JPH09224671A - 新規なチトクロームｐ４５０をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 病原菌に対する防御物質を蓄積させたり、二
次代謝産物の合成量を制御するために、それらの反応経
路で重要な役割を果たしていると考えられるジャスモン
酸で特異的に誘導されるチトクロームP450遺伝子を単離
する。 【解決手段】 大豆の培養細胞にジャスモン酸処理を行
い、ジャスモン酸処理細胞と無処理の培養細胞から調製
したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、各々をゲル電気泳動
し、ジャスモン酸処理細胞由来のｃＤＮＡのみに認めら
れ、無処理の培養細胞由来のｃＤＮＡには認められない
バンドをゲルから抽出することによって、チトクローム
P450をコードしているＤＮＡを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なチトクロー
ムP450遺伝子に関し、詳しくは、ジャスモン酸で特異的
に誘導される大豆のチトクロームP450遺伝子およびその
利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ジャスモン酸は、ジャスミンの花から得
られるジャスミン油の香気成分の一つとして単離された
物質であり、ジャガイモの塊茎形成、果実の成熟、植物
の病原菌に対する抵抗反応、植物の成長阻害や葉の老化
促進、気孔開閉制御などの生理作用を有することが知ら
れている。また、ジャスモン酸によって発現が誘導され
る多くのタンパク質（jasmonate induced protein;JI
P）が見い出され、遺伝情報物質としても知られてお
り、ジャスモン酸を用いた遺伝子発現制御に関する研究
も進められている。

【０００３】上記のようなジャスモン酸によって誘導さ
れる遺伝子産物のなかには、プロテイナーゼインヒビタ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7713 (1990))、リ
ボゾーム不活性化タンパク質(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91, 7012 (1994))、植物貯蔵タンパク質（vegetati
ve storage protein (Plant Sci. 62, 45 (1989))、リ
ポキシゲナーゼ(Plant Cell Physiol. 34, 1063 (199
3))などのほか、病原菌の攻撃に対する防御機構に関す
るタンパク質(Annu. Rev. Plant Physiol. PlantMol. B
iol. 44, 569 (1993))が存在することが知られている。

【０００４】ところで、植物のチトクロームP450は、フ
ラボノイド、テルペノイド、アルカロイド等、植物の二
次代謝産物の合成におけるさまざまな酸化反応に関わっ
ていることが報告されている。これらの二次代謝産物の
なかには、紫外線や病原菌に対する防御物質(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 90, 4102 (1993))、花の色素物質(P
lant Mol. Biol. 23, 933 (1993))が含まれている。ま
た、植物の二次代謝産物のうちいくつかの物質は、ジャ
スモン酸処理後に蓄積する(Proc. Natl. Acad.Sci. USA
89, 2389 (1992))ことが明らかにされている。

【０００５】上記のように、植物の二次代謝産物には、
ジャスモン酸で誘導されるもの、及びチトクロームP450
で誘導されるものが知られている。また、植物の二次代
謝産物の一種であるグルコシノレイトの生合成にはジャ
スモン酸およびチトクロームP450が関与していることが
報告されている。例えば、チトクロームP450のインヒビ
ターを添加してグルコシノレイトの合成反応を行うと、
中間体の生成が阻害される（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 92, 12505 (1995))。また、グルコシノレイトのde n
ovoの合成量は、ジャスモン酸処理により８倍増加する
ことが明らかにされている。

【０００６】ジャスモン酸で誘導されるチトクロームP4
50が存在すれば、そのようなチトクロームP450は、グル
コシノレイトの生合成に重要な役割を果たしていると考
えられる。したがって、このようなチトクロームP450遺
伝子が単離されれば、グルコシノレイトの量を調節する
ことができると期待される。また、ジャスモン酸とチト
クロームP450との関係が明らかになれば、紫外線や病原
菌に対する防御物質を大量に発現させることが可能にな
り、病気に強い植物を作出できることが期待される。さ
らに、チトクロームP450遺伝子の発現を制御することが
できれば、二次代謝産物の量をコントロールできると考
えられる。

