JPH09173056A - 免疫抑制物質を生産する微生物 - Google Patents
免疫抑制物質を生産する微生物Info
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- JPH09173056A JPH09173056A JP7338384A JP33838495A JPH09173056A JP H09173056 A JPH09173056 A JP H09173056A JP 7338384 A JP7338384 A JP 7338384A JP 33838495 A JP33838495 A JP 33838495A JP H09173056 A JPH09173056 A JP H09173056A
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- JP
- Japan
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- aeromonas
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を抑制する免疫抑制
物質を生産する能力を有する新規な微生物を提供する。 【解決手段】 魚類の腸内細菌より分離したエアロモナ
ス・カビエ(Aeromonas caviae)。 【効果】 新しいタイプの免疫抑制物質を生産する能力
を有するエアロモナス属細菌が提供された。
物質を生産する能力を有する新規な微生物を提供する。 【解決手段】 魚類の腸内細菌より分離したエアロモナ
ス・カビエ(Aeromonas caviae)。 【効果】 新しいタイプの免疫抑制物質を生産する能力
を有するエアロモナス属細菌が提供された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞
の誘導を抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する
新規なエアロモナス属細菌に関する。
の誘導を抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する
新規なエアロモナス属細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】既存の免疫抑制剤であるシクロスポリン
ＡやＦＫ５０６はその作用が強力であるが、まだ不満足
な点もある。かような段階にある現在、新たな作用機作
に基づく免疫抑制剤の開発をめざして、天然からの免疫
抑制作用を有する物質の単離は重要な課題となってい
る。
ＡやＦＫ５０６はその作用が強力であるが、まだ不満足
な点もある。かような段階にある現在、新たな作用機作
に基づく免疫抑制剤の開発をめざして、天然からの免疫
抑制作用を有する物質の単離は重要な課題となってい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫抑制物
質源として、従来ほとんど研究されていなかった海洋性
微生物から、高活性の新しいタイプの免疫抑制物質を生
産する能力を有する新規な微生物を提供せんとするもの
である。
質源として、従来ほとんど研究されていなかった海洋性
微生物から、高活性の新しいタイプの免疫抑制物質を生
産する能力を有する新規な微生物を提供せんとするもの
である。
【０００４】
【課題を解決しようとする手段】本発明者等は、海洋性
微生物を扱う際にしばしば遭遇する種々の困難を解決
し、免疫抑制物質を生産する海洋性微生物について探索
した結果、魚類の腸内細菌より分離したエアロモナス属
細菌が新しいタイプの免疫抑制物質を生産する能力を有
することを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、下記の菌学的性質を有する、エアロモナス(Aeromon
as)属に属する新種の細菌である、エアロモナス・カビ
エに関する。この新菌株は、Ｈ−２ハプロタイプの異な
る２種類のマウスリンパ球の混合培養によって誘導され
る細胞傷害性Ｔ細胞を抑制する免疫抑制物質を生産する
能力を有する。
微生物を扱う際にしばしば遭遇する種々の困難を解決
し、免疫抑制物質を生産する海洋性微生物について探索
した結果、魚類の腸内細菌より分離したエアロモナス属
細菌が新しいタイプの免疫抑制物質を生産する能力を有
することを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、下記の菌学的性質を有する、エアロモナス(Aeromon
as)属に属する新種の細菌である、エアロモナス・カビ
エに関する。この新菌株は、Ｈ−２ハプロタイプの異な
る２種類のマウスリンパ球の混合培養によって誘導され
る細胞傷害性Ｔ細胞を抑制する免疫抑制物質を生産する
能力を有する。
【０００５】本発明の微生物としては、エアロモナス(A
eromonas)属に属し、上記の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を
抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する微生物で
あれば何れであってもよく、このような微生物は自然界
から新たに分離することができ、例えば、本発明者等が
下記に詳述する方法により赤エイ由来の腸内細菌より新
たに分離、同定した、エアロモナス・カビエ(Aeromonas
caviae)ＳＣＲＣ４Ｘ２５を挙げることができる。この
新菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生
物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１５９２１として寄託
されている。
eromonas)属に属し、上記の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を
抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する微生物で
あれば何れであってもよく、このような微生物は自然界
から新たに分離することができ、例えば、本発明者等が
下記に詳述する方法により赤エイ由来の腸内細菌より新
たに分離、同定した、エアロモナス・カビエ(Aeromonas
caviae)ＳＣＲＣ４Ｘ２５を挙げることができる。この
新菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生
物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１５９２１として寄託
されている。
【０００６】この新菌株は、下記の菌学的性質を有す
る。
る。
【０００７】以上のような諸性質から、本菌株ＳＣＲＣ
４Ｘ２５は下記のような特徴を持つ。 1 グラム陰性 2 運動性を持つ 3 非胞子形成の通性嫌気性桿菌 4 Ｏ−Ｆテスト陰性 5 カタラーゼ、オキシターゼ陽性 6 一本の極鞭毛を持つ 7 ゼラチン、ＤＮＡ分解能を持つ 8 グルコースからのガス産生(−) 9 サリシンスからの酸産生(−) NaClまたは海水要求性 10 Ｇ＋Ｃ含量 . 11 硝酸塩還元能を持つ 12 オルチニン分解能（−）
４Ｘ２５は下記のような特徴を持つ。 1 グラム陰性 2 運動性を持つ 3 非胞子形成の通性嫌気性桿菌 4 Ｏ−Ｆテスト陰性 5 カタラーゼ、オキシターゼ陽性 6 一本の極鞭毛を持つ 7 ゼラチン、ＤＮＡ分解能を持つ 8 グルコースからのガス産生(−) 9 サリシンスからの酸産生(−) NaClまたは海水要求性 10 Ｇ＋Ｃ含量 . 11 硝酸塩還元能を持つ 12 オルチニン分解能（−）
【０００８】なお、本菌株の分類学的な位置は、バージ
イズ・マニュアル・オブ・ディタミナティブ・バクテリ
オロジー(Bergey's Manual of Determinative Bacterio
logy) 第８版、１９７４年、及びバージィズ・マニュア
ル・オブ・システマティク・バクテリオロジー(Bergey'
s Manual of SystematicBacteriology) 第１巻、１９８
４年の分類基準に従って、エアロモナス(Aeromonas)属
に属する新規微生物であると同定し、アロモナス・カビ
エ(Aeromonas caviae)ＳＣＲＣ４Ｘ２５と命名した。
イズ・マニュアル・オブ・ディタミナティブ・バクテリ
オロジー(Bergey's Manual of Determinative Bacterio
logy) 第８版、１９７４年、及びバージィズ・マニュア
ル・オブ・システマティク・バクテリオロジー(Bergey'
s Manual of SystematicBacteriology) 第１巻、１９８
４年の分類基準に従って、エアロモナス(Aeromonas)属
に属する新規微生物であると同定し、アロモナス・カビ
エ(Aeromonas caviae)ＳＣＲＣ４Ｘ２５と命名した。
【０００９】この菌株は、次のような組成の培地を用い
て得たものである。 ペプトン １０ｇ／Ｌ 酵母エキス ５ｇ／Ｌ グルコース ２０ｇ／Ｌ 寒 天 人工海水（１／２濃度）に溶解 すなわち、各地の海洋より採取した海洋性サンプルを適
宜、上記の寒天平板培地に接種し、２５℃で１〜２日間
培養した。この寒天平板培地に出現したコロニーを同じ
培地組成の斜面培地に釣菌した。このようにして多数の
菌株を分離し、上記の培地より寒天を抜いたものを試験
管に５ｍｌずつ分注し滅菌後、それぞれの菌株をこの培
地で２５℃、１〜２日間培養し、その培養上澄（培養物
を遠心分離後、上澄を滅菌フィルターを通して菌体を除
去した。）が細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を抑制する菌株と
して、赤エイ由来の腸内細菌より得た。なお、免疫抑制
の評価は、大森らの方法によって行った[Ohmori,H. et
al. J. Immunol. Methods 147,119(1992)]。
て得たものである。 ペプトン １０ｇ／Ｌ 酵母エキス ５ｇ／Ｌ グルコース ２０ｇ／Ｌ 寒 天 人工海水（１／２濃度）に溶解 すなわち、各地の海洋より採取した海洋性サンプルを適
宜、上記の寒天平板培地に接種し、２５℃で１〜２日間
培養した。この寒天平板培地に出現したコロニーを同じ
培地組成の斜面培地に釣菌した。このようにして多数の
菌株を分離し、上記の培地より寒天を抜いたものを試験
管に５ｍｌずつ分注し滅菌後、それぞれの菌株をこの培
地で２５℃、１〜２日間培養し、その培養上澄（培養物
を遠心分離後、上澄を滅菌フィルターを通して菌体を除
去した。）が細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を抑制する菌株と
して、赤エイ由来の腸内細菌より得た。なお、免疫抑制
の評価は、大森らの方法によって行った[Ohmori,H. et
al. J. Immunol. Methods 147,119(1992)]。
【００１０】本発明の菌株は、常法に従って保存するこ
とができ、例えば寒天スラント培地上で保存することが
できる。寒天スラント培地としては、エアロモナス(Aer
omonas)属細菌の保存に常用されている培地を使用する
ことができる。
とができ、例えば寒天スラント培地上で保存することが
できる。寒天スラント培地としては、エアロモナス(Aer
omonas)属細菌の保存に常用されている培地を使用する
ことができる。
【００１１】また、培養条件としては、基礎栄養培地と
して、本発明の微生物が増殖しうるものであればいずれ
を使用しても良いが、窒素源として、例えば酵母エキ
ス、ペプトン等の１種類または複数種類を含有する。ま
たこの培地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を
加えることができる。この培地には、塩化ナトリウム、
