JPH0919293A - 組換えｄｎａ手法によるヌクレオシド・ホスホリラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを用いた効率
的なヌクレオシドアナログ合成を可能とするため、組換
えＤＮＡ手法によるヌクレオシド・ホスホリラ−ゼの大
量製造を目的とする。 【構成】 ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を
含有するＤＮＡ分子、それを用いた組換えＤＮＡ手法に
よるヌクレオシド・ホスホリラ−ゼの製造、および該方
法で得られた培養物、微生物菌体、またはその処理物を
酵素源として使用するヌクレオシドの製造法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バシラス属に属する好
熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼの組換えＤＮ
Ａ手法による製造法および該方法で得られた酵素のヌク
レオシド製造への応用に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】核酸系化学療法剤は、抗腫瘍、免疫抑
制、抗ウイルスなどの種々の用途に使用されている。ま
た、近年のエイズの流行とともにヌクレオシドアナログ
の抗ウイルス作用が着目され、種々のヌクレオシドアナ
ログが合成され、その抗ウイルス活性が試験されている
（化学と生物、第２７巻、第６号、第３５６〜３６６
頁）。従来、これらのヌクレオシドアナログの多くは化
学的に合成されてきたが、微生物由来のヌクレオシド・
ホスホリラ−ゼを利用することにより数々のヌクレオシ
ドアナログを効率よく調製できる事が明らかになるにつ
れて、該酵素の利用はヌクレオシドアナログ合成の重要
な手段となっている（発酵と工業、第３９巻、第１０
号、第９２７〜９３７頁）。

【０００３】一般に、酵素の調製源としては操作性ある
いは経済性の点から微生物が有利である。ヌクレオシド
・ホスホリラ−ゼは、動物、微生物など種々の生物に存
在することが確認されており、そのいくつかは単離精製
されて酵素学的諸性質が報告されている。たとえば、バ
シラス属に属する好熱菌の一種であるバシラス・ステア
ロサ−モフィラス（Bacillus stearothermophilus）に
関してもヌクレオシド・ホスホリラ−ゼの存在が確認さ
れている。すなわち、プリンヌクレオシド・ホスホリラ
−ゼ（E.C. 2. 4. 2. 1.）、ピリミジンヌクレオシド・
ホスホリラ−ゼ（E.C. 2. 4. 2. 2.）とも該微生物より
単離精製され、その諸性質も報告され（J. Biol. Che
m., 244,3691 (1969)、Agric. Biol. Chem., 53, 2205
(1989)、Agric. Biol. Chem., 53, 3219(1989)）、それ
らの酵素を利用したヌクレオシドアナログの合成も報告
されている（Agric. Biol. Chem., 53, 197-202 (198
9)、特開昭５６−１６６１９９号公報、特開昭５６−１
６４７９３号公報、特開平１−３２０９９５号公報）。

【０００４】山内らは、バシルス属に属する好熱菌から
耐熱性があり比活性が高いヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼ（プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ及びピリミジ
ンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ）を有するバシラス・
ステアロサ−モフィラス（Bacillus stearothermophil
us）ＴＨ６−２株を見いだし、該菌株からヌクレオシド
・ホスホリラ−ゼを単離することに成功した（国際特許
公開ＷＯ９０／１００８０号、日本農芸化学会誌、第６
３巻、第３号（１９８９年度大会講演要旨集）、第２８
３頁）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】山内らの見いだした上
記の酵素は極めて優れた酵素ではあるが、ヌクレオシド
製造の酵素源として上記微生物の菌体自体を使用する場
合、胞子形成に伴う自己溶菌により反応液中に酵素が離
脱し、ヌクレオシドの連続的な合成に悪影響を及ぼした
り、溶菌に伴う菌体蛋白質の流出がヌクレオシドの合成
および精製に支障をきたすという欠点を有していた。ま
た、微生物の菌体を酵素源として使用する場合の一般的
な問題として、菌体内に含まれる種々の酵素により基質
もしくは生成物の分解などの副反応が生じ、生成物の収
率の低下を招くという問題があることを常に認識してお
かなければならない。