【０００７】しかしながら、ジャスモン酸とチトクロー
ムP450の関係については知見が得られておらず、チトク
ロームP450遺伝子の発現をジャスモン酸により制御しよ
うとする試みも当然なされていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、ジャスモン酸による遺伝子の発現
機構の解析、及びジャスモン酸を用いた遺伝子の発現制
御を課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ジャスモン
酸処理した後に特異的に出現する遺伝子について研究を
行ったところ、そのような遺伝子の一つを単離すること
に成功し、その遺伝子がチトクロームP450遺伝子である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】具体的には、大豆の培養細胞にジャスモン
酸処理を行い、ディファレンシャルディスプレイ法によ
り複数の遺伝子を単離した。そしてこのうちの１つの遺
伝子がチトクロームP450をコードしていることを明らか
にした。またこの遺伝子のセンス・アンチセンス遺伝子
を作成し、タバコ培養細胞を形質転換して組み換え体植
物を得た。

【００１１】すなわち本発明は、配列表の配列番号２に
示すアミノ酸配列を有し、チトクロームP450としての活
性を実質的に害さない限り１以上のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、付加又は転移を有してもよいチトクロームP4
50、及びこれをコードするＤＮＡである。

【００１２】上記ＤＮＡとして具体的には、例えば配列
表の配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号２５
〜１５５１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げら
れる。尚、上記塩基配列に限らず、遺伝暗号の縮重によ
る同一のアミノ酸配列をコードする異なった塩基配列を
有するＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１３】本発明はまた、配列番号１に示す塩基配列
（センス配列）に相補的な塩基配列（アンチセンス配
列）の少なくとも一部を有するＤＮＡを提供する。さら
に本発明は、上記センス配列またはアンチセンス配列を
有するＤＮＡで形質転換された植物体を提供する。

【００１４】尚、上記の「チトクロームP450としての活
性」とは、通常チトクロームP450が有する酸素添加活性
（この中には基質自身が酸素の受容対となると同時に水
素供与体として働く場合も含まれる。例えば水酸基の添
加など。）であり、具体的には二次代謝産物の合成にお
けるさまざまな反応を触媒する活性である。

【００１５】例えば、トランス桂皮酸に水酸基を添加し
トランスパラクマリン酸を生成する活性、あるいはグル
コシノレイト合成の中間体であるN, N-ジヒドロキシチ
ロシンを生成する過程で水酸基を添加する活性などであ
る。

【００１６】本発明のチトクロームP450の遺伝子は、大
豆の培養細胞をジャスモン酸メチルエステルで処理した
後、特異的に発現が誘導されるものであり、通常の細胞
では発現が検出できない。したがってチトクロームP450
遺伝子は、ジャスモン酸で特異的に誘導される遺伝子で
ある。

【００１７】ジャスモン酸は、多くの遺伝子の発現を誘
導する情報伝達物質として知られている。本発明のチト
クロームP450は、二次代謝産物の合成に関わるさまざま
な酸化反応を触媒する酵素であり、ジャスモン酸によっ
て発現が誘導される。これらの二次代謝産物には、花の
色素物質などが含まれ、この花の色素物質の合成に関わ
るチトクロームP450遺伝子の発現は光によって誘導され
ることが知られているが、本発明のチトクロームP450遺
伝子は、光による誘導はみられない。

【００１８】以上のことから、本発明のチトクロームP4
50は、ジャスモン酸のシグナルを受け取って、紫外線や
病原菌に対する防御物質の合成を制御していると推定さ
れる。したがって、本発明のＤＮＡ利用して、チトクロ
ームP450を植物中で大量発現させれば、病原菌に強い植
物を作出することが可能であると期待される。

【００１９】また、植物の二次代謝産物の一種グルコシ
ノレイトは、おもにナタネ科の植物に含まれている物質
であるが、作物中にこれらが含まれているとその分解物
質の毒性のため市場価値が低くなる。「従来技術」の項
に記載したように、このグルコシノレイトの合成にチト
クロームP450が関与していることが示されている。した
がって、本発明にチトクロームP450は、グルコシノレイ
トの生合成に関わっていることが十分考えられる。この
チトクロームP450の遺伝子のアンチセンス遺伝子をナタ
ネ科の植物に導入すれば、チトクロームP450の発現が抑
制され、グルコシノレイトの量を抑えることができ、市
場価値の高い作物を作出できると期待される。