もしくは天然海水や人工海水を加えることが必要であ
る。
して、本発明の微生物が増殖しうるものであればいずれ
を使用しても良いが、窒素源として、例えば酵母エキ
ス、ペプトン等の１種類または複数種類を含有する。ま
たこの培地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を
加えることができる。この培地には、塩化ナトリウム、
もしくは天然海水や人工海水を加えることが必要であ
る。
【００１２】培養は固体培地または液体培地のいずれを
用いても良いが、目的とする物質を多量に得る為には、
液体培地を用い、静置培養等により嫌気条件下で培養を
行うことが好ましい。培養温度は菌が生育し、目的物質
が生産される温度範囲であればいずれの温度でも良く、
好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは２０〜
３０℃である。pHは４〜１１、好ましくは７〜８の範囲
である。培養期間は採取し得る量の目的物質が生産され
る時間を選べば良く、好ましくは１〜３日間である。
用いても良いが、目的とする物質を多量に得る為には、
液体培地を用い、静置培養等により嫌気条件下で培養を
行うことが好ましい。培養温度は菌が生育し、目的物質
が生産される温度範囲であればいずれの温度でも良く、
好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは２０〜
３０℃である。pHは４〜１１、好ましくは７〜８の範囲
である。培養期間は採取し得る量の目的物質が生産され
る時間を選べば良く、好ましくは１〜３日間である。
【００１３】以上、自然界から分離したこの新菌株につ
いて詳細に記載したが、この菌に変異を生じさせて一層
生産性の高い菌株を得ることも出来る。以下実施例、及
び試験例によりさらに詳しく説明するが、この方法にの
み限定されるものではない。
いて詳細に記載したが、この菌に変異を生じさせて一層
生産性の高い菌株を得ることも出来る。以下実施例、及
び試験例によりさらに詳しく説明するが、この方法にの
み限定されるものではない。
【００１４】
実施例１ ＳＣＲＣ４Ｘ２５の培養 ＰＹＧ１／２ＡＳＷ（ペプトン１.0％、酵母エキス０.5
％、グルコース２％を含む１／２濃度の人工海水、pH
７.0）にエアロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)ＳＣ
ＲＣ４Ｘ２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２１）の菌体を６
００ｎｍの波長で吸光度が０．０５（セル10mm）となる
よう懸濁し、２５℃で２日間静置培養した。こうして得
られた培養物を遠心分離することによって菌体を沈め、
その上澄を０.2μｍの滅菌フィルターを通して菌体を除
去し、被検試料としての培養上澄を得た。
％、グルコース２％を含む１／２濃度の人工海水、pH
７.0）にエアロモナス・カビエ(Aeromonas caviae)ＳＣ
ＲＣ４Ｘ２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２１）の菌体を６
００ｎｍの波長で吸光度が０．０５（セル10mm）となる
よう懸濁し、２５℃で２日間静置培養した。こうして得
られた培養物を遠心分離することによって菌体を沈め、
その上澄を０.2μｍの滅菌フィルターを通して菌体を除
去し、被検試料としての培養上澄を得た。
【００１５】免疫抑制試験 Ｈ−２ハプロタイプの異なる２種類のマウスリンパ球、
Ｃ３Ｈマウスの脾臓リンパ球(6x106個)とＢＡＬＢ
／ｃマウスの脾臓リンパ球(1.2x106個、あらかじめ25μ
g/mlのマイトマイシンCで３７℃、３０分間処理したも
の)を１．６ｍｌのＲＰＭＩ−１６．４０培地(10%ウシ
胎児血清含有)中で５日間混合培養した。この培養によ
りＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞を認識して破壊するＣ３Ｈ
マウス由来の細胞障害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)が誘導された
〔０％（ｖ／ｖ）〕。被検試料は、上記の培養系に、そ
れぞれ０．３１３％、０．６２５％、１．２５％、２．
５％、５％（ｖ／ｖ）となるよう添加して培養した。対
照として、無刺激はＢＡＬＢ／ｃの細胞を加えずに培養
したものを用いた。このリンパ球混合培養系にはＣＴＬ
（エフェクター細胞と呼びＥと略す。）が含まれてお
り、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ(β-gal)を導入した
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のエミローマ細胞株ＮＳ−１／
Ｚ（Ｔと略す。）を標的細胞として、１０4個のＮＳ−
１／ＺをＥ／Ｔ比８または１６となるようエフェクター
細胞と混合し、０．２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中
で３７℃、４時間保温した。標的細胞の破壊により上清
中へ遊離したβ−ｇａｌ活性を測定し、ＣＴＬによる細
胞傷害性を次の式により計算した。
Ｃ３Ｈマウスの脾臓リンパ球(6x106個)とＢＡＬＢ
／ｃマウスの脾臓リンパ球(1.2x106個、あらかじめ25μ
g/mlのマイトマイシンCで３７℃、３０分間処理したも
の)を１．６ｍｌのＲＰＭＩ−１６．４０培地(10%ウシ
胎児血清含有)中で５日間混合培養した。この培養によ
りＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞を認識して破壊するＣ３Ｈ
マウス由来の細胞障害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)が誘導された
〔０％（ｖ／ｖ）〕。被検試料は、上記の培養系に、そ