【０００６】このような微生物菌体を酵素源として使用
する方法の問題点を解決するため、精製酵素標品を酵素
源として用いる方法も考えられてはいるが、バシラス・
ステアロサ−モフィラスは、蛋白質分解活性を有し、ヌ
クレオシド・ホスホリラ−ゼの生産量も少なく、かつ該
酵素の精製操作も煩雑であることから、該菌株からヌク
レオシド・ホスホリラ−ゼを収率よく回収することは事
実上困難なことであった。

【０００７】上記の問題を克服するための第一歩とし
て、山内はバシラス・ステアロサ−モフィラス由来のヌ
クレオシド・ホスホリラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含有
するＤＮＡ断片を大腸菌内でクロ−ン化し、当該酵素が
大腸菌において生産できることを見いだした（特開平４
−４８８２号公報）。しかしながら、該方法で造成され
た組換え大腸菌におけるヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ
の生産量は好熱菌におけるそれの生産量と同等以下であ
り、これをヌクレオシド製造の酵素源として使用したと
しても、到底実用化に耐えうるものではなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、バシラス・ステアロサ
−モフィラス由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼをコ
−ドするＤＮＡの一次構造を解析し、この解析結果をも
とに組換えＤＮＡ手法により大腸菌において該酵素を大
量生産させることに成功し、本発明を完成させた。

【０００９】すなわち、本発明は、バシラス属に属する
好熱菌に由来し、下記式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ−ド
するプリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を
含有するＤＮＡ分子に関するものである。

【００１０】

【式４】

【００１１】また、本発明は、バシラス属に属する好熱
菌に由来し、下記式（ＩＩ）のアミノ酸配列をコ−ドす
るピリミジンヌクレオシド・ホスホリラーゼ構造遺伝子
を含有するＤＮＡ分子に関するものである。

【００１２】

【式５】

【式６】

【００１３】さらに、本発明は、細胞内で複製可能なベ
クタ−の発現制御シグナルの下流に上記ヌクレオシド・
ホスホリラーゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ分子を組み
込んでなる組換えベクタ−、該組換えベクタ−で形質転
換された形質転換体を培養して当該酵素を生産させた、
好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを保持する
微生物菌体を含有する培養物、および該培養物から分離
した好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを保持
する微生物菌体もしくはその処理物に関するものであ
る。

【００１４】以下、本発明について詳述する。なお、本
明細書における以下の用語は下記の定義で用いられてい
る。「バシラス属に属する好熱菌由来」とは、ＤＮＡ分
子の塩基配列がバシラス属に属する好熱菌の遺伝子のそ
れと実質的に同じであるということを意味するものであ
って、必ずしも本発明によるＤＮＡ断片がバシラス属に
属する好熱菌から抽出されたものに限定されることを意
味するものではない。「塩基配列が実質的に同じ」と
は、ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼとしての遺伝情報が
維持されている限り、いくつかの単位ヌクレオチド（塩
基）の置換、欠失及び／または付加があってもよいこと
を意味する。

【００１５】１．ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺
伝子を含有するＤＮＡ分子 本発明におけるバシラス属に属する好熱菌由来のヌクレ
オシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ分
子とは、上記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）のアミ
ノ酸配列をコ−ドするヌクレオシド・ホスホリラーゼ構
造遺伝子を含有するものであり、その具体的な塩基配列
は特に限定されるものではない。たとえば、図１に示す
制限酵素地図に規定されるＤＮＡ分子、より具体的に、
プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を含有
するＤＮＡ分子としてはＮｃｏＩとＨｐａＩで切断され
るものを、ピリミジンヌクレオシド・ホスホリラーゼ構
造遺伝子を含有するＤＮＡ分子としてはＰｓｔＩとＨｉ
ｎｃＩＩで切断されるものを、プリンヌクレオシド・ホ
スホリラ−ゼおよびピリミジンヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼの両構造遺伝子を含有するＤＮＡ分子としてはＮ
ｃｏＩとＥｃｏＲＩで切断されるものをそれぞれ例示す
ることができる。

【００１６】このようなＤＮＡ分子は、ヌクレオシド・
ホスホリラーゼの構造遺伝子の他に少なくとも構造遺伝
子の上流にＳＤ配列をを含有するものであり、構造遺伝
子のみを含有するＤＮＡ分子を使用した時と比較してヌ
クレオシド・ホスホリラーゼの生産量を著しく増加させ
ることができる点で、本発明の目的にかなうものであ
る。従って、本発明方法においては、図２〜４に示す塩
基配列中の少なくともＳＤ配列から終止コドンまでの塩
基配列を含有するＤＮＡ分子を使用することが肝要であ
る。なお、プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼおよび
ピリミジンヌクレオシド・ホスホリラーゼの両酵素を生
産させる場合には、そのＤＮＡ分子中の構造遺伝子の上
流にＳＤ配列が少なくとも一つ存在するものを使用すれ
ばよい。

【００１７】なお、図１における「punA」はプリンヌク
レオシド・ホスホリラ−ゼをコ−ドする遺伝子（822 b
p、274 個のアミノ酸からなる分子量29,637のポリペプ
チドをコ−ドする）、「pyn」 はピリミジンヌクレオシ
ド・ホスホリラ−ゼをコ−ドする遺伝子（1,299 bp、43
3個のアミノ酸からなる分子量46,271のポリペプチドを
コ−ドする）を示す。本発明者らによる解析では、両遺
伝子はクラスタ−をなしており、それぞれその翻訳開始
に必要なリボソ−ム結合部位を有しているが、その近傍
の5'上流に好熱菌のプロモ−タ−構造及び大腸菌で機能
できるようなプロモ−タ−構造を有していない。

【００１８】このようなＤＮＡ分子は、先の山内の方法
（特開平４−４８８２号公報）などのように高温でのヌ
クレオシド分解活性を指標としてバシラス属に属する好
熱菌からクロ−ン化することができる。あるいは通常よ
く行われるように、バシラス属に属する好熱菌由来の精
製したヌクレオシド・ホスホリラ−ゼのアミノ末端など
の一部アミノ酸配列を既知の方法で決定し、もしくは上
記式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）のアミノ酸配列の
一部の配列を参考にし、それに相当するオリゴヌクレオ
チドを合成し、該オリゴヌクレオチドをプロ−ブとして
バシラス属に属する好熱菌の遺伝子バンクよりヌクレオ
シド・ホスホリラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片を選出する方法も採用できる。クロ−ン化に用
いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から
大腸菌を宿主とするのが適当である。さらに、図２〜４
を参照して通常のＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成し
てもかまわない。

【００１９】通常、プラスミドベクタ−などにこれらの
断片をクロ−ン化しても、該ＤＮＡ断片はプロモ−タ−
を有していないか、あるいはプロモ−タ−を有していて
も異種微生物内で効率的に機能できないことが多く、コ
ードされた遺伝子の高発現は通常起こらないとされてい
る。また、コ−ディング領域以外の余分なＤＮＡを有し
ていると、たとえプラスミドベクタ−上に存在している
他の遺伝子のプロモ−タ−からのリードスルー（read t
hrough）転写によっても、その発現が起こりうることが
あり、好ましいことではない。このため、目的とする遺
伝子の高発現を具現化するためには、クロ−ン化したＤ
ＮＡ断片の塩基配列を解析し、該遺伝子のコ−ディング
領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌
体中で高発現可能となるように発現制御シグナル（転写
開始及び翻訳開始シグナル）をその５’上流に連結した
組換え発現ベクタ−を作製する必要がある。ＤＮＡ塩基
配列の決定は、常法により行うことができ、たとえばマ
キサム−ギルバ−トの方法（Methods in Enzymology, 6
5, 499(1980)）もしくはダイデオキシチェインタ−ミネ
−タ−法（Methods in Enzymology, 101, 20(1983)）な
どを応用して行うことができる。

【００２０】２．組換えベクタ− ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ遺伝子を異種微生物内で
大量発現させるために使用する発現制御シグナルとして
は、人為的制御が可能で、ヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼ遺伝子の発現量を飛躍的に上昇させるような強力な転
写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望まし
い。このような転写開始シグナルとしては、宿主として
大腸菌を用いる場合には、lacプロモ−タ−、 trpプロ
モ−タ−、tacプロモ−タ−（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 80, 21 (1983)、 Gene, 20,231 (1982)）、trcプ
ロモ−タ−（J. Biol. Chem., 260, 3539(1985)）など
を、酵母を宿主とする場合にはグリセルアルデヒド−３
−ホスフェ−ト・デヒドロゲナ−ゼ（J. Biol. Chem.,
254, 2078 (1980)）や抑制性酸性ホスファタ−ゼ（Nu
cl. Acids Res., 11, 1657(1983)）などの遺伝子の発現
制シグナルを例示することができる。

【００２１】ベクタ−としては、種々のプラスミドベク
タ−、ファ−ジベクタ−などが使用可能であるが、微生
物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マ−カ−と
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピ−数の高
いプラスミドベクタ−を使用するのが望ましい。具体的
に大腸菌を宿主とする場合には、pBR322（Gene, 2,95
(1975)）、pUC18、pUC19（Gene, 33, 103(1985)）など
を例示することができる。また、酵母を宿主とする場合
には、YEp13（ ATCC 37115 ）、YEp24（ATCC37051）な
どを例示することができる。ヌクレオシド・ホスホリラ
−ゼ構造遺伝子の調製、クロ−ニングした遺伝子と発現
制御シグナルとの連結などの方法は、一般の技術者、特
に分子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術者にとっ
ては周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecula
r Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor、New
York (1982)）に記載の方法に従って行うことができ
る。

【００２２】３．形質転換体の作製と培養 作製した組換えベクタ−を用いて微生物を形質転換す
る。宿主となる微生物としては安全性は高く取扱いやす
いものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵
母などＤＮＡ組換え操作に常用されている微生物を使用
することができる。その中でも、大腸菌が取扱い上、及
びヌクレオシドアナログ合成上有利であり、例えば組換
えＤＮＡ実験に使用される K12株、C600菌、JM105菌、J
M109菌などが使用可能である。微生物を形質転換する方
法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使
用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸
菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム
処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol.
Biol., 53, 159(1970)）により大腸菌を形質転換するこ
とができる。また、酵母を宿主とする場合には、プロト
プラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929
(1978)）、あるいはアルカリ金属処理法（J. Bacterio
l., 153, 163 (1983)）などの方法を採用することがで
きる。

【００２３】得られた形質転換体は、当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクロ−ン化したヌクレ
オシド・ホスホリラ−ゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内
に該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体
の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必
要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えば
よい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地
として２ｘＹＴ培地（Methods in Enzymology, 100,
20(1983)）、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molecular Clon
ing、 前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地
を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気、攪
袢しながら培養することができる。また、ベクタ−とし
てプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラス
ミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの
薬剤耐性マ−カ−に応じ、アンピシリン、テトラサイク
リンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。

【００２４】培養中にヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ遺
伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロ
モ−タ−で常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導
する。例えば、lacプロモ−タ−やtacプロモ−タ−を使
用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴ
Ｇと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロ
モ−タ−が構成的に転写活性を有する場合には、特に発
現誘導剤を添加する必要はない。ヌクレオシド・ホスホ
リラ−ゼ遺伝子の発現を誘導した後、該遺伝子産物を菌
体内に大量蓄積させるため、さらに数時間の培養を継続
して酵素源としての培養物を得る。得られた培養物はヌ
クレオシドアナログ合成の酵素源として使用できる。

【００２５】４．培養菌体及びその処理物 組換え菌は、培養後膜分離あるいは遠心分離処理などに
よりその菌体を回収する。培養菌体そのものを酵素源と
して使用する場合、回収菌体を適当な緩衝液に懸濁して
直接ヌクレオシドアナログの合成に使用できる。また、
酵素的ヌクレオシド・アナログ合成を行うためには、回
収菌体より生産されたヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを
調製すればよい。例えば、回収した菌体を適当な緩衝液
に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより
物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチ−ム処理な
ど酵素的に溶菌させ、菌体残渣を遠心分離により除去し
て無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液内に該酵素は
過剰に存在しているため、無細胞抽出液そのものを酵素
標品として使用することができる。さらに精製が必要と
される場合でも、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エ
タノ−ルなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィ−処理
などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、ま
たはせいぜい２種類の処理を組み合わせただけの簡便な
手段でヌクレオシドアナログ合成に好適な高度に精製さ
れた酵素標品を調製できる。なお、大腸菌を宿主微生物
とする場合、無細胞抽出液を熱処理（６０〜８０℃で１
〜１０分）するとほとんどの大腸菌由来蛋白質が変性
し、遠心分離操作により簡単に除去でき、非常に効率的
な酵素の精製が可能である。