【００２０】さらに、植物のチトクロームP450は二次代
謝産物の合成に関与しているが、このチトクロームP450
が反応経路の鍵になっている場合があると考えられる。
例えば、チトクロームP450が触媒する反応の前段階の反
応と、後の反応経路を触媒する酵素は活性があるが、チ
トクロームP450の活性が非常に弱い場合などである。こ
のような場合、本発明のチトクロームP450をコードする
ＤＮＡのセンス又はアンチセンス遺伝子を導入してやれ
ば、二次代謝産物の合成量を調節することが可能である
と考えられる。

【００２１】本発明により、ジャスモン酸によって誘導
されるチトクロームP450をコードするｃＤＮＡが得られ
たので、この配列もしくはこの配列を基に作製したオリ
ゴヌクレオチドをプローブに用いたハイブリダイゼーシ
ョン法、あるいは前記オリゴヌクレオチドをプライマー
とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン）法によって、植物染色体ＤＮＡから、チトクローム
P450遺伝子を単離することができる。この遺伝子が有す
るプロモーターは、ジャスモン酸によって誘導され得る
ので、植物体内における遺伝子発現調節に利用できる。

【００２２】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態を説明
する。本発明のＤＮＡは、塩基配列及びそれによってコ
ードするアミノ酸配列が明らとなったので、そのアミノ
酸配列に基づいて合成し、あるいは前記塩基配列に基づ
いて作製した１組のオリゴヌクレオチドをプライマーと
するＰＣＲ法、あるいは前記塩基配列をもとに作製した
オリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼー
ション法により、植物の染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃ
ＤＮＡから単離することができる。尚、染色体ＤＮＡか
らＰＣＲ法による増幅によって本発明のチトクロームP4
50の遺伝子を得た場合には、イントロンが含まれている
可能性が高いが、そのような１つあるいは２以上のイン
トロンを内部に含むものも、本発明のＤＮＡに含まれ
る。

【００２３】上記の方法の中では、ＰＣＲ法が好ましい
が、本発明を完成するに際しては、本発明のＤＮＡはデ
ィファレンシャルディスプレイ法（Science 257, 967
(1992)）によるｃＤＮＡクローニングによって得られた
ものである。

【００２４】本発明のＤＮＡは、植物細胞、例えば大豆
の培養細胞からジャスモン酸によって特異的に誘導され
るｃＤＮＡを単離することによって得られる。具体的に
は、ジャスモン酸処理した培養細胞と無処理の培養細胞
からＲＮＡを抽出し、ディファレンシャルディスプレイ
法（Science 257, 967 (1992)）を行って、ジャスモン
酸処理した培養細胞のみから得られるｃＤＮＡを単離す
る。すなわち、ジャスモン酸処理細胞と無処理の培養細
胞から調製したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、各々をゲ
ル電気泳動し、ジャスモン酸処理細胞由来のｃＤＮＡの
みに認められ、無処理の培養細胞由来のｃＤＮＡには認
められないバンドをゲルから抽出することによって、ジ
ャスモン酸によって誘導される遺伝子由来のｃＤＮＡが
得られる。

【００２５】上記のようにして得られたｃＤＮＡの塩基
配列を決定し、コード領域全長を含んでいないと認めら
れる場合には、得られたｃＤＮＡをプローブとするコロ
ニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイ
ゼーションによって、植物細胞由来のｃＤＮＡライブラ
リーから、ハイブリダイゼーション陽性のクローンをス
クリーニングすればよい。

【００２６】ｃＤＮＡライブラリーは、植物組織からｍ
ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成
し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したものをベク
ターに挿入し、大腸菌等に形質転換することにより作製
することができる。ｃＤＮＡクローニングキットが市販
されているのでこれらを使用してもよい。

【００２７】ライブラリーの作製に用いるベクターは、
多数種市販されており、これらを使用することができ
る。ＤＮＡの切断、連結、形質転換、遺伝子の塩基配列
の決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換え
に必要な方法は、各操作に使用する市販の酵素等に添付
されている説明書や、Molecular cloning (Maniatis T.
et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載
されている。

