JPH09176012A

JPH09176012A - Ｈｓｐ２７ファミリーに属するタンパク質のトコフェロール含有合成抑制剤

Info

Publication number: JPH09176012A
Application number: JP35201895A
Authority: JP
Inventors: Masayoshi Morino; 眞嘉森野; Tomoko Tsuzuki; 智子都築; Hiroko Iijima; 弘子飯島; Toshimi Shiragami; 俊美白神; Yoichi Shobu; 洋一清輔; Makoto Yoshimura; 真吉村; Chikao Yoshikumi; 親雄吉汲; Nagahiro Saijo; 長宏西條
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 1997-07-08

Abstract

(57)【要約】【課題】分子量１６キロダルトンから４０キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ２７ファミ
リー）がその悪性化や温熱療法の効果の減少に関連する
癌、又はＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質がそ
の発症に関連する多発性硬化症などの自己免疫疾患の患
者の生理学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的
に治療することができる、ＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質の合成抑制剤を提供する。【解決手段】トコフェロール又はその誘導体を有効成
分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トコフェロール又
はその誘導体、特にα−トコフェロール（すなわち、ビ
タミンＥ）を有効成分として含有する、分子量１６キロ
ダルトン（ｋＤ）から４０ｋＤまでの間の熱ショックタ
ンパク質群（以下、ＨＳＰ２７ファミリーと称する）に
属するタンパク質の合成抑制剤に関する。本発明による
ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤
は、特に、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の
組織内合成を抑制することによって、ＨＳＰ２７ファミ
リーに属するタンパク質が発症、悪性化、又は治療の障
害に関与するものと考えられている病気、例えば、癌、
又は多発性硬化症などの患者の生理学的状態を有効に改
善させ、前記の病気を効果的に治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年の化学療法、外科療法、放射線療
法、及び免疫療法などの進歩にもかかわらず、依然とし
て癌による死亡原因に癌の悪性化が直接的又は間接的に
関わっており、癌の悪性化の克服が今後の癌治療の大き
な課題の一つとなっている。癌の悪性度は、癌の増殖
性、浸潤性、又は転移性などによって定められる。悪性
化の現象の一つである転移は原発癌の種類により、転移
を起こしやすい臓器が異なる。癌の転移は複合事象であ
り、原発腫瘍の増殖、癌細胞の原発巣からの離脱と周辺
組織への浸潤・増殖から始まって、腫瘍血管新生、癌細
胞の最寄りの血管内への侵入、血流による遠隔部位への
移動と血管内皮細胞への接着・着床、更に、血管外への
浸潤、遠隔部位（転移組織）での増殖の開始に続いて新
たな腫瘍血管が新生され、やがて可視的な転移巣の形成
に至るまでの複雑な反応カスケードから成り立ってい
る。一般に、癌は、高い悪性度を有するものと、比較的
に悪性度の低いものとに分けられる。しかし、悪性度の
高い癌に対しては根本的な治療法は確立しておらず、患
者は遂には死に至ることが極めて多い。

【０００３】また、癌の温熱療法（ハイパーサーミア；
hyperthermia）とは、癌組織を加温することにより、腫
瘍細胞を選択的に殺し、癌を治療しようとする方法であ
り、近年注目を浴びている。温熱療法による癌治療は、
温熱の生物学的効果をみると、４１〜４５℃の比較的温
和な加温で細胞致死効果が得られること、また放射線や
抗癌剤などと併用することにより相乗的な効果が得られ
ることなど、有利な点が多い。温熱療法による癌の治療
法は、臨床においてはほとんどすべての各科で試みられ
ている。しかし、温熱療法の問題点の一つは、加温後一
過性に誘導される温熱耐性である。すなわち、癌細胞が
１回目の加温により一時的に温熱耐性になるために、次
の加温による殺細胞効果が減少する。温熱耐性とは、細
胞（又は組織）を一度亜致死的な加温をすることによ
り、次の加温に対してその細胞（又は組織）が一過性に
温熱抵抗性になることである。温熱耐性のため、現在ほ
とんどの施設において温熱療法を行うのは週１〜２回に
限定されているのが現状である。

【０００４】また、癌の化学療法においても、化学療法
に殆ど反応しない肺癌や大腸癌などの固型癌が依然とし
て存在する一方で、化学療法剤に反応する癌でも、やが
て抗癌剤が効かなくなる耐性化が問題となっている。１
９８８年のアメリカの統計によれば、１年間に診断され
た癌の４９％が化学療法に最初から抵抗性を示す内因性
耐性であり、４７％が当初化学療法が有効で、腫瘍がい
ったん消退した後に再発した獲得性耐性とされている。
これらの事実から、癌に対する化学療法の効果を妨げる
最も重要な問題の一つは細胞毒性薬剤に対する耐性であ
ることがわかる。