【００２６】５．ヌクレオシド・アナログの合成 本発明のヌクレオシド・アナログの合成は、上記の培養
物または上記の培養菌体もしくはその処理物を使用する
ことを特徴とするものであり、その他の条件方法は公知
の方法（たとえば、国際特許公開ＷＯ９０／１００８０
号参照）に準じて行えばよい。すなわち、使用する酵素
の最適条件を予備試験により設定し、この条件下で原料
化合物と培養物または培養菌体もしくはその処理物とを
反応させることにより実施することができる。さらに具
体的には、反応温度としては２０〜９５℃、反応ｐＨと
しては３〜１０から適宜至適条件を選択し、適当量の無
機リン酸を含有する適当な緩衝液に糖残基供与体として
ヌクレオシド及び塩基供与体として塩基アナログなどを
添加し、設定条件下で反応させることにより行うことが
できる。反応終了後、合成されたヌクレオシドアナログ
は核酸関連物質の精製法として通常使用されている方法
を適宜組み合わせて精製単離することができる。

【００２７】

【発明の効果】本発明により前述した従来の問題点が解
決され、バシラス属に属する好熱菌由来のヌクレオシド
・ホスホリラ−ゼを用いた効率的なヌクレオシドアナロ
グ合成が可能となった。すなわち、本発明は下記の利点
を与える。 （イ）微生物菌体を酵素源とした、副反応の少ない効率
的なヌクレオシドアナログ合成が可能となる。バシラス
属に属する好熱菌菌体を酵素源としてヌクレオシドアナ
ログを合成する場合、ヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ以
外の基質あるいは生成物分解酵素も耐熱性を有するた
め、高温での反応でも副反応が進行する。しかしながら
例えば、宿主微生物として大腸菌を用いて高温で合成反
応を行えば、大腸菌由来の酵素はそのほとんどが失活
し、副反応はほとんど生じない。また、大腸菌などを宿
主微生物とすれば、従来の自己溶菌の問題は解決され
る。さらに、組換え菌においては好熱菌由来ヌクレオシ
ド・ホスホリラ−ゼが大量生産されているため、合成反
応に使用する菌体量は少量で充分であり、経済的にも効
率的なヌクレオシドアナログ合成が可能となる。

【００２８】（ロ）酵素大量調製が簡便となり、酵素的
ヌクレオシドアナログ合成の実用化が可能となる。従来
のバシラス属に属する好熱菌からのヌクレオシド・ホス
ホリラ−ゼの調製は極めて困難であったが、組換えＤＮ
Ａ手法により該酵素を大量生産させることで、その大量
調製は極めて簡便となる。例えば、大腸菌を宿主微生物
とすれば、リゾチ−ム処理あるいは超音波処理などの簡
便な操作で高収率で該酵素を抽出できる。また該酵素は
耐熱性を有することから、熱処理を施すことで、副反応
に関与する大腸菌酵素を失活除去させることが可能であ
り、簡便な操作で比活性の高い酵素標品を調製すること
も可能である。プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ及
びピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ両酵素を用
いてヌクレオシドアナログを合成する場合、どちらかの
酵素が関与する反応が律速となり、効率的な反応が生じ
ない現象がある。しかし、好熱菌からは一定の比率でし
かプリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼとピリミジンヌ
クレオシドホスホリラ−ゼが調製されず、その比率を変
えることは極めて困難であった。しかしながら、両酵素
を組換えＤＮＡ手法で別々に生産することにより、その
比率を改変して効率的なヌクレオシドアナログ合成を行
うことも可能となる。このように、本発明はヌクレオシ
ドアナログの効率的な製造を実用化するものであり、産
業上きわめて有益なものである。

【００２９】

【実施例】以下、Bacillus stearothermophilus TH6-2
株（微工研条寄第２７５８号）由来のヌクレオシド・ホ
スホリラ−ゼに関して実施例をあげ、具体的に説明す
る。また、本実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素に
よる切断、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼによるＤＮＡ連結、並び
に大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」
（前述）に従って行った。また、各種制限酵素、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガ−ゼ、プラスミドベクタ− pUC118及び pUC11
9、pPstI リンカ−並びにキロシ−クエンス用デレ−シ
ョンキットは全て宝酒造（株）より入手した。

【００３０】実施例１：好熱菌ヌクレオシド・ホスホリ
ラ−ゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ分子のＤＮＡ塩基配
列の決定 先に山内らにより調製された好熱菌Bacillus stearothe
rmophilus ＴＨ６−２株由来のプリンヌクレオシド・ホ
スホリラ−ゼとピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼをコ−ドする遺伝子を含有する4.6 kbのＤＮＡ断片
（図１参照、特開平４−４８８２、この断片が挿入され
たpUC119プラスミドを保持する大腸菌Ｋ１２株エシェリ
シア・コリＫＹ−２は平成２年１月１６日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託され、微工研菌寄第１１１
９７号の受託番号を受けている）よりプリンヌクレオシ
ド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を含有すると思われる
2.4kb の SacI-EcoRV ＤＮＡ断片を pUC118及びpUC119
にサブクロ−ン化した。該組換えプラスミドをキロシ−
クエンス用デレ−ションキットを用いて、文献（Gene,
28, 351 (1984)）の方法に従って当該挿入部分の一部が
脱落し、異なる鎖長を持った種々のクロ−ンを作製し
た。得られた種々のクロ−ンの挿入断片について、ダイ
デオキシチェインタ−ミネ−タ−法（Science, 214, 12
95(1981)）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。その結
果、図２に示すプリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構
造遺伝子のＤＮＡ配列を得た。この塩基配列は、822 bp
であり、Metで始まる 274 個のアミノ酸からなる分子量
29,637のポリペプチドをコ−ドする。なお、このペプ
チドのアミノ末端２０個のアミノ酸配列は、精製単離し
た好熱菌プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼのそれと
完全に一致した。

【００３１】次に、ピリミジンヌクレオシド・ホスホリ
ラ−ゼ構造遺伝子を含有すると思われる2.8 kbのPstI-E
coRIＤＮＡ断片に関しては、pUC118及びpUC119に各種制
限酵素を用いてショトガン−サブクロ−ニングを行い、
先と同様ダイデオキシチェインタ−ミネ−タ−法でその
塩基配列を決定した。その結果、図３および４に示すピ
リミジンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を得
た。この塩基配列は、1,299 bpであり、433 個のアミノ
酸からなる分子量 46,271 のポリペプチドをコ−ドす
る。なお、このペプチドのアミノ末端１０個のアミノ酸
配列は、精製単離した好熱菌ピリミジンヌクレオシド・
ホスホリラ−ゼのそれと完全に一致した。

【００３２】実施例２：好熱菌ヌクレオシド・ホスホリ
ラ−ゼ高発現用組換えベクタ−の作製 プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ生産用組換えベク
タ− pTrc-punAを以下の方法で作製した（図５参照）。
すなわち、プラスミドベクタ−pTrc99A（Gene,69, 301
(1988)、Pharmacia 社より入手）を制限酵素 NcoI及びS
maIで切断後、プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構
造遺伝子及びＳＤ配列を含有するNcoI-HpaI ＤＮＡ断片
と上記プラスミドベクターpTrc99Aの切断断片とをＴ４
ＤＮＡリガ−ゼを用いて連結し、該連結反応液を用いて
大腸菌 JM105株を形質転換した。得られたアンピシリン
耐性形質転換体より、pTc99Aの発現用trc プロモ−タ−
の直後にＳＤ配列及びプリンヌクレオシドホスホリラ−
ゼ構造遺伝子が挿入された組換えベクタ−pTrc-punAを
得た。

【００３３】次に、ピリミジンヌクレオシド・ホスホリ
ラ−ゼ高発現用組換えベクタ−pTrc-pynを作製した（図
６参照）。すなわち、先の4.6 kb のＤＮＡ断片を制限
酵素HincIIで部分分解し、さらにその生成物にＴ４ＤＮ
Ａリガ−ゼを用いて pPstIリンカ−を連結した。反応生
成物は、さらに制限酵素PstIで切断し、ピリミジンヌク
レオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子及びそのＳＤ配列
を含有する2.2 kb のPstIＤＮＡ断片を調製した。この
ＤＮＡ断片と制限酵素PstIで切断したpTrc99AをＴ４Ｄ
ＮＡリガ−ゼを用いて連結反応を行い、さらに該反応液
を用いて大腸菌JM105株を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性形質転換体より、pTrc99Aの trcプロモ−
タ−直後のPstI切断部位にＳＤ配列及びピリミジンヌク
レオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子が trcプロモ−タ
−からの転写方向と一致して挿入された組換えベクタ−
pTrc-pynを得た。

【００３４】さらに、好熱菌プリンヌクレオシド・ホス
ホリラ−ゼ及びピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼ両酵素生産用ベクタ− pTrc-NEを作製した（図７参
照）。すなわち、先の4.6 kbのＤＮＡ断片より両酵素構
造遺伝子及びそれぞれのＳＤ配列を含有する NcoI-EcoR
I ＤＮＡ断片と制限酵素 NcoI 及び EcoRI で切断したp
Trc99AをＴ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて連結し、その連結
反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。得られ
たアンピシリン耐性形質転換体より、pTrc99Aのtrcプロ
モ−タ−直後のNcoI-EcoRI切断部位にプリンヌクレオシ
ド・ホスホリラ−ゼ及びピリミジンヌクレオシド・ホス
ホリラ−ゼのＳＤ配列及び構造遺伝子が挿入された組換
えベクタ−pTrc-NEを得た。

【００３５】実施例３：形質転換体の培養と酵素抽出 上記の３種類の組換えベクタ−を保持する大腸菌形質転
換体を、100 μg/mlのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ
培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４
ｘ１０⁸ 個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度１ｍ
ＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で５時
間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０
００ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、２０ｍｌ
の緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．８）、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ trition X100）に懸濁した。
菌体懸濁液に終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチ−
ムを加え、３７℃で一時間保温することで形質転換体を
溶菌させ、さらに遠心分離（２，０００ｇ、１０分間）
により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上
清画分を菌体抽出液とした。菌体抽出液におけるヌクレ
オシド・ホスホリラ−ゼ活性を対照菌（pTrc99Aを保持
する大腸菌JM105、及びpUC119-PYR2（特開平４−４８８
２）を含有する大腸菌JM105）と共に下記表に示す。な
お、プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ及びピリミジ
ンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ活性は、山内の方法
（特開平４−４８８２）に従い、７０℃におけるそれぞ
れイノシン及びウリジンの加リン酸分解活性を測定して
算出した。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１に示すように作製した組換えベクタ−
を保持する形質転換体においては、対照菌（pTrc99Aを
保持する大腸菌JM105）の１００倍以上の高温で活性を
有するヌクレオシドホスホリラ−ゼ活性が確認された。
また、本発明で造成された形質転換体（pTrc-NE 保持
菌）は、従来法（特開平４−４８８２）で造成された形
質転換体（pUC119-PYR2 保持菌）の６〜８倍のヌクレオ
シド・ホスホリラ−ゼを生産できることも確認された。
また、この形質転換体の生産性は元株である好熱菌Baci
llus stearothermophilus TH6-2 株の約８倍に相当す
る。なお、これら組換えベクタ−を保持する大腸菌形質
転換体より調製されたヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ
は、好熱菌由来の酵素と同等の性質を有していた。

【００３８】実施例４：培養菌体を用いたヌクレオシド
アナログ（リバビリン）の合成 実施例３と同様の方法で得られたpTrc-NE を保持する大
腸菌 JM109株の培養液１０ｍｌより遠心分離により培養
菌体を回収し、１ｍｌの生理食塩水に懸濁した。この菌
体懸濁液に塩基供与体として４０ ｍＭ １，２，４−ト
リアゾ−ル−３−カルボキサミド（以下、「トリアゾ−
ル」と略称する）、また糖残基供与体として６０ｍＭの
ウリジンを含有する４０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．
０）９ｍｌを添加し、４５℃で１時間反応させリバビリ
ンを合成した。生成したリバビリンは、文献の方法（国
際特許公開ＷＯ ９０／１００８０号 ）に従い、ＨＰＬ
Ｃでリバビリンの生成率を測定した結果、対トリアゾ−
ル比９２％でリバビリンが合成された。また、副産物の
生成は認められなかった。

【００３９】実施例５：菌体抽出液を用いたヌクレオシ
ドアナログ（リバビリン）の合成 実施例４と同組成のトリアゾ−ル、ウリジンを含有する
リン酸緩衝液１０ｍｌに、実施例３で調製された形質転
換体JM109／pTrc-NE由来の菌体抽出液を１８６μｌ添加
（終濃度プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ10 unit/
ml、ピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼとし 5 u
nit/ml）して、５０℃で８時間反応させた。実施例４と
同様の方法でリバビリンの生成率を測定した結果、対ト
リアゾ−ル比９０％でリバビリンが合成されていること
が確認された。また、先と同様、副産物の生成も認めら
れなかった。

【００４０】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、好熱菌 Bacillus stearothermophilus
TH6-2株由来のプリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ及
びピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子
を含有する4.8 kb SacI-EcoRI ＤＮＡ断片の制限酵素地
図を示したものである。

【図２】図２は、好熱菌 Bacillus stearothermophilus
TH6-2株由来のプリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構
造遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したもの
である。図中、S.D.はＳＤ配列を、Met はプリンヌクレ
オシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子の翻訳開始コドン
を、stopはその停止コドンを、Met of gppynはピリミジ
ンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子の翻訳開始
コドンをそれぞれ示す。

【図３】図３は、好熱菌 Bacillus stearothermophilus
TH6-2株由来のピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示した
ものである。図中、S.D. はＳＤ配列を、Metはピリミジ
ンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子の翻訳開始
コドンを、stop of gppunAはプリンヌクレオシド・ホス
ホリラ−ゼ構造遺伝子の終了位置をそれぞれ示す。

【図４】図４は、好熱菌 Bacillus stearothermophilus
TH6-2株由来のピリミジンヌクレオシド・ホスホリラ−
ゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示した
ものである。図中、stopはその停止コドンを示す。な
お、図３及び４に示された塩基配列は一連の連続した塩
基配列である。

【図５】図５は、組換えプラスミドベクタ− pTrc-punA
の構築法を示したものである。

【図６】図６は、組換えプラスミドベクタ− pTrc-pyn
の構築法を示したものである。

【図７】図７は、組換えプラスミドベクタ− pTrc-NE
の構築法を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バシラス属に属する好熱菌に由来し、下
   記式（Ｉ）のアミノ酸配列をコ−ドするプリンヌクレオ
   シド・ホスホリラ−ゼ構造遺伝子を含有するＤＮＡ分
   子。 【式１】
2. 【請求項２】 プリンヌクレオシド・ホスホリラ−ゼ構
   造遺伝子の上流にＳＤ配列を含有する、請求項１記載の
   ＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 バシラス属に属する好熱菌に由来し、下
   記式（ＩＩ）のアミノ酸配列をコ−ドするピリミジンヌ
   クレオシド・ホスホリラーゼ構造遺伝子を含有するＤＮ
   Ａ分子。 【式２】 【式３】
4. 【請求項４】 ピリミジンヌクレオシド・ホスホリラー
   ゼ構造遺伝子の上流にＳＤ配列を含有する、請求項３記
   載のＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 細胞内で複製可能なベクタ−の発現制御
   シグナルの下流に請求項１および／または３記載のＤＮ
   Ａ分子を組み込んでなる、組換えベクタ−。
6. 【請求項６】 発現制御シグナルが大腸菌内で作用する
   プロモーターを少なくとも含むものである、請求項５記
   載の組換えベクタ−。
7. 【請求項７】 請求項５記載の組換えベクタ−で形質転
   換された形質転換体を培養して当該酵素を生産させた、
   好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを保持する
   微生物菌体を含有する培養物。
8. 【請求項８】 請求項７記載の培養物から分離した好熱
   菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ−ゼを保持する微生
   物菌体、またはその処理物。