れぞれ０．３１３％、０．６２５％、１．２５％、２．
５％、５％（ｖ／ｖ）となるよう添加して培養した。対
照として、無刺激はＢＡＬＢ／ｃの細胞を加えずに培養
したものを用いた。このリンパ球混合培養系にはＣＴＬ
（エフェクター細胞と呼びＥと略す。）が含まれてお
り、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ(β-gal)を導入した
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のエミローマ細胞株ＮＳ−１／
Ｚ（Ｔと略す。）を標的細胞として、１０4個のＮＳ−
１／ＺをＥ／Ｔ比８または１６となるようエフェクター
細胞と混合し、０．２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中
で３７℃、４時間保温した。標的細胞の破壊により上清
中へ遊離したβ−ｇａｌ活性を測定し、ＣＴＬによる細
胞傷害性を次の式により計算した。
【００１６】 Ａ：遊離したβ-gal活性 Ｂ：自然遊離したβ-gal活性 エフェクター細胞の無い場合に見られる酵素遊離 Ｃ：全β-gal活性 使用したＴを0.0425%のTriton-X100で溶解し、含まれる
全酵素活性を測定する。
全酵素活性を測定する。
【００１７】その結果を図１に示す。エアロモナス(Aer
omonas sp.)の培養上清はＣＴＬを誘導する培養系にお
いて、２．５％または５％（ｖ／ｖ）となるように添加
すると、ＣＴＬ活性の誘導が用量依存的に抑制され、５
％添加した場合、ＣＴＬの誘導は無刺激対照と同程度に
まで抑制されることがわかった。これらの結果はこの培
養上清中に免疫抑制物質が含まれていることを示してい
る。また、PYG1/2ASW培地自体は全く抑制活性を示さな
いことを別の実験により確認しており、培養上清の添加
によりマウスリンパ球の生存率はほとんど影響を受けな
かったことから、非特異的細胞毒性は低いと考えられ
る。この有効成分は８０℃で１０分間の熱処理、トリプ
シン処理に対して安定であり、分子量は５，０００以上
と推定された。
omonas sp.)の培養上清はＣＴＬを誘導する培養系にお
いて、２．５％または５％（ｖ／ｖ）となるように添加
すると、ＣＴＬ活性の誘導が用量依存的に抑制され、５
％添加した場合、ＣＴＬの誘導は無刺激対照と同程度に
まで抑制されることがわかった。これらの結果はこの培
養上清中に免疫抑制物質が含まれていることを示してい
る。また、PYG1/2ASW培地自体は全く抑制活性を示さな
いことを別の実験により確認しており、培養上清の添加
によりマウスリンパ球の生存率はほとんど影響を受けな
かったことから、非特異的細胞毒性は低いと考えられ
る。この有効成分は８０℃で１０分間の熱処理、トリプ
シン処理に対して安定であり、分子量は５，０００以上
と推定された。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、細胞障害性Ｔ細胞の誘導
を抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する新規な
エアロモナス属細菌が提供された。
を抑制する免疫抑制物質を生産する能力を有する新規な
エアロモナス属細菌が提供された。
【図１】図１は本発明の実施例１で得られた培養上澄の
免疫抑制試験を示す。
免疫抑制試験を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 来島 正幸 岡山県岡山市津島中三丁目１番１号 岡山 大学工学部内 (72)発明者 疋田 正喜 岡山県岡山市津島中三丁目１番１号 岡山 大学工学部内
Claims (2)
- 【請求項１】 細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を抑制する免疫
抑制物質を生産する下記の菌学的性質を有するエアロモ
ナス・カビエ。 - 【請求項２】 エアロモナス・カビエ(Aeromonas cavia
e)ＳＣＲＣ４Ｘ２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２１）であ
る請求項１に記載のエアロモナス・カビエ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7338384A JPH09173056A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 免疫抑制物質を生産する微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7338384A JPH09173056A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 免疫抑制物質を生産する微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173056A true JPH09173056A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=18317654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7338384A Pending JPH09173056A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 免疫抑制物質を生産する微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09173056A (ja) |
-
1995
- 1995-12-26 JP JP7338384A patent/JPH09173056A/ja active Pending
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