JPH09183791A - Ｄｎａ断片 - Google Patents

Ｄｎａ断片

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JPH09183791A
JPH09183791A JP8162018A JP16201896A JPH09183791A JP H09183791 A JPH09183791 A JP H09183791A JP 8162018 A JP8162018 A JP 8162018A JP 16201896 A JP16201896 A JP 16201896A JP H09183791 A JPH09183791 A JP H09183791A
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pili
adhesin
polypeptide
gene
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Frederick Carl Peter Lindberg
カール ピーター リンドベルク、フレデリック
Bjorn O Lund
オロフ ルンド，ビョルン
Britt M Baga
モニカ バガ，ブリット
Mari E Norgren
エリザベート ノルグレン，マリ
Mikael Goransson
ゲランソン，ミカエル
Bernt Eric Anund Uhlin
エリック アヌンド ウーリン，バーント
Jan S Normark
スタファン ノルマーク，ジャン
David L Lark
リー ラーク，ダビッド
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Symbicom AB
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ＤＮＡ断片に関し、より詳細には、例えば哺
乳類の免疫感作に有用な抗原、その抗原に対して生成さ
れる抗体に有用なＤＮＡ断片を提供する。 【解決手段】 哺乳動物組織に接着することができる病
原性線毛形成細菌の線毛のマイナー成分であり、これが
ないと細菌の接着が起こらず、線毛構造の主要なサブユ
ニットとは異なり、アドヒシンポリペプチドと反応する
抗体を誘発するアドヒシンポリペプチドの抗原決定基を
エンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明はＤＮＡ断片に関
し、より詳細には、例えば哺乳類の免疫感作に有用な抗
原、その抗原に対して生成される抗体に有用なＤＮＡ断
片に関する。
【０００２】
【従来の技術】病原性細菌菌株もしくは種において、明
確な表現型(phenotype)を形成するいくつかの蛋白で構
成され、それ故に多数の免疫原性を有する抗原決定基を
有すると当然考えられる抗原類は広く知られている。し
かし、かような抗原類及びそれらから製造されるワクチ
ン類はいくつもの不利な点がある。特にそれらは、免疫
感作を行う際に、抗体が、抗原が得られたひとつの特定
細菌菌株を証明するこれらの免疫原性抗原決定基(immun
ogenic determinant)に対して形成されるが、同一種の
他の細菌菌株に対しては形成されず、その結果免疫感作
がこの特定菌株に対してだけ行われ他の同一の種の極め
て関連の深い菌株に対しては行われないという点で著し
く選択性であるという傾向がある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】この発明は、所望の免疫
をもたらす免疫原性抗原決定基だけを実質的に有し、さ
らに問題の病原性細菌の一つの特定菌株に限定されない
抗原を提供することによって、これらの不利な点を克服
するのを目的とするものである。多くの病原性細菌の、
細胞表面に接合する能力は多くの伝染病の発病に極めて
重要であるということがますます明らかになってきた
〔ビーチエイ(Beachey)，ジャーナル オブ イン フ
エクシャス デイジージス(J.Infect. Dis.)，第１４３
巻，１９８１年，第３２５〜３４５頁〕。この接合能力
(adhesion capacity)は上皮細胞のごとき哺乳類の組織
細胞もしくは哺乳類の赤血球上に存在する受容体によっ
てもたらされるもので、その受容体はその配置構造(con
figuration)にしたがってアドヒシン ポリペプチド類
と結合する。〔この明細書において、“アドヒシン ポ
リペプチド(adhesin polypeptide)”という用語は、接
合の表現型を特に必要とするペプチド及びより一般的に
いえばそれが存在しなければ接合が（いかなる理由があ
ろうとも）起こらないポリペプチドの両者を示すための
ものである。〕各受容体は異なるアドヒシン構造体と結
合すると考えられる。この受容体は、糖または、より一
般的にはノイラミン酸−（２→３）−ガラクトース、マ
ンノース−α（１→２）−マンノースもしくはジガラク
トシド〔この明細書において時々グロボシドと呼称され
るグリコリピド類のグロボシリーズ(globoseries)中に
存在するα−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−４）−β−Ｄ−Ｇａ
ｌｐ基〕に存在するアミノ酸のようなペプチド受容体で
あってもよい。
【０００４】多くの病原性細菌において、適切なアドヒ
シン ポリペプチドは、いずれにしてもすべてが接合機
能に関連するポリペプチド類（例えば細胞壁を通じてア
ドヒシンの運搬を仲介するかもしくはアドヒシンを細胞
壁の外表面などに固着させるポリペプチド類）の大きな
塩基配列(sequence)の一部だけを形成すると信じられ、
そしてこの発明の目的に従って、特定のアドヒシン ポ
リペプチドはその塩基配列の他のポリペプチド類中に見
出され抗原として使用される。これは選択性のり小さな
同定マーカーを構成すると考えられ、その結果、抗体は
抗原が得られる菌株に対して生成するのみならず、同じ
細菌種の他の病原性菌株に対しても生成される。
【０００５】従ってこの発明は、その免疫感作を行う主
要構成要素として、アドヒシン ポリペプチドもしくは
その免疫原性的に活性な部分配列(subsequence)もしく
は免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗
原決定基からなり、その抗原決定基に対する抗体が、哺
乳類組織と接合する病原性アドヒシン形成細菌によって
産生されたアドヒシン ポリペプチドと反応するもので
ある抗原に関する。この抗原は、アドヒシン ポリペプ
チドの少なくとも五つのアミノ酸から全アミノ酸までの
アミノ酸塩基配列を有していてもよい。
【０００６】アドヒシン ポリペプチドはアドヒシン形
成細菌より簡単に得ることができる。この群の細菌には
グラム陽性菌とグラム陰性菌の両者が含まれ、そしてこ
の明細書において最も興味深い細菌種は、１以上の特定
のアドヒシン ポリペプチド類が有利にえられる細菌種
であり、すなわち泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株
である、エシエリヒア・コリ(Escherichia Coli) もし
くは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノ
ルホエ(Neisseria gonorhoeae)，ネイセリア・メニンギ
デイティス(Neisseria meningiditis)，ネイセリア・キ
ャタルハリス(Neisseria catarrhalis)，イエルシニア
・エスピーピー(Yersinia spp.)，スードモナス・エル
ギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)もしくは他のスード
モナス・エスピーピー(Pseudomonas spp.)，モラキセラ
・ボビス(Moraxella bovis)もしくは他のモラキセラ・
エスピーピー(Moraxella bovis)，バクテロイデス・ノ
ドスス(Bacteroides nodosus)，スタフィロコッカス・
エスピーピー(Staphylococcusspp.)，ストレプトコッカ
ス・エスピーピー(Streptococcus spp.)またはボルデテ
ラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)のごときボルデ
テラ・エスピーピー(Bordetella spp.)である。
【０００７】一方アドヒシン ポリペプチドは下記のよ
うにして合成的に製造することができる。この群のいく
つかの病原性細菌については、細胞壁から突出する線毛
[pili(fimbriae)]と呼称される繊維状構造物があるいみ
で接合と関連しており、それ故にまた線毛は容易に精製
できるので、全線毛製剤(whole pili preparations)が
ワクチン中の抗原として使用されてきた。例えばゴノコ
ッカス線毛抗原(gonococcus pili antigen)（米国陸軍
で実地テストされた）がある。
【０００８】線毛製剤を研究してる従来の研究者達は、
蛋白の特性づけと免疫感作のために“純粋な”線毛蛋白
を作製しようと永年研究してきた。そして彼等の努力は
彼等の製剤がＳＤＳゲル中に一つのバンドを示すだけで
あるという点で成功したことは明である〔米国特許第
４，４４３，４３１号（ブキャナン・テイ・エムら〈Bu
chanan T.M. et al〉）；サリート・アイ・イー及びイ
ー・シー・ゴッドリッシュ(Saliet I.E. and E.C. Gott
lisch)，ジャーナル オブ エクスペリメンタルメディ
スン(J.Exp.Med.)第１４６巻，１９７７年，第１１６９
頁；クレム・ピイ、アイ・オルスコフおよびエフ・オル
スコフ(Klemm P., I Orskov and F. Orsdov)，インフエ
クション アンド イミュニティ(Infection and Immun
ity)第３６巻，１９８２年，第４６２頁；スクールニッ
ク・ジイ・ケイら(Schoolnik G.K.et al)，ジャーナル
オブ エクスペリメンタル メディスン(J. Exp. Me
d.)，第１５９巻，１９８４年，第１３５１頁；スバン
ボルグ・イー・シー(Svanborg E.C.)，プログ・アレル
ギィ(Prog・Allergy)，第３３巻，１９８３年，第１８
９頁〕。得られた線毛蛋白製剤は少なくとも三つの機能
を示した。第一の機能は、おそらく疎水性結合プロセス
を通じてポリマーを形成する能力であり、すなわちモノ
マーのサブユニットから線毛フィラメントを形成するた
めに必須の性質である。第二の性質は抗体を発生させる
能力であり、すなわちその蛋白をワクチンとして用いよ
うとする場合に必須の性質である。第三の性質は細胞表
面の受容体に接合する能力である。研究者らは、線毛自
体の中はもとより、彼等の線毛蛋白製剤中にひとつの蛋
白しか同定できなかったので線毛は同一のモノマーの蛋
白サブユニットの高分子状集合体であり、そして各サブ
ユニットは三つの上記機能のすべてを有すると結論した
〔米国特許第４，４４３，４３１号（ブキャナン・テイ
・エムら〈Buchanan T.M. et al〉）；ロスバード・ジ
ェイ・ビィ(Rothbard J.B.)，ＰＮＡＳ 第８２巻 １
９８５年 第９１５頁〕。
【０００９】しかし前記のように、単一の種から得た完
全な全線毛は大きな抗原の多様性を有する。加うるにワ
クチンとして用いると、単一抗原型の完全な全線毛は、
シエアーされた(shared)線毛抗原よりもむしろ単一抗原
型に対して主として抗体を産生する。従来の研究者ら
は、精製された線毛サブユニットを化学的に切断して指
名された機能：重合機能，共通する抗原機能及び結合機
能を有するフラグメントとした。それぞれ個々の機能は
精製された線毛のサブユニットの別個のフラグメントで
同定された。かくして精製された線毛蛋白製剤は単一の
蛋白−ピリンモノマー(pilin monomer)を含有すると考
えられてきた。このピリンモノマーは化学的に分解され
たが結合機能と主要な抗原性−高分化された純粋な線毛
蛋白と同一物−を含有すると考えられてきた。
【００１０】しかし、本願出願人らによって行われた広
範な研究は、仮定上の純粋の線毛蛋白が実際に、別個の
機能を有するいくつかの蛋白フラクションで構成されて
いることを示している。事実、線毛フィラメントは細胞
表面での接合の原因ではなくて、該フィラメントにおそ
らく結合している汚染物とみなされる少量成分が、細胞
表面での接合の原因物質である。この独特の所見は線毛
の構造形成およびそのジガラクトシド受容体への接合性
が遺伝子的に除去されうるという事実だけを根拠にして
いるものである。認識しうる程度の線毛構造を残してい
るが接合できない他の突然変異微生物はさらにこの所見
を確認している。この所見は、さらに、以前純粋である
と考えられていた線毛蛋白が少なくとも二つのフラクシ
ョン、すなわち線毛の実際の形成時に含有されている構
成要素の一つの及びその接合性の原因のフラクションで
あるもう一つのフラクションを含有しているにちがいな
いということを意味する。両フラクションが抗原性を有
するという事実は、接合性の原因であるフラクションだ
けに対して抗体を生成する可能性を開いたのである。
【００１１】線毛運搬細菌の場合も、もし存在するのな
らば小さな菌株選択性を示す抗原を産生するのが有利で
ある。そしてかような抗原は、全線毛の構造の一部を形
成し、特にその接合能力を仲介する１以上の要素を確認
し産生することによって得られる。この明細書におい
て、かような成分は線毛アドヒシン ポリペプチド(pil
us adhesin polypeptide)と呼称される。上記事項によ
れば、線毛アドヒシンポリペプチドは、通常、病原性の
線毛形成細菌から得られる線毛の全線毛アミノ酸配列の
少数の成分からなり、ピリン（線毛繊維の大部分を形成
する、精製線毛のサブユニット）とは異なる。この目的
に有用な線毛形成細菌の例は、泌尿器病原性もしくは腸
内病原性菌株の、エシエリヒア・コリ、ネイセリア・ゴ
ノルホエ、ネイセリア・メニンギディテス、ネイセリア
・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスまたは他のモラ
キセラ・エスピーピーおよびボルデテラ・ペルツシスで
ある。
【００１２】この発明のための、この明細書に開示され
た研究は主として、腎盂炎を起こす尿路病原性菌株のエ
シエリヒア・コリに関するものである。しかし、線毛ア
ドヒシンの遺伝情報を指定する種々のエシエリヒア・コ
リの遺伝子システムは非常に類似しており、その結果、
接合を仲介するかような少数の線毛成分がすべてのタイ
プの線毛に存在し、すなわちエシエリヒア・コリ以外の
細菌由来の線毛にも存在することは理解さるべきであ
る。受容体（もしくはその受容体の一部）とアドヒシン
分子との連結構造による、病原性線毛形成細菌の結合に
あずかる受容体は、泌尿器病原性エシエリヒア・コリに
ついては、グリコリピドのグロボシリーズ中に存在する
α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ部分
であるジガラクトシドであると同定された。そしてこの
ジガラクトシドは、前記細菌のウロエピセリウム(uroep
ithelium)に連結していてもよく、またヒト赤血球にＰ
血液型抗原の一部として存在する。
【００１３】この発明をもたらす研究経過において発明
者らは、少なくとも八つの異なるポリペプチドの遺伝情
報を指定することが分かった8.5 kb長の部位のPap pili
（腎盂炎に関連する線毛）をエンコード(encode)する、
泌尿器病原性のエシエリヒア・コリ菌株の染色体部位を
同定した。またこの発明の発明者らは、それが存在しな
いとエシエリヒア・コリが接合しないポリペプチドを完
成した。それ故にこれらのポリペプチド類は泌尿器病原
性エシエリヒア・コリの接合表現型の原因であると考え
られる。したがって、この発明は次のアミノ酸配列の抗
原に関する。
【００１４】
【外４】
【００１５】もしくはその免疫原性的に活性な部分配
列、または
【００１６】
【外５】
【００１７】もしくはその免疫原性的に活性な部分配
列、または
【００１８】
【外６】
【００１９】もしくはその免疫原性的に活性な部分配列
である。これらのアミノ酸配列は実施例５に記載の公知
の方法によって確認された。後者の二つの抗原がない
と、すべての場合に（下記実施例３参照）グロボシド受
容体への結合がなくなることを明確に示し、それ故にこ
れらの両者はアドヒシン ポリペプチド プロパーであ
ると考えられる。一方前者の抗原はある種の環境内だけ
で結合がなくなることを示し（下記実施例３参照）、そ
れ故細胞壁の外表面に形成されたアドヒシン ポリペプ
チドを固定するのに必要であると考えられる。
【００２０】上記アミノ酸配列は、Ｎ−ターミナル・シ
グナル・ペプチド様配列を含む線毛アドヒシン ポリペ
プチドの前駆体の形態であり、その配列はポリペプチド
が細菌内膜を通じて外部へ輸送されるときに分割される
ことに留意すべきである。この発明について、この発明
の抗原は、その抗原が免疫感作に用いられる際に多種類
の抗体を形成しその結果、前記要約のような不利益がも
たらされるのを避けるために、線毛の他の成分のごとき
接合機能に関連する成分以外の成分を実質的に有してい
ないのが好ましい。最も好ましいのは、抗原が実質的に
純粋な形態であり、すなわち、いずれにしてもアドヒシ
ン形成に関係しないが、好ましくない免疫学的な反応を
起こすかもしれない他の抗原決定基を含まない抗原であ
る。
【００２１】他の態様として、この発明は、その主要な
免疫感作成分として、アドヒシンポリペプチドもしくは
その免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活
性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からな
る前記抗原に対しもしくは実質的に前記抗原に対しての
み生成される抗体に関する。かような抗体は、前記定義
の抗原で免疫にされうる動物を免疫にし、それ自体公知
のしかたで、動物から免疫グロブリンのごとき抗血清を
得ることによって得られるものであってもよい。その免
疫感作は抗原の安定化された水溶液によって行うのが好
ましい。すなわち、安定化剤はリン酸塩緩衝液もしくは
補助剤（抗原性をさらに増大させるために）であっても
よく、適切な補助剤はフロイントの補助剤(Freund's ad
juvant)もしくは水酸化アルミニウムである。免疫感作
するのに豚の免疫グロブリンも抗体として用いられる
が、好ましい動物はマウス、ラビット、山羊および羊で
ある。動物を出血させ抗血清を分離するのは公知の方法
によって行われる。
【００２２】この発明による抗体も実質的に純粋な形態
が好ましく、この形態の抗体は下記のように診断用に有
用になる。一方、その抗体も、抗体類の公知の製造法で
あるハイブリドーマ技術によって製造することができ
る。例えば免疫感作された動物としてマウスを使用する
ハイブリドーマ技術において、マウスは問題の抗原で免
疫にされ、免疫にされたマウスから得た脾臓細胞が骨髄
腫細胞と融合され次いで融合ハイブリドーマ細胞がクロ
ーンされ、抗体産生細胞が適切な増殖培地中で培養さ
れ、抗体がその培養物から回収される。ハイブリドーマ
技術で得られた抗体は大きな特異性を有し、それ故に例
えば一層優れた精度の診断ができるという利点を有す
る。またさらに進んだ段階においては、組換えＤＮＡ技
術を用い、その抗体をエンコードする単一もしくは複数
の遺伝子がハイブリドーマ細胞クローンから適切なベク
ターに転移され(transfer)、そのハイブリッドベクター
が適切な細菌の宿主に形質転換され、該宿主は適切な培
体で培養され、次いで得られた抗体が培養物から回収さ
れる。この方法では抗体を改善された収率で得られる。
その宿主は、エシエリヒア・コリもしくはバチルス・ズ
ブチリスのごとき組換えＤＮＡ技術の分野で通常用いら
れるものであってもよい。
【００２３】この発明の非常に重要な態様は哺乳類の組
織に接合する病原性細菌が原因で起る疾病に対して、そ
の哺乳類を免疫にするためのワクチンに関するものであ
る。そしてそのワクチンは、任意に適切な担体に結合さ
れた上記抗原の免疫原性的に有効量と、免疫学的に受容
な賦形剤とを含有する。この賦形剤は、稀釈剤、分散
剤、補助剤などのごときワクチンの製造に通常用いられ
るいずれの賦形剤であってもよい。
【００２４】いくつかのケースでは、抗原がそれ自体で
重合する傾向がある場合、担体を用いることは必要でな
いが、このような場合以外には、抗原を担体に共有結合
的に結合させるのが有利である。この担体は通常高分子
物の担体であり、特にワクチンがヒトを免疫化するのに
用いられるときには、それは生理的に受容であることが
重要である。抗原の固定化用の非毒性および／または非
アレルゲン性担体は公知である。例えばアーノン(Arno
n)，ジャーナル オブ イムノロジカル メソッズ(J.