【００２８】上記のようにしてハイブリダイゼーション
陽性のクローンが得られたら、その塩基配列決定を行
う。塩基配列の決定は、Maxam-Gilbert法あるいは、ダ
イデオキシ法により行う。ダイデオキシ法による塩基配
列の決定は、市販されているキットを用いて行うことが
でき、配列決定を自動的に行うオートシークエンサーを
使用してもよい。

【００２９】上記のようにして得られた本発明のＤＮＡ
の塩基配列を配列番号１に示す。また、この塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。この
アミノ酸配列について、データベース解析を行ったとこ
ろ、アボカドのチトクロームP450 (CYP71A1)、トウモロ
コシのチトクロームP450 (CYP71)、ナスのチトクローム
P450 (CYP71, CYP75)、及びペチュニアのチトクロームP
450 (CYP75)と、それぞれ順に41%、33-35%、35-38%、及
び38%のホモロジーがあることがわかり、チトクロームP
450であることが示された。

【００３０】上記チトクロームP450の遺伝子を、ＣＹＰ
９３Ａ１と命名した。この遺伝子の発現様式を調べるた
めに、ノーザン解析を行った。すなわち、ジャスモン酸
処理した細胞と無処理の細胞からＲＮＡを抽出し、アガ
ロースゲル電気泳動を行い、ゲルからＲＮＡをメンブラ
ンに移した。先に得られたｃＤＮＡをプローブとしてハ
イブリダイゼーションを行ったところ、ＣＹＰ９３Ａ１
は無処理の細胞では発現が見られず、ジャスモン酸処理
した細胞で特異的に発現していることが明らかとなっ
た。したがって、上記ＣＹＰ９３Ａ１は、ジャスモン酸
で特異的に誘導されるチトクロームP450の遺伝子である
ことが明らかとなった。

【００３１】本発明により、ジャスモン酸で特異的に誘
導されるチトクロームP450のｃＤＮＡが得られたので、
この配列を用いたハイブリダイゼーションにより染色体
ＤＮＡライブラリーから、あるいはこのｃＤＮＡ配列に
基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとす
るＰＣＲ法により、染色体ＤＮＡからＣＹＰ９３Ａ１を
単離することができる。

【００３２】本発明のＤＮＡ又はＣＹＰ９３Ａ１の全部
あるいは一部をカリフラワーモザイクウイルス由来のプ
ロモーターなど植物で発現可能なプロモーターと結合
し、これを含む組換えＤＮＡを植物に導入して形質転換
することによって、チトクロームP450を高発現する植物
を作製することが出来る。また、本発明のＤＮＡ又はＣ
ＹＰ９３Ａ１の全部又は一部を、逆方向にプロモーター
に結合したものを植物に導入し、いわゆるアンチセンス
ＲＮＡを発現させることによって、チトクロームP450ｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害し、発現量を抑制させることができ
る。

【００３３】植物の形質転換は、パーティクルガン法、
エレクトロポレーション（電気的穿孔法）あるいはアグ
ロバクテリウムのＴｉプラスミドを利用する方法などに
よって、プロトプラストにＤＮＡを導入することによっ
て行うことができる。

【００３４】ＣＹＰ９３Ａ１のセンス又はアンチセンス
遺伝子が導入されたクローンの選択は、形質転換細胞か
ら得られたカルスあるいは植物体の細胞を採り、サザン
ハイブリダイゼーション等の方法で確認することにより
行えばよい。また、再生後に、植物体の葉の抽出液等の
タンパク中のチトクロームP450をウエスタン解析等によ
り調べる一方、ＣＹＰ９３Ａ１が導入されていることを
サザン解析等により確認することが好ましい。

【００３５】

【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明
する。

【００３６】

【実施例１】チトクロームP450をコードするｃＤＮＡの
単離 ＜１＞ジャスモン酸処理により特異的に発現するｃＤＮ
Ａのディファレンシャルディスプレイ法による単離 大豆の培養細胞（SB-P cells、Jack M. Widholm教授よ
り提供された。Plant Physiol. 72, 426 (1983)参照）
を２０μＭのジャスモン酸メチルエステルおよび１００
μＭのシクロヘキシミドで３０分間処理し、デ・ノボの
タンