのＤＮＡ断片中には
ＰstＩサイト、ＳalＩサイトおよびＰvuＩＩサイトがそ
れぞれ１個ずつ存在する。これらの簡単な制限酵素地図
を図１に示す。
地図 pＦＶ２０２内に挿入された４.７kbのＤＮＡ断片中には
ＰstＩサイト、ＳalＩサイトおよびＰvuＩＩサイトがそ
れぞれ１個ずつ存在する。これらの簡単な制限酵素地図
を図１に示す。
【００２４】実施例２ 表２に示す組成の液体培地を、オートクレーブ中１２１
℃、１５分間加熱滅菌し、２００ml三角フラスコに２０
mlずつ分注した。ここに、斜面培地から実施例１の(７)
で得られたエシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２
０２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７）、ＦＶ５０６９／
pＦＶ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３９５）をそれぞれ
１白金耳量接種し、３０℃で２０時間、２２０rpmで回
転振とう培養した。このシード培養物１mlを表２に示す
組成の培地２０mlに移植し、２００ml容ひだ付き三角フ
ラスコ中で３８℃にて７２時間振とう培養した。培養
中、表３に示す要領で各種物質を添加した。培養終了時
のパントテン酸生成量（PaA）およびバリン量（Val）を
表４に示す。
℃、１５分間加熱滅菌し、２００ml三角フラスコに２０
mlずつ分注した。ここに、斜面培地から実施例１の(７)
で得られたエシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦＶ２
０２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２２７）、ＦＶ５０６９／
pＦＶ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３９５）をそれぞれ
１白金耳量接種し、３０℃で２０時間、２２０rpmで回
転振とう培養した。このシード培養物１mlを表２に示す
組成の培地２０mlに移植し、２００ml容ひだ付き三角フ
ラスコ中で３８℃にて７２時間振とう培養した。培養
中、表３に示す要領で各種物質を添加した。培養終了時
のパントテン酸生成量（PaA）およびバリン量（Val）を
表４に示す。
【００２５】
【表２】 培地組成 ・シード培地 ＣＳＬ ０.５％ (ＮＨ4)2ＳＯ4 ０.５％ ＭgＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０.０１％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.０１％ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０１％ 塩酸チアミン ２μg／ml グルコース ５％ＣaＣＯ3 ２％ pＨ ７.０ ・メイン培地 ＣＳＬ ２％ (ＮＨ4)2ＳＯ4 １.２５％ ＭgＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０.０２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.０１％ β−アラニン １％ 塩酸チアミン ０.５μg／ml グルコース ９％ＣaＣＯ3 ４％ pＨ ７.０
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【発明の効果】本発明のＤ−パント酸、Ｄ−パントテン
酸（またはその塩）の製造法は、パント酸、パントテン
酸の生合成経路の上流に位置するバリン生合成経路の活
性を向上させてバリン生産性を高め、より高濃度のパン
ト酸、パントテン酸の蓄積を可能とするため、工業的に
有利で効率的な製造法である。
酸（またはその塩）の製造法は、パント酸、パントテン
酸の生合成経路の上流に位置するバリン生合成経路の活
性を向上させてバリン生産性を高め、より高濃度のパン
ト酸、パントテン酸の蓄積を可能とするため、工業的に
有利で効率的な製造法である。
【図１】 pＦＶ２０２に挿入された４.７kbのＤＮＡ断
片の制限酵素地図である。
片の制限酵素地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 山口 高正 兵庫県神戸市垂水区塩屋北町２丁目10番３ 号
Claims (10)
- 【請求項１】 パントテン酸生合成遺伝子領域またはそ
の一部と、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはそ
の一部とを有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質
転換させた微生物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩
を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＤ−パ
ント酸またはその塩の製造法。 - 【請求項２】 パントテン酸生合成遺伝子領域またはそ
の一部と、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはそ
の一部とを有するＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質
転換させた微生物をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ
−パントテン酸またはその塩を蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするＤ−パントテン酸またはその塩の
製造法。 - 【請求項３】 パントテン酸生合成遺伝子領域またはそ
の一部を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドと、分岐
鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはその一部を有する
ＤＮＡとを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生
物を培養し、Ｄ−パント酸またはその塩を蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするＤ−パント酸またはそ
の塩の製造法。 - 【請求項４】 パントテン酸生合成遺伝子領域またはそ
の一部を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドと、分岐
鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはその一部を有する
ＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換させた微生物
をβ−アラニンの存在下に培養し、Ｄ−パントテン酸ま
たはその塩を蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するＤ−パントテン酸またはその塩の製造法。 - 【請求項５】 １）パントテン酸生合成遺伝子領域また
はその一部と、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域また
はその一部とを有するＤＮＡを組み込んだプラスミドま
たは ２）パントテン酸生合成遺伝子領域またはその一部を有
するＤＮＡを組み込んだプラスミドと、分岐鎖アミノ酸
生合成系遺伝子領域またはその一部を有するＤＮＡを組
み込んだプラスミドで形質転換されたＤ−パント酸生産
能またはβ−アラニン存在下でＤ−パントテン酸生産能
を有する微生物。 - 【請求項６】 分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域また
はその一部がilvＧＭ遺伝子である請求項５記載の微生
物。 - 【請求項７】 エシェリヒア・コリＦＶ５０６９／pＦ
Ｖ２０２（ＦＥＲＭＢＰ−５２２７）である請求項５記
載の微生物。 - 【請求項８】 パントテン酸生合成遺伝子領域またはそ
の一部と、分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域またはそ
の一部とを有するＤＮＡを組み込んだプラスミド。 - 【請求項９】 分岐鎖アミノ酸生合成系遺伝子領域また
はその一部がilvＧＭ遺伝子である請求項８記載のプラ
スミド。 - 【請求項１０】 pＦＶ２０２である請求項８記載のプ
ラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24169596A JP4020991B2 (ja) | 1995-09-13 | 1996-09-12 | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23506595 | 1995-09-13 | ||
| JP7-235065 | 1995-09-13 | ||
| JP24169596A JP4020991B2 (ja) | 1995-09-13 | 1996-09-12 | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09135687A true JPH09135687A (ja) | 1997-05-27 |
| JP4020991B2 JP4020991B2 (ja) | 2007-12-12 |
Family
ID=26531932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24169596A Expired - Fee Related JP4020991B2 (ja) | 1995-09-13 | 1996-09-12 | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4020991B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024257791A1 (ja) * | 2023-06-12 | 2024-12-19 | グリーンケミカルズ株式会社 | 芳香族化合物組成物およびポリマー |
-
1996
- 1996-09-12 JP JP24169596A patent/JP4020991B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024257791A1 (ja) * | 2023-06-12 | 2024-12-19 | グリーンケミカルズ株式会社 | 芳香族化合物組成物およびポリマー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4020991B2 (ja) | 2007-12-12 |
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