Immunological Methods)，第６１巻，１９８３年，第２
６１〜２７３頁である。この目的のため現在有用である
と注目されているこのタイプの担体は例えばポリ−Ｌ−
リシンおよびポリ−Ｄ，Ｌ−アラニンである。天然の担
体も非毒性で非アレルゲン性であれば用いてもよい。
【００２５】この発明はさらに、かようなワクチンの製
造法に関し、すなわちそのワクチン中の、免疫原性的に
有効な量の前記抗原が、任意に適切な担体に結合され、
ワクチン製剤に所望濃度の抗原を付与する量の免疫学的
に受容な賦形剤と合せられ、たとえば混合されるワクチ
ンの製造法に関する。この発明の方法の特別な態様にお
いて、少なくとも五つのアミノ酸からなる免疫原性的に
活性なアミノ酸配列は上記の担体の一つごとき生理的に
受容な担体に共有結合的に結合されている。融合ポリペ
プチド製造の技術は、例えばキャサダバンら(Casadaban
et al)，メソッズ イン エンザイモロジィ(Methods
in Enzymology)，第１００巻，１９８３年，第２９３〜
３０８頁によって公知である。
【００２６】この発明の方法の他の態様では、上記抗原
をエンコードするヌクレオチド配列が生理的に受容な担
体のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に
融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切なベクター
に挿入され、得られたハイブリッドベクターが適切な細
菌宿主に形質転換され、得られた宿主が適当な培地中で
培養され、融合ポリペプチドがその培養物から回収さ
れ、任意に精製される。
【００２７】さらに他の態様では、この発明は、前記抗
原をエンコードするヌクレオチド配列から少なくともな
るＤＮＡフラグメントに関する。このＤＮＡフラグメン
トは実質的に他の抗原をエンコードしないものが好まし
い。そのヌクレオチド配列は、実質的に全アドヒシン
ポリペプチドをエンコードするものか、免疫原性的に活
性な形態に変換しうるアドヒシン ポリペプチドの前駆
体をエンコードするものか、またはアドヒシン ポリペ
プチドの免疫原性的に活性な部分配列をエンコードする
ものであってもよい。免疫原性的活性を有するアミノ酸
配列の情報を指定するためには、そのＤＮＡフラグメン
トは少なくとも５コドン（トリプレット）の長さを有し
ていなければならない。このＤＮＡは、病原性のアドヒ
シン形成細菌類の、染色体もしくはプラスミドに存在す
る遺伝情報の一部であってもよく、これら細菌の代表例
は、泌尿器病原性菌株もしくは腸内病原性菌株である、
エシエリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内
細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギ
ディティス、ネイセリア・キャタルハリス、イエルシニ
ア・エスピーピー、スードモナス・エルギノーサもしく
は他のスードモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビ
スもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイ
デス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピーピー、
ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボルデテラ
・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピーピーが挙げ
られる。
【００２８】かくしてそのＤＮＡフラグメントは、泌尿
器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシエリヒア
・コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニン
ギディティス、ネイセリア・キャタルハリス、モラキセ
ラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、ま
たはボルデテラ・ペルツシスのごとき、病原性線毛形成
細菌由来であってもよい線毛アドヒシン ポリペプチド
の遺伝情報を指定するＤＮＡもしくはそのＤＮＡ配列の
一部であってもよい。
【００２９】例示のために、ＤＮＡフラグメントはエシ
エリヒア・コリの病原性菌株から得られる１以上のアド
ヒシン ポリペプチドの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列
を全部もしくは部分的に含有するものであってもよい。
したがってこの発明は、主要構成要素として下記ＤＮＡ
配列で構成されているＤＮＡフラグメントに関する。
【００３０】
【外７】
【００３１】または、
【００３２】
【外８】
【００３３】または、
【００３４】
【外９】
【００３５】または、表現された場合に、上記の全ＤＮ
Ａ配列のいずれかひとつによってエンコードされるアド
ヒシン ポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を
構成する、そのいずれかの部分配列。それぞれのＤＮＡ
フラグメントの配列は、実施例４に記載の公知の方法で
樹立された。
【００３６】別の重要な態様において、この発明は、少
なくとも後記定義の抗原をエンコードするヌクレオチド
タイプ配列からなり、また実質的に他の抗原をエンコー
ドしないＤＮＡフラグメントが挿入されたハイブリッド
ベクターを収容する細菌宿主が培養され、前記ＤＮＡフ
ラグメントから表現された産物を回収し次いで任意に精
製されることからなるその主要な免疫感作成分としてア
ドヒシン ポリペプチドの抗原決定基を有する抗原の製
造法に関する。
【００３７】アドヒシン ポリペプチドもしくはその免
疫原性的に活性な部分配列もしくは遺伝学的に活性な形
態に変換しうるその前駆体をエンコードするＤＮＡフラ
グメントは、例えば、該フラグメントが実際に存在する
細菌ＤＮＡから該フラグメントを例えば次のような組換
えＤＮＡ技術で切りとることによって得ることができ
る。
【００３８】一つのアドヒシン−ポリペプチド産生細菌
から染色体ＤＮＡが制限酵素を用いて切りとられ、個々
のＤＮＡフラグメントが適切なベクターとリリゲート(r
eligate)され、次いでそのベクターが適切な細菌宿主に
形質転換される。次いでベクターを受けとった細菌のク
ローンは、特定の受容体を有するいずれかの固体表面に
結合する性能によって評価されるアドヒシン機能につい
て、例えば標準法の赤血球との凝集法によって試験され
る。次いでアドヒシン機能を保持してきたクローンから
得たＤＮＡフラグメントを適切なベクターにサブクロー
ンし、次いでトランスポゾン変異法(transposon mutage
nesis)および／または部分消化(partialdigestion)及び
リリゲーション(religation)に付され、その結果、細菌
宿主中にアドヒシン機能をエンコードできる性質を保持
する最小のＤＮＡフラグメントを有するサブクローンを
作製できる。これによって、細胞表面アドヒシン機能を
表現するＤＮＡオペロンの、必要な最小のピースが得ら
れる。さらに、組換えＤＮＡ技術を利用するトランスポ
ゾン変異法もしくは欠失法による操作が、アドヒシン
ポリペプチドを表現できる性能を保時または保持しな
い、オペロン中の個々の遺伝子を同定するのに用いられ
る。次いでアドヒシン ポリペプチドを表現する単一も
しくは複数の遺伝子が適切なベクターに挿入され、また
任意に適切なプロモーターを挿入して単一もしくは複数
のアドヒシン ポリペプチドの表現を増大させる。次い
でそのベクターは細菌、例えばエシエリヒア・コリもし
くはバチルス・ズブチリスのごときグラム陰性細菌のご
とき適切な宿主生物に形質転換される。この最後の段階
での他の方策はアドヒシン ポリペプチド産生に必須で
ない遺伝子を選択的にブロックするか脱離する方法であ
り、その遺伝子はエシエリヒア・コリの場合、ＤＮＡオ
ペロンの上記の必要な最小ピース中のpap AとpapCであ
る。
【００３９】主要な(major)線毛構成成分と混合して小
さな(minor)線毛アドヒシン ポリペプチドが存在して
いる（通常同じオペロンから産生される）製剤からその
小さな線毛アドヒシン ポリペプチドを古典的な化学的
方法によって精製することは、本来、免疫原性である前
記構成成分が非常に大量存在している事実によって、不
可能ではないまでも極めて難しいので、小さな線毛アド
ヒシン ポリペプチド製造の組換えＤＮＡ技術は、好ま
しくない抗原をエンコードするかもしくは他のしかたで
表現される遺伝子を選択的に除去し、所望の小さなアド
ヒシン ポリペプチドをエンコードする単一もしくは複
数の遺伝子を選択することができて、この発明用とし
て、免疫原性的に有効かつ十分純粋な抗原を得ることが
決定的に重要なことである。単一もしくは複数のこの遺
伝子を適切なベクターに挿入し、任意に、この明細書に
記載のようにして他の遺伝子と融合させることによっ
て、公知の線毛製剤中には、免疫原性的に実質的に無効
で従来なら無視される小比率でしか存在していなかった
小さな線毛アドヒシン ポリペプチドを大量に得ること
ができる。
【００４０】特定の態様によれば、一つもしくはいくつ
かの所望のアドヒシン ポリペプチドを同じベクターに
挿入することができる。その結果、微生物によって産生
された産物は、問題の抗原の抗原決定基を再発ししたが
ってその免疫原性もしくは受容体結合効率を増大させる
産物である。これらの操作はすべて組換えＤＮＡ技術の
分野で公知の方法にしたがって行われ、下記の実施例１
〜３でより詳細に説明される。この方法に用いられるベ
クターは、ｐＢＲ３２２誘導体類、lac ＵＶ５プロモー
ターベクター類、Tacプロモーターベクター類のごとき
広範囲宿主のベクター類、シャトルベクター類、ランア
ウェイプラスミド誘導体類などのごとき、この目的に通
常用いられるいずれのベクターでもよい。細菌宿主が培
養される増殖培地は、Ｌ−ブロスもしくはＭ９グリセロ
ール培地のごとき醗酵法に通常用いられるいずれの増殖
培地であってもよい。細菌宿主は、エシエリヒア・コリ
もしくはバチルス・ズブチリスのごとき醗酵中の挙動が
知られている宿主の中から簡便に選択される。
【００４１】上記のように、多くの場合、宿主細胞によ
って形成されることのある有毒物質、例えばリポポリサ
ッカライドが抗体と同時に投与されるので、精製は、不
適切な抗体類、すなわち問題の抗原に対する免疫感作に
関与せずしかもそれが形成される動物の一部に好ましく
ない反応を起こしさえする抗体類の形成が避けられるか
ら有利である。しかし問題があることが分かってきた。
精製を容易にするために、融合されたポリペプチドの使
用を伴う方法が考案された。この方法では、アドヒシン
ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配
列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆
体からなる第一ポリペプチドをエンコードするＤＮＡフ
ラグメントが第二にポリペプチドをエンコードするＤＮ
Ａ配列に融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切な
細菌宿主に挿入され、その宿主が適切な培地で培養さ
れ、その融合ポリペプチドは培養物から回収され、第二
ポリペプチドに対して生成する抗体の検査法(assay)を
利用して精製され、そして第二ポリペプチドは任意に適
切なプロテアーゼによって切断され、次いでその二つの
ポリペプチドは分離される。
【００４２】この目的に有利に採用しうるＤＮＡ配列の
例はβ−ガラクトシダーゼをエンコードする1ac Z遺伝
子である。というのはこの遺伝子産物したがってアドヒ
シンポリペプチドもしくはその部分配列もしくはその前
駆体の表現が、例えばラクトース・インディケーター・
プレート上で細菌宿主を培養し、陽性(Lac+)コロニイを
選択することによって容易に検出されるからである。
【００４３】精製後、第二ポリペプチドはトリプシンま
たはキモトリプシンのごときプロテアーゼによって切断
できる。第二ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子
が融合された第一ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ
フラグメントからだけ得られる所望のペプチドフラグメ
ントは、例えば生体外で試験される、それらの免疫原性
活性に基づいて選択される。この二つのポリペプチドの
分離は、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ逆相ク
ロマトグラフィ、又はイムノアフィニティ クロマトグ
ラフィ(immunoaffinity chromatography)もしくは受容
体アフィニティクロマトグラフィのごときアフィニティ
クロマトグラフィのような標準方法で行うことができ
る。イムノアフィニティ クロマトグラフィの場合、こ
の発明の抗原（第一ポリペプチドからなる）に対して形
成される抗体または第二ポリペプチドに対して生成する
抗体のいずれかをカラムに固定化された抗体として用い
ることができる。受容体アフィニティ クロマトグラフ
ィにおいては、産生されたアドヒシンの受容体が同様に
利用できる。第二ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ
配列との融合に用いられるＤＮＡフラグメントは、上記
のいずれかのＤＮＡフラグメントであってもよい。
【００４４】この発明の抗体の他の製造法では、線毛ア
ドヒシン ポリペプチドのごときアドヒシン ポリペプ
チドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列は、液相
ペプチド合成法とか固相ペプチド合成法によるといった
公知方法〔例えば、スチュワートおよびヤング(Stewart
and Young)，固相ペプチド合成法(Solid Phase Peptid
e Synthesis)，フリーマン アンド カンパニィ(Freem
an & Co.)，サンフランシスコ，米国，１９６９年〕に
よって製造することができる。固相ペプチド合成法が好
ましい方法である。固相ペプチド合成法では、アミノ酸
配列がイニシャルアミノ酸を担体にカップリングさせ次
いで引続き他のアミノ酸をこの場合少なくとも五つのア
ミノ酸の長さまで、ペプチド結合によってその配列に付
加することによって組立てられる。アドヒシン ポリペ
プチドもしくはその部分配列を固相ペプチド合成法で製
造する場合、その配列中のイニシャルアミノ酸がカップ
ルされる担体と同様にワクチン中の抗原用の担体として
有用な生理的に受容なポリマーを使用するのが有利であ
ろう。ワクチンとしての用途用の合成ペプチドの製造
は、シニック(Shinnick)，“シンセティック ペプチド
ズ、イムノゲンズ アンド ワクチンズ(Synthetic pep
tides,immunogens and vaccins)”，Ann.Rev.Microbio
l.,第３７巻，１９８３年，第４２５〜４４６頁に記載
されたのと特に同様にして行うことができる。
【００４５】この発明によれば、アドヒシン ポリペプ
チドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは
免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体からなる
抗原に対して生成するかもしくは実質的に生成する抗体
は、任意に適切な担体に結合された前記抗体の免疫学的
に有効な量と免疫学的に受容な賦形剤とからなる、哺乳
類の組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対
する哺乳類の受動免疫用組成物に用いることができる。
この組成物は、免疫原性的に有効な量の抗体と免疫学的
に受容な賦形体とを、例えば両成分を混合することによ
って合することからなる方法によって製造することがで
きる。
【００４６】抗体が任意に共有結合的に結合される担体
はワクチンについての記載に関連して上記した担体のい
ずれでもよい。抗体が混合される賦形剤は、組成物中の
抗体の濃度を所望の濃度にする量で添加される稀釈剤、
分散剤、補助剤などのごときこの目的のために通常用い
られるいずれの賦形剤であってもよい。前記抗原よりも
免疫感作の効率が低いけれども、その抗体は免疫感作の
ために用いることができる。しかしその主要な用途は哺
乳類例えばヒトの組織に接合する病原性アドヒシン形成
細菌によって起こる疾病の診断用診断剤としての用途で
あり、その細菌の例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原
性菌株である、エシエリヒア・コリもしくは他の腸内細
菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセ
リア・メニンギディティス、ネイセリア・キャタルハリ
ス、イエルシニア・エスピーピー、スードモナス・エル
ギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モ
ラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピ
ー、バクテロイデス・ノドスス、スタフィロコッカク・
エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、ま
たはボルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エス
ピーピーである。それ故にまたこの発明は、線毛アドヒ
シン ポリペプチドの免疫原性のある抗原決定基に対し
て生成する抗体、またはアドヒシン ポリペプチドもし
くはその部分配列もしくはその前駆体ではない、抗原の
免疫原性抗原決定基に対して生成する抗体のごとき前記
抗体からなる診断剤に関する。この抗原は例えばアドヒ
シン遺伝子クラスターによってエンコードされる他のポ
リペプチドでもよい（その遺伝子を有する細菌の接合性
能を仲介するのに若干必要な遺伝子配列）。例えば泌尿
器病原性エシエリヒア・コリ由来の線毛ポリペプチド、
例えば１３kd、８１kdおよび２８．５kdそれぞれのポリ
ペプチドをエンコードする、遺伝子pap B、pap Dもしく
はpap D（第１図および／または第２図に示す）の遺伝
子産物の場合の、例えば線毛の形成に必要な他の一つの
ポリペプチドである。papC、pap D遺伝子の産物は、ピ
リン(pilin)の分泌と重合工程（線毛の形成のための）
中に、ピリン・サブユニットの組立ておよび／または固
定（遺伝子pap Aによってエンコードされている）を仲
介すると現在信じられる。
【００４７】その抗体は、診断剤として用いられる際、
例えば診断試験において、検出すべき抗原を有する細菌
が着色凝塊として見えるように着色剤で標識を付けても
よい。エンザイム−リンクトイムノソーベント検査法(e
nzyme-linked immunosorbentassay)（ＥＬＩＳＡ；原料
および方法の項参照）または放射能標識された抗体を用
いるラジオ イムノアッセイ[radioimmunoassay(RIA)]
のような他の標準方法も用いることができる。
【００４８】一方、その診断剤は、存在するか存在しな
いかが診断試験によって証明されるべき細菌中のＤＮＡ
配列と少なくとも約６０％が同じの、安定な、標識のつ
けられたＤＮＡ配列で構成されていてもよい。この明細
書において、“安定な”という用語は、そのヌクレオチ
ド配列が比較的一定であること、すなわち一つの塩基対
が他の塩基対と置きかえられる塩基対置換は当然まれで
あることを示すのを目的とするものである。多くの遺伝
子において、かような塩基対置換は、遺伝子から表現さ
れる遺伝子産物のアミノ酸組成には必ずしも影響を与え
ず、比較的普通のことである。しかしこの塩基対置換
は、プローブ(probe)のＤＮＡ（部分）配列は、同じ配
列、または細菌ＤＮＡ中のよく似た配列を認識するの
で、プローブからのＤＮＡと試験されるべき試料として
用いられる細菌ＤＮＡとの相同性がかなり高いことに依
存する前記診断方法に影響を与える。その診断法におい