【０００５】また、多発性硬化症（multiple sclerosi
s，ＭＳ）は中枢神経白質を特異的に障害する炎症性脱
髄性疾患であり、その発症機序に、神経線維を包んでい
るミエリン鞘を免疫系が攻撃することが示されている自
己免疫疾患である。多発性硬化症は多くの場合、初期に
は急性憎悪・寛解を繰り返すが、その後徐々に進行性の
経過をとるようになる。急性期の症状改善を目的とした
ものとして、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）や副腎
皮質ステロイド剤が、また寛解期での再発予防や慢性進
行型の症状進展防止を目的として、アザチオプリンやサ
イクロフォスファミドなどの免疫抑制剤が用いられてき
た。しかし、現在、多発性硬化症患者に投与されている
薬剤の多くは、その効果が期待されていたほどでなく、
非特異的な療法で副作用も多くみられるなど、十分とは
いい難いのが現状である。多発性硬化症のより特異的な
治療法の開発が期待されている。

【０００６】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば熱、重金属、薬剤、ア
ミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激す
ることにより、細胞に発現される一群のタンパク質であ
る。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在し
ており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等
動物により産生される。

【０００７】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
２７ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ２７』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００８】ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
の発現は、ヒト乳癌において、リンパ節転移、リンパや
血管への浸潤、より短い生存率との間に顕著な相関があ
る（"J. Natl. Cancer Inst." 83: 170-178, 1991)。胃
癌においてもＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
はネガティブな予後因子であるとの報告がある（"Br.J.
Surg.", 78: 334-336, 1991)。ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質の原発癌細胞における発現レベルが
癌悪性度、特に癌の再発率と正の相関があるという報告
もあるので（"Breast Cancer Res. Treat.", 12: 130,
1988; "Proc.Am. Assoc. Cancer Res.", 30: 252, 19
89)、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現
を抑制することにより、癌の悪性化を防止することが可
能である。

【０００９】癌の温熱療法で問題となる温熱耐性にＨＳ
Ｐ２７ファミリーに属するタンパク質が関与するという
報告がある。ヒトＨＳＰ２７遺伝子をマウス又はハムス
ター細胞に導入して発現させたところ、熱ショック後に
生き残る温熱耐性の細胞がＨＳＰ２７のタンパク質の量
に依存して誘導され増加する（"J. Cell. Biol.", 109
: 7-15, 1989）。また、チャイニーズハムスター細胞
で、ＨＳＰ２７を定常的に発現するようになった変異株
が熱耐性を獲得できるようになる（"J. Cell. Physio
l.", 137 : 157, 1988)。α−Ｂクリスタリンは、熱シ
ョック処理で誘導され、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相
同性が高いタンパク質であり、ＨＳＰ２７ファミリーに
属するタンパク質の一つであるが、α−Ｂクリスタリン
を過剰発現させた細胞も熱ストレスに対する耐性を獲得
する（"J. Cell. Biol.", 125 : 1385-1393, 1994)。こ
のことは、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の
発現を抑制することにより、温熱耐性を抑え、癌に対す
る温熱療法の効果を増強する可能性を示している。ま
た、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現と
薬剤耐性とが相関するとの報告もあるので（"Breast Ca
ncer Res. Treat.", 23:178, 1992; "Cancer Res.", 5
1: 5245-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質の発現を抑制することにより、薬剤耐性を抑
え、化学療法の効果を増強することも可能である。

【００１０】多発性硬化症における免疫的に優性な抗原
が、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質であるα
−Ｂクリスタリンであることが突き止められている（"N
ature", 375 : 739-740, 1995)。α−Ｂクリスタリン
は、多発性硬化症患者の神経組織中での発現が、非発病
者の組織中での発現よりも強く、非常に免疫原性が高い
（"Nature", 375 : 798-801, 1995)。これらの事実は、
多発性硬化症で自己抗原となっているのは、ＨＳＰ２７
ファミリーに属するタンパク質の１種であるα−Ｂクリ
スタリンであり、ミエリン鞘におけるα−Ｂクリスタリ
ンの発現を抑制することが多発性硬化症の根本的治療に
結び付くことを示している。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、癌や多発性硬化症などの病気の患者の生理学
的状態を有効に改善させ、前記の病気を効果的に治療す
ることのできる方法を開発するために、ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質に対して合成抑制作用を示す
化合物に関して、種々検討を重ねてきた。その結果、本
発明者らは、意外にも、トコフェロール又はその誘導
体、特にα−トコフェロール（すなわち、ビタミンＥ）
が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳＰ２７ファミリ
ーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制することを
見出した。すなわち、トコフェロール又はその誘導体を
投与することにより、細胞内でのＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質の合成が抑制され、従って、癌や多
発性硬化症などの病気の治療が可能であることを見出し
たのである。本発明はこうした知見に基づくものであ
り、癌や多発性硬化症などの病気を効果的に治療するこ
とのできる、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
の合成抑制剤を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、トコ
フェロール又はその誘導体、特にα−トコフェロール
（すなわち、ビタミンＥ）を有効成分として含有するこ
とを特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０キロ
ダルトンまでの間の熱ショックタンパク質（すなわち、
ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質）の合成抑制
剤に関する。本明細書において、「ＨＳＰ２７ファミリ
ー」とは、前記のとおり、分子量が１６ｋＤ〜４０ｋＤ
の熱ショックタンパク質群を意味する。ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質としては、例えば、哺乳動物
のＨＳＰ２７（すなわち、分子量２７ｋＤの熱ショック
タンパク質）〔若しくはＨＳＰ２８（すなわち、分子量
２８ｋＤの熱ショックタンパク質）〕、トリのＨＳＰ２
５（すなわち、分子量２５ｋＤの熱ショックタンパク
質）、又は酵母のＨＳＰ２６（すなわち、分子量２６ｋ
Ｄの熱ショックタンパク質）などを挙げることができ
る。なお、一般的に、タンパク質の分子量は、例えば、
分子量測定方法又は実験条件などの違いにより多少の差
が生じるので、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の中には、例えば、哺乳動物におけるＨＳＰ２７とＨ
ＳＰ２８とのように、分子量表記が異なっていても、そ
れらがアミノ酸配列の異なる別異のタンパク質であるの
か、あるいは単に分子量表記のみが外見上異なる同一の
タンパク質であるのかが、現在のところ明らかではない
ものも含まれている。ＨＳＰ２７ファミリーに属するタ
ンパク質は、前記の低分子ＨＳＰファミリーに属する熱
ショックタンパク質のうち哺乳動物において最も主要な
熱ショックタンパク質であり、生物種を超えてよく保存
された特徴を示す。しかし、ＨＳＰ２７ファミリーに属
するタンパク質は、他の熱ショックタンパク質とは異な
り、種ごとに異なる分子量を有しており、分子量１６ｋ
Ｄ〜４０ｋＤと、非常に多様なタンパク質である。ま
た、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相同性の高いα−Ｂク
リスタリンも熱ショック処理で誘導され、ＨＳＰ２７フ
ァミリーに属するタンパク質の一つである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分としてトコフェ
ロール又はその誘導体を含有する。本明細書においてト
コフェロールとは、例えば、α−トコフェロール、β−
トコフェロール、γ−トコフェロール、又はδ−トコフ
ェロールなどを意味し、本発明においては、それらのト
コフェロール同族体を単独で、又はこれらの混合物を用
いることができる。トコフェロールとしては、特にα−
トコフェロール〔３，４−ジヒドロ−２，５，７，８−
テトラメチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデ
シル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−オール〕、すな
わちビタミンＥが最も好適である。

【００１４】トコフェロール誘導体としては、例えば、
天然物中に本来含有されているトコフェロール誘導体、
抽出又は分画の際の化学的処理によって変換したトコフ
ェロール誘導体、及び化学的修飾を行ったトコフェロー
ル誘導体等を挙げることができる。天然物中に本来含有
されているトコフェロール誘導体としては、例えば、ト
コトリエノール誘導体、すなわちα−トコトリエノー
ル、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、又
はδ−トコトリエノール等を挙げることができる。抽出
若しくは分画の際の化学的処理によって変換したトコフ
ェロール誘導体、又は化学的修飾を行ったトコフェロー
ル誘導体としては、例えば、トコフェロールエステル誘
導体又はトコトリエノールエステル誘導体等を挙げるこ
とができる。

【００１５】トコフェロールエステル誘導体の具体例と
しては、例えば、直鎖状若しくは分枝状のアルキルモノ
カルボン酸若しくはジカルボン酸（好ましくは炭素数１
〜３０の直鎖状若しくは分枝状のアルキルモノカルボン
酸若しくはジカルボン酸）、直鎖状若しくは分枝状のア
ルケニルモノカルボン酸若しくはジカルボン酸（好まし
くは炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分枝状のアルケニ
ルモノカルボン酸若しくはジカルボン酸）、アリール部
分の炭素数が６〜３０のアリールモノカルボン酸若しく
はジカルボン酸（例えば、安息香酸）、又は窒素原子１
若しくは２個を含む５員若しくは６員の複素環式モノカ
ルボン酸若しくはジカルボン酸（例えば、ニコチン酸）
と、トコフェロールとのエステル化合物、例えば、酢酸
トコフェロール、コハク酸トコフェロール、又はニコチ
ン酸トコフェロール等が挙げられる。なお、前記のトコ
フェロール又はその誘導体には、立体異性体が存在し、
本発明では、それらの任意の純粋な立体異性体又はそれ
らの混合物を用いることができる。本発明の合成抑制剤
に含有されるトコフェロール又はその誘導体は、化学合
成によって、又は天然物から抽出して精製することによ
って、調製することができる。あるいは、市販品を用い
てもよい。

【００１６】本発明の合成抑制剤は、トコフェロール又
はその誘導体を、それ単独で、又は好ましくは製剤学的
若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と
共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与
することができる。投与剤型としては、特に限定がな
く、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル
剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、
若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏
剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの
非経口剤を挙げることができる。これらの経口剤は、例
えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーン
スターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボ
キシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロ
リドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪
酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリ
エチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ
酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合
剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈
剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿
剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って
製造することができる。

【００１７】例えば、軟カプセル剤を製造する場合に
は、植物油又は合成油等にビタミンＥを、必要に応じて
加温しながら溶解し、常法に従って製造したゼラチン、
グリセリン、及び／又は防バイ剤等を混合・溶融した皮
膜用組成物を用いて、軟カプセル充填機により軟カプセ
ル剤を製造することができる。また、硬カプセル剤を製
造する場合には、例えば、ビタミンＥを加温し、軟質無
水ケイ酸等の賦形剤に吸着し、必要であれば更に結晶セ
ルロース及び／又はコーンスターチ等を加えて、混合・
造粒の後に、篩過したものを、カプセル充填機を使用し
て、硬カプセルに充填することによって製造することが
できる。また、内服液剤を製造する場合には、例えば、
ポリエチレン硬化ヒマシ油等の合成界面活性剤、又はレ
シチン等の天然界面活性剤等を用いて、常法により乳化
又は可溶化することによって製造することができる。

【００１８】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのトコフェロール又は
その誘導体の他に、例えば生理食塩水、リンゲル液等の
水溶性溶剤、植物油、若しくは脂肪酸エステル等の非水
溶性溶剤、ブドウ糖、若しくは塩化ナトリウム等の等張
化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は
乳化剤等を任意に用いることができる。また、本発明の
合成抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤
の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の合成
抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り
込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に
移植することができる。本発明の合成抑制剤は、これに
限定されるものではないが、トコフェロール又はその誘
導体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８
０重量％の量で含有することができる。

【００１９】本発明の合成抑制剤を用いる場合の投与量
は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程
度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はない
が、α−トコフェロール量として通常成人１人当り１ｍ
ｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけて、経口的
に又は非経口的に投与する。更に、用途も医薬品に限定
されるものではなく、種々の用途、例えば、機能性食品
や健康食品として飲食物の形で与えることも可能であ
る。

【００２０】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるトコフェロール又はその誘導体、特にα−トコフェ
ロール（すなわちビタミンＥ）は、細胞内のＨＳＰ２７
ファミリーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制す
る作用があるので、前記トコフェロール又はその誘導体
を投与すると細胞でのＨＳＰ２７ファミリーに属するタ
ンパク質の生合成が特異的に減少する。従って、前記ト
コフェロール又はその誘導体は、例えば、ＨＳＰ２７フ
ァミリーに属するタンパク質がその悪性化に関連する癌
の予防及び治療、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパ
ク質がその療法への障害となる温熱耐性に関連する癌温
熱療法の効果の増強、又はＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質がその発症に関連する多発性硬化症などの
自己免疫疾患の予防及び治療などに使用することができ
る。また、前記のように、ＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質の発現と薬剤耐性とが相関することが指摘
されているので、本発明のＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質の合成抑制剤を投与することにより、薬剤
耐性を抑え、化学療法の効果を増強することも可能であ
る。

【００２１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定（１）ヒト培養癌細胞の培養以下の各種ヒト培養癌細胞を、５％二酸化炭素条件下
で、熱ショック処理時以外は、３７℃で培養した。子宮
癌細胞株ＨｅＬａＳ３（ＡＴＣＣＣＣＬ２．２）
は、１０％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称す
る）を含むＭＥＭ培地にて培養した。神経腫瘍細胞株
（神経芽細胞腫）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ
１０）は、非必須アミノ酸（Ｌ−アラニン８．９ｍｇ／
ｌ、Ｌ−アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．０ｍｇ／ｌ、Ｌ−
アスパラギン酸１３．３ｍｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン酸１
４．７ｍｇ／ｌ、グリシン７．５ｍｇ／ｌ、Ｌ−プロリ
ン１１．５ｍｇ／ｌ及びＬ−セリン１０．５ｍｇ／ｌ）
並びに１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養し
た。

【００２２】（２）α−トコフェロール処理及び熱ショ
ック処理播種２日後の前記各種培養ヒト癌細胞の培地中に、最終
濃度２０μＭになるようにＤ−α−トコフェロール（フ
ナコシ、カタログ番号ICN 81-1521-47）を添加し、２４
時間培養した。その後、４５℃にて１５分間熱ショック
処理をしてから、３７℃にて終夜培養した。対照試験
は、α−トコフェロールを添加しないこと以外は前記と
同様に実施した。

【００２３】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００２４】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N .K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００２５】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ２７マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
00）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
２７マウスモノクローナル抗体は、ヒト乳癌細胞株ＭＣ
Ｆ７（ＡＴＣＣＨＴＢ２２）より単離したＨＳＰ２
４を免疫原として作製した抗体であり（"Cancer Res.",
42, 4256-4258, 1982 ）、ＨＳＰ２７（ヒトＨＳＰ２
７、チンパンジーＨＳＰ２７、及びヒツジＨＳＰ２７）
と特異的に反応し（"Cancer Res.", 42, 4256-4258, 1
982 ； "CancerRes.", 43, 4297-4301, 1983)、ＨＳＰ
２４及びＨＳＰ２８とも特異的に反応する。１次抗体反
応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２
回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ず
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。

【００２６】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ２
７の有無の検討を行った。

【００２７】対照試験、すなわち、α−トコフェロール
を添加しなかった細胞では、子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ
３及び神経腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣにおいて、分子量
約２７ｋＤのバンドが一本検出された。なお、分子量
は、前記抗ヒトＨＳＰ２７マウスモノクローナル抗体と
の結合、及び分子量マーカー（ダイズトリプシンインヒ
ビター及びウシカーボニックアンヒドラーゼ）により決
定した。α−トコフェロールを添加した細胞では、子宮
癌細胞株ＨｅＬａＳ３及び神経腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−
ＭＣにおいて、ＨＳＰ２７の発現が抑制された。すなわ
ち、α−トコフェロールは、ＨＳＰ２７の発現を抑制す
る合成抑制剤の活性を有するものと結論することができ
る。

【００２８】

【発明の効果】以上詳述したように、トコフェロール又
はその誘導体、特にα−トコフェロール（すなわち、ビ
タミンＥ）は、細胞内のＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有す
る。従って、トコフェロール又はその誘導体、特にα−
トコフェロール（すなわち、ビタミンＥ）を投与するこ
とにより、例えば、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタン
パク質がその悪性化や温熱療法の効果の減少に関連する
癌、又はＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質がそ
の発症に関連する多発性硬化症などの自己免疫疾患の患
者の生理学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的
に治療することができる。また、ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質の発現と薬剤耐性とが相関するとの
報告もあるので（"Breast Cancer Res. Treat.", 23:
178, 1992; "Cancer Res.", 51: 5245-5252, 1991)、Ｈ
ＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現を抑制す
ることにより、薬剤耐性を抑え、化学療法の効果を増強
することも可能である。

フロントページの続き (72)発明者清輔洋一東京都新宿区百人町３−26−１−303 (72)発明者吉村真神奈川県川崎市麻生区下麻生1154−91 (72)発明者吉汲親雄東京都国立市東２−19−46 (72)発明者西條長宏東京都目黒区東が丘２−５−28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トコフェロール又はその誘導体を有効成
分として含有することを特徴とする、分子量１６キロダ
ルトンから４０キロダルトンまでの間の熱ショックタン
パク質の合成抑制剤。
【請求項２】トコフェロールがα−トコフェロールで
ある、請求項１に記載の分子量１６キロダルトンから４
０キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成
抑制剤。