PT755632E

PT755632E - Tratamento enzimatico do cacau

Info

Publication number: PT755632E
Application number: PT96201692T
Authority: PT
Inventors: Carl Erik Hansen; Eric Raetz; Anthony Kluppel
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1995-06-20
Filing date: 1996-06-18
Publication date: 2001-12-28
Also published as: KR970000051A; MY114713A; US5888562A; CZ179796A3; EP0755632A2; IL118678A0; DE69615105D1; EP0749694A1; HU219572B; AR002538A1; JPH09156A; EP0755632A3; PL314868A1; EP0755632B1; HUP9601700A3; SG50740A1; ES2161967T3; MX9602397A; EP0755632B9; CA2179533A1

Description

a

DESCRIÇÃO TRATAMENTO ENZIMÁTICO DO CACAU" A invenção refere-se a um processo de tratamento enzimático de uma pasta ou de um licor de cacau para melhorar a sua composição em precursores de aroma, permitindo utilizar uma vasta gama de grãos de cacau em diversos estados de fermentação.

Estado da técnica A qualidade de um chocolate é directamente influenciada pela proveniência geográfica e genética e pelas condições de tratamento dos grãos de cacau, desde a sua cultura em campos até à sua transformação em fábrica. Os grãos de cacau, logo que colhidos, são assim submetidos no seu pais de origem a uma fermentação e a uma secagem natural que se destinam a fazer aparecer os precursores de aroma. Infelizmente, a colheita na maturidade dos grãos e as condições da sua fermentação nem sempre são controladas de uma forma adequada. Além disso, os três tipos principais de cacaueiros da espécie Theobroma cacao, chamados Criollo, Forastero e Trinitario, produzem cada um deles grãos com uma composição diferente. Por fim, os grãos secos podem ser também danificados durante o seu transporte até aos países especializados na transformação dos grãos. A indústria deve portanto fazer face a uma grande variabilidade de composição dos lotes de grãos de cacau (ver, por exemplo, Smaffer M., The manufacturing Confectioner, 92-94, Junho de 1994) . 1

Os grãos de cacau fermentados e secos são em seguida tradicionaliueiiLe submetidos a uma trituração mais ou menos pronunciada, as cascas são separadas e em seguida são submetidas a uma torrefacção, combinada, se for caso disso, com uma alcalinização, que são destinadas a fazer aparecer o uromo c o côr do cacau. A etapa da torrefacção faz com efeito intervir as reacções de Maillard entre os açúcares redutores e os produtos de degradação das proteínas, nomeadamente os aminoácidos e os produtos de hidrólise (Wood and Lass, Cocoa, Longman Scientific&Technical, Longman Group UK, Inglaterra, 1985, ISBN 0-582-46352-1).

Os precursores de aroma aparecem apenas no momento da fermentação natural dos grãos, devido a reacções de hidrólises. As experiências de incubação in-vitro dos grãos ou de fragmentos de grãos de cacau não fermentados mostraram assim que estas reacções de hidrólises dependem do pH, da temperatura e da compartimentação das enzimas e dos substratos no grão. Além disso, as reacções de hidrólises são também sensíveis à presença de polifenóis. Assim, é vantajoso extrair à acetona os polifenóis dos grãos e incubar também os referidos grãos no ácido acético para separar as enzimas e os substratos (Biehl B. e outros. J. Sei. Food. Agric. 33_, 1280-1290, 1982) .

Além disso, outros trabalhos mostraram que os grãos de cacau compreendem pelo menos três actividades proteolíticas implicadas no aparecimento dos precursores de aroma de cacau, nomeadamente uma endoprotease com uma actividade óptima com pH 3,5, uma carboxipeptidase com uma actividade óptima com pH 5,8 e uma aminopeptidase com uma actividade óptima com pH 7. As experiências de hidrólise da globulina de grãos de 2 cacau purificado (proteina que apresenta por cromatograf ia SObre gel SDS-PAGE duas bandas de 31 kD e 47 kD) cujos polifenóis foram extraídos, com as proteases comerciais e/ou a endoprotease e a carboxipeptidase de cacau purificados mostraram que é preferível hidrolisar a globulina suce33Ívomcntc por endoprotease de cacau com pH 3,5, em seguida por carboxipeptidase de cacau ou uma carboxipeptidase comercial com pH 5-6. Desta forma, obtém-se uma composição de produtos de hidrólise e de aminoácidos que é adequada para reencontrar um aroma de cacau no momento da torrefacção subsequente da mistura, em presença de açúcares redutores (Voigt J. e outros, Food Chemistry, 50, 177-184, 1994).

Além disso, a patente US2965490 descreve um processo de hidrólise in-vitro de grãos de cacau não fermentados (grãos verdes) destinado a substituir a fermentação natural dos grãos. Para este efeito, hidrolisa-se com ácido ou enzimaticamente as proteínas de grãos de cacau verdes, hidrolisam-se enzimaticamente os hidratos de carbono dos referidos grãos a fim de produzir açúcares simples, faz-se reagir os dois hidrolisados em condições anidras a uma temperatura e durante um período de tempo suficientes. Entretanto, é necessário assinalar que os polifenóis dos grãos verdes limitam particularmente a hidrólise enzimática das proteínas de reserva (ver exemplo comparativo 1 adiante) .

Em definitivo, os processos e trabalhos acima descritos destinam-se manifestamente a substituir a fermentação natural dos grãos de cacau por uma hidrólise enzimática controlada dos grãos verdes (problema colocado pelos polifenóis) ou das suas proteínas purificadas (das quais os polifenóis foram extraídos) . Além disso, a qualidade e a quantidade de 3 precursores de aroma necessários à criação de um bom aroma de cacau no momento da torref acção não são ainda conhecidos.

Resumo da invenção A presente invenção tem por objectivo dissimular a variabilidade de composição de precursores de aroma dos grãos de cacau fermentados e conferir a uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados uma composição óptima em precursores de aroma.

Para este efeito, segundo o processo de acordo com a presente invenção, prepara-se uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias, mistura-se pelo menos uma protease num meio aquoso com pH 3-8 e incuba-se a mistura durante um período de tempo e a uma temperatura suficiente para hidrolisar as proteínas e as peptidárias.

De preferência, incuba-se a mistura durante um período de tempo e a uma temperatura suficiente para obter pelo menos 10 yMol de aminoácidos hidrófobos por g de matéria seca e/ou pelo menos 1,4 vezes mais de produtos de hidrólise em relação aos presentes inicialmente nos grãos de cacau. 0 presente processo permite reforçar a hidrólise das proteínas de reserva dos grãos de cacau, o que teve lugar inicialmente no momento da fermentação natural dos grãos, até à obtenção de quantidades suficientes e uma composição correcta em aminoácidos e em produtos de hidrólise. A torrefacçâo subsequente da mistura de acordo com a invenção permite portanto obter um bom aroma de cacau, que 4 pode mesmo ser mais forte ou mais concentrado em relação ao obtido após a torrefacção dos grãos do cacau fermentados tradicionalmente.

Podem-se também utilizar grãos de cacau obtidos em diferentes esiadns de. fermentação, como por exemplo OS grãos pouco fermentados que não contêm precursores de aroma suficientes, não contendo os grãos demasiado fermentados uma boa composição em precursores de aromas, ou os grãos mal fermentados como os grãos ácidos que contêm uma mã composição em precursores de aroma. Da mesma forma, os grãos de cacau podem ser de origem vegetal e geográfica diferentes. 0 presente processo permite assim homogeneizar a composição em precursores de aroma de uma mistura de grãos com proveniência e estados de fermentação diferentes.

Além disso, a hidrólise de uma pasta ou de um licor de cacau por enzimas técnicas é surpreendente devido à sua sensibilidade aos polifenóis dos grãos. Foi possível mostrar que os grãos fermentados naturalmente durante pelo menos 1 dia apresentam uma taxa em polifenóis suficientemente baixa para que as enzimas técnicas não sejam significativamente inibidas no presente processo. Pelo contrário, os grãos verdes apresentam uma taxa demasiado elevada em polifenóis para serem utilizados no presente processo.

Em particular, a adição de uma invertase permite aumentar vantajosamente o conteúdo natural em glucose e em frutose da mistura, o que favorece a formação de aroiuas nu momento de uma torrefacção subsequente da mistura. 5

Por fim, a utilização possível de diversas enzimas técnicas na presente invenção abre a possibilidade de criar variantes de aroma de cacau que podem ser apreciadas pelo consumidor.

Figura 1: representação da quantidade de glucose produzida por uma invertase numa mistura de água e de pasta de grãos de cacau insuficientemente fermentados, consoante o tempo de tratamento e em função da quantidade de invertase adicionada.

Descrição detalhada da invenção

Uma unidade de actividade enzimática é definida na sequência da descrição por pmol de produto transformado por minuto. Da mesma forma, as percentagens são dadas em peso, salvo indicação em contrário. A expressão "grãos de cacau pouco ou insuficientemente fermentados" designa grãos fermentados tradicionalmente durante cerca de 1 a 4 dias e em seguida secos, cujas proteínas apresentam por cromatografia sobre gel SDS-PAGE de poliacrilamida 2 bandas visíveis, correspondentes à proteínas de reserva 21 kD e 31 kD/47 kD (ver W091/00913 e W0091/00914) . Além disso, estes grãos não apresentam uma quantidade suficiente em aminoácidos e em peptidárias para formar uma aroma de cacau no momento de uma torrefacção subsequente. A expressão "grãos de cacau bem fermentados" designa grãos fermentados e secos tradicíonalmente durante cerca de 2 6

a 10 dias, cujas proteínas apresentam por cromatografia sobre gel SDS-PAGE dc poliacrilamida uma banda visível correspondendo à proteína de reserva 21 kD, sendo as duas bandas correspondendo à proteína de 31 kD/47 kD parcialmente ou completamente degradadas. Além disso, estes grãos aprosont^m nma quantidade suficiente em aminoácidos e em peptidarias para formar um aroma de cacau no momento de uma torreícjc-c.í - subsequente. A expressão "grãos de cacau demasiado fermentados" design^ qraos fermentados e secos tradicionalmente durante cerca de 7 a 13 dias, cujas proteínas não apresentam por cromatografia sobre gel SDS-PAGE de poliacrilamida bandas visíveis e distintas correspondendo às proteínas de reserva 21kD e 31kD/47kD. Além disso, estes grãos apresentam uma quantidade suficiente em aminoácidos, mas uma quantidade insuficiente em peptidárias para formar um aroma de cacau no momento de uma torrefaeção subsequente.

Por último, de acordo com a presente invenção, obteve-se uma pasta por trituração clássica de grãos de cacau fermentados ou não, e um licor de cacau por moagem mais ou menos pronunciada dos referidos grãos ou da pasta até que a manteiga de cacau se liberte das células.

Para a realização do presente processo, prepara-se uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias. Podem-se portanto utilizar, em mistura ou não, grãos de cacau obtidos em diferentes estados de fermentação, tais como grãos pouco fermentados, bem fermentados, demasiado fermentados ou mal fermentados, por exemplo. Podem também utilizar-se, em mistura ou não, grãos de cacau provenientes 7 r

de diferentes genotipos de cacaueiros Theobroma cacao Cnollo, borastero e/ou Trinitario, pui exemplo. Pode-se reduzir a pasta ou o licor a um pó fino, no entanto, convém notar que se se tratar enzimaticamente a pasta ou o licor a uma temperatura superior a 35-45°C, os pedaços de pasta ou licor fundir se ão, permitindo assim às enzimas aceder à matéria interna da mistura.

Mistura-se em seguida a pasta ou o licor com pelo menos uma protease num meio aquoso com pH 3-8. A protease pode ser seleccionada por si só ou em combinação no grupo formado pelas endoproteases, as carboxipeptidases e as aminopeptidases, por exemplo. 0 pH do meio aquoso pode ser ajustado por adição de um ácido mineral ou orgânico, ou de um tampão escolhido entre os correntemente utilizados nos processos industriais alimentares, nomeadamente os tampões com base em citrato, fosfato ou acetato, por exemplo. Em particular, pode-se preferir um pH 3-5 de forma a activar também as endoproteases endógenas do grão, sendo no entanto preferível escolher em consequência uma protease técnica que é activa neste domínio da acidez. A mistura pode compreender 10-80% de uma pasta ou de um licor de cacau, nomeadamente 20-70%, e 1-100 unidades de protease por g de mistura, nomeadamente 0,01-5% (peso/peso) de uma preparação de protease técnica comercial, por exemplo.

Para a realização do presente processo, incuba-se em seguida a mistura durante um período de tempo e a uma temperatura suficiente para hidrolisar as proteínas e peptidárias da mistura. 8

De preferência, incuba-se a mistura durante um período de lempu e a uma temperatura suficiente para obter pelo mcnoo 10 umol de aminoácidos hidrófobos por g de matéria seca e/ou pelo menos 1,4 vezes mais, ou mesmo 1,7 ou mesmo 2 vezes mais de produtos de hidrólise em relação aos inicialmente presentes nos grãos de cacau tratados. Neste contexto, pede-se comparar a quantidade dos mesmos produtos de hidrólise (peptidárias e aminoácidos) que se encontra nas pastas obtidas antes e depois do tratamento de acordo com a invenção. Pode-se também considerar o aparecimento de novos produtos de hidrólise em relação aos presentes na pasta não tratada de acordo com a invenção, limitando-se contudo aos que aparecem significativamente no momento da fermentação natural dos grãos verdes, por exemplo. Em particular, compara-se a quantidade de quatro produtos de hidrólise com tempos de retenção de cerca de 9, 17, 24 e 29,5 minutos no momento de uma cromatografia sobre uma coluna HPLC Reverse-Phase C18 (n.° 218TP54 Vydac; EUA) caracterizada por um débito constante de 1 ml/min e eluentes que consistem numa solução aquosa que compreende 0,1¾ de ácido trifluoroacético e 2% de acetonitrilo durante 10 minutos, seguida de um gradiante linear que compreende 0,1% de ácido trifluoroacético e 2% a 52,7% de acetonitrilo durante 50 minutos. Os produtos da hidrólise eluída são detectados a 215 e 280 nm.

Da mesma forma, podem considerar-se como aminoácidos hidrófobos unicamente os presentes maioritariamente na pasta tratada de acordo com a invenção, em particular a fenilamina, a leucina e a alanina, por exemplo.

Para obter uma quantidade suficiente de aminoácidos hidrófobos e de produlo de hidrólise, pode-se incubar a mistura a 10-60°C durante 30 minutos a 20 h, por exemplo. Entretanto, a temperatura e o tempo da hidrólise deverão ser escolhidos em função do meio, do tipo de enzima, do grau de fermeniação doc grãos e da proveniência dos grãos.

Numa primeira forma de realização particular da presente invenção, prepara-se uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias, mistura-se a um meio aquoso com pH 3-ú, incuba-se a mistura a 40-60°C durante 10 minutos a 20 h, de forma a favorecer a acção da endoprotease do cacau, ajusta-se o pH da mistura a um pH 4-8, adiciona-se pelo menos uma protease técnica e incuba-se a 10-60°C durante 5 minutos a 20 h, de forma a obter uma hidrólise das proteínas e das peptidárias, mas de preferência pelo menos lOpmol de aminoácidos hidrófobos por g de matéria seca e/ou pelo menos 1,4 vezes mais de produtos de hidrólise (peptidárias e aminoácidos) em relação aos presentes inicialmente nos grãos de cacau.

Numa segunda forma de realização particular da presente invenção, prepara-se uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias, mistura-se a um meio aquoso com pH 4-8, adiciona-se pelo menos uma protease e incuba-se a 10-60°C durante 5 minutos a 20 h, de forma a obter uma hidrólise das proteínas e das peptidárias, mas de preferência pelo menos lOpmol de aminoácidos hidrófobos por g de matéria seca e/ou pelo menos 1,4 vezes mais de produtos de hidrólise (peptidárias e aminoácidos) em relação aos inicialmente presentes nos grãos de cacau. De preferência, escolhe-se uma 10 gama de pH na qual permaneça activa a endoprotease de cacau, bem como a protease técnica.

Por fim, numa terceira forma de realização particular da presente invenção, pode adicionar-se à mistura reactiva, pelo pelos uma enzima escolhida no grupo formado pelas invertases, glicosidases, celulases, pectinases e oxidases. De preferência, adiciona-se pelo menos uma das referidas enzimas à razão de 0,01 a 5% de uma preparação comercial de enzimas, ou 1-100 unidades por g de mistura. A mistura reagente deve ser compreendida como uma das misturas acima descritas, que se incuba durante um determinado período de tempo (compreendendo ou não a protease técnica) .

Em particular, combina-se o tratamento de uma protease técnica, e/ou de uma endoprotease de cacau com uma invertase técnica. Este tratamento permite vantajosamente produzir aminoácidos hidrófobos e outros produtos de hidrólises que se combinarão à glucose e frutose no momento de uma torrefaeção subsequente para dar um aroma mais achocolatado (que evoca uma riqueza de gosto) . De forma inesperada, pode-se realizar a endoprotease de cacau, a protease e a invertase técnicas numa só etapa (segunda forma de realização da invenção) , escolhendo entretanto uma gama de pH favorável à actividade de todas as enzimas (a endoprotease, a protease técnica e a invertase).

Se não se utilizar invertase, pode ser também vantajoso adicionar peio menos 0,1¾ de um açúcar redutor á mistura final antes da torrefaeção, como por exemplo glucose e/ou frutose, à razão de 0,1 a 5%, por exemplo. 11

Por fim, depois de ter realizado o presente processo, pode-se conservar a mistura desactivando as enzimas pox meio de calor (80-120°C durante 1 a 60 minutos) ou por um tratamento sob elevada pressão hidrostática (superior a 500000 kPa), por exemplo. Pode-se também secar a mistura por eAemplo por liofilização, por atomização, por aspiração em vácuo, ou por evaporação de água durante um aquecimento moderado da mistura. De preferência, seca-se a mistura até atingir um conteúdo em humidade da mistura inferior a 10%, nomeadamente 5*. Pode-se igualmente submeter a mistura a uma torrefacção e/ou alcalinização clássicas, como a descrita na patente EP0226727.

De preferência, depois da realização do presente processo, ajusta-se o pH da mistura a 5-6, seca-se e torra-se. A invenção refere-se também às composições que compreendem uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias e uma protease técnica e/ou uma invertase técnica. Se as enzimas estiverem ainda activas, as composições podem conter pelo menos 1 unidade de actividade enzimática por grama de composição. No caso em que as enzimas estão inactivas, na sequência de um tratamento de desnaturação por calor por exemplo, estas podem entretanto ser ainda identificadas com a ajuda de anticorpos adequados, o que traduz a utilização anterior desta enzima.

As composições podem portanto compreender uma pasta ou um licor de cacau preparado a partir de uma mistura de grãos em diversos estados de fermentação e/ou provenientes de diversos genotipos de cacaueiro. Estas composições podem ser 12 uma das composições acima apresentadas no âmbito do presente processo. A invenção abiange assim também as composições secas, que compreendem a adição de glucose e/ou de frutose e em particular os cacaus (em pó, pasta, licor...) obtidos por torrefaeção das referidas composições. Estas composições distinguem-se cm particular da situação da técnica da especialidade devido ao facto de serem derivadas de uma mistura que compreende grãos obtidos em diferentes estados de fermentação e/ou provenientes de diversos genotipos de cacaueiros, e proteases e/ou invertases técnicas activas ou inactivas. A presente invenção é descrita em maior pormenor adiante com referência aos exemplos que se seguem. Estes exemplos são precedidos por uma descrição de diversos testes e de uma breve apresentação da figura. É no entanto evidente que estes exemplos são dados a titulo de ilustração do objectivo da invenção, da qual não constituem de forma alguma uma limitação.

Análise dos aminoácidos

Submete-se a mistura inactiva de acordo com a invenção a um banho de ultra-sons durante 10 minutos, homogeneiza-se 2 vezes durante 1 minuto a 9600 rpm (Polytron) , centrifuga-se durante 10 minutos a 10000 g, recolhe-se o sobrenadante, filtra-se, em seguida analisa-se o seu conteúdo em aminoácidos por meio do kit ACCQTag® (Waters, EUA) .

Para o efeito, 20 μΐ de amostra ou de padrão são misturados com 140 μΐ de um tampão de borato, adicionam-se 40 μΐ de um reagente que compreende carbamato de 6- 13

aminoquinolil-N-hidroxisucinimidilo (AQC) , submete-se a mistura a um vórtice, deixa-ae repousar à temperatura ambiente durante 1 minuto, aquece-se a 55°C durante 7 minutos, injecta-se numa coluna HPLC Reverse-Phase C18 (Nova-Pak Cl 8, 4pm; EUA) e eluem-se os aminoácidos derivados a 36,5°C, com um débito de 1 ml/min, num gradiante: 100% de solvente A durante 10 minutos, 98% de solvente A durante 10,5 minuto:·., 9 3 de solvente A durante 26 minutos, 90% de solvente A durante 30 minutos, 67% de solvente A durante 43 minutos, ui de solvente A durante 53 minutos, 100% de água durante r··’ mr.utos e 100% de um solvente acetonitrilo/água (65%/35 durante 60 minutos (solvente A = tampão de fosfato fornecido pela Waters).

Os aminoácidos obtidos e eluidos são detectados a 395 nm por um detector Applied Biosystem, modelo 980. Os aminoácidos da mistura são em seguida quantificados em ymol por grama de mistura seca em relação às amostras padrão derivadas e eluídas nas mesmas condições.

Análise dos produtos de hidrólise

Adiciona-se à mistura inactiva de acordo com a invenção metanol até uma concentração de 70%, adiciona-se 1,5 ml de metanol a 70% e 100 mg de polivinilpolipirrolidona (PVPP) , deixa-se agir sob agitação suave durante 1 h à temperatura ambiente, centrifuga-se 2 vezes durante 10 minutos a 200000 g, recolhem-se as partículas sobrenadantes, elimina-se o metanol por aspiração em vácuo, adiciona-se 0,35 ml de água ao resíduo, centrifuga-se a solução durante 5 minutos a 20000 g, filtra-se, em seguida analisa-se o seu conteúdo em produto de hidrólise por eluição sobre uma coluna HPLC Reverse-Phase 14 C18 (η.° 218ΤΡ54 Vydac; EUA) com um débito de 1 ml/min em 0,1¾ de ácido trifluoroacético e 2% de acetonitrilo em água durante 10 minutos, seguido de um gradiante linear que compreende 0,1¾ de ácido trif luoroacético e 2 a 52,7% de acetonitrilo durante 50 minutos. Os produtos da hidrólise cluidos são detectados a 215 e 280 nm.

No âmbito da presente invenção, determina-se o aumento da quantidade de produtos de hidrólise (peptidárias e aminoácidos) na mistura tratada de acordo com a invenção em relação aos presentes na mistura não tratada, comparando as áreas dos picos de eluição de quatro produtos de hidrólise antes de um tempo de retenção de 9, 17, 24 e 29,5 minutos.

Estes picos encontram-se geralmente no momento da fermentação tradicional dos grãos de cacau dos cacaueiros Theobroma cacao Trinitario, Criollo e Forastero. Entretanto, apenas se podem excluir outros produtos de hidrólise que possam também aparecer no momento da fermentação tradicional de grãos de cacau provenientes de certos genotipos particulares de cacaueiros.

Análise dos açúcares

Incuba-se a mistura inactiva de acordo com a invenção durante 30 minutos a 60°C sob agitação, deixa-se repousar à temperatura ambiente durante 15-30 minutos, centrifuga-se 2 vezes a 20000 g durante 5 minutos, filtra-se o sobrenadante através de um cartucho Waters Sep-Pak C18, filtra-se de novo o filtrado através de um filtro sartorius Minisart (SRP15, n.° 1755K) e determina-se o seu conteúdo em glucose pelo método espectrofotométrico "God-Perid" com a ajuda do kit n.° 124028 de Boehringer-Mannheim (Alemanha), ou ainda por HPLC. 15

Análise sensorial

Inactiva-se por calor a pasta ou o licor hidrolisado de acorde com a invenção, ajusta-se o pH a 5-6, seca-se por evaporação em vácuo da água no momento de um aquecimento moderado (<60°C) ate que o conteúdo em humidade seja inferior a 10' , em seguida torra-se num forno a 130°C durante 15 minutes. Os aromas gerados pela torrefaeção são assim avaliados por um painel de pessoas habituadas a avaliar tais aromas .

Todos os aromas são comparados com estes produtos por pastas ou licores de grãos de cacau, simplesmente secos e torrados nas mesmas condições, que são derivados de grãos de cacau Sanchez e Sulawesi insuficientemente fermentados e de grãos de cacau Ghana bem fermentados (grãos conhecidos dos técnicos da especialidade).

Cada amostra é avaliada quanto às sensações seguintes "aroma de cacau" (derivada dos grão Ghana) , "acidez" (qualifica o sabor elementar provocado pelas soluções aquosas diluídas da maior parte dos ácidos) , "amargura" (qualifica o sabor elementar provocado pelas soluções diluídas de diversas substâncias, como o quinino, ressentido na parte superior da língua e na parte de trás do palato) , "adstringência" (o termo foi já alargado à totalidade das acções dos polifenóis que se traduzem por sensações de carácter físico desde a supressão de untuosidade até à adstringência no sentido médico que abrange uma constrição e/ou crispação dos tecidos), "frutado" (nota gustativa que pertence ao bouquet e que evoca o fruto chegado à sua maturidade: maçã, banana, pera...) "florido" (corresponde a uma sensação olfactiva que 16 lembra as flores em geral: rosa, jasmim, jacinto, lilás...) "fumado" (sabor e odor de presunLo fumado; defeito proveniente em geral da secagem dos grãos de cacau após a fermentação por meio de fogo de lenha) , "bolorento" e "cru" (carácter de cacaus insuficientemente torrados em que o aroma não oc dcGcnvolvou; ligado a uma adstringência & a uma acidez; lembra amendoins crus).

Exemplo comparativo 1

Prcpara-se classicamente uma pasta de grãos de cacau verdes de Theobroma cacao Trinitario ICS-95, mistura-se a 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 4, 100 mg da referida pasta e, se for caso disso, 100 mg de PVPP que forma um complexo com os polifenóis. Incuba-se a mistura durante 2 h a 50°C, ajusta-se o seu pH com 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 7, adiciona-se, se for caso disso, 40 μΐ de carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ, Sigma) incuba-se a 25°C durante 1 h, em seguida interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C durante 5 minutos.

Analisa-se em seguida o grau de hidrólise das proteínas de cacau, determinando por meio dos métodos acima descritos o conteúdo em aminoácidos livres nas pastas tratadas, e as áreas dos picos de eluição de quatro produtos de hidrólise na pasta inicial e as pastas tratadas (produtos associados à fermentação natural dos grãos: aminoácidos e peptidárias) .

Os resultados apresentados no quadro 1 que se segue mostram que uma autólise da pasta com pH 4 e com pH 7 não permite obter um aumento significativo em precursores de aromas em relação aos inicialmente presentes nos grãos 17 verdes. Pelo contrário, uma autólise com pH 4 da pasta que compreende PVPP, seguida de uma hidrólise enzimática das proteínas com um pH 7 permite obter um aumento significativo dos precursores de aroma. Os polifenóis dos grãos verdes têm portanto um inibidor importante.

Quadro 1

Tratamento enzimático Adição de PVPP Aminoácidos (yimol/g de peso seco) Áreas dos produtos de hidrólise (unidades arbitrárias) Total Hidrófobo Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 não 15,9 2,5 604 551 716 - sim 26, 8 8,3 695 1224 696 - sim + 34,9 12,1 1559 2847 2854 1804 (0 tempo de retenção respectivamente de 9, dos produtos de hidrólise 17, 24 e 29,5 minutos) 1 a 4 é

Exemplo comparativo 2

Preparam-se classicamente pastas de grãos de cacau de Theobroma cacao Trinitario ICS-95 que foram tradicionalmente fermentados durante 1, 2, 3, 4, 5 e 7 dias e em seguida secos. Analisa-se seguidamente o grau de hidrólise das proteínas das pastas, determinando por meio do método acima descrito as áreas dos picos de eluição dos quatro produtos de hidrólise nas pastas fermentadas (produtos associados à fermentação natural dos grãos). Os resultados são apresentados no quadro 2 adiante. A análise das proteínas das pastas por cromatograf ia sobre gel SDS-PAGE de poliacrilamida mostra uma degradação intensa das bandas de 31kD e 47kD para os grãos fermentados 18 durante pelo menos 3 dias. Pelo contrário, a banda de 21kD náo e degradada para os grãos fermentados duranLe 1 a 7 dias.

Torra-se a 130°C durante 15 minutos num forno as diferentes pastas. A análise sensorial do aroma libertado pelas pastas mo3tra que uma fermentação dos grãos de 3 dias é suficiente para obter um aroma de cacau aceitável.

Exemplo 1

Preparam-se classicamente pastas de grãos de cacau Theobroma cacao Trinitario ICS-95 que foram tradicionalmente fermentados durante 1, 2, 3, 4, 5 e 7 dias e em seguida secos. Mistura-se seguidamente a 100 mg de cada tipo de pasta 1 ml de um tampão de 2 00mM de citrato com pH 4, incuba-se a mistura durante 2 h a 50°C, ajusta-se o pH com 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 7, adicionam-se 40 μΐ de carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ, Sigma), incuba-se a 25°c durante 1 h e em seguida interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C durante 5 minutos. Analisa-se em seguida o grau de hidrólise das proteínas de cacau, determinando-se por meio dos métodos acima descritos o conteúdo em aminoácidos livres e as áreas dos picos de eluição dos quatro produtos mais importantes de hidrólise das pastas (produtos associados à fermentação natural dos grãos) .

Os resultados apresentados no quadro 2 mostram que se pode aumentar pelo menos 1,4 vezes o conteúdo em produtos de hidrólise numa pasta proveniente de grãos de cacau pouco ou bem fermentados. Além disso, o conteúdo em aminoácidos hidrófobos de todas as pastas tratados e das pastas 19 fermentadas durante 3 a 7 dias é sempre superior a lOpmol por g de matéria seca.

Quadro 2

Dias do fermentação Tratamento enzimático irpas rios produtos de hidrólise (unidades arbitrárias) Aumento dos produtos de hidrólise Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 1 Não 565 1017 833 - 1 Sim 1181 2626 1191 - x 2.06 2 Não 1072 2393 1190 - 2 Sim 1880 4044 1968 - x 1,70 3 Não 1600 3643 1595 170 3 Sim 2083 5074 2618 890 x 1,52 4 Não 1583 3444 1794 202 4 Sim 3107 6051 2836 596 x 1,79 5 Não 1663 3383 1249 270 5 Sim 2230 4719 2486 - x 1,43 7 Não 2061 3971 1202 267 7 Sim 2862 5555 2563 - x 1,46 (0 tempo de retenção dos produtos de hidrólise 1 a 4 é respectivamente de 9, 17, 24 e 29,5 minutos)

Exemplo 2

Preparam-se classicamente pastas de grãos de cacau de Theobroma cacao Trinitario ICS-95 que foram tradicionalmente fermentados durante 1, 2, 3, 4, 5 e 7 dias e em seguida secos. Misturam-se seguidamente a 100 mg de cada tipo de pasta 100 μΐ de um tampão de 200 mM de citrato com pH 4, incuba-se a mistura durante 2 h a 50°C, ajusta-se o seu pH com 100μ1 de um tampão de 200mM de citrato com pH 7, adicionam-se 40μ1 de carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ, Sigma), incuba-se a 25°C durante 1 h, em seguida interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C, durante 5 minutos. Analisa-se em seguida o grau de hidrólise das 20

proteínas de cacau determinando por meio dos métodos acima descritos o conleúdo em aminoácidos livres e as áreas dos picos de eluição dos quatro produtos de hidrólise das pastas (produtos associados à fermentação natural dos grãos) . Os resultados são idênticos aos obtidos no exemplo 1.

ExempI r:·; r classicamente um licor de grãos de cacau insuf i r :-.· r - r fermentados provenientes de diversos genotip . c · ^obroma cacao. As proteínas destes grãos apreser.tc. por cromatografia sobre gel SDS-PAGE de poliacr; * c;.t.í da 2 bandas visíveis de proteínas correspondentes às proteínas ae reserva 21kD e 31kD/47kD.

Determinam-se os conteúdos em produtos de hidrólise de uma parte do licor por meio dos métodos acima descritos. Mistura-se em seguida a lOOmg de uma parte do licor 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 4, incuba-se a mistura durante 2 h a 50°C, ajusta-se o pH com 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 7, adicionam-se 40μ1 de carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ, Sigma), incuba-se a 25°C durante 1 h, em seguida interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C, durante 5 minutos. Analisa-se por fim o grau de hidrólise das proteínas determinando o conteúdo em produtos de hidrólise do licor (métodos acima).

Os resultados apresentados no Quadro 3 abaixo mostram que o tratamento de acordo com a invenção permite aumentar significativamente o conteúdo em precursores de aroma de um licor proveniente de uma mistura de grãos pouco fermentados. 21

Quadro 3

Tratamento enzimático Aminoácidos (μιιιοΐ/g de peso seco) Área dos produtos de hidrólise (unidades arbitrárias) Total Hidrófobo Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 não 22,2 7,7 1451 613 sim 35,9 14,7 771 2359 1115 724 (0 tempo de retenção dos produtos de hidrólise 1 a 4 é respectivamente de 9, 17, 24 e 29,5 minutos)

Exemplo 4

Tratam-se enzimaticamente 500 g de grãos de cacau insuficientemente fermentados provenientes de diversos genotipos de Theobroma cacao de forma idêntica à descrita no exemplo 3. Ajusta-se em seguida o pH da mistura inactiva a 5-6, adiciona-se 0,3% de glucose e 0,6% de frutose, seca-se por evaporação sob vácuo da água no momento do aquecimento moderado (<60°C) até que o conteúdo em humidade seja inferior a 5%, torra-se num forno a 130°C durante 15 minutos e analisa-se o aroma libertado da mistura torrada pelo teste sensorial acima descrito. Os resultados mostram que as pastas de grãos pouco fermentados, tratados de acordo com a invenção e torrados apresentam um aroma intenso caracteristico de um aroma de cacau derivado de grãos bem fermentados e torrados.

Exemplo 5

Prepara-se classicamente um licor de grãos de cacau demasiadamenLe fermentados provenientes de diver303 genotipos de Theobroma cacao. As proteínas destes grãos não apresentam por cromatografia sobre gel SDS-PAGE de poliacrilamida bandas 22 visíveis de proteínas correspondendo às proteínas de reserva 2lkU e 31kD/47kD.

Determina-se o conteúdo em produtos de hidrólise de uma parte do licor por meio dos métodos acima descritos. Mistura oe cm ocguida a lOOmg de uma parte do licor 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 4, incuba-se a mistura durante 2 h a 50°C, ajusta-se o pH com 1 ml de um tampão de 200mM de citrato com pH 7, adicionam-se 40μ1 de carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ, Sigma), incuba-se a 25°C durante 1 h, em seguida interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C durante 5 minutos. Analisa-se por fim o grau de hidrólise das proteínas determinando o conteúdo em produtos de hidrólise do licor (métodos acima).

Os resultados apresentados no Quadro 4 abaixo mostram que o tratamento de acordo com a invenção permite aumentar significativamente o conteúdo em precursores de aroma de um licor proveniente de uma mistura de grãos demasiadamente fermentados.

Quadro 4

Tratamento enzimático Aminoácidos (μιηοΐ/g de peso seco) Área dos produtos de hidrólise (unidades arbitrárias) Total Hidrófobo Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 não 49,5 19,2 960 2192 727 - sim 59, 6 25,8 2102 4508 3026 (0 tempo de retenção dos produtos de hidrólise 1 a 4 é respectivamente de 9, 17, 24 e 29,5 minutos) 23

Exemplo 6

Tratam-se enzimaticamente 500 g de grãos de cacau demasiadamente fermentados provenientes de diversos genotipos de Theobroma cacao de forma idêntica à descrita no exemplo 5. Ajusta-se em seguida o pH da mistura inactiva a 5-6, adiciona-se 0,3¾ de glucose e 0,6% de frutose, seca-se por evaporação sob vácuo da água no momento do aquecimento moderado (<60°c) até que o conteúdo em humidade seja inferior a 5-6, torra-se num forno a 130°C durante 15 minutos e analisa-se o aroma libertado da mistura torrada pelo teste sensorial acima descrito. Os resultados mostram que as pastas de grãos demasiadamente fermentados, tratados de acordo com a invenção e torrados apresentam um aroma intenso caracteristico de um aroma de cacau derivado de grãos bem fermentados e torrados.

Exemplo 7

Preparam-se diversas pastas de grãos de cacau fermentados tradicionalmente durante 1 dia, misturam-se 140 mg de cada pasta a 100μ1 de uma solução aquosa de invertase Maxinvert L10000 (Gist Brocades) compreendendo diferentes unidades de actividades, incubam-se as misturas 30 minutos ou 120 minutos, interrompe-se a reacção aquecendo a 95°C durante 1 minuto e determina-se o conteúdo em glucose de cada mistura por meio do método acima descrito. Os resultados apresentados na figura 1 mostram que 1 unidade/ml de invertase é suficiente para hidrolisar luais de 80% da sacarose em glucose e em frutose. 24

Exemplo 8

Incuba-se um licor de grãos de cacau Sanchez pouco fermentados (175 g) durante 2 h a 50°C, em 350 ml de água cujo pH é ajustado a um pH 4,5 por uma solução de ácido acético (activação dao cndoproteases) , em seguida ajusta-se o pH a 7 com uma solução de carbonato de potássio e incuba-se a mistura durante 15 minutos a 50°C com o invertase Maxinvert L10000 (20 unidades/g) e a carboxipeptidase A (0,06 unidades/μΐ) , incuba-se a mistura durante 15 minutos a 50°C com 20 unidades/g de invertase Maxinvert L10000 e 1% de protease Corolase PP (Roehm, DE) ou durante 60 minutos a 50°C com 20 unidades/g de invertase Maxinvert L10000 e 1% de protease Promod 192P (Biocatalyst, Reino Unido) ou 1% de protease Promod 279P (Biocatalyst) . Interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C durante 5 minutos. Analisa-se por fim o grau de hidrólise das proteínas determinando o conteúdo em produtos de hidrólise do licor (métodos acima).

Após a reacção, ajusta-se o pH da mistura a 5,2, seca-se, torra-se e submete-se à análise sensorial acima descrita.

Os resultados apresentados no quadro 5 que se segue mostram que os precursores de aroma são formados utilizando os preparativos de protease e de invertase.

Quadro 5

Enzimas ftminoácidos (μιηοΐ/g de peso seco) aminoácido hidrófobo (fen., leu., ala.) Produtos de hidrólise (área: unidade arbitrária) Glucose formada (mg/g) Total Hidrófobo Pico 1 Pico 2 Pico 3 Sem tratamento 36,6 10, 6 29, 0 412 651 377 0,0 Promod 192P 49,8 15,4 30,9 607 1012 494 5,2 Promod ?79P 53, 4 16,3 30,5 575 958 470 5, 6 Coroiase PP 44,3 15,6 35,2 1053 1423 1088 1,7 Carboxipeptidase 37,6 12,9 34,3 759 1194 646 2,3 (0 tempo de retenção dos produtos de hidrólise 1 a 3 é respectivamente de 9, 17 e 24 minutos)

Exemplo 9

Obtêm-se resultados idênticos aos obtidos no exemplo 8, se nas mesmas condições se tratarem os grão de cacau indonésio Sulawesi não demasiadamente fermentados com uma protease e se a invertase for substituída pela adição de 0, 6% de frutose e 0,3¾ de glucose durante o tratamento enzimático.

Exemplo 10

De forma idêntica à descrita no exemplo 8, incuba-se um licor de grãos de cacau Sanchez pouco fermentados com 20 unidades/g de invertase e com diferentes concentrações da protease Promod 192P, fazendo-se agir a pH 4,5 a endoprotease e a protease Promod 192 simultânea ou consecutivamente. Interrompe-se a reacção aquecendo a mistura a 95°C durante 5 minutos (excepto para o teste 5) . Analisa-se o grau de hidrólise das proteínas determinando o conteúdo em produtos de hidrólise do licor (métodos acima) . Ajusta-se o pH da 26 mistura a 5,2, seca-se, torra-se e submete-se à análise sensorial acima descrita.

As condições das reacções são apresentadas no quadro 6 que se segue. Os resultados apresentados no quadro 7 que se segue mostram (1) que sc pode reduzir a concentração de enzimas, (2) que se pode realizar o conjunto de reacções numa só etapa, (3) que se pode evitar desactivar a mistura antes da secagem e (4) que se pode reduzir o conteúdo de água durante a incubação.

Quadro 6

Testes Enzima Promod 192P Endo-protease PH 4,5 Promod 192P pH 4,5 Invertase 1 h pH 4,5 Licor de cacau (g) Água adicionada (ml) Aquecimento antes da secagem pH final 1 Comparação: sem tratamento 2 1,0% 2h lh 20U/g 175 350 Sim 5,2 3 1,0% 3h, em simultâneo 20u/g 175 350 Sim 5,2 4 0,2% 3h, em simultâneo 2 0U/ g 175 350 Sim 5,2 5 1,0% 2h lh 20U/g 175 350 Não 5,2 6 1,0% 2n lh 20U/g 175 175 Sim 5,2 _i 27 * *

Quadro 7

Testes Aminoácidos (jimol/g de peso seco) % aminoácido hidrófobo (fen., leu., ala.) Produtos de hidrólise (área: unidade arbitrária) Glucose formada (mg/g) Tr.ral Hidrófobo Pico 1 Pico 2 Pico 3 1 . ) ' 10, 6 28,9 412 651 377 0,0 O 18,4 30,4 736 1277 560 4,6 J - ·. no, 7 29,8 1025 1692 751 4,3 4 14,0 30, 4 547 942 427 5,0 5 : - i, > 31,6 30,2 1322 2241 1167 5,4 6 ► ’ t i 20, 6 31,5 798 1444 606 3, 8 (0 temp: :k retenção dos produtos de hidrólise 1 a 3 é respectivurv.Mt* de 9, 17 e 24 minutos)

Após a reacção, ajusta-se o pH das misturas a 5,2, secam-se, torram-se e submetem-se à análise sensorial acima descrita. Os resultados mostram que os maus aromas específicos dos grãos de cacau insuficientemente fermentados desapareceram. Além disso, o aroma de cacau desenvolvido nas misturas tratadas aproxima-se do desejado. Em particular, as amostras do teste 5 (conteúdo em água reduzido) são particularmente preferidas.

Lisboa, 26 de Setembro de 2001

o AOCnTê OF.C1AL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

* *

/C* REIVINDICAÇÕES 1. Processo de tratamento de uma pasta ou de um licor de cacau, no qual se prepara a partir de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias uma pasta por trituração doc referidos grãos ou um licor, se mistura a pelo menos uma protease técnica num meio aquoso com pH 3-8 e se incuba a mistura durante um período de tempo e a uma temperatura suficiente para hidrolisar as proteínas e as peptidárias.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual se incuba a mistura durante um período de tempo e a uma temperatura suficiente para obter pelo menos 10 pMole de aminoácidos hidrófobos por g de matéria seca e pelo menos 1,4 vezes mais produtos de hidrólise em relação aos inicialmente presentes nos grãos de cacau fermentados.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual se prepara uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias, se mistura a um meio aquoso com pH 3-6, se incuba a mistura a 40-60°C durante 10 minutos a 20 h, se ajusta o pH da mistura a um pH 4- 8, se adiciona pelo menos uma protease técnica e se incuba a 10-60°C durante 5 minutos a 20 h.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual se prepara uma pasta ou um licor de grãos de cacau fermentados durante 1 a 15 dias, se mistura a um meio aquoso com pH 3-8, se adiciona pelo menos uma protease técnica e se incuba a 10-60°C durante 5 minutos a 20 h. 1 1 * Λ
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual a pasta ou o licor de cacau é preparado a partir de uma mistura de grãos em diversos estados de fermentação e/ou provenientes de diversos genotipos de cacaueiro.
C. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, no qual a mistura compreende 10-80% de uma pasta ou de um licor de grãos de cacau e 1-100 unidade(s) de protease técnica por g de mistura.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, no qual se adiciona além disso à mistura uma enzima técnica escolhida de um grupo formado por invertases, as glicosidases, celulases, pectinases e oxidases.
8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, no qual se adiciona também à mistura final antes da torrefacção pelo menos 0,1% em peso de um açúcar redutor. Lisboa, 26 de Setembro de 2001 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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