てプローブＤＮＡには標識が付され、そのＤＮＡは変性
されプローブと細菌ＤＮＡの両者のストランドを分離す
る；それらのＤＮＡを混合後、ストランドは二重らせん
構造を再形成するために残されるが、相同の場合（ＤＮ
Ａ配列の認識）、プローブＤＮＡのいくつかは細菌ＤＮ
Ａ内に導入されたであろう。この技術はハイブリッド形
成法として知られ、例えば、サザーン(Southern)，メソ
ッズ イン エンザイモロジイ(Methods in Enzymolog
y)，第６８巻，１９８０年，第１５１〜１７６頁に記載
されている。診断剤として十分な特異性を有するため、
プローブとして用いられるＤＮＡは特定のヌクレオチド
配列で構成されるべきであり、それ故少なくとも１２の
ヌクレオチドの長さを有するべきである。そのプローブ
ＤＮＡは、本来公知のしかたで3Ｈもしくは14Ｃのごと
き放射性同位元素で標識されるのが有利である。
【００４９】プローブＤＮＡとして用いられるＤＮＡ配
列は、アドヒシン遺伝子クラスターの一部であるがアド
ヒシン ポリペプチド自体をエンコードしない遺伝子か
らなる配列かまたはその診断用に有効な部分配列であっ
てもよい。この遺伝子は、例えば線毛アドヒシン ポリ
ペプチドでない、病原性線毛形成細菌によって産生され
る線毛ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子か、ま
たはその診断用に有効な部分配列であってもよい。この
明細書に例示するシステムにおいて、その線毛ポリペプ
チドをエンコードするＤＮＡ配列もしくはその部分配列
は泌尿器病原性菌株のエシエリヒア・コリ由来のもので
ある。このシステムで特に有利な診断剤は、上記の遺伝
子安定性からみて遺伝子pap B、pap Cおよびpap Dであ
るか、またはこれら遺伝子のいずれかの診断用として有
効な部分配列であることが見出された。
【００５０】上記のように、この発明による抗原はワク
チンの成分として用いることができる。したがってこの
発明は、任意に適切な担体に結合された前記抗原の免疫
原性的に有効な量を含有するワクチン、または任意に適
切な担体に結合された前記抗体および免疫学的に受容な
賦形剤を含有する受動免疫用組成物を投与することから
なる、哺乳類例えばヒトの組織に接合する病原性細菌に
よって起こる疾病に対するヒトのごとき哺乳類の免疫感
作方法を包含するものである。その投与は、抗原もしく
は抗体を等張性食塩水のごとき適切な注射用賦形剤と混
合して注射するようなそれ自体公知の方法で行うことが
できる。
【００５１】これらの病原性細菌はアドヒシン類もしく
はアドヒシン様のポリペプチド類を形成するいずれの細
菌であってもよい。それらの例は、泌尿器病原性もしく
は腸内病原性の菌株である、エシエリヒア・コリもしく
は他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノル
ホエ、ネイセリア・メニンギディティス、ネイセリア・
キャタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スード
モナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エス
ピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ
・エスピーピー、バクテロイデス・ノドスス、スタフィ
ロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エス
ピーピー、またはボルデテラ・ペルツシスのごときボル
デテラ・エスピーピーである。かような細菌の興味深い
種類は線毛形成細菌で構成されている。その重要な例
は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシ
エリヒア・コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア
・メニンギディティス、ネイセリア・キャタルハリス、
モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピー
ピー、またはボルデテラ・ペルツシスである。
【００５２】最後に、この発明による抗原は、上皮細胞
のごとき哺乳類の組織上にある、特定のアドヒシン ポ
リペプチドもしくはその活性部の受容体の存在を測定す
るのに用いることができる。この抗原は、高い危険度に
ある人間、すなわち問題の感染症をおこす病原性細菌が
自ら産生するアドヒシンによって結合する受容体を大量
に産生しそのためある種の感染症にかかりやすいと思わ
れる人間を同定することは非常に重要である。かような
人間が同定されたならば、予防治療すなわち主として免
疫感作／予防接種を行うことができる。アドヒシン受容
体の存在および存在するアドヒシン受容体の量の測定法
は、組織の試料もしくは細胞スクレイピング(cell scra
pings)からなる試料をアドヒシンとともに培養し次いで
洗浄することから構成されている。アドヒシンに対して
生成し、例えば蛍光もしくはＩ−１２５のような放射性
同位元素で標識が付された抗体が試料とともに培養され
てもよく、または一方ではこのように標識の付されたア
ドヒシンは直接試験に用いてもよい。次いで試料のアド
ヒシン受容体の量は、それ自体公知のしかたで試料の放
射能もしくは蛍光の量を測定することによって測定する
ことができる。
【００５３】具体的に述べれば、エシエリヒア・コリの
泌尿器病原性菌株のアドヒシン ポリペプチド類、すな
わち前記のアミノ酸配列はしたがって、泌尿器管中に大
量のグロボシド受容体を産生しそのため泌尿器管の感染
症にかかりやすいと考えられる女性を同定するのに用い
ることができると考えられる。この発明のこの態様は一
般に、ヒトのごとき宿主哺乳類からの組織試料を受容体
−特異性ポリペプチドで処理し、未結合の受容体−特異
性ポリペプチドを除去し、結合された受容体−特異性ポ
リペプチドの量を測定することからなる前記宿主におけ
る受容体の密度もしくは分布の測定法として示すことが
できる。結合されたポリペプチドの量の測定はそのポリ
ペプチドに標識をつけるか、または上記のごとき標識を
つけた抗体と試料とを培養するかによって行うことがで
きる。
【００５４】この発明の方法は、受容体密度もしくは受
容体分布が特定の受容体に対して誘導された抗体によっ
て測定された以前の方法にくらべて非常に有利である。
というのは、アドヒシン ポリペプチドによって例示さ
れる受容体−特異性ポリペプチドは、通常一つもしくは
二つの糖である受容体自体が糖の鎖の端部にあってもま
たはその二つの糖の系が糖の鎖のいくぶん中央部にあっ
ても特定の受容体に結合しうるが、一方抗体は前記鎖の
端部の二つの糖を認識するだけで中央部の二つの糖を認
識しないからである。それ故に抗体の結合範囲はアドヒ
シン ポリペプチドと比較して限定されており、受容体
密度を定量する試みは、受容体と直接結合させるために
抗体を用いるといつも低く評価されている。
【００５５】最後に、この発明の一つの態様は、ヒトも
しくは他の哺乳類が病原性のアドヒシン−結合微生物に
感染する可能性を防止するかもしくは減少させる方法に
関するものであり、すなわち、ヒトもしくは他の哺乳類
を、特定の細菌の感染が防止されるべき細胞表面にポリ
ペプチドを分布させる適切な方法にて、１以上のアドヒ
シン ポリペプチドによって処理することからなる方法
であり、使用されるアドヒシン ポリペプチドは、病原
性細胞によって産生されるアドヒシンが結合する受容体
と結合するアドヒシン ポリペプチドである。この場
合、そのアドヒシン ポリペプチドは、抗原としては使
用されないが受容体をふさぐ直接予防的治療剤として使
用され、したがって病原性細菌が受容体と結合できなく
なる。最も局所的な感染症において、第１段階は特定の
細菌からのアドヒシン ポリペプチドの特定細胞の表面
への特異的な結合であり、このことは受容体がすでにふ
さがれている場合、感染を進行させる工程の第一段階は
起ることはないことを意味する。また細菌が結合できな
ければ感染は起こらない。
【００５６】下記の図面を参照してこの発明をさらに説
明する。第１図はｐＲＨＵ８４５中のＰａｐＤＮＡの遺
伝子構成を示す地図である。上方の線はプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１８４に挿入されたＥｃｏＲＩフラグメントのサ
イズ（キロベース・ペア）を示す。種々のＴｎ５挿入の
位置は上部に示してある。ｐＲＨＵ８４５の制限地図と
同定されたpap遺伝子類の位置が示されている。厚みの
ある垂直のバーはシグナルペプチドの遺伝子情報を指定
する領域を示す。前記バーの下に示したのは成熟ポリペ
プチド類の分子量（×１０3ドルトン単位）を示す。
【００５７】第２図は生体外の突然変異誘発に用いられ
るpapハイブリッドプラスミドの制限地図と遺伝子構成
を示す。プラストミドｐＰＡＰ５はＰａｐ線毛の表現と
ヒト赤血球のジガラクトシドー特異性凝集反応に必要な
全ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有している。
プラスミドｐＰＡＰ１６はｌａｃＵＶ５プロモーターか
らの転写調節下のＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩだけを有す
る。
【００５８】プラスミドｐＰＡＰ９は、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーターを有していないことを除けばｐＰＡＰ１６と
同一である。水平線の下のＡｐRはアンピシリン耐性
（１００μｇ／ml）を示す。
【００５９】第３図は、ｐＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ２
２中に見出された全pap領域を示す（上部の半分）。ｐ
ＰＡＰ２２は、ベクターＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＰｖｕII
部を欠いていることを除けばｐＰＡＰ５と同一である。
このプラスミドはpap A1誘導体ｐＰＡＰ２３の親であ
る。またpap A1突然変異の位置が示されている。この図
の下部はＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩ領域の物理的地図を示
す。この領域でのＴｎ５挿入の位置が示されている。す
べてが血球凝集反応を仲介する容量を破壊する。この下
にpap E、pap Fおよびpap G遺伝子の位置が示されてい
る。ハッチングした領域は、これらの遺伝子によってエ
ンコードされていると信じられる推定上のシグナルペプ
チドを示す。pap E1，pap F1およびpap G1の突然変異の
位置が示されている。それらはｐＰＡＰ５とｐＰＡＰ１
６との両者に別個に導入された。図面に示されたプラス
ミド類の構造と特性づけは、実施例１〜３のみならず原
料と方法の項に記載されている。
【００６０】一般的原料と方法 化学試薬類と酵素類 制限酵素類とＴ４ＤＮＡリガーゼはベーリンガーマンハ
イム社(Boehringer Mannheim GmbH)もしくはニュー イ
ングランド バイオラブズ(New England Biolobs)から
購入し製造メーカーのすすめたのと同様にして使用し
た。３’−劣性末端(3'-recessive ends)のフイリング
(filling)は、必要なｄＮＴＰ類をそれぞれ２００μＭ
添加した連結緩衝液(ligation buffer)にいれたクレナ
ウ フラグメント(Klenow fragment)（ニュー イング
ランド バイオラブ社）を用いて行った。ＸｈｏＩリン
カー(5'-CCTCGAGG-3')およびＢａｍＨＩリンカー(5'-CG
GATCCG-3')はコラボレイテイブ リサーチ社(Collabora
tive Reseach)から入手し、そのメイカーが述べるとお
りに、ニュー イングランド バイオラブスから入手し
たポリヌクレオチドキナーゼを用い、５’−ホスホリル
化した。化学試薬はすべて市販の最高純度のものであっ
た。ｐ−赤血球はビイ・セダーグレン博士(Dr.B.Cederg
ren)，ブラッド．バンク，大学病院、ウメア(Umea)の御
好意で入手した。
【００６１】線毛の精製 線毛は、ブリントら(Brinton et al)，イムノビオロジ
イ オブ ネイセリア・ゴノルホエ(Immunobiology of
Neisseria gonorrhoeae)，ワシントン デイシー，米
国，１９７８年，第１５５−１７８頁に記載の方法の修
正方法によって精製された。細胞は２２時間、３７℃
で、グルコースなしのＬ−エガーの入った五つのトレイ
（４００×２５０mm）中で培養された。細胞をトレイか
らけずりとり、３４０mlの氷冷５mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ 8.0）中に分散させ、４にセットしたソーバル
オムニミキサー(Sorvall Omnimixer)中の氷上で１０分
間混合した。細胞および細胞破砕片をペレテーション(p
elletation)した後（３０分間20,000xgで２回）、硫酸
アンモニウムを上澄液に５５％飽和度まで添加し、一夜
氷上において線毛を沈澱させた。得られた沈澱を遠心分
離で収集し５mMトリス緩衝液（ｐＨ 8.0）中に再分散さ
せた。同じ緩衝液に対して４℃で一夜透析させた後、不
溶物を３０分間40,000xgで遠心分離して除去した。この
沈澱−透析操作をさらに３回繰返し（３時間の沈澱）、
その後１ＭＭｇＣｌ2−1.5ＭＮａＣｌ−１００mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ 7.5）の0.2容量部を添加することによ
って線毛を沈澱させた。得られた沈澱は、ローリィら(L
owry et al)，ジャーナル オブバイオロジカル ケミ
ストリィ(J.Biol.Chem.)，第１９３巻，１９５１年，第
９２０〜９２９頁によって測定して蛋白濃度２mg/mlに
溶解した。収率は、野性型で約１５mg変異株では２〜３
０mgであった。
【００６２】受容体結合性の検査法 スライド凝集試験(slide agglutination)用に、グルコ
ースなしのＬ−エガー培地上２２時間培養された細菌細
胞を、３％のヘパリン化し洗浄したヒト赤血球含有の凝
集緩衝液(150mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.5)中に、約１
０10Ｃｅｌｌｓ／mlの濃度で分散させた。その反応は、
陽性の場合、通常６０秒以内に現れてくる。この陽性反
応は赤血球の肉眼で見える凝集反応であった。この半定
量的検査法において上記のように培養された細胞はＡ
600＝２０に再度分散された。次いでコニカル底のウエ
ル(well)を有するマイクロタイター・プレート(microti
terplate)〔リンブロ／タイターテック社(Linbro/Titer
tek)，カタログ番号７６−３２１−０５，コネチカッ
ト，米国〕を用いて、５０μｌの凝集緩衝液で連続的に
２倍稀釈を行った。これに、同じ緩衝液による３％赤血
球分散液の１０μｌを加えた。４℃で２時間後に陽性の
凝集を示す最後のウエルの稀釈度を凝集力価(agglutina
tion titer)とした。もとの分散液の細胞数算定をこの
力価とともに用いて、凝集に必要な最小細菌濃度を計算
した。
【００６３】精製線毛の凝集力価は、全細胞に用いたの
と本質的に同じ方法で測定した。しかし凝集緩衝液を用
いる場合、凝集に必要な線毛濃度は非常に高いので、こ
の検査法の感度を増加させるために種々のこころみがな
された。線毛は生理的ｐＨ中では負に帯電し、１６７mM
ＭｇＣｌ2の存在下で凝集するので（線毛の精製の項
参照）、野生型の線毛製剤は、グロボシド受容体（ジガ
ラクトシド含有）を含有するＰ1−赤血球およびこの炭
水化物を含まないｐ−赤血球を用い、ＭｇＣｌ2の濃度
を上げながら滴定した。その凝集力価は、ＭｇＣｌ2濃
度を１００mMに増大すると１２８倍増大することが見出
された。このことは同じ緩衝液による２００μｇ／ml線
毛溶液のＡ400の増加と平行している。ＣａＣｌ2と１０
倍の高濃度のＮＨ4Ｃｌを用いても同じ結果が得られ
る。このことはその効果は線毛−線毛間の相互作用につ
いてであり特定受容体の結合についてではないというこ
とを示唆している。加うるに、全ピリエイテッドセル(w
hole pilliated cells)の凝集力価はＭｇＣｌ2を２００
mMまで添加しても余り影響されない。またｐ−赤血球を
用いると凝集力価が増大するということは、この検査法
の特異性(P1-titerover p-titer)は変化しないようであ
るけれども、不特定の線毛−赤血球凝集がＭｇ 2+イオン
の添加によって促進されるということを示している。そ
れ故に線毛製剤の滴定はすべて、１００mMＭｇＣｌ2含
有の凝集緩衝液中でなされ、特定の凝集反応について半
定量的な値を与える。
【００６４】抗体の産生 免疫前の血清を二匹の健康な1.8Kgの雌のニュージーラ
ンド・ホワイト・ラビットから心臓穿刺によって得、濾
過殺菌し、−２０℃で貯蔵した。等張性食塩水1.0mlに
入れた精製Ｐａｐ線毛7.5μｇを同容積のフロイントの
完全補助剤でエマルジョン化し、その0.5mlずつを四つ
の部位に、すなわち肩甲下の２部位と２本の後足の筋肉
に注射した。６週間後、完全フロイント アジュバント
でブースター注射を行った。第二免疫感作後の１０日
間、前記動物から心臓穿刺によって採血し、その血清を
濾過殺菌し、0.02％のアジ化ナトリウムとともに−２０
℃で貯蔵した。
【００６５】線毛抗原の検査法 スライド凝集法試験用に、細菌を、血球凝集性検査法に
ついて記載したのと同様にして培養して作製した。全細
胞の凝集試験は精製Pap線毛に対して生成した抗血清の
５００倍稀釈(PBS pH7.5)したもの（上記参照）で行っ
た。この陽性反応は６０秒以内に現れる、肉眼で見える
細菌の細胞集合として測定された。
【００６６】ミニ細胞中の蛋白の表現 プラスミドｐＰＡＰ５とその誘導体をミニ細胞産生菌株
Ｐ６７８−５４に形質転換させた〔アドラーら(Adler e
t al)，プロシーディング オブ ナショナルアカデミ
ィ オブ サイエンス オブ ユナイテッド ステイツ
オブ アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第５７
巻，１９６７年，第３２１〜３２６頁〕。プラスミド含
有のミニ細胞の製造と[35S]メチオニンによる標識づけ
はトンプソン及びアクトマン(Thompson and Achtman)，
モレキユラー アンド ジエネナルジエネテイッス(Mo
l.Gen.Genet.)，第１６５巻，１９７８年，第２９５〜
３０４頁に記載したのと同様にしてなされた。得られた
放射性試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に
付した（下記参照）。そのゲルを固定し、染色し、エン
ハンスし〔エンハンス，ニュー イングランド ヌクリ
アー(Enhance,New England Nuclear)〕、オートラジオ
グラフィに付した。分子量標準品〔ファーマシャ ファ
イン ケミカルズ，アプサラ，スエーデン(Pharmacia F
ine Chemicals,Uppsala,Sweden)と精製線毛を平行して
電気泳動法に付した。
【００６７】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル 電気
泳動法 放射性試料を、62.5mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 6.8)、１
％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5％β−メルカプト
エタノールおよび１０％グリセロール含有のサンプリン
グ緩衝液の１００μｌ中に分散させた。５分間沸騰後、
抽出物(extracts)が0.1％ＳＤＳ含有の１５％ポリアク
リルアミド・スラブゲル中で電気泳動に付され〔ラエム
リ(Laemmli)，ネイチャー(Nature)，第２２７巻，１９
７０年，第６８０〜６８５頁，分子量が３０００〜９
４，０００の範囲の蛋白標準品を平行にはしらせた。固
定、染色および脱色後（グランドストロムら〈Grundstr
om et al〉，ジャーナル オブ バクテリオロジィ〈J.
Bacteriol.〉，第１４３巻，１９８０年，第１１２７〜
１１３４頁〕、そのゲルを、Ｅｎ3Ｈａｎｃｅ（ニュー
イングランド ニュークリアー コーポレイション，
ボストン マサチューセッツ）を用いることによってフ
ルオログラフィに付した。
【００６８】トランスポゾン変異発生法(transposon mu
tagenesis) Ｔｎ５によるトランスポゾン変異発生法を、ファージλ
ｃｌ857ｂ２２１ｒｅｘ：：Ｔｎ５を用いて、ビヨルク
およびオルセン(Bjork and Olsen)，アクタケミカ ス
カンジナビカ(Acta Chem. Scan.)，第Ｂ３３巻，１９７
９年，第５９１〜５９３頁に記載されたのと本質的に同
様にして行った。
【００６９】細胞抽出物 種々のハイブリッド プラスミドを含有するＰ６７８−
５４菌株の細胞を、適当な抗生物質の存在下、トリプチ
ック・ソイ・アガー(tryptic soy agr)上で培養した。
細菌は、一夜３７℃で培養後採集し、ＰＢＳ(pH7.2)−
ＢｒｉｊR−３５中に５６０nmにおいて1.5吸収度単位の
細胞密度で分散され、次いで遠心分離して収集した(12,
000xg,10分間)。次いで細胞ペレットを、リゾチームを
１mg/ml含有する、１％ノニデットＰ−４０(Nonidet P-
40)−１％ナトリウムデオキシクロレート−0.1％ＳＤＳ
−0.15ｍＮａＣｌ−0.01ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.2)の
４００μｌ中に分散させ、１０分間４℃（２６）で培養
した。Ｐａｐ抗血清の１／15,000稀釈の試料４００μｌ
を細胞抽出物に添加した。４℃で１６時間培養後、細胞
抽出物抗体混合物を遠心分離(12,000xg,10分間)で透明
化した。
【００７０】コンペイティブ エンザイム−リンクド
イムノソーベントアセイ(Competitiveenzyme-linked im
munosorbent assay,ELISA) 使いすてミクロ滴定用血球凝集プレート[Cooke（クー
ケ）ポリスチレン，９６Ｕウエル）を、ひとつのウエル
当り、0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)による精製Ｐ
ａｐ線毛の１μｇ／ml溶液の１００μｌに２５℃で１６
時間さらした。ウエルを、0.05％(v/v)ＢｒｉｊR−３５
（シグマ，Sigma）を含有する0.15ＭＮａＣｌで３回洗
浄して、未結合の線毛を除去した。抗−Ｐａｐ線毛ラビ
ット抗血清をＰＢＳ(pH7.2)中0.05％(v/v)ＢｒｉｊR−
３５で、５０％の最大結合となる濃度まで稀釈し(1/3,0
00稀釈) 、次いで全細菌、細胞なしの抽出物もしくはＰ
ａｐ線毛（正のコントロール）を、または線毛を添加せ
ずに（負のコントロール）ＰＢＳ−Ｂｒｉｊ ｌｙｓａ
ｔｅ中で連続稀釈物を混合した。１６時間４℃で培養し
た後１００μｌの試料を感作されたマイクロタイターウ
エルに移した。そのプレートを３時間３７℃で培養し次
いでＮａＣｌ−ＢｒｉｊRで３回洗浄した。ＰＢＳ−Ｂ
ｒｉｊR中1/1,000に稀釈され、アルカリホスファターゼ
をコンジュゲートした山羊の抗−ラビット免疫グロブリ
ンＧを全てウエルに添加し、１時間３７℃で培養した。
これらプレートをＰＢＳ−ＢｒｉｊRで３回洗浄し、1.0
Mジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)溶液として１mgのｐ
−ニトロフェニルホスフェート（シグマ社）を各ウエル
に添加して１時間３７℃で培養した。２ＮのＮａＯＨを
添加して反応をとめ、４０５nmにおける吸光度をＭＲ５
８０Ｍｉｃｒｏ ＥＬＩＳＡ ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ(D
ynatech 011-960-0000;Dynatech Laboratories,アレキ
サンドリア、バージニア)で測定した。イムノプリシピ
テイション(Immunoprecipitation)[35S]メチオニンで標
識付けされかつプラスミドをエンコードされた蛋白のイ
ムノプリシピテイションを、セフアロース(SepharoseR)
に結合された純粋なスタフイロコッカス・アウレウス蛋
白Ａをスタフィロコッカス・アウレウスの細胞の代わり
に用いたことを除いて、ダラス アンド ファルコウ(D
allas and Falkow)，ネイチャー(Nature)，第２７７
巻，１９７９年，第４０６〜４０７頁に記載されている
のと本質的に同様にして行った。
【００７１】ウエスターン ブロッティング法(Western
blotting) 精製線毛をＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル 電気泳
動に付した後に、スワンソン(Swanson et al)，インフ
ェクション アンド イムニティ(Infect.Immun.)第３
８巻，１９８２年第６６８〜６７２頁に記載してあるの
と同様にしてウエスターン ブロティング法に付した。
プラスミドｐＲＨＵ８４５を収容するＰ６７８−５４菌
株から精製された線毛に対して生成するＰａｐ抗血清の
稀釈物（エンザイム−リンクト イムーン ソーベント
アセイ タイター，1:1,000）を使用した。
【００７２】プラスミド誘導体の組立て Ｐａｐ線毛の表現に必要なすべての遺伝子とジガラクト
シドー特異性結合性を有する、ｐＲＨＵ３０の9.6Kb長
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＰＡＰ５
（第２図参照）を与えるＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで
消化されたｐＢＲ３２２〔ボリバーら(Bolivar et a
l)，ジーン(Gene)，第２巻，１９７７年，第９５〜１１
３頁〕にクローンした。分子のｐＢＲ３２２部分にＰｖ
ｕII座位を欠く誘導体を組立てるために、ベクターは、
ＰｖｕIIが消化され２０倍過剰のＢａｍＨＩリンカーに
リゲイトされた。次いでこのＤＮＡはＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩで切断され、ｐＢＲ３２２のヌクレオチド２
０６５〜４３６０を有する最大のフラグメント〔ストク
リックフェ(Sutcliffe)，ＤＮＡ：Replication and Rec
ombination，第４３巻，Cold Spring Habor Laboratory
Press，ニューヨーク，１９７８年，第７７〜９０頁〕
を0.7％アガロース ゲルから単離した。このフラグメ
ントはｐＲＨＵ３０からのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩに連
結され、エシエリヒア・コリ菌株ＨＢ１０１〔ボイヤー
アンド ローランド ダッソー(Boyerand Roulland D
ussoix)，ジャーナル オブ モリキュラー バイオロ
ジィ(J.Mol.Biol.)，第４１巻，１９６９年，第４５９
〜４７２頁〕に形質転換した〔マンデル アンド ヒガ
(Mandel and Higa)，ジャーナル オブ モリキュラー
バイオロジィ，第５３巻，１９７０年第１５９〜１６２
頁）。その単離されたクローンはｐＰＡＰ２２と命名さ
れ、そのクローンがＢａｍＨＩ−ＰｖｕIIセグメントを
欠いていることを除けばｐＰＡＰ５と同一物である。pa
p A中の単一のＰｖｕII座位にフレームシフト変異を有
する誘導体のｐＰＡＰ２３を、ｐＰＡＰ２２をＰｖｕII
で直線状にしてそれを２０倍過剰のＸｈｏＩリンカーで
リゲイトして組立てた。ＤＮＡのＸｈｏＩ／μｇの２０
単位を用いて３時間消化(digestion)した後、フラグメ
ントを、１０mM Tris-HCl ｐＨ8.0と１mM EDTAで平
衡にしたセファデックス(SephadexR)Ｇ１５０カラム
（ファーマシア ファイン ケミカルズ，アプサラ，ス
エーデン）で精製した。リゲイション(ligation)とエシ
エリヒア・コリ菌株ＨＢ１０１への形質転換の後、六つ
のクローンからのＤＮＡを単離し〔バーンボイム アン
ド ドリィ(Birnboim and Doly)，Nucleic Acids Re
s.，第７巻，１９７９年，第１５１３−１５２３頁〕分
析した。五つのクローンが前者のＰｖｕII座位に新たな
ＸｈｏＩ座位を有した。これらのうちの一つはｐＰＡＰ
２３と呼称され後の研究に使用された。
【００７３】下記の操作はプラスミドｐＰＡＰ１６（第
２図）およびこのプラスミドとＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩ
領域に変異を有するｐＰＡＰ５との両者の誘導体を組立
てるためになされた。プラスミドｐＰＡＰ１は２μｇの
ｐＢＲ３２２をＣｌａＩで直線状にすることによって組
立てられ、ブラントエンド(blunt end)は５単位のクレ
ノウフラグメントおよびｄＧＴＰとｄＣＴＰそれぞれ２
００μＭずつで作製した〔連結（リゲイション）緩衝液
中３０℃で１５分間〕。このＤＮＡは、酵素を熱不活性
化した後、ｐＰＡＰ５のゲルで精製されたＳｍａＩ1−
ＳｍＩ2フラグメント（第２図）に連結され、次いでス
モール−スケールのプラスミド製剤をスクリーニングす
ることによって、ベクターに関してｐＰＡＰ５と同配向
にフラグメントを有するプラスミドを単離した。そのク
ローンｐＰＡＰ１はわずかに先端が切れた形態で最後の
ポリペプチド（３５ｋｄ）を表現した。したがってこの
ポリペプチドの遺伝子はＳｍａＩ2座位を超えて伸び、
ｐＰＡＰ１の先端がきれた形態で存在している。この突
然変異体は、これらの酵素で切断されたｐＰＡＰ５に連
結されたＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント上に分離さ
れた。したがってこのようにして得られた誘導体のｐＰ
ＡＰ７はＳｍａＩ2座位にまでpapＤＮＡを有する。全Ｓ
ｍａＩ1−ＢａｍＨＩ領域を有するプラスミドｐＰＡＰ
９は、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＰＡＰ１に
過剰のｐＰＡＰ５のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント
を連結することによって組立てられた。ｐＰＡＰ９の挿
入部(insert)にフレームシフト変異体を作るために、こ
のプラスミドは１５０μｇ／mlのエチジウム ブロミド
の存在下ＨｉｎｃIIで部分的に消化された〔グリーンフ
ィールドら（Greenfield et al），バイオキミカ エ
バイオフィジカ アクタ（Biochim. Biophys. Acta），
第４０７巻，１９７５年，第３６５〜３７５頁）。直線
化された（linearized）プラスミドは次いで０．７％ア
ガロースゲルから単離され、過剰のＸｈｏＩリンカーに
連結された。ＸｈｏＩ消化、セファデックスＧ１５０ゲ
ルクロマトグラフィ及び連結の後、そのＤＮＡは、アン
ピシリン耐性を選択しながらエシエリヒア・コリ菌株Ｈ
Ｂ１０１に形質転換された。２３のクローンから精製さ
れたＤＮＡはＸｈｏＩおよびＳａｌＩでの消化によって
分析された。挿入部内の１５の突然変異のうち１３はＨ
ｉｎｃII2座位におけるリンカー挿入であり２はＨｉｎ
ｃII1座位であった。ＨｉｎｃII3における突然変異体は
得られなかった。これらの突然変異を有するｐＰＡＰ５
誘導体はｐＰＡＰ７と類似のしかたで組立てられた。こ
れらのプラスミドはｐＰＡＰ１５（ＨｉｎｃII1）およ
びｐＰＡＰ１４（ＨｉｎｃII2）と命名された。ｐＰＡ
Ｐ１９はプラスミドｐＰＡＰ１４のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ
ダイジェストを、再連結（re-ligatin）することにより
ｐＰＡＰ１４のＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを欠失
させて組立てられた。ｐＰＡＰ２０はｐＰＡＰ１５から
同様のしかたで組立てられた。プラスミドｐＰＡＰ２６
（ｐａｐＡ１，ｐａｐＥ１二重突然変異体）を作るため
に、ｐＰＡＰ２３（ｐａｐＡ１）の大きなＫｐｎＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントをｐＰＡＰ１０（ｐａｐＥ１）の
小さなＫｐｎＩ−ＢｍＨＩフラグメントに連結された。
【００７４】プラスミドｐＰＡＰ９はＳｍａＩ1−Ｂａ
ｍＨＩ領域内へのＴｎ５挿入を相補（complement）しな
かった。これはその挿入部の不充分な転写によるのでは
ないかと思われる。それ故にｌａｃＵＶ５プロモーター
を有するＥｃｏＲＩフラグメントはｐＳＫＳ１０６から
単離され（キヤサバダンら，Mechods Enzymol., 第１０
０巻，１９８３年，第２９３〜３０８頁）、ＥｃｏＲＩ
で直線化されたｐＰＡＰ９に過剰に連結された。次いで
正しい配向のフラグメントを有するクローンのｐＰＡＰ
１６がＰｓｔＩ消化を用いてＤＮＡ製剤をスクリーニン
グすることによって単離された。というのはそのプロモ
ーターフラグメントがこの酵素に対して不斉に位置する
座位を有するからである。同じ操作が他のｐＰＡＰ９誘
導体にも適用されてｐＰＡＰ４（ＳｍａＩ2−ＢａｍＨ
Ｉ欠失）、ｐＰＡＰ１８（ＨｉｎｃII1突然変異）およ
びｐＰＡＰ１７（ＨｉｎｃII2突然変異）が得られた。
【００７５】実施例１ 大きな線毛サブユニットの遺伝子のクローニングと同定 エシエリヒア・コリＪ９６の泌尿器病原性単離物（isol
ate)の自然発生的に得られるＬａｃ−誘導体から高分子
量の染色体ＤＮＡ〔アール・ハルら（R. Hullet al)，
インフェクション アンド イムニティ，第３３巻，１
９８１年，第９３３〜９３８頁；マンノース耐性血球凝
集反応（ＭＨＲＡ+）およびジガラクトシド−特異性結
合参照〕が標準の方法で単離された。このＤＮＡは次い
で部分的に制限酵素Ｓａｕ３Ａで消化された。この制限
フラグメントは前記の制限酵素ＢａｍＨＩで先に直線化
されたプラスミドベクターｐＨＣ７９〔コリンズ（Coll
ins)，Methods Enzymol., 第６８巻，１９７９年，第３
０９〜３２６頁〕に連結された。このＤＮＡは、ビイ
ホルム（B. Holm)，メソッズ イン エンザイモロジイ
（Methods in Enzymology)、第６８巻，１９７９年，第
１１２７−１１３４頁に記載された操作によって、生体
外でλファージ粒子中にパッケージされた。これらの粒
子はエシエリヒア・コリ菌株Ｐ６７８−５４を感染させ
るのに用いられた〔アドラーら（Adler et al)の前記文
献〕。次いでその細菌は、アンピシリン耐性の組換えプ
ラスミドを含有するコロニイの形成をもたらすアンピシ
リン含有のプレート上に流延された。
【００７６】個々のコロニイを、１％マンノースの存在
下でのヒト赤血球の凝集反応でスクリーニングし、マン
ノース耐性の血球凝集反応を起こすクローン（ｐＲＨＵ
８０７）が選別された。ｐＲＨＵ８０７のサブクローン
（ｐＲＨＵ３０およびｐＲＨＵ８４５）は、アール ハ
ルらの前記文献に記載されているのと同様にしてＭＲＨ
Ａ+を残して組立てられた。またエシエリヒア・コリ菌
株ＨＢ１０１中にこれらサブクローンの両者が存在する
と線毛を形成させる。ｐＲＨ８４５含有のエシエリヒア
・コリ菌株ＨＢ１０１によって起こる血球凝集反応は、
マンノースが存在していても存在していなくても溶解性
ジガラクトシドの存在によって完全に阻害された。した
がってこの場合、この菌株で表現されるＭＨＲＡ+表現
型はジガラクトシド特異性の結合と同一であることを示
している。
【００７７】Ｐａｐ（腎盂炎に関連のある線毛）線毛
（ｐａｐＡ）を形成する主要なポリペプチドの構成遺伝
子は、サブクローンからウエスターン・ブロッティング
法やイムノプリシピティション法によって同定され、第
１図に示すごとく約２．２Ｋｂで地図に示されている。
ｐａｐＡ遺伝子の位置は大きなＰａｐ線毛サブユニット
のＮ−終末配列と比べて〔オーハンリィら（O'Hanley e
t al），ジャーナル オブ エクスペリメンタル メデ
ィスン（J. Exp. Med.），第１５８巻，１９８３年１１
月，第１７１３〜１７１９頁参照）、そのＤＮＡ配列か
ら推論される遺伝子産物のアミノ酸配列間の同一性によ
って確認された〔エム バガら（M. Bagaet al)，ジャ
ーナル オブ バクテリオロジィ（J. Bacteriol.)，第
１５７巻，１９８４年１月，第３３０〜３３３頁〕。
【００７８】実施例２ 線毛ＤＮＡ配列の同定 Ｐａｐ線毛の形成およびジガラクトシド−特異性の凝集
反応に必要な遺伝子を特徴づけるために、ｐＲＨＵ８４
５のサブクローンおよびトランスポゾンＴｎ５挿入突然
変異体をノルマークら（Normark et al)，インフェクシ
ョン アンドイムニティ，第４１巻，１９８３年９月，
第９４２〜９４９頁に記載してあるのと同様にして組立
て分析した。Ｔｎ５挿入突然変異体およびサブクローン
をさらに分析することによって、左側のＥｃｏＲＩ座位
から約１．０Ｋｂと約９．４Ｋｂの間の位置にあるＤＮ
Ａだけが（第１図参照）Ｐａｐ線毛形成とジガラクトシ
ド−特異性結合の遺伝子情報を指定するのに必要である
ことが示された。そのＥｃｏＲＩ座位から７．９Ｋｂと
９．２Ｋｂとの間の挿入突然変異体は、Ｐａｐ線毛の形
成を阻害することなくジガラクトシド−特異性の結合性
を消失させた。
【００７９】実施例３ 線毛アドヒシンＤＮＡの遺伝子的特徴づけ Ｐａｐ線毛形成とジガラクトシド特異性結合に必要であ
るとして実施例２で同定された領域は、原料と方法の項
に記載されているのと同様にして、プラスミドｐＰＡＰ
５（第２図参照）およびｐＰＡＰ２２を与えるｐＢＲ３
２２に、ｐＲＨＵ３０の９．６Ｋｂ長ＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとして再クローンされた。ｐＰＡＰ
２２は、ベクターＤＮＡ中の欠失によって、そのｐａｐ
Ａ構成遺伝子中に唯一のＰｖｕII座位を有するけれど
も、ｐＰＡＰ５とｐＰＡＰ２２の両者は全ＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨII挿入部を有している。フレームシフト突然変
異部ｐａｐＡ１を有するｐＰＡＰ２３は、ｐＰＡＰ２２
中の唯一のＰｖｕII座位中に８ｂｐ長のＸｈｏＩリンカ
ーを導入して組立てられた（第３図参照）。エシエリヒ
ア・コリ菌株ＨＢ１０１においてこのフレームシフト突
然変異体は、野性型とことなり精製されたＰａｐ線毛に
対して生成する抗血清によって凝集されなかった。
【００８０】ｐＰＡＰ２３を収容するエシエリヒア・コ
リ菌株ＨＢ１０１は、ジガラクトシドで被覆されたラテ
ックス・ビーズのみならずヒトのＰ1−赤血球を凝集さ
せる。したがってｐＰＡＰ２３／ＨＢ１０１は、野性型
ｐａｐオペロンをｐＰＡＰ２２もしくはｐＰＡＰ５上に
有するＨＢ１０１と同じ受容体結合特異性を表現すると
考えられる。かくして線毛遺伝子ｐａｐＡの不活性化
は、用いられる分析法におけるジガラクトシド−特異性
凝集反応の度合を低下させなかった。
【００８１】ｐａｐＤＮＡの末端部へのＴｎ５を挿入す
ると血球凝集反応を消失させるが、Ｐａｐ線毛は形成さ
れる。かくして凝集反応を伝達する遺伝子はこの領域に
存在するであろうと推量される。ここにエンコードされ
たポリペプチドの重要性をさらに研究するために、第２
図に示すように、ＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩフラグメント
がｐＢＲ３２２中にサブクローンされた（原料と方法の
項参照）。得られたプラスミドはＳｍａＩ1−ＢａｍＨ
Ｉ領域へのＴｎ５挿入を相補しなかったので、クローン
されたフラグメントは、ｐＳＫＳ１０６由来のＥｃｏＲ
Ｉフラグメント（原料と方法の項参照）としてそのプラ
スミドに挿入されたｌａｃＵＶ５プロモーター（フラグ
メント上の遺伝子を確実に十分転写するために）の転写
コントロール下に置かれた。この構成物ｐＰＡＰ１６
（第２図参照）は、ＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩフラグメン
ト中の挿入位置に四つの血球凝集反応をしないＴｎ５突
然変異体を相補した。これら突然変異体の局在状況を第
３図に示す。
【００８２】ＳｍａＩ1−ＢｍＨＩフラグメント上の遺
伝子をさらに明確にするためにｐＰＡＰ１６挿入部の詳
細な制限地図を、関連のＴｎ５挿入部の正確な配置位置
を付して作成した（第３図参照）。この領域に傷を有す
るｐＰＡＰ５の三つのフレームシフト変異誘導体（第３
図および原料と方法の項参照）も作製された。二つの突
然変異プラスミドのｐＰＡＰ４とｐＰＡＰ１５はＨｉｎ
ｃII2とＨｉｎｃII1座位それぞれにＸｈｏＩリンカーを
有する。第三の突然変異体ｐＰＡＰ７については、Ｓｍ
ａＩ2からＢａｍＨＩにかけてのｐａｐＤＮＡ（第３図
参照）は削除された。
【００８３】ｐＰＡＰ５から表現されるポリペプチド類
とその三つの変異誘導体類は、エシエリヒア・コリのミ
ニ細胞中、〔35Ｓ〕メチオニンで標識され、表現された
ポリペプチドはＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル法で
分析された。ｐＰＡＰ５と比較したところ、プラスミド
ｐＰＡＰ７は３５ｋｄのプラスミドを表現しなかった。
その代わりに３４ｋｄの新規のポリペプチドが現れた。
ｐＰＡＰ７中の突然変異によってＳｍａＩ2座位におけ
るｐａｐ領域が切りとられたので、ＳｍａＩ2とＢａｍ
ＨＩ座位の間に３５ｋｄのポリペプチドの遺伝情報を指
定する遺伝子ｐａｐＧの３’末端が存在するであろう
（第３図参照）。これはｐａｐ領域の最後の遺伝子であ
る。
【００８４】Ｔｎ５挿入の００２と０２１を行った際の
ｐＰＡＰ１４におけるＨｉｎｃII2変異は、自らをエン
コードする遺伝子ｐａｐＦを明確に示している（第３図
参照）ところの１５ｋｄポリペプチドの表現をなくして
しまった。他のポリペプチド類はいずれもｐＰＡＰ４に
おけるＨｉｎｃII2変異（ｐａｐＦ）によって影響され
なかった。ＨｉｎｃII1リンカー挿入突然変異体のｐＰ
ＡＰ１５のミニ細胞製剤は１６．５ｋｄポリペプチドを
産生しない。このポリペプチドの遺伝子はｐａｐＥと呼
称され、そのフレームシフト突然変異はｐａｐＥ１と呼
称される。ｐａｐＧ遺伝子産物のＳｍａＩ2−ＢａｍＨ
Ｉの欠失による切りとりはこの遺伝子が第３図において
左から右へ転写されることを示す。ｐａｐＧ上へのＴｎ
５挿入によってｐａｐＥとｐａｐＦにもたらされる極性
効果（polarity effect)は三つの遺伝子の全部の転写は
この方向であることを示す。
【００８５】ｐａｐＦとｐａｐＧ遺伝子に関するＴｎ５
変異の位置を確認するため、Ｔｎ５変異の００２、０２
１、０２６および０４２（第３図参照）が、変異された
ＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩ領域で相補された。この目的の
ために、ｌａｃＵＶ５プロモーターのコントロール下に
あるＳｍａＩ1−ＢａｍＨＩ領域を有するｐＰＡＰ１６
のｐａｐＥ１、ｐａｐＦ１およびｐａｐＧ１誘導体を原
料と方法の項で記載したのと同様にして作製した。次い
でこれらをｐＲＨＵ８４５のＴｎ５誘導体を有するエシ
エリヒア・コリ菌株ＨＢ１０１に形質転換し（ノルマー
クらの前記文献）、Ｐ1およびｐ−赤血球を用いるグロ
ボシド−特異性血球凝集反応について検査した。ｐａｐ
Ｅ１誘導体は、親プラスミドのｐＰＡＰ１６が行ったの
と同様にすべてのＴｎ５変異を相補した。ｐａｐＦ１プ
ラスミドはＴｎ５変異の０２６と０４２を相補し、一方
ｐａｐＧ１を有するプラスミドは００２と０２１の変異
を相補した。これは００２と０２１のＴｎ５挿入をｐａ
ｐＦ中の突然変異と定義しており、そしてＴｎ５挿入の
０２６と０４２がｐａｐＧ遺伝子中に存在するというこ
とを示している。またｐａｐＦとｐａｐＧは別々の独立
したトランス−コンプリメンタブルな（trans-compleme
ntable）遺伝子であることを明確に示している。この領
域の遺伝子地図（第３図に示す）はこれらのデータに基
づいて作成された。
【００８６】上記のように、ｐａｐＦとｐａｐＧへＴｎ
５を挿入すると、線毛は形成されるけれども血球凝集性
を全くなくしてしまう。ｐａｐＥ、ｐａｐＦおよびｐａ
ｐＧの遺伝子産物の血球凝集性についての固有の重要性
を評価するためのものとして、血球凝集試験における、
ｐＰＡＰ５の非極性リンカー挿入変異体の誘導体があ
る。ｐａｐＦとｐａｐＧの両者の遺伝子産物は凝集に必
要であることを示しているがｐａｐＦ１誘導体とｐａｐ
Ｇ１誘導体はいずれもＰ1−赤血球の凝集を示さないこ
とが見出された。ｐａｐＥ１変異体はそれ自体血球凝集
性力価に影響しなかったが、驚くべきことにはｐａｐＡ
１，ｐａｐＥ１二重変異体，ｐＰＡＰ２６は、エシエリ
ヒア・コリ菌株ＨＢ１０１に形質転換してもＰ1−赤血
球を凝集させなかった。
【００８７】エシエリヒア・コリ菌株ＨＢ１０１中のｐ
ＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ２２の各種変異体誘導体の線
毛抗原形成性およびジガラクトシド−特異性結合性を第
１表に示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】ｐＳＮプラスミド類はｐＡＣＹＣ１８４誘
導体類（ｐＲＨＵ８４５由来のＥｃｏＲＩフラグメント
を有し、各プラスミドは、第１図に示すように異なるＴ
ｎ５挿入部を有する）であり、一方ｐＰＡＰプラスミド
類はｐＢＲ３２２の誘導体である。線毛抗原は、Ｐａｐ
線毛に対して生成する抗血清での細胞分散物のスライド
凝集性によって測定した。
【００９０】ｐＰＡＰ２３中の変異ｐａｐＡ１は、ジガ
ラクトシド−特異性結合性に影響を与えることなく大き
なＰａｐ線毛サブユニット（ｐａｐＡ遺伝子産物）の形
成を全くなくしてしまったことはこの表から明らかであ
る。逆にｐＰＡＰ１４中の変異ｐａｐＦ１およびｐＰＡ
Ｐ７中の変異ｐａｐＧ１はＰａｐ線毛の形成を阻害する
ことなしにジガラクトシド−特異性結合性をなくしてし
まった。
【００９１】遺伝子のｐａｐＣとｐａｐＤの変異は線毛
形成とジガラクトシド−特異性結合の両者を消失させ
た。ｐａｐＦとｐａｐＧにおける変異だけが、Ｐａｐ線
毛の形成を阻害することなくジガラクトシド−特異性結
合性の消失をもたらした。唯一の例外は前記のように凝
集に対して陰性の二重変異体のｐａｐＡ１−ｐａｐＥ１
である。ｐａｐＡもしくはｐａｐＥにおける変異だけが
接合性である。この効果は、ｐａｐＡもしくはｐａｐＥ
ポリペプチド（多分）細胞壁ヘアドヒシンを固定するの
に必要であるという事実に起因していると考えられる。
それ故にｐａｐＦおよび／またはｐａｐＧ遺伝子がジガ
ラクトシド−特異性接合をエンコードすると結論するこ
とができる。
【００９２】実施例４ 線毛アドヒシンＤＮＡのＤＮＡ配列の樹立 ｐＰＡＰ９（第２図に示すように、原料と方法の項に記
載したのと同様にして組立られた）の１００μｇをＥｃ
ｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ＳｍａＬ1−ＢａｍＨＩ
領域を有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（第
３図参照）を単離するため、分離用アガロースゲル電気
泳動法（preparative agarose gel electrophoresis)に
付した。
【００９３】このフラグメントの一部を、エンドヌクレ
アーゼのＨａｅIII、ＲｓａＩ、ＡｌｕＩ、ＨｐａII、
Ｓａｕ３Ａ、ＴａｑＩ、ＨｉｎｃIIおよびＢｇｌIIで別
々にもしくは組合わせて消化した。得られたフラグメン
トは、直接または分離用アガロースゲル電気泳動法に付
した後にクローンされ、フラグメントの分離はファージ
Ｍ１３ベクター中になされた〔Ｍ１３ｍｐ８およびＭ１
３ｍｐ９；メシングら（Messing et al)，Nucleic Acid
s Res., 第９巻，１９８１年，第３０９〜３２１頁〕。
その挿入物は、サングラーら（Sangler et al)，プロシ
ーディング オブ ナショナル アカデミイ オブ サ
イエンス オブ ユナイテッド ステイツ オブ アメ
リカ，第７４巻，１９７７年，第５４６３〜５４６７頁
（ジデオキシ配列法）の方法を用いて配列され、Ｓｍａ
Ｉ1−ＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列の明確な重
複が両ストランドについて読みとることができた。
【００９４】実施例５ 線毛アドヒシンについてのアミノ酸の配列法 可能性のある読とりフレーム中に、遺伝子ｐａｐＥ、ｐ
ａｐＦおよびｐａｐＧが、リンカーおよびトランスポゾ
ンＴｎ５の挿入（第３図挿入）によって達成されたこれ
ら遺伝子の知られている位置およびこれらそれぞれの遺
伝子の産物の公知の大きさ１６．５ｋｄ、１５ｋｄおよ
び３５ｋｄからそれぞれ同定された。これらの遺伝子の
Ｎ−ターミナル末端が同定された。そのアミノ酸配列
は、エシエリヒア・コリについて達成された遺伝暗号を
用いてＤＮＡ配列から誘導された。それらの遺伝子産物
はすべて、単一のペプチドを含有する前駆体として作ら
れるのでその遺伝子の５−末端は、シグナルペプチド状
配列が続くメチオニンであると考えられる〔ジイ フオ
ン ヘイネ（G Von Heijne），イオロピアン ジャーナ
ル オブ バイオケミストリイ，第１３３巻，１９８３
年，第１７〜２１頁〕。
【００９５】実施例６ 他の泌尿器病原性エシエリヒア・コリＤＮＡとの相同性 ＳｍａｌＩ1−ＢａｍＨＩ領域からいくつかのフラグメ
ントが単離され、ニック トランスレーション（nick t
ranslation）によって32Ｐで標識をつけた。そのフラグ
メントは小さなセグメントの全領域をカバーするために
選択された。次にこれらのフラグメントはプラスミドｐ
ＤＣ５〔クレッグ アンド ピアース（Clegg and Pier
ce），インフェクション アンド イムニテイ，第４２
巻，１９８３年，第９００〜９０６頁〕およびｐＰＩＬ
１００−３５〔バン デイら（Van Die et al)，FEMS M
icrobiol. Letters,第１９巻，１９８３年，第７７〜８
２頁〕のダイジェスト（digest）のサザンブロット中の
プローブとして、緊縮条件下で用いられた。ｐａｐＧ遺
伝子領域からは全く信号は得られなかったが、強い雑種
形成信号が、ｐａｐＥおよびｐａｐＦ遺伝子からのプロ
ーブによって得られた。緊縮条件下での強い雑種形成
は、ＥｃｏＲＩ座位から約３．２〜３．４ｋｂのところ
に位置するＨｐａＩ座位の間にあるｐａｐＣ遺伝子のプ
ローブからも得られた（第１図参照）。
【００９６】ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−３５の詳細な
制限地図が作成されたが、ｐａｐＣとｐａｐＤの領域に
ついてのｐＰＡＰ５の制限地図とほぼ同一であることが
見出された。ｐａｐＥとｐａｐＦ遺伝子については高度
の類似性が認められたがより小さいものであった。それ
故に、エシエリヒア・コリの他の泌尿器病原性菌株中の
ＭＲＨＡ+をエンコードするＤＮＡはｐＰＡＰ５（エシ
エリヒア・コリＪ９６由来）にエンコードされたＤＮＡ
に極めて類似しており、Ｐａｐ系において得られる結果
はほとんどの腎盂炎病原性菌株に不変することができる
と結論できる。またｐＰＩＬ１１０−３５については、
そのＤＮＡから表現されるＭＲＨＡがジガラクトシド−
特異性であることが証明された。同様の結果が、他の研
究者のみならずこの発明の発明者らによる臨床単離物か
らの染色体ＤＮＡについて得られた〔ロウら（Low et a
l)，インフェクション アンド イムニテイ，第４３
巻，１９８４年，第３５３〜３５８頁〕。
【００９７】実施例７ ｐａｐＧ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子との融合体の形成 プラスミドｐＰＡＰ９がＢｇｌIIとＳａｌＩ（ｐＰＡＰ
９中のＢａｍＨＩ座位の右側約３７５ｂｐの位置にあ
る）で消化された。得られたフラグメントは予めＢａｍ
ＨＩとＳａｌＩで消化されたプラスミドｐＭＣ８７４に
