JPH09156A - カカオニブの酵素処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発酵したカカオ豆のフレーバ前駆物質の変わ
りやすさを解消し、カカオ豆のニブまたはリカーに最適
のフレーバ前駆物質組成を与える。 【解決手段】 ニブまたはリカーを１〜１５日間発酵さ
せたカカオ豆から調製し、ｐＨ３〜８の水性媒体中で少
なくとも１つの工業的プロテアーゼと混合し、混合物を
乾燥物質のｇ当り少なくとも１０μモルの疎水性アミノ
酸および、カカオ豆中に最初に存在するものに比べて少
なくとも１．４倍多い加水分解生成物を得るのに十分な
時間と温度でインキュベートする、カカオのニブまたは
リカーを処理する方法、１〜１５日間発酵させたカカオ
豆からのニブまたはリカーと、工業的プロテアーゼおよ
び／または工業的インベルターゼを含む組成物、並びに
その組成物を焙焼して得たココア。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フレーバ前駆物質
の組成を改善し、各種発酵状態で広範囲のカカオ豆を使
用することを可能ならしめるカカオニブまたはリカーの
酵素処理方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】チョコレートの品質は、地理的および遺
伝子的起源、並びにそれらの畑での栽培から工場におけ
る処理までのカカオ豆の処理条件によって直接影響され
る。いったん収穫されると、カカオ豆は例えば、それら
の生産国で、フレーバ前駆物質の発現を意図する発酵お
よび自然乾燥に付される。不運にも、豆の成熟期での収
穫およびそれらの発酵条件は、必ずしも適切に制御され
ない。その上、クリオロ、フォラステロおよびトリニタ
リオと称されるテオブロマ種の３種類の主なカカオの木
は、各々各種組成を有する豆を産生する。最後に、乾燥
豆はまた豆の加工を行なう国へ輸送中に損傷を受けるこ
ともある。したがって、カカオ豆のバッチの組成は広く
変動しやすいので工業化には注意しなければならない
（例えば、エム・スマッファー、Ｔｈｅ Ｍａｎｕｆａ
ｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｆｅｃｔｉｏｎｅｒ，９２−９
４，１９９４年６月参照）。

【０００３】発酵し乾燥したカカオ豆は、次いで伝統的
にある程度粉砕され、外皮を分離し、次いで必要に応じ
てアルカリ剤と組合せて、ココアフレーバと色を発現さ
せるために焙焼に供する。焙焼工程は、還元糖とタンパ
ク質の分解産物、特にアミノ酸と加水分解生成物との間
のメイラード反応を伴なう（Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｌａｓ
ｓ，Ｃｏｃｏａ，Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｌｏｎｇｍａｎ Ｇｒｏ
ｕｐ ＵＫ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８５，ＩＳＢＮ ０
−５８２−４６３５２−１）。

【０００４】フレーバ前駆物質は、加水分解反応の結
果、豆の自然発酵中にのみ出現する。未発酵カカオ豆ま
たは豆断片を試験管内インキュベーションによる実験に
よれば、これらの加水分解反応はｐＨ、温度および酵素
および豆の基質の区分に依存することを示した。更に加
水分解反応はポリフェノールの存在にも敏感である。し
たがって、アセトンを使用して豆からポリフェノールを
抽出すること、そしてまた酵素および基質を非区分化す
るために酢酸中で豆をインキュベートするのが良い（ビ
ー・ビール等、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ．Ａｇｒｉｃ．，
３３，１２８０−１２９０，１９８２）。

【０００５】更に、他の研究では、カカオ豆は、ココア
フレーバ前駆物質の出現に少なくとも３つのタン白分解
活性、すなわちｐＨ３．５に最適活性を有するエンドプ
ロテアーゼ、ｐＨ５．８に最適活性を有するカルボキシ
ペプチダーゼ、およびｐＨ７に最適活性を有するアミノ
ペプチダーゼが関与していることを示した。市販のプロ
テアーゼおよび／または精製カカオエンドプロテアーゼ
およびカルボキシペプチダーゼを使用して、ポリフェノ
ールを抽出した、精製カカオ豆グロブリン（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥクロマトグラフィーゲル上に３１ｋＤと４７ｋＤ
の２つのバンドを有するタンパク質）の加水分解を含む
実験では、連続してｐＨ３．５でカカオエンドプロテア
ーゼで、次いでｐＨ５〜６でカカオカルボキシペプチダ
ーゼまたは市販のカルボキシペプチダーゼでグロブリン
を加水分解することが好ましいことを示した。この方法
で、還元糖の存在下に混合物のその後の焙焼の間にココ
アフレーバを得るのに適している加水分解生成物および
アミノ酸組成物が得られる（ジェイ・ボイト等、Ｆｏｏ
ｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０，１７７−１８４，１９
９４）。

【０００６】さらに、米国特許第２，９６５，４９０号
明細書は、豆の自然発酵に置き換えることを意図した、
未発酵カカオ豆（生カカオ豆）の試験管内加水分解の方
法を記載している。生カカオ豆のタンパク質を酸でまた
は酵素によって加水分解し、豆中の炭水化物を酵素加水
分解して単糖類を生成し、そして両水解物は、アロマ因
子を生成するのに十分な温度および時間無水条件下に反
応させる。しかしながら、生豆中のポリフェノールは、
特に貯蔵タンパク質の酵素加水分解を制限すると言うべ
きである（下記の比較例１参照）。

【０００７】最終分析において、上記の方法および研究
は、カカオ豆の自然発酵を生豆（ポリフェノールにより
もたらされる問題）またはそれらの精製タンパク質（そ
れからポリフェノールは抽出された）の制御された加水
分解と置き換えることを明らかに意図する。その上、焙
焼中の良好なココアフレーバの発現に必要なフレーバ前
駆物質の品質および量は未だ分かっていない。

【０００８】

【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、発酵したカ
カオ豆のフレーバ前駆物質の組成の変わりやすさを克服
し、そしてカカオ豆のニブまたはリカーに最適のフレー
バ前駆物質組成を与えることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明の方法においては、ニブまたはリカーは１〜１５日間
発酵させたカカオ豆から調製し、ｐＨ３〜８の水性媒体
中で少なくとも１つのプロテアーゼと混合し、そして混
合物をタンパク質およびペプチドを加水分解するのに十
分な時間と温度でインキュベートする。

【００１０】好ましくは、混合物は乾燥物質のｇ当り少
なくとも１０μモルの疎水性アミノ酸および／またはカ
カオ豆中に最初に存在するものに比べて少なくとも１．
４倍多い加水分解生成物を得るのに十分な時間および温
度でインキュベートする。

【００１１】本発明方法によれば、十分な量と適当なア
ミノ酸と加水分解生成物組成が得られるまで、豆の自然
発酵中に最初に起こる、カカオ豆中の貯蔵タンパク質の
加水分解を促進することができる。

【００１２】本発明に係る混合物を続いて焙焼すること
により、伝統的に発酵させたカカオ豆の焙焼後に得られ
たものと比べて、より強くかつより濃厚な良好なココア
フレーバを得ることができる。

【００１３】また、例えば、十分なフレーバ前駆物質を
含有しない低発酵豆、適当なフレーバ前駆物質組成物を
含有しない過発酵豆、または不十分なフレーバ前駆物質
組成物を含有する酸性豆のような不十分に発酵した豆の
ような、各種発酵段階のカカオ豆を使用することができ
る。同様に、カカオ豆は異なる植物および地理的起源の
ものであってもよい。このように本発明の方法は、いろ
いろな起源および発酵段階の豆の混合物のフレーバ前駆
物質組成を均質化することを可能にする。

【００１４】その上、工業的酵素によるカカオニブまた
はリカーの加水分解は、豆の中のポリフェノールに対す
るそれらの感受性のゆえに驚くべきことである。少なく
とも１日自然発酵した豆はポリフェノール濃度が十分低
く、工業的酵素は、本発明方法において有意に阻害され
ないことを示すことができる。

【００１５】特に、インベルターゼを添加することによ
り、混合物の天然グルコースとフルクトース含量を有利
に増加することができ、混合物のその後の焙焼中フレー
バの生成を促進する。

【００１６】最後に、本発明において各種工業的酵素が
使用できることは、消費者により価値を認められる各種
ココアフレーバを創出し得ることを開く。

【００１７】１酵素活性単位は、分当りに転換される生
成物のμモルとして明細書に定義している。同様に、パ
ーセントは特に指示なきかぎり重量表示によるものであ
る。

【００１８】表現「低発酵または不十分に発酵されたカ
カオ豆」は、伝統に従って約１〜４日間発酵させ次いで
乾燥させた豆を示し、その中のタンパク質が、ポリアク
リルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー
において、２１ｋＤおよび３１ｋＤ／４７ｋＤ貯蔵タン
パク質に対応する２つの可視バンドを示す（ＷＯ９１／
００９１３およびＷＯ９１／００９１４参照）。さら
に、豆はその後の焙焼の間にココアフレーバを生成する
のに十分量のアミノ酸およびペプチドを有しない。

【００１９】表現「よく発酵したカカオ豆」は、伝統に
従って約２〜１０日間発酵させ乾燥させた豆を意味し、
その中のタンパク質が、ポリアクリルアミドゲルのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにおいて、２１ｋＤ貯
蔵タンパク質に対応する可視バンドを示し、２１ｋＤ／
４７ｋＤタンパク質に対応する２つのバンドが部分的に
または完全に減成している豆を明示する。さらに、これ
らの豆は、その後の焙焼の間にココアフレーバを生成す
るのに十分な量のアミノ酸およびペプチドを有する。

【００２０】表現「過発酵カカオ豆」は、伝統に従って
約７〜１５日間発酵させ乾燥させた豆を意味し、その中
のタンパク質が、ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥクロマトグラフィーにおいて、２１ｋＤおよび３
１ｋＤ／４７ｋＤ貯蔵タンパク質に対応するはっきりし
た可視バンドを示さない。さらに、これらの豆は、その
後の焙焼の間にココアフレーバを生成するのに十分な量
のアミノ酸を有するが、不十分量のペプチドしか有しな
い。

【００２１】最後に、本発明の目的のために、発酵また
は未発酵カカオ豆を常法により粉砕してニブは得られ、
ココアリカーは前記の豆またはニブを幾分摩砕しカカオ
バターを細胞から遊離して得られる。

【００２２】本発明の方法を実施するために、ニブまた
はリカーは１〜１５日間発酵させたカカオ豆から調製す
る。それゆえ、混合ココア豆かさもなければ、例えば、
低発酵の、十分に発酵した、過発酵のまたは不十分に発
酵した豆のような、各種発酵段階で取得したカカオ豆を
使用することが可能である。または、混合カカオ豆かさ
もなければ、各種遺伝子型のカカオの木、例えば、Ｔｈ
ｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｃｒｉｏｌｌｏ，Ｆｏｒ
ａｓｔｅｒｏおよび／またはＴｒｉｎｉｔａｒｉｏから
得たカカオ豆を使用することも可能である。ニブまたは
リカーは微粉に変えることができる。しかしながら、ニ
ブまたは液を３５〜４５℃よりも高い温度で酵素処理す
ると、またはニブの小片は溶融するから、酵素を混合物
の最も内奥部の材料に達することを可能にすることに注
意すべきである。

【００２３】ニブまたはリカーは、次いでｐＨ３〜８の
水性媒体中で少なくとも１つのプロテアーゼと混合され
る。プロテアーゼは、例えば、エンドプロテアーゼ、カ
ルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼよりな
る群から、単独でまたは組合せて選ぶことができる。水
性媒体のｐＨは、無機もしくは有機酸、または工業的な
食品加工に普通に使用されるものから選ばれる緩衝剤、
特に例えばクエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩に基づく
緩衝剤を添加して調製できる。特に、３〜５のｐＨが豆
の中の内在性のエンドプロテアーゼも活性化するために
好ましい。しかしながら、その結果、この酸性度領域に
おいて活性である工業的プロテアーゼを選ぶことが好ま
しい。

【００２４】混合物は、例えば、カカオニブまたはリカ
ー１０〜８０％、特に２０〜７０％と、市販の工業的プ
ロテアーゼ標品の混合物のｇ当り１〜１００単位のプロ
テアーゼ、特に０．０１〜５％（重量／重量）を含みう
る。

【００２５】本発明方法を実施するために、混合物は次
いで混合物中のタンパク質およびペプチドを加水分解す
るのに十分な時間および温度でインキュベートされる。

【００２６】好ましくは、混合物は、乾燥物質のｇ当り
少なくとも１０μモルの疎水性アミノ酸および／または
処理されるカカオ豆中に最初に存在するものに比べて、
少なくとも１．４倍以上、１．７倍さえもあるいは２倍
以上さえも多い加水分解生成物を得るのに十分な時間お
よび温度でインキュベートされる。これに関連して、本
発明に係る処理の前と後で得られたニブ中に見出される
同じ加水分解生成物（ペプチドおよびアミノ酸）の量が
比較できる。また、本発明に係る未処理のニブ中に存在
するもの、制限されるけれども、例えば、生カカオ豆の
自然発酵の間に顕著に出現するものに対する、新しい加
水分解生成物の出現を考慮に入れることも可能である。
特に、約９、１７、２４および２９．５分の保持時間を
有する４つの加水分解生成物の量を、１ｍｌ／分の一定
の流量および１０分間の０．１％トリフルオロ酢酸と２
％アセトニトリルを含む水溶液からなる溶離液により、
続いて５０分間の０．１％トリフルオロ酢酸と２％〜５
２．７％のアセトニトリルを含む線形傾斜により特徴づ
けられるＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｎｏ．２１８ＴＰ
５４ Ｖｙｄａｃ社製、米国）上のクロマトグラフィー
の間に比較する。溶離した加水分解生成物を２１５およ
び２８０ｎｍで検出する。

【００２７】同様に、疎水性アミノ酸として、本発明に
よって処理されたニブ中に主に存在するものだけ、例え
ば、特にフェニルアラニン、ロイシンおよびアラニンを
考慮に入れることが可能である。

【００２８】十分量の疎水性アミノ酸および加水分解生
成物を得るために、例えば、混合物は１０〜６０℃で３
０分〜２０時間インキュベートされる。しかしながら、
加水分解時間および温度は、媒体、酵素の型、豆の発酵
の程度および豆の出所の函数として選ばれることが必要
である。

【００２９】本発明の第１の特定の実施態様において、
ニブまたはリカーは１〜１５日間発酵させられたカカオ
豆から調製され、それはｐＨ３〜６の水性媒体と混合さ
れ、混合物はココアエンドプロテアーゼの作用を促進す
るように４０〜６０℃で１０分〜２０時間インキュベー
トされ、媒体のｐＨはｐＨ４〜８に調製され、少なくと
も１種類の工業的プロテアーゼが添加され、それはタン
パク質およびペプチドの加水分解、しかし好ましくは乾
燥物質のｇ当り少なくとも１０μモルの疎水性アミノ酸
および／またはカカオ豆中に最初に存在するものと比べ
て、少なくとも１．４倍多い加水分解生成物（ペプチド
およびアミノ酸）を得るように１０〜６０℃で５分〜２
０時間インキュベートされる。

【００３０】本発明の第２の特定の実施態様において、
ニブまたはリカーは１〜１５日間発酵させたカカオ豆か
ら調製され、ｐＨ４〜８の水性媒体と混合され、少なく
とも１種類のプロテアーゼが添加され、タンパク質およ
びペプチドの加水分解、しかし好ましくは乾燥物質のｇ
当り少なくとも１０μモルの疎水性アミノ酸および／ま
たはカカオ豆中に最初に存在するものに比べて少なくと
も１．４倍多い加水分解生成物（ペプチドおよびアミノ
酸）を得るように１０〜６０℃で５分〜２０時間インキ
ュベートされる。好ましくは、ｐＨ範囲は工業的プロテ
アーゼのみならずココアエンドプロテアーゼが活性を残
す範囲内に選ばれる。

【００３１】最後に、本発明の第３の特定の実施態様に
おいて、インベルターゼ、グリコシダーゼ、セルラー
ゼ、ペクチナーゼおよびオキシダーゼよりなる群から選
ばれる少なくとも１種類の酵素が反応混合物に添加され
る。好ましくは、前記の酵素の少なくとも１種類が、市
販の酵素標品０．０１〜５％、または混合物について１
〜１００単位／ｇの量で添加される。反応混合物は、あ
る特定の期間インキュベートされる（工業的プロテアー
ゼやその他を含む）上記の混合物の一つであると理解す
べきである。

【００３２】特に、工業的プロテアーゼおよび／または
ココアエンドプロテアーゼ処理を、工業的インベルター
ゼと組合せる。この処理は、その後の焙焼の間に、グル
コースおよびフルクトースと組合わせる疎水性アミノ酸
その他の加水分解生成物を生成することを有利に可能な
らしめて、よりチョコレート様フレーバ（豊富な味わい
を引き起こす）を生じる。意外なことに、しかしなが
ら、すべての酵素（エンドプロテアーゼ、工業的プロテ
アーゼおよびインベルターゼ）の活性に好都合であるｐ
Ｈ範囲を選ぶことにより、ココアエンドプロテアーゼ、
工業的インベルターゼおよびプロテアーゼは単一工程で
使用できる（本発明の第２の実施態様）。

【００３３】インベルターゼを使用しないならば、焙焼
の前に最終混合物に、例えば０．１〜５％の量の例えば
グルコースおよび／またはフルクトースのような還元糖
を少なくとも０．１％添加することもまた好都合であ
る。

【００３４】最後に、本発明の方法を実施した後、混合
物は、例えば、熱（８０〜１２０℃で１〜６０分間）を
使用して酵素を失活させて、または高い静水圧（５０
０，０００ｋＰａ以上の）での処理によって保存するこ
とができる。また、例えば凍結乾燥により、噴霧乾燥に
より、真空吸引により、または混合物の穏やかな加熱の
間の蒸発により混合物を乾燥することも可能である。好
ましくは、混合物は１０％、特に５％以下の混合物の水
分率が達せられるまで乾燥される。混合物はまた、ヨー
ロッパ特許出願公告第０，２２６，７２７号に記載され
ているように、常法の焙焼および／またはアルカリ化に
付すこともできる。

【００３５】好ましくは、本発明方法を実施後、混合物
のｐＨは５〜６に調整し、乾燥、焙焼される。

【００３６】本発明はまた、１〜１５日間発酵させたカ
カオ豆からのニブまたはリカー、および工業的プロテア
ーゼおよび／または工業的インベルターゼを含む化合物
に関する。酵素が依然活性であるならば、組成物は組成
物ｇ当り少なくとも１酵素活性単位を含有してもよい。
これらの酵素が例えば熱変性処理により不活性である場
合には、それでも、この酵素の以前の使用を示す適当な
抗体の助けによってこれらの酵素は依然として同定する
ことができる。

【００３７】それゆえ、これらの組成物は、各種発酵状
態のおよび／またはさまざまな遺伝子型のカカオの木か
ら得た豆の混合物から調製したカカオニブまたはリカー
を含む。これらの組成物は、本発明方法の中の上記に提
示した組成物の一つでありうる。従って、本発明は、グ
ルコースおよび／またはフルクトースの添加を含む乾燥
組成物、および特に上記組成物を焙焼して得たカカオ
（粉末、ニブ、リカーなど）を包含する。これらの組成
物は特に従来技術とは異なる。何故なら、各種発酵状態
で取った豆および／または各種遺伝子型のココアの木か
ら得た豆、および活性または不活性な工業的プロテアー
ゼおよび／またはインベルターゼを含む混合物由来のも
のであるからである。

【００３８】

【実施例】本発明を、以下の実施例によってさらに詳細
に説明する。これらの実施例は、各種試験の記述および
図面の簡単な説明より重要である。しかしながら、これ
らの実施例は本発明の実体の説明のために提示するもの
であって、本発明を限定するものでないことは言うまで
もない。

【００３９】（アミノ酸分析）本発明に係る失活混合物
を１０分間超音波浴に付し、９６００ｒｐｍで１分間２
回均質化し（Ｐｏｌｙｔｒｏｎで）、１０，０００ｇで
１０分間遠心分離し、上澄液を取り出し、濾過し次いで
アミノ酸含量をＡＣＣＱＴａｇ（登録商標）キット（米
国、Ｗａｔｅｒｓ社製）によって分析した。

【００４０】そのために、２０μｌの試料と標準を１４
０μｌのホウ酸緩衝液と混合し、６−アミノキノリル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱ
Ｃ）を含む４０μｌの試薬を添加し、混合物を渦巻状攪
拌し、室温で１分間放置し、５５℃に７分間加熱し、Ｃ
１８逆相ＨＰＬＣカラム（米国、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ社製
Ｃ１８，４μｍ）中へ注入し、３６．５℃で誘導したア
ミノ酸を、１０分間１００％の溶媒Ａ、１０．５分間９
８％の溶媒Ａ、２６分間９３％の溶媒Ａ、３０分間９０
％の溶媒Ａ、４３分間６７％の溶媒Ａ、５３分間３０％
の溶媒Ａ、５４分間１００％の水および６０分間１００
％のアセトニトリル／水溶媒（６５％／３５％）（溶媒
Ａ＝Ｗａｔｅｒｓ社製リン酸緩衝液）の勾配で、１ｍｌ
／分の流量で溶離した。

【００４１】誘導して溶離したアミノ酸を、Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍモデル９８０検出器により３
９５ｎｍで検出した。混合物のアミノ酸を次いで同一条
件下に誘導および溶離した標準試料と比較して、乾燥混
合物のｇ当りのμモルで定量した。

【００４２】（加水分解生成物の分析）メタノールを本
発明に係る失活混合物に７０％の濃度まで添加し、７０
％メタノール１．５ｍｌとポリビニルピロリドン（ＰＶ
ＰＰ）１００ｍｇを添加し、混合物を室温に１時間穏や
かな攪拌下に維持し、２０，０００ｇで１０分間２回遠
心分離し、上澄液を取り出し、メタノールを真空吸引に
より除去し、水０．３５ｍｌをペレットに添加し、溶液
を２０，０００ｇで５分間遠心分離し、濾過し次いで加
水分解生成物含量を１０分間水中の０．１％トリフルオ
ロ酢酸と２％アセトニトリルで１ｍｌ／分の流量でＣ１
８逆相ＨＰＬＣカラム（米国、Ｖｙｄａｃ社製、Ｎｏ．
２１８ＴＰ５４）上の溶離、続いて５０分間０．１％ト
リフルオロ酢酸および２〜５２．７％アセトニトリルか
らなる線状勾配により分析した。溶離した加水分解生成
物を２１５および２８０ｎｍで検出した。

【００４３】本発明の構成の範囲内で、未処理混合物中
に存在するものに対する本発明に係る処理混合物中の加
水分解生成物（ペプチドおよびアミノ酸）の量の増加
は、９、１７、２４および２９．５分の保持時間を有す
る４種類の加水分解生成物の溶離ピークの面積を比較し
て決定した。これらの面積は、カカオの木Ｔｈｅｏｂｒ
ｏｍａ ｃａｃａｏ Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏ，Ｃｒｉｏ
ｌｌｏおよびＦｏｒａｓｔｅｒｏからのカカオ豆の伝統
的発酵の間に一般的に見られる。しかしながら、他の加
水分解生成物もまたいくつかの特定の遺伝子型のカカオ
の木から得たカカオ豆の伝統的発酵の間にも現れうるこ
とを排除できない。

【００４４】（糖類の分析）本発明に係る失活混合物を
６０℃で３０分間攪拌しながらインキュベートし、室温
で１５〜３０分間放置し、２０，０００ｇで５分間２回
遠心分離し、上澄液をＣ１８ Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−
Ｐａｋカートリッジ上で濾過し、濾液を再びＳａｒｔｏ
ｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルター（ＳＲＰ１５，
Ｎｏ．１７５５Ｋ）によって濾過し、そのグルコース含
量をベーリンガ／マンハイムＮｏ．１２４０２８キット
（ドイツ製）の助けによって、または代わりにＨＰＬＣ
により「Ｇｏｄ−Ｐｅｒｉｄ」分光測光法により定量し
た。

【００４５】（感覚分析）本発明に係る加水分解リカー
またはニブを加熱失活させ、ｐＨを５〜６に調整し、水
分率が１０％以下になるまで穏やかな加熱（６０℃以
下）の間に真空下に水の蒸発により乾燥し、次いで１３
０℃で１５分間炉中で焙焼した。焙焼により発生したフ
レーバを、そのようなフレーバを評価するために使う個
々のパネルにより評価した。

【００４６】すべてのフレーバを、同じ条件下に単純に
乾燥して焙焼した、不十分に発酵させたＳａｎｃｈｅｚ
およびＳｕｌａｗｅｓｉカカオ豆、および十分に発酵さ
せたＧｈａｎａカカオ豆（当業者に知られている豆）か
ら誘導したカカオ豆のニブまたはリカーにより生成した
ものと比較した。

【００４７】各試料を次の感覚「ココアフレーバ」（Ｇ
ｈａｎａ豆由来）、「酸性度」（たいていの酸の希薄水
溶液により発生される塩基性の味を加減する）、「苦
味」（舌の先端および口蓋の裏で知覚される、キニーネ
のような各種物質の希薄溶液により発生される塩基性の
味を加減する）、「渋味」（この用語は、組織の緊縮お
よび／または収縮を含む医学的感覚における渋味に対す
るなめらかさの抑制によって、物理的性質の感覚に帰因
するポリフェノールの全作用に広げられた）、「フルー
ティ」（ブーケに属しかつ成熟した果物、リンゴ、バナ
ナ、セイヨウナシなどを呼び起こす味覚要素）、「花の
ような味」（一般に花、バラ、ジャスミン、ヒヤシン
ス、リラなどを呼び起こす嗅覚の感覚に対応する）、
「スモーキィ」（スモークハムの味と匂い、木材の火に
よる発酵後のコーヒー豆を乾燥することから一般に生じ
る欠陥）、「かび臭さ」、および「生焼けさ」（渋味と
酸性度に結び付いた、生のナンキン豆を呼び起こす、フ
レーバが進展しなかった不十分に焼成されたカカオの特
徴）について評価した。

【００４８】比較例 １ Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｔｒｉｎｉｔａｒｉ
ｏ ＩＣＳ−９５からの生カカオ豆のニブを伝統的に調
製し、前記のニブ１００ｍｇと、適当な場合、ポリフェ
ノールと錯体を生成するＰＶＰＰ１００ｍｇを、２００
ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４ １ｍｌと混合した。混合物
を５０℃で２時間インキュベートし、そのｐＨを２００
ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７ １ｍｌで調整し、適当な場
合フェノキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／μｌ、シ
グマ社製）４０μｌを添加し、２５℃で１時間インキュ
ベートし、次いで９５℃で５分間混合物を加熱して反応
を停止した。

【００４９】次いで、カカオタンパク質の加水分解度
を、処理したニブの遊離アミノ酸含量および最初のニブ
および処理したニブ中の４種類の加水分解生成物（豆の
自然発酵と関連した生成物、すなわちアミノ酸とペプチ
ド）の溶離ピークの面積を、上記の方法により定量して
分析した。

【００５０】下記の表１に示す結果は、ｐＨ４およびｐ
Ｈ７でのニブの自己分解は、生カカオ豆中に最初に存在
するものと比べて、フレーバ前駆物質の著しい増加を得
ることが不可能であることを示した。他方、ＰＶＰＰを
含むニブのｐＨ４での自己分解は、続いてｐＨ７でのタ
ンパク質の酵素加水分解により、フレーバ前駆物質中に
著しい増加を得ることを可能にした。したがって、生カ
カオ豆中のポリフェノールは、実質的な阻害効果を有す
る。

【００５１】

【表１】 （加水分解生成物１〜４の保持時間は、それぞれ９、１
７、２４および２９．５分であった）

【００５２】比較例 ２ ニブを、伝統に従って１、２、３、４、５および７日間
発酵させたＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｔｒｉｎ
ｉｔａｒｉｏ ＩＣＳ−９５からのカカオ豆から常法に
より調製し、次いで乾燥した。ニブのタンパク質の加水
分解度を次いで、上記の方法によって、発酵したニブの
４種類の加水分解生成物（豆の自然発酵に関連した生成
物）の溶離ピークの面積を定量して分析した。結果を下
記の表２に示す。

【００５３】ポリアクリルアミド上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
クロマトグラフィーによるニブのタンパク質の分析は、
少なくとも３日間発酵させた豆の場合に３１ｋＤと４７
ｋＤの激しい劣化を示した。一方、２１ｋＤのバンド
は、１〜７日間発酵させた豆の場合には劣化しなかっ
た。

【００５４】各種ニブを、炉中で１３０℃で１５分間焙
焼した。ニブにより与えられたフレーバの感覚分析は、
豆の３日間の発酵が許容しうるココアフレーバを得るの
に十分であることを示した。

【００５５】実施例 １ ニブを伝統に従って１、２、３、４、５および７日間発
酵させたＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｔｒｉｎｉ
ｔａｒｉｏ ＩＣＳ−９５からのカカオ豆から常法によ
り調製し、次いで乾燥した。次いで、２００ｍＭクエン
酸緩衝液ｐＨ４１ｍｌを各型のニブ１００ｍｇと混合
し、混合物を５０℃で２時間インキュベートし、ｐＨを
２００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７ １ｍｌで調整し、カ
ルボキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／μｌ、シグマ
社製）４０μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベー
トし次いで９５℃で５分間混合物を加熱して反応を停止
した。次いで、カカオタンパク質の加水分解度を、遊離
アミノ酸含量とニブの４種類のおもな加水分解生成物
（豆の自然発酵と関連した生成物）の溶離ピークの面積
を、上記の方法によって、定量して分析した。

【００５６】表２に示す結果は、低発酵または十分に発
酵させたカカオ豆から得たニブ中の加水分解生成物を少
なくとも１．４倍増加することが可能であることを示し
た。その上、すべての処理したニブおよび３〜７日間発
酵させたニブの疎水性アミノ酸含量は、常に乾燥物質の
ｇ当り１０μモルよりも大きかった。

【００５７】

【表２】 （加水分解生成物１〜４に対する保持時間は、それぞれ
９、１７、２４および２９．５分であった）

【００５８】実施例 ２ ニブを常法により１、２、３、４、５および７日間発酵
させたＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ Ｔｒｉｎｉｔ
ａｒｉｏ ＩＣＳ−９５からのカカオ豆から常法により
調製し、次いで乾燥した。２００ｍＭクエン酸緩衝液ｐ
Ｈ４ １００μｌを次いで各型のニブ１００ｍｇと混合
し、混合物を５０℃で２時間インキュベートし、ｐＨを
２００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７ １００μｌで調整
し、カルボキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／μｌ、
シグマ社製）４０μｌを添加し、２５℃で１時間インキ
ュベートし、次いで９５℃で５分間混合物を加熱して反
応を停止した。カカオタンパク質の加水分解度を、次い
でニブの４種類のおもな加水分解生成物（豆の自然発酵
と関連した生成物）の遊離アミノ酸含量および溶離ピー
クの面積を、上記の方法によって、定量して分析した。
結果は、実施例１で得たものと同様であった。

【００５９】実施例 ３ カカオリカーを、各種遺伝子型のＴｈｅｏｂｒｏｍａ
ｃａｃａｏから得た不十分に発酵させたカカオ豆から調
製した。これらの豆のタンパク質は、２１ｋＤおよび３
１ｋＤ／４７ｋＤ貯蔵のタンパク質に対応するタンパク
質の３本の可視バンドを、ポリアクリルアミドゲル上の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーで示した。

【００６０】リカーの一部の加水分解生成物含量を、上
記の方法によって定量した。次いで２００ｍＭクエン酸
緩衝液ｐＨ４ １ｍｌをリカーの一部の１００ｍｇと混
合し、混合物を５０℃で２時間インキュベートし、ｐＨ
２００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７ １ｍｌで調整し、カ
ルボキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／μｌ、シグマ
社製）４０μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベー
トし次いで９５℃で５分間混合物を加熱して反応を停止
した。タンパク質の加水分解度を分泌液の加水分解生成
物含量を定量して最終的に分析した（上記の方法）。

【００６１】下記の表３に示す結果は、本発明に係る処
理が低発酵豆の混合物から得たリカー中のフレーバ前駆
物質の含量を著しく増加することを可能にすることを示
した。

【００６２】

【表３】 （加水分解生成物１〜４の保持時間は、それぞれ９、１
７、２４および２９．５分であった）。

【００６３】実施例 ４ 各種遺伝子型のＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏから得
た不十分に発酵させたカカオ豆５００ｇを、実施例３に
記載したのと同一の方法で酵素的に処理した。失活混合
物のｐＨを次いで５〜６に調整し、０．３％グルコース
と０．６％フルクトースを添加し、混合物を水分率が５
％以下になるまで穏やかな加熱（６０℃）の間に真空下
に水の蒸発により乾燥し、１３０℃で１５分間炉内で焙
焼し、焙焼混合物により出された風味を上記の感覚試験
により分析した。結果は、本発明に従って処理して焙焼
した低発酵豆からのニブは、十分に発酵させて焙焼した
豆から誘導したココアフレーバの強烈なフレーバ特性を
有することを示した。

【００６４】実施例 ５ 液を、さまざまな遺伝子型のＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａ
ｃａｏから得た過発酵カカオ豆から常法により調製し
た。これらの豆のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲ
ル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーで、２１ｋ
Ｄおよび３１ｋＤ／４７ｋＤ貯蔵タンパク質に対応する
タンパク質のいかなる可視バンドも示さなかった。

【００６５】リカーの一部の加水分解生成物含量を、上
記の方法によって定量した。次いで２００ｍＭクエン酸
緩衝液ｐＨ４ １ｍｌを液の一部の１００ｍｇと混合
し、混合物を５０℃で２時間インキュベートし、ｐＨを
２００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７ １ｍｌで調整し、カ
ルボキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／μｌ、シグマ
社製）４０μｌを添加し、２５℃で１時間インキュベー
トし、次いで９５℃で５分間混合物を加熱して反応を停
止した。タンパク質の加水分解度を、液の加水分解生成
物含量を定量して最終的に分析した（上記の方法で）。

【００６６】下記の表４に示す結果は、本発明に係る処
理が過発酵豆の混合物から得たリカー中のフレーバ前駆
物質の含量を著しく増加することを可能にすることを示
した。

【００６７】

【表４】 （加水分解生成物１〜４の保持時間は、それぞれ９、１
７、２４および２９．５分であった）。

【００６８】実施例 ６ さまざまな遺伝子型のＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
から得た過発酵カカオ豆５００ｇを、実施例５に記載し
たのと同一の方法で酵素的に処理した。失活混合物のｐ
Ｈを次いで５〜６に調整し、０．３％グルコースと０．
６％フルクトースを添加し、混合物を水分率が５％以下
になるまで穏やかな加熱（６０℃）の間に真空下に水の
蒸発により乾燥し、１３０℃で１５分間炉中で焙焼し、
焙焼した混合物により出されたフレーバを上記の感覚試
験により分析した。結果は、本発明に従って処理して焙
焼した過発酵豆からのニブは、十分に発酵させて焙焼し
た豆から誘導したココアフレーバの強烈フレーバ特性を
有することを示した。

【００６９】実施例 ７ 数種類のニブを常法により１日間発酵させたカカオ豆か
ら調製し、各々のニブ１４０ｍｇをさまざまな活性単位
を含むＭａｘｉｎｖｅｒｔ Ｌ１００００インベルター
ゼ（Ｇｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓ社製）の水溶液１００
μｌと混合し、混合物を３０分または１２０分間インキ
ュベートし、反応を９５℃で１分間加熱して停止し、各
混合物のグルコース含量を上記の方法によって定量し
た。図１に示した結果は、１単位／ｍｌのインベルター
ゼがスクロースの８０％以上をグルコースおよびフルク
トースに加水分解するのに十分であることを示した。

【００７０】実施例 ８ 低発酵Ｓａｎｃｈｅｚカカオ豆からのリカー（１７５
ｇ）を、そのｐＨを酢酸の溶液でｐＨ４．５に調整され
ている（エンドプロテアーゼの活性化）水３５０ｍｌ中
で５０℃で２時間インキュベートし、次いでｐＨを炭酸
カリウムの溶液で７に調整し、混合物をＭａｘｉｎｖｅ
ｒｔ Ｌ１００００インベルターゼ（２０単位／ｇ）お
よびカルボキシペプチダーゼＡ（０．０６単位／ｍｌ）
と５０℃で１５分間インキュベートし、または混合物を
２０単位／ｇのＭａｘｉｎｖｅｒｔＬ１００００インベ
ルターゼと１％Ｃｏｒｏｌａｓｅ ＰＰプロテアーゼ
（西独、Ｒｏｅｈｍ社製）と５０℃で１５分間、または
２０単位／ｇのＭａｘｉｎｖｅｒｔ Ｌ１００００イン
ベルターゼと１％Ｐｒｏｍｏｄ １９２Ｐプロテアーゼ
（英国、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ社製）または１％Ｐｒ
ｏｍｏｄ ２７９Ｐプロテアーゼ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙ
ｓｔ社製）と５０℃で６０分間インキュベートした。９
５℃で５分間混合物を加熱して反応を停止した。タンパ
ク質の加水分解度を、リカーの加水分解生成物含量を定
量して最終的に分析した（上記の方法）。

【００７１】反応の後、混合物のｐＨを５．２に調整
し、混合物を乾燥し、焙焼して上記の感覚性分析に付し
た。

【００７２】下記の表５に示す結果は、フレーバ前駆物
質がプロテアーゼおよびインベルターゼ製品を使用して
生成したことを示した。

【００７３】

【表５】 （加水分解生成物１〜３の保持時間は、それぞれ９、１
７および２４分であった）。

【００７４】実施例 ９ 同一条件下に、不十分に発酵させたＩｎｄｏｎｅｓｉａ
ｎ Ｓｏｌａｗｅｓｉカカオ豆がプロテアーゼで処理さ
れて、酵素処理の間にインベルターゼが０．６％フルク
トースおよび０．３％のグルコースの添加により置き換
えられるならば、実施例８で得たものと同様の結果が得
られる。

【００７５】実施例１０ 実施例８と同様の方法で、低発酵Ｓａｎｃｈｅｚカカオ
豆からのリカーを、２０単位／ｇのインベルターゼと共
に、そしてエンドプロテアーゼとＰｒｏｍｏｄ１９２プ
ロテアーゼとをｐＨ４．５で同時にまたは連続して作用
させながらさまざまな濃度のＰｒｏｍｏｄ １９２Ｐプ
ロテアーゼと共にインキュベートした。９５℃で５分間
混合物を加熱して反応を停止した（試験５を除く）。タ
ンパク質の加水分解度を、リカーの加水分解生成物含量
を定量して分析した（上記の方法で）。混合物のｐＨを
５．２に調整し、混合物を乾燥し、焙焼して上記の感覚
分析に付した。

【００７６】反応条件を下記の表６に示す。下記の表７
に示す結果は、（１）酵素濃度を減少でき、（２）すべ
ての反応が単一工程で成し遂げることができ、（３）乾
燥前の混合物の失活を防止することが可能で、（４）水
分率をインキュベーションの間に減少できることを示し
た。

【００７７】

【表６】

【００７８】

【表７】 （加水分解生成物１〜３の保持時間は、それぞれ９、１
７および２４分であった）。

【００７９】反応の後、混合物のｐＨを５．２に調整
し、乾燥し、焙焼して上記の感覚分析に付した。結果
は、不十分に発酵させたカカオ豆に特有の悪いフレーバ
が消失したことを示した。その上、処理混合物に進展し
たココアフレーバは、所望のものと類似していた。特
に、試験５の試料（水分率が減少した）は、特に好まし
かった。

【図面の簡単な説明】

【図１】処理時間を基準として、インベルターゼ添加量
の函数としての、水と不十分に発酵させたココア豆のニ
ブの混合物中のインベルターゼにより生成したグルコー
スの量を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エリック ラエツ スイス国ローザンヌ，シーエィチ．ドゥ パンソン 11

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カカオニブまたはリカーを調製し、カカ
   オ豆を１〜１５日間発酵させて、少なくとも１つの工業
   的プロテアーゼとｐＨ３〜８の水性媒体中で混合し、そ
   してタンパク質およびペプチドを加水分解するのに十分
   な時間及び温度でその混合物をインキュベートすること
   を特徴とする、カカオニブまたはリカーを処理する方
   法。
2. 【請求項２】 乾燥物質ｇ当り少なくとも１０μモルの
   疎水性アミノ酸及びカカオ豆中に当初から存在するもの
   に比べて少なくとも１．４倍多い加水分解生成物を得る
   のに十分な時間および温度で混合物をインキュベートす
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 カカオニブまたはリカーを１〜１５日間
   発酵させたカカオ豆から調製し、ｐＨ３〜６の水性媒体
   と混合し、その混合物を４０〜６０℃で１０分〜２０時
   間インキュベートし、混合物のｐＨをｐＨ４〜８に調整
   し、少なくとも１つの工業的プロテアーゼをそこに添加
   し、そして１０〜６０℃で５分〜２０時間インキュベー
   トする、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 カカオニブまたはリカーを１〜１５日間
   発酵させたカカオ豆から調製し、ｐＨ４〜８の水性媒体
   と混合し、少なくとも１つの工業的プロテアーゼをそこ
   に添加し、そして１０〜６０℃で５分〜２０時間インキ
   ュベートする、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 さまざまな発酵状態のおよび／または各
   種遺伝子型のカカオの木から得た豆の混合物からカカオ
   ニブまたはリカーを調製する、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 混合物はカカオ豆ニブまたはリカー１０
   〜８０％と混合物ｇ当り１〜１００単位の工業的プロテ
   アーゼを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方
   法。
7. 【請求項７】 さらに、インベルターゼ、グリコシダー
   ゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼおよびオキシダーゼより
   なる群から選ばれる少なくとも１つの工業的酵素を混合
   物に添加する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方
   法。
8. 【請求項８】 さらに、少なくとも０．１重量％の還元
   糖を混合物に添加する、請求項１〜５のいずれか１項記
   載の方法。
9. 【請求項９】 １〜１５日間発酵させたカカオ豆ニブま
   たはリカー、および工業的プロテアーゼおよび／または
   工業的インベルターゼを含む組成物。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の組成物を焙焼して得た
    ココア。