連結された（キャサバダンら，ジャーナル オブ バク
テリオロジイ，第１４３巻，１９８０年，第９７１〜９
８０頁）。ｐＭＣ１０６１へ形質転換し（キャサバダン
らの前記文献）アンピシリンを１０μｇ／ml含有のプレ
ートにプレートした後組換え体を分析した。そのＢｇｌ
II−ＳａｌＩフラグメントがｐＭＣ８７４からのｌａｃ
−カセット（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメント）によ
って置換されたｐＰＡＰ９で構成されたプラスミドｐＨ
ＭＧ５１が単離され、原料と方法の項に記載したのと同
じミニ細胞分析法によって、ｐａｐＧ−ｌａｃＺ融合ペ
プチドの遺伝情報を指定することが示された。またこの
結果はｐａｐＧ遺伝子の公知の配列およびｐＭＣ８７４
中に存在するｌａｃＺ遺伝子の配列からも予想された。
【００９８】指示事項 Ａ．他の融合遺伝子類の製造 実施例７に記載方法に代わる方法で、ｐａｐＦ遺伝子か
らなるＮ−ターミナルＤＮＡフラグメントがｐＰＡＰ９
をＢｇｌIIで直線化することによって得られる。次いで
このＤＮＡは、エキソヌクレアーゼＥｘｏIIIとともに
長時間培養され、次いでヌクレアーゼＳ１で処理される
とＢｇｌII座位からの欠失が増加した。ＨｉｎｄIIIリ
ンカーが連結される。次にこのＤＮＡはＳｍａＩおよび
ＨｉｎｄIIIで再消化され（redigest）、分離用アガロ
ースゲル電気泳動法に付される。１，４００ｂｐから
１，０００ｂｐにかけて並ぶフラグメント（第３図参
照）が分離され、下記のようにしてＳｍａＩとＨｉｎｄ
IIIで予め消化された適当な融合ベクターに連結され
る。
【００９９】ｐａｐＧ遺伝子を有するフラグメントは、
下記の方法で作られるが、ＢｇｌIIIの代わりにＢａｍ
ＨＩで消化することによって行われる。ゲル上の２，４
００ｂｐから１，５００ｂｐにかけて並ぶフラグメント
（第３図参照）が選択される。ｐａｐＥ遺伝子を有する
フラグメントは、８００〜４００ｂｐにかけて並ぶフラ
グメント（第３図参照）を選択して同様のしかたで作ら
れる。
【０１００】ｐａｐＦ遺伝子のＮ−ターミナル部をエン
コードするＤＮＡフラグメントは、ｌａｃＺ遺伝子との
遺伝子融合体を作りだすために、ｐＳＫＳ１０４、ｐＳ
ＫＳ１０５もしくはｐＳＫＳ１０６のごとき融合ベクタ
ー中にクローンされる（キャサダバンら，メソッズ イ
ン エンザイモロジイ，第１００巻、１９８３年，第２
９３〜３０８頁）。これらの構造体中の融合された遺伝
子はｌａｃ ＵＶ５プロモーターによって転写される。
【０１０１】この構造体は、アンピシリン耐性をセレク
トしながら、Ｌａｃｌq遺伝子を有する菌株、例えばエ
シエリヒア・コリ菌株ＪＭ１０３（メシングら，Nuclei
c Acids Res., 第９巻，１９８１年，第３０９〜３２１
頁）に形質転換される。この菌株は次いでＬＢ−ブロス
のごとき適切な培地〔ジイ・ベルタニG. Bertani），ジ
ャーナル オブ バクテリオロジイ，第６２巻，１９５
１年，第２９３〜３０３頁〕中で、光学密度がＯＤ600
＝０．４になるまで培養される。次いで融合遺伝子の転
写はＩＰＴＧを添加することによって誘導される〔ジェ
イ・ミラー（J.Miller)，Experiments In Molecular Ge
netics,コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，
１９７２年〕。培養は融合遺伝子の産物の最大表現が得
られるまで続けられる。次いで細胞が収穫され、融合遺
伝子産物はβ−ガラクトシダーゼ活性の検査法（ジェイ
・ミラーの前記文献参照）を用いる標準法で精製され
る。次いでこの精製融合産物は、例えばげっし動物類、
さる類もしくは豚についてのワクチン試験に直接使用で
きる。
【０１０２】Ｂ．ワクチンの製造 ワクチンとして用いられる、全ｐａｐＥ、ｐａｐＦもし
くはｐａｐＧ遺伝子産物またはその適当なフラグメント
は下記のいずれかの方法で作製される。 １．ｌａｃＺ遺伝子と、ｐａｐＥ、ｐａｐＦもしくはｐ
ａｐＧ遺伝子の精製 融合蛋白は適切なプロテアーゼ例えばトリプシンもしく
はキモトリプシン、またはシアノゲン ブロミドやヒド
ロキシルアミンごとき化学試薬で消化される。得られた
ポリペプチド混合物から、所望のペプチドが、標準の技
術、例えばイオン交換クロマトグラフィもしくはＨＰＬ
Ｃ逆相クロマトグラフィによって得られる。
【０１０３】２．一方その融合蛋白に対する抗体がこれ
らをラビットに注射することによって生成される。得ら
れた抗体は、融合されていない純粋のｐａｐＥ、ｐａｐ
ＦもしくはｐａｐＧ遺伝子の産物を、これらの遺伝子を
有するプラスミドを含有するｌａｃＺ-細菌から精製す
るのに用いることができる。このプラスミドは、ｐＰＡ
Ｐ５もしくはｐＰＡＰ１６のごときｐＢＲ３２２誘導
体、またはＰＢＥＵ２８のごときランアウエイプラスミ
ド誘導体〔ユーリンら（Uhlin et al)，Gene, 第２２
巻，１９８３年，第２５５〜２６５頁〕であってもよ
い。
【０１０４】この精製は、イムノアフィニテイ ゲル
クロマトグラフィによって行われるか、その抗体は精製
方法を開発する際にポリペプチド類を検出するのに用い
られるＥＬＩＳＡ分析法を開発するのに用いられる（原
料および方法の項参照）。これらの精製ポリペプチド類
のフラグメントは、所望により、上記１に記載のプロテ
アーゼなどで分割することによって得られる。
【０１０５】３．５〜３０のアミノ酸で構成されるフラ
グメント、またはより大量のｐａｐＥ、ｐａｐＦおよび
ｐａｐＧ遺伝子産物は固相ペプチド合成法（スチュワー
ト アンド ヤング，Solid Phase Peptide Synthesis,
フリーマン アンド カンパニイ，サンフランシスコ，
米国，１９６９年）で合成される。次いでそれらは、そ
れ自体か、またはポリ−Ｌ−リシンもしくはポリ−Ｄ，
Ｌ−アラニンのごとき生理的に受容な担体の担体分子
に、助剤とともにもしくは助剤なしで、アルノン，J. I
mmunological Method,第６１巻，１９８３年，第２６１
〜２７３頁に記載されているのと実質的に同じようにし
てカップリングされて、予防摂取に用いることができ
る。
【０１０６】Ｃ．スードモナス系 線毛形成と接合がスードモナス種中にリンクされている
と仮定してスードモナスの接合性菌株からの染色体ＤＮ
Ａが、ｐＢＲ３２２誘導体、スードモナス／エシエリヒ
ア・コリのシャトルベクター、プラスミドベクターもし
くはファージベクターにクローンされ、ついでエシエリ
ヒア・コリに形質転換／トランスフェクトされるフラグ
メントを作製するために制限エンドヌクレアーゼで消化
される。そのハイブリッドベクターを収容する細菌は、
精製スードモナス線毛に対して生成する抗体を用いて大
きなスードモナス線毛サブユニットの産生のためにスク
リーニングされる〔このことはベクターとしてｐＢＲ３
２２を用いるエヌ・ゴノルホエについてなされている。
メイヤーら、（Meyer et al)，Cell, 第３０巻，１９８
２年，第４５〜５２頁を参照〕。
【０１０７】次いでこのクローンは、直接には、または
線毛遺伝子含有のより大きなＤＮＡフラグメントを得る
ためのプローグとして用いられる。このフラグメント
は、次いでスードモナス／エシエリヒア・コリのシャト
ルベクターにクローンされ、ノン−ピリエイトされた
（non-piliated）非接合性のスードモナス菌株に転移さ
れ次いで接合性と線毛形成性が検査される。次いでこの
フラグメントの突然変異誘発は、代わりに表現型の検査
がスードモナスについて行われることを除けば、泌尿器
病原性エシエリヒア・コリについて実施例２に記載した
のと本質的に同じ方法で行われる。
【０１０８】一方、その染色体ＤＮＡが、スードモナス
ベクターもしくはスードモナス／エシエリヒア・コリ
シャトルベクターに直接クローンされ、非接合性のスー
ドモナス菌株に形質転換されるならば、そのクローンは
接合性について直接スクリーニングすることができる。
他の検査法例えば溶解性受容体の結合性を用いることが
できる。
【０１０９】エシエリヒア・コリ中での融合蛋白生産と
蛋白生産は、おこりうる転写信号と翻訳開始信号を人工
的に変えなければならないが上記の方法と類似のしかた
で行われる。一方、蛋白生産は、例えば、バクダサリア
ンら（Bagdasarian et al)，Gene, 第２６巻，１９８３
年，第２７３〜２８２頁に記載の例えば広域宿主範囲の
Ｔａｃプロモーターベクターを用い、スードモナスの相
同システム中で行うことができる。ＤＮＡの配列とアミ
ノ酸分析は上記実施例４と５に記載したのと本質的に同
じに行われ、そしてその塩基配列分析法に基づいて合成
ペプチド類を上記記載のようにして生産することができ
る。
【０１１０】スードモナスについて要約した方法のみな
らず実施例１〜５に記載の方法と類似の方法は、ネイセ
リア種などのごとき他の接合性細菌から得られると考え
られるアドヒシン ポリペプチド類を同定および生産す
るのに用いることができる。原則として、すべての研究
は蛋白化学を用いて行うことができる。アドヒシンポリ
ペプチド類は、例えばジガラクトシドといった受容体、
アフィニテイ クロマトグラフィまたは他のいずれの適
切な方法（抗体アフィニティ クロマトグラフィのごと
き）によって濃度をたかめ、精製することができる。蛋
白の純度は、原料と方法の項に記載したＳＤＳ−ポリア
クリルアミド ゲル電気泳動法によって検査できる。ア
ドヒシン類が製剤の大きなフラクションを構成するとい
うことを確認するために、放射能標識のされた受容体を
用いる平衡透析実験法を用いて、存在する蛋白の１分子
当りの結合座位を計算してもよい。これは蛋白１分子当
り０．１〜１０リガンドであると考えられる。
【０１１１】実施例８ この実施例に用いられた原料と方法 細菌菌株、プラスミドおよび培養条件 細菌菌株はすべて、第２表に記載の臨床での単離物を除
いて、エシエリヒア・コリＫ１２の誘導体である。蛋白
表現分析用にＰ６７８−５４（１）のｒｅｃＡ誘導体の
ＡＡ１０が用いられた。Ｍ１３のクローニングとファー
ジの増殖はＪＭ１０３中で行われた。ＨＢ１０１は他の
すべての実験における宿主であった。
【０１１２】プラスミドｐＰＡＰ５（前記の一般原料と
方法の項参照）はエシエリヒア・コリＪ９６から単離さ
れた。９．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ染色体フラ
グメントを有するｐＢＲ３２２の誘導体である。このク
ローンは血清学的にＦ１２に関連するＦ“Ｃ１３４．
３”線毛抗原を表現する。ｐａｐクラスターの遺伝子地
図を第１図に示す。プラスミドｐＤＣ５はエシエリヒア
・コリＩＡ２の８．０ｋｂＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メントを有するｐＡＣＹＣ１８４誘導体であり、一方ｐ
ＰＩＬ１１０−３５は、Ｆ７2線毛抗原形成の原因であ
るエシエリヒア・コリＡＤ１１０から分離された１６ｋ
ｂのＥｃｏＲＩフラグメントを有するｐＡＣＹＣ１８４
の誘導体である。
【０１１３】下記濃度の抗生物質が選別に用いられた。
すなわち１００μｇ／mlのカルベニシリン、１５μｇ／
mlのテトラサイクリン、２０μｇ／mlのカナマイシンお
よび２０μｇ／mlのクロラムフェニコールである。細菌
は３７℃でルリア・ブロスもしくはルリア寒天上で培養
された。
【０１１４】一般的な処理法 ＣａＣｌ2処理が形質転換に用いられた。プラスミドＤ
ＮＡは、バーンボイムエイチ シイおよびジェイ ドリ
イ（Birnboim H. C. and J. Doly）〔“A rapid alkali
ne extraction procedure for screening recombinant
plasmid ＤＮＡ”，Nuclear Acids Res., 第７巻，１９
７９年，第１５１３−１５２３頁〕、およびグロスベル
ドら（Hrosveld et al)(“Isolation of β−globin-re
latedgenes from a human cosmid library”，Gene，第
１３巻，１９８１年，第２２７〜２３７頁）のアルカリ
ン クリアー ライゼイト処理法（alkaline clear lys
ate procedure)につづいて二つの連続したエチジウムブ
ロミド／ＣｓＣｌ平衡遠心分離法を行う、改良法で単離
された。制限エンドヌクレアーゼ類は製造メーカーの推
せんする条件下で使用した〔ニューイングランド バイ
オラブズ，米国，ベーリンガー マンハイスジイエムビ
イエイチまたはベセスダ リサーチ ラボラトリイズ
ジイエムビイエイチ（Bethesda Research Laboratories
GmbH)〕。消化されたＤＮＡは０．５％〜１．５％（ｗ
ｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル上で分離された。Ｈｉｎｄ
IIIおよびＨａｅIIIでそれぞれ分割されたファージλＤ
ＮＡとファージφＸ１７４ＤＮＡ（ニューイングランド
バイオラブズ）は分子量標準として用いられた。ＤＮ
Ａフラグメントは、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリル
アミドゲルからエレクトロエリューション（electroelu
tion）によって純粋な形態で得られた。
【０１１５】ブロッティングおよび雑種形成手順 〔32Ｐ〕で標識されたＤＮＡプローブを、ニックトラン
スレーションによるかまたはＭ１３雑種形成プローブプ
ライマー（ニューイングランド バイオラブス）での、
クローンされたＭ１３一重鎖ＤＮＡ鋳型（coloned Ｍ13
single stranded ＤＮＡ templates)のプライミング
ＤＮＡ合成法（priming ＤＮＡ synthesis）によって製
造される。〔α32Ｐ〕ｄＧＴＰ〔アマーシャム（Amersh
am），イングランド〕は約１×１０8ｃｐｍ／μｇの比
活性にまで組入れられた。プラスミドＤＮＡは、アガロ
ースゲル上でサイズフラクションされ、サザン，イーエ
ム（Southern, E. M.)，“Detection of specific sequ
ences among ＤＮＡ fragments separated by gelelect
rophoresis”，ジャーナル オブ モリキュラーバイオ
ロジイ，第９８巻，１９７５年，第５０３〜５１７頁に
したがって、ニトロセルロースフィルター〔シュライヘ
ル アンド シェル（Schleicher and Schiill），ＢＡ
８５〕に移された。そのブロットされたフィルターは、
４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５
ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０である）、１０×デ
ンハルト溶液（Denhardt's solution)、０．１％ＳＤ
Ｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび音波処理された子牛胸線Ｄ
ＮＡ（５０μｇ／ml）からなる雑種形成溶液中２時間６
８℃で予備雑種形成がなされた（prehybridized)。次い
で新しい雑種形成溶液中の放射能標識されたプローブ
（１×１０6cpm／ml）がフィルターに添加されプラスチ
ック バッグ中１８時間培養された。緊縮条件下で雑種
形成が６８℃で行われ、洗浄は同温度で２×ＳＳＣ；
０．１％ＳＤＳから０．１×ＳＳＤ；０．１％ＳＤＳへ
かけての塩濃度で行われた。非緊縮雑種形成は、雑種形
成温度が５５℃で洗浄が２×ＳＳＣでなされることを除
いて同じ条件下で行われた。フィルターを一夜増感板つ
きのデュポン クロネックス４ エックス線フィルムに
露光した。
【０１１６】ミニ細胞中の蛋白表現の分析 プラスミドｐＰＡＰ５，ｐＰＳＰ５０２，ｐＤＣ５およ
びｐＰＩＬ１０−３５を、ミニ細胞産生の菌株ＡＡ１０
に形質転換した。ミニ細胞の製造と、〔35Ｓ〕−メチオ
ニン（アマーシャム）での標識付けは、トンプソン ア
ール アンドエム アヒトマン（Thompson, R. and M.
Achtman), “The control region ofthe F sex factor
ＤＮＡ transfer cistrons : restriction mapping and
ＤＮＡ cloning”，モリキュラー アンド ジェネラ
ル ジェネティックス（Mol. Gen. Genet.），第１６５
巻，１９７８年，第２９５〜３０４頁に記載されている
のと同じである。放射性の試料はリニアーの１５％（ｗ
ｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で分
離された。次いでそのゲルは固着され、染色され、脱色
されエンハンスされ〔エンハンス（Enhance)，New Engl
and Nuclear GmbH〕、次いでエックス線フィルムに１〜
６日間露光した。分子量標準はファーマシヤ ファイン
ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals），スエーデ
ンからのものであった。
【０１１７】ヌクレオチド配列の測定 関連のあるフラグメントはファージＭ１３クローニング
ベクターのＭ１３ｍｐ８とＭ１３ｍｐ９にクローンさ
れ、次いでエシエリヒア・コリ菌株ＪＭ１０３に形質転
換された。一重鎖鋳型ＤＮＡは、メシングら（Messing
et al)，“A system for shotgun ＤＮＡ sequencin
g”，Nucleic Acid Res.,第９巻，１９８１年，第３０
９〜３２１頁に記載のようにしてファージから単離され
た。そのＤＮＡ配列は、サンガーら（Sanger et al），
“ＤＮＡ sequencing with chain-terminating inhibit
ors”，プロシーデング オブ ナショナル アカデミ
イ オブサイエンス オブ ＵＳＡ，第７４巻，１９７
７年，第５４６３〜５４６７頁に記載の、Ｍ１３ ペン
タデカマー シーケンシング プライマー（Ｍ１３ pe
ntadecamer sequencing primer)(ニューイングランド
バイオラブズ）を利用するジデオキシ チェイン−ター
ミネイション法（dideoxy chain-termination method）
によって測定された。
【０１１８】受容体結合性検査法 第１表と第２表に挙げたプラスミド類によってエンコー
ドされる遺伝子産物の結合性は、上記の一般原料と方法
の項に記載された、グロボシド受容体含有のＰ 1−赤血
球とグロボシドを欠くｐ−赤血球とを用いるスライド凝
集法によって測定された。
【０１１９】線毛抗原検査法 精製Ｐａｐ線毛（３７）に対して生成する抗血清を利用
するスライド凝集法は上記の一般原料と方法の項に記載
したのと同様にして行われた。抗血清はＰＢＳ（ｐＨ
７．５）に５００倍稀釈して使用された。
【０１２０】相補性分析用プラスミド誘導体の組立て プラスミドｐＰＡＰ４３は、ＳｍａＩ消化とこれにつづ
く低ＤＮＡ濃度での連結によって得られるｐＰＡＰ５の
誘導体である。このプラスミドはｐＰＡＰ５のＳｍａＩ
1−ＳｍａＩ4領域を欠いており（第１図）、したがって
ｐａｐＢとｐａｐＡの遺伝子のみを有する。カットバッ
ク誘導体ｐＰＡＰ５０２を組立てるために、プラスミド
ｐＤＣ５（第１図）をＢｇｌIIで完全に消化し、Ｂａｍ
ＨＩで部分的に消化し、次いでリリゲーション（religa
tion）され、ＨＢ１０１に形質転換された。プラスミド
ＤＮＡは形質転換細胞から分離され計算されたサイズで
スクリーニングされた。適切な大きさの一つのクローン
ｐＰＡＰ５０２をさらに分析したところ、予想どおりに
ｐａｐＧ遺伝子はなかった（第３図参照）。プラスミド
ｐＰＡＰ５０３は、ｌａｃプロモーターを有するｐＳＫ
Ｓ１０６由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント
と、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化されたｐＢＲ３２
２に対してのｐＤＣ５の最も右側のＨｉｎｄIII−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントとを連結することによって組立てら
れた。プラスミドｐＰＡＰ５０４は、ｐＰＡＰ５０３を
ＢｇｌIIとＢａｍＨＩによって消化し、次いで低ＤＮＡ
濃度でリリゲーションすることによって得られた。プラ
スミドｐＰＡＰ５０７は、アンピシリン耐性を選択し、
血球凝集反応をスクリーニングするｐＰＡＰ５０３の唯
一のＨｉｎｄIII座位にｐａｐＡ、ｐａｐＨおよびｐａ
ｐＣと同等の遺伝子を有するｐＤＣ５のＨｉｎｄIIIフ
ラグメントをクローニングすることによって組立てられ
た。この中間体（ｐＰＡＰ５０６）は次いでＢｇｌIIＢ
ａｍＨＩとで消化され、次いでｐＰＡＰ５０３からｐＰ
ＡＰ５０４を組立てる際と同様のしかたでリリゲイトさ
れｐＰＡＰ５０７が得られた。
【０１２１】電子顕微鏡法 電子顕微鏡法は、２％フォームバー（formvar)の薄いフ
ィルムで被覆された１００メッシュ銅グリッド付きＪＥ
ＯＬ１００Ｂ顕微鏡を用いて行った。細菌を１０ｍＭ
Tris HCl（ｐＨ７．５）中に再分散させ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2と前記グリッド上に置いた。過剰分を直ちに
濾紙で除去した。次いでグリッドを緩衝液で洗浄し、
３．５５％のモリブデン酸アンモニウムで５秒間ネガテ
ィブ染色を行ない、再蒸留した水で洗浄した。
【０１２２】結果 ｐＰＡＰ５の、ｐＤＣ５およびｐＰＩＬ１０−３５との
構造比較 三つのプラスミドはすべてグロボシド−結合特異性をエ
ンコードすることを示した（第２表）。これらプラスミ
ドの染色体挿入部分はいくつかの制限エンドヌクレアー
ゼによって地図が作成された。フラグメントの大きさの
小さな不一致でも検出しうるように、異なるプラスミド
の制限酵素による消化物がアガロースゲル電気泳動法に
よる平行スロットで分析された。第１図に示すように中
央のＳｍａＩ1−ＫｐｎＩフラグメントは三つのプラス
ミド全部について同じ大きさ（４．６ｋｂ）である。ｐ
ＰＡＰ５中ではこのフラグメントは、ｐａｐＣとｐａｐ
Ｄ遺伝子のみならず付加された遺伝子の一部の遺伝子情
報を指定する。この中央のフラグメントの物理的地図に
は全く差異が認められなかった。さらにｐＰＡＰ５中の
ｐａｐＣのコーディング領域（coding region)由来で大
きさがほぼ３７０ｂｐのＰｓｔＩフラグメントは、ｐＤ
Ｃ５やｐＰＩＬ１１０−３５中の同じサイズのＰｓｔＩ
フラグメントと雑種形成がなされる（hybridize)。同様
に、ｐａｐＣのＮ−ターミナル領域からの１２８ｂｐの
ＨｐａＩフラグメントはｐＤＣ５やｐＰＩＬ１１０−３
５からの同じサイズのＨｐａＩフラグメントと雑種形成
がなされる。これらの観察結果は、グロボシド−結合性
遺伝子クラスターの中央領域は輸出および組立ての機能
をエンコードすると信じられ、高度に保存されている
（conversed)ことがわかる。
【０１２３】プラスミドｐＰＩＬ１１０−３５は、保存
されたＳｍａＩ1−ＫｐｎＩ領域の左方向に延びる５．
７ｋｂのＤＮＡフラグメントを有している。この領域は
Ｆ７ 2線毛の構造遺伝子を取囲んでおり、ｐａｐＡと同
等の位置を占めている。その制限座位相同性は、この領
域では保存されていない（第１図）。またｐａｐＡの中
央部からの２２１のヌクレオチドの長さのプローブは、
ｐａｐＡのまさに５’部分が緊縮条件下で強く雑種形成
したけれども、低い緊縮状態でさえもｐＰＩＬ１１０−
３５とのよわい雑種形成信号しか与えなかった。これは
二つのピリン遺伝子の５’末端が高度に保存されている
ことを意味し、一方中央部は著しく分岐したようであ
る。
【０１２４】ｐａｐＢのコーディング部から通常得られ
るＤＮＡプローブは、ｐＰＩＬ１１０−３５の６．０ｋ
ｂＨｉｎｄIIIフラグメントとの強い雑種形成信号（hyb
ridization signal）を与えた。このことは、この遺伝
子が保存され、その二つのクローン中同じ位置に存在し
ていることを示唆している。三つの遺伝子ｐａｐＥ、ｐ
ａｐＦとｐａｐＧはｐＰＡＰ５のＳｍａＩ3−ＢａｍＨ
Ｉフラグメントにあることが分かった。このフラグメン
トの制限パターンは、中央にＳｍａＩ1−ＫｐｎＩより
もｐＤＣ５およびｐＰＩＬ１１０−３５中では保存のて
いどが少ない。ｐＰＡＰ５のＳｍａＩ3−ＢｇｌIIフラ
グメントはｐａｐＥ、ｐａｐＦおよびｐａｐＧの５’末
端側の半分を有している。このフラグメントをサザンブ
ロッティング実験でプローブとして用いると、同じ強度
の信号が、分析された三つのプラスミド全部に検出され
た。雑種形成するフラグメントは三つのプラスミドの物
理的地図中同等の位置を占めている。一方、ｐａｐＧの
３’末端側の半分を有するＢｇｌII−ＳｍａＩ4プロー
ブはｐＰＡＰ５ＤＮＡで強い信号を与えるが、低い緊縮
条件でさえもｐＤＣ５もしくはｐＰＩＬ１１０−３５Ｄ
ＮＡと雑種形成しない。これらの二つのプラスミドはこ
の領域からのｐａｐＧと類似のサイズを持つ蛋白をエン
コードするということに留意すべきである。またそれら
はｐａｐＧ領域にｐＰＡＰ５とは異なる、類似の制限パ
ターンを有するようである。相同性と非相同性との間の
境界線をより正確に定義するために、ｐａｐＥ、ｐａｐ
ＦおよびｐａｐＧの限定された領域を有する多数のＭ１
３クローンが用いられた。ニックトランスレートされた
ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−３５がプローブとして用い
られた。ｐａｐＥとｐａｐＦＤＮＡを有するＭ１３プロ
ーブすべてについて陽性の雑種形成性が検出された。ｐ
ａｐＧＤＮＡだけを有するＭ１３クローンはいずれも陽
性の信号を与えなかった。したがってｐａｐＥとｐａｐ
Ｆは保存されているが、ｐａｐＦの端部とｐａｐＧのス
タート部との近傍において相同性の急激な低下がある。
【０１２５】ミニ細胞における蛋白表現 ｐＰＡＰ５、ｐＤＣ５およびｐＰＩＬ１１０−３５から
表現される蛋白は、エシエリヒア・コリのミニ細胞中で
〔35Ｓ〕−メチオニンの標識が付けられており、その放
射能で標識の付された遺伝子産物は１５％ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で分析された。ｐＰＡＰ５のｐａ
ｐＢとｐａｐＡと類似の分子量の蛋白はｐＰＩＬ１１０
−３５からは表現されたがｐＤＣ５からは表現されなか
った。ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−３５の両者は、ｐＰ
ＡＰ５のｐａｐＣとほぼ同じ位置に位置しており、一つ
の蛋白７１−７５Ｋを表現することは分かっていた〔ク
レッグ・エス アンド ジェイ・ケイ・ピアース（Cleg
g, S. and J. K. Pierce）、“Organization of genes
responsible for the production of mannose-resistan
t fimbriae of uropathogeneic Escherichia coli isol
ate”，インフェクション アンド イムニテイ，第４
２巻，１９８３年，第９００〜９０６頁、並びにバン
デイ，アイら（van Die, I. et al)，“Molecular orga
nisation ofthe genes involved in the production of
Ｆ７2 fimbriae, causing mannoseresistant haemaggl
utination, of a uropathogenic Escherichia coli ０
６：Ｋ２：Ｈ１：Ｆ７ strain”，モリキュラー アン
ド ジェネラル ジェネティックス，第１９４巻，１９
８４年，第５２８〜５３３頁〕。ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１
１０−３５のｐａｐＣ遺伝子産物は、ｐＰＡＰ５のＰａ
ｐＣ蛋白よりもわずかに低い分子量を有する弱く表現さ
れた蛋白として出現するが、一方ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１
１０−３５の両者はＰｐａＤ蛋白と同じ分子量を有する
蛋白を表現する。ｐＰＩＬ１１０−３５について、この
蛋白をエンコードする遺伝子はｐａｐＤに対応する領域
にあることが分かっていた（バン デイ アイら，“Mo
lecularorganisation of the genes involved in the p
roduction of Ｆ７2 fimbriae,causing mannose resist
ant haemagglutination, of a uropathogenic Escheric
hia coli ０６：Ｋ２：Ｈ１：Ｆ７ strain”，モリキュ
ラー アンド ジェネラル ジェネティックス，第１９
４巻，１９８４年，第５２８〜５３３頁）。ｐＰＡＰ５
のＰａｐＥ蛋白は１６．５Ｋの見掛けの分子量を有す
る。ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−３５中には同じサイズ
の蛋白を検出できなかったが、両プラスミドから表現さ
れたわずかに小さい蛋白はこれらの遺伝子のクラスター
のｐａｐＥ遺伝子産物であったのかも知れない。三つの
プラスミド全部が、グロボシド結合には必須のｐａｐＦ
によってエンコードされていることが知られている１５
Ｋの蛋白を表現した。ｐＰＡＰ５のＰａｐＧ蛋白は３５
Ｋのポリペプチドであり、ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−
３５の両者中にはわずかに分子量の大きい蛋白を見出さ
れた。ｐＤＣ５，ｐＰＡＰ５０２のＢｇｌII−ＢａｍＨ
Ｉカットバック誘導体は３６Ｋのポリペプチドを表現し
なかった。これは、ｐＰＡＰ５中のｐａｐＧと同じ領域
にこの蛋白の遺伝子を局在させている。
【０１２６】ｐＤＣ５とｐＰＩＬ１１０−３５から高度
に表現された１７Ｋのポリペプチドはこれらのプラスミ
ドの末端ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに与えられ
た（クレッグ・エス エンド ジェイ・ケイ・ピアー
ス，“Organization of genesresponsible for the pro
duction of mannoseresistant fimbriae of a uropatho
genic Escherichia coli isolate”，インフェクション
アンド イムニティ，第４２巻，１９８３年，第９０
０〜９０６頁、並びにバン デイ，アイら，“Molecula
r organization of the genes involved in the produc
tion of Ｆ７2fimbriae, causing mannose resistant h
aemagglutination, of a uropathogenic Escherichia c
oli ０６：Ｋ２：Ｈ１：Ｆ７ strain”，モリキュラー
アンドジェネラル ジェネティックス，第１９４巻，
１９８４年，第５２８〜５３３頁）。ｐＰＡＰ５の構成
はこの領域に同等のＤＮＡを欠いており、このため１７
Ｋ蛋白はこれらのプラスミドもしくはｐＰＡＰ５０２か
らは表現されない。 ｐＰＡＰ５とｐＤＣ５上の遺伝子クラスター間の相補性
（Complementation) ｐＤＣ５はｐａｐＣ、ｐａｐＤ、ｐａｐＥおよびｐａｐ
Ｆに高度に相同のＤＮＡを有するので、ｐＤＣ５がｐＰ
ＡＰ５中のｐａｐＡによって相補されてｐａｐＡ線毛の
形成をもたらすならば問題が起こる。そのため、ｐａｐ
ＢとｐａｐＡ遺伝子だけを有し、ｐａｐＡ抗原を表面に
局在することのできないｐＰＡＰ４３が作製された。こ
のプラスミドを有するＨＢ１０１もｐＤＣ５を有する同
じ菌株も抗線毛抗血清によって凝集しなかった。これら
の適合性のあるプラスミドは両方とも、同じ細胞中に存
在するが、抗血清凝集法によって示されるように、ｐａ
ｐＡピリンは表面に局在していた。電子顕微鏡によっ
て、ｐａｐＡピリンが線毛の形態に組立てられたことが
確認された（データは示さず）。ｐＰＡＰ４３もｐＤＣ
５も単独では、ＨＢ１０１に収容された際には表面に局
在する線毛を表現しなかった。
【０１２７】アドヒシン機能も遺伝子クラスター間で相
補されうるのかどうかを知るために、ｐＤＣ５の右端に
あるＢｇｌII座位からＢａｍＨＩ座位にかけてのＤＮＡ
を欠くｐＰＡＰ５０２が作製された。ｐＤＣ５と比較し
て、この誘導体は、ミニ細胞中に３６Ｋと１７Ｋのポリ
ペプチドを表現できなかった。マツピングおよび雑種形
成データと一致して、３６Ｋの蛋白がｐａｐ遺伝子クラ
スターのｐａｐＧによってエンコードされる３５Ｋ蛋白
に対応すると考えられる。プラスミドｐＰＡＰ５０２
は、ｐＤＣ５と著しく異なり、血球凝集性を伝達しなか
った。ｐａｐＥ、ｐａｐＦおよびｐａｐＧをｐＰＡＰ５
中に表現するプラスミドのｐＰＡＰ１６を用いて、欠失
誘導体ｐＰＡＰ５０２を相補して血球凝集性にすること
はトランス配置では可能である。かくしてアドヒシン機
能は一つの遺伝子クラスターからもうひとつの遺伝子ク
ラスターにトランス相補することができる。このこと
は、ｐａｐＧ領域はクローン間では十分に保存されてい
ないので驚くべきことである。ｐＰＡＰ１６の、ｐａｐ
Ｅ１，ｐａｐＦ１およびｐａｐＧ１突然変異体であるプ
ラスミドｐＰＡＰ１８、ｐＰＡＰ１７およびｐＰＡＰ４
（前記の一般原料と方法の項参照）はそれぞれ、ｐＰＡ
Ｐ５０２上の欠失を相補できなかった。ｌａｃプロモー
ターのコントロール下にある、ｐＤＣ５のＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドｐＰＡＰ
５０３も血球凝集できなかった。しかしｐＰＡＰ５０３
はｐＰＡＰ５０２の欠陥を相補できた。これは両者のプ
ラスミドを有する細胞によって陽性の血球凝集反応が得
られたことによって分かった。予想通りに、ｐＰＡＰ５
０３のＢｇｌII−ＢａｍＨＩ欠失誘導体はこの相補を達
成できなかった（第３表中のｐＰＡＰ５０４）。これら
のプラスミドは、ｐａｐクローンにおける補体突然変異
（complement mutation)に用いられた。ｐＰＡＰ５０３
は、Ｔｎ５挿入体全部をｐａｐＦとｐａｐＧにおいて相
補し、一方カットバック誘導体ｐＰＡＰ５０４だけはｐ
ａｐＦにおいてこれらを相補した。ｐａｐＣ、ｐａｐ
Ｄ、ｐａｐＥ、ｐａｐＦ遺伝子同等物をエンコードする
ｐＤＣ５誘導体のｐＰＡＰ５０７は、ｐａｐＦ遺伝子中
にＴｎ５変異を有するｐＳＮ０２１を相補した。これら
の結果は、ｐａｐＦとｐａｐＧ遺伝子産物と機能が類似
している蛋白は、ｐＤＣ５上の対応する領域によってエ
ンコードされることを示す。この実施例における実験か
ら、ｐａｐＡ遺伝子と、ある程度ｐａｐＧ遺伝子は三つ
のエシエリヒア・コリ菌株に可変性（variability)を示
すが一方ｐａｐＦ遺伝子はほとんど可変性を示さないと
結論することができる。ｐａｐＧもしくはｐａｐＦが特
定の結合タンパク質の遺伝情報を指定するかどうかを決
定することはできない。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】グロボシド結合特異性は、グロボシド受容
体を有するＰ1−赤血球の陽性スライド血球凝集法（Ｈ
Ａ）とグロボシドを欠くｐ−赤血球の陰性ＨＡによって
測定された。検査条件は、前記の一般原料と方法に記載
したのと同じである。Ｎ．Ｄ．：測定されなかったこと
を意味する。
【０１３０】
【表３】
【０１３１】ＨＢ１０１に収容されたプラスミド変異に
おける相補性を、前記の原料と方法並びに一般原料と方
法に記載したのと同様にしてＰ1−赤血球のスライド血
球凝集法によってモニターした。ｐａｐＥ１とｐａｐＦ
１突然変異はリンカー挿入突然変異誘発法（linker ins
ertion mutagenesis）によってなされる非極性の突然変
異である（前記の一般原料と方法参照）。ｐａｐＧ１突
然変異はＳｍａＩ4−ＢａｍＨＩフラグメントの欠失で
あり、これによってｐａｐＧ蛋白を１Ｋまできりとる
（前記の一般原料と方法参照）。Ｔｎ５突然変異ｐａｐ
Ｆ：：Ｔｎ５−０２１とｐａｐＧ：：Ｔｎ５−０４２が
ｐａｐＦとｐａｐＧ遺伝子それぞれにあることが分かっ
た。プラスミドｐＰＡＰ１６、ｐＰＡＰ１８、ｐＰＡＰ
１７およびｐＰＡＰ４はｐＰＡＰ５誘導体である。左欄
のプラスミドはｐＢＲ３２２（ｐＭＢ１）レプリコンを
有し、一方、上段の欄にあるプラスミドはｐＡＣＹＣ１
８４（ｐ１５Ａ）レプリコンを有する。角括弧〔 〕内
の遺伝子は、ｐＰＡＰ５中の対応するｐａｐ遺伝子と同
等のｐＤＣ５である。
【０１３２】実施例９ エシエリヒア・コリの臨床単離物の雑種形成 この実施例に用いられた原料と方法 細菌菌株とプラスミド 試料は、重症の細菌尿症の患者の尿（＞１０5細菌／m
l）から収集したエシエリヒア・コリの６６のアイソレ
イト、および健康な個体から得られた９６の糞便のエシ
エリヒア・コリ アイソレイトで構成されていた。プラ
スミドｐＰＡＰ５は、全ｐａｐ遺伝子クラスターを有す
るエシエリヒア・コリＪ９６（０：４）由来のａ×ｋｂ
の大きさのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有す
る。その遺伝子構成を第２図に示す。プラスミドｐＤＣ
５は泌尿器病原性エシエリヒア・コリ菌株ＩＡ２（０：
６）のグロボシド特異性アドヒシンの遺伝情報を指定す
る。これらの二つのプラスミドがｐａｐ遺伝子クラスタ
ーの主要部分にわたって広い相同性を示すことが最近判
明した。しかしｐａｐＧ遺伝子由来のｐＰＡＰ５のＤＮ
ＡはｐＤＣ５と雑種形成しなかった。ＤＮＡ配列法（Ｄ
ＮＡsequencing）によって、二つのクローンのｐａｐＧ
遺伝子間に大きな差異のあることが確認された〔ルンド
ら（Lund et al）未発表〕。
【０１３３】培地および培養条件 完全な培地は、培地Ｅと０．２％グルコースとを補充し
たベルタニ（Bertani)のルリアブロス培地であった。細
菌は３７℃で振盪しながら培養された。グルコースなし
のルリアブロスアガープレートを血球凝集検査に用い
た。
【０１３４】受容体−結合性の検査 ジガラクトシド結合性の同定のために、グルコースなし
のルリアブロスエガー上で２２時間培養されたエシエリ
ヒア・コリ細菌細胞が、ジガラクトシド受容体で被覆さ
れたラテックスビーズの溶液中に再分散された。その細
胞は、１分間以内にビーズを凝集させるならばアドヒシ
ンを表現するとみなした。
【０１３５】染色体ＤＮＡの製造 各細菌のアイソレイトは、１００mlＬＢ培地中で４×１
０8／cell／mlまで培養された。その細菌を遠心分離で
収集し、４０mlＰＢＳ（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝
液，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に分散さ
せ、再遠心分離に付し、５mlＰＢＳ＋０．１mg／mlプロ
テイナーゼＫ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）中に分散させた。その分散
液を一夜室温で培養し、最後にフェノールで抽出し、エ
タノールで沈殿させ、これを２度繰返した。
【０１３６】32Ｐ−放射能標識されたＤＮＡフラグメン
トの製造 プラスミドｐＰＡＰ５とｐＤＣ５が適当な制限酵素で消
化され、ＤＮＡフラグメントが精製され、ニックトラン
スレーション法で32Ｐ標識を行った。
【０１３７】ブロッティングと雑種形成の手順 ドット−ブロット法（dot-blot procedure）にしたがっ
て行った。２μｇの染色体ＤＮＡを１７０μｌの０．１
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。３０μｌの
２Ｍ ＮａＯＨと１００μｌの３Ｍ ＮａＣｌ−０．３
Ｍクエン酸ナトリウムを添加後、混合物を８０℃で２０
分間培養した。その変性ＤＮＡは冷却され、４０μｌの
２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７）で中和され、ニトロセルロ
ースフィルター上の７mm2の区域に吸引され、風乾さ
れ、減圧下６５℃で１２ｈｒベイクされた。これらのフ
ィルターを１０×デンハルト（Denhardt)(デンハルト＝
０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコー
ル（Ficoll）、０．０２％ＢＳＡ）中、２ｈｒ培養され
た。それらをもう一度、４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０×デンハルト、および５０μｇ
／mlの子牛胸線ＤＮＡ（９５℃で３分間加熱）を含有す
る溶液中で、１ｈｒ６５℃で培養された。最後にそれら
は、前記したのと同じ溶液中の放射能標識されたプロー
ブとともに１６ｈｒ１６℃で培養し、４×ＳＳＣで２×
５分間および２×ＳＳＣで２×２０分間６０℃で洗浄
し、次いで風乾した。得られたフィルムは、増感フィル
ム付きのデュポンクロネックス４エックス線フィルムに
−７０℃で露光され次いで現像された。
【０１３８】
【表４】
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
【表１１】
【０１４６】
【表１２】
【０１４７】
【外１０】
【０１４８】Ｐ−spec ＭＲＨＡ：動物の赤血球をも凝
集させる菌株を含む。 ｐ−spec ＭＲＨＡ：ヒトｐ−血液を凝集させる赤血球 Ｚ−spec ＭＲＨＡ：ヒト赤血球には全く血球凝集を起
こさないが、次の動物：豚、山羊、雌牛の赤血球のいず
れにも血液凝集を起こす。 この実施例で得られた結果は、ジガラクトシドに結合す
るエシエリヒア・コリ菌株の多数の臨床アイソレイト
（単離物）がそれらのｐａｐオペロンにＥ、ＦおよびＧ
領域を有すること、並びにジガラクトシドに結合しない
菌株はそのオペロン中に他の領域を有するけれどもｐａ
ｐオペロンにＥ、ＦおよびＧ領域を有していないことを
示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＲＨＵ８４５中のＰａｐＤＮＡの遺伝子構成
を示す地図である。
【図２】生体外の突然変異誘発に用いられるpapハイブ
リッドプラスミドの制限地図と遺伝子構成を示す図であ
る。
【図３】ｐＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ２２中に見出され
た全pap領域を示し（上部の半分）、下部はＳｍａＩ1−
ＢａｍＨＩ領域の物理的地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:44） (72)発明者 バガ，ブリット モニカ スウェーデン、エス−902 40 ウメア、 ビィオロギグレンド 36 (72)発明者 ノルグレン，マリ エリザベート スウェーデン、エス−902 45 ウメア、 ヘラドシシェブディンゲガタン 30ビィ (72)発明者 ゲランソン，ミカエル スウェーデン、エス−902 40 ウメア、 スプラクグレンド 41 (72)発明者 ウーリン，バーント エリック アヌンド スウェーデン、エス−902 37 ウメア、 レードハケベーゲン 20 (72)発明者 ノルマーク，ジャン スタファン スウェーデン、エス−913 00 ホルムス ンド、ザクリスベーゲン 28 (72)発明者 ラーク，ダビッド リー スウェーデン、エス−902 37 ウメア、 トラストベーゲン ９エイ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物組織に接着することができる病
    原性線毛形成細菌の線毛のマイナー成分であり、これが
    ないと細菌の接着が起こらず、線毛構造の主要なサブユ
    ニットとは異なり、アドヒシンポリペプチドと反応する
    抗体を誘発するアドヒシンポリペプチドの抗原決定基を
    エンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
  2. 【請求項２】 ヌクレオチド配列が、アドヒシンポリペ
    プチド全部をエンコードするヌクレオチド配列からなる
    請求項１記載のＤＮＡ断片。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が、免疫学的に活性な
    形態に変換しうるアドヒシンポリペプチドの前駆体をエ
    ンコードする請求項１又は２記載のＤＮＡ断片。
  4. 【請求項４】 病原性線毛形成細菌に由来する請求項１
    〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡ断片。
  5. 【請求項５】 エシエリヒア・コリの泌尿器病原性又は
    腸内病原性の菌株又はネイセリア・ゴノルホエに由来す
    る請求項４記載のＤＮＡ断片。
  6. 【請求項６】 エシエリヒア・コリの病原性菌株が、泌
    尿器病原性菌株である請求項５記載のＤＮＡ断片。
  7. 【請求項７】 下記ＤＮＡ配列： 【外１】 または、発現される際に、全ＤＮＡ配列によってエンコ
    ードされるマイナー線毛成分の抗原決定基を構成する上
    記配列の副配列を有する請求項６記載のＤＮＡ断片。
  8. 【請求項８】 下記ＤＮＡ配列： 【外２】 または、発現される際に、全ＤＮＡ配列によってエンコ
    ードされるマイナー線毛成分の抗原決定基を構成する上
    記配列の副配列を有する請求項６記載のＤＮＡ断片。
  9. 【請求項９】 下記ＤＮＡ配列： 【外３】 または、発現される際に、全ＤＮＡ配列によってエンコ
    ードされるマイナー線毛成分の抗原決定基を構成する上
    記配列の副配列を有する請求項６記載のＤＮＡ断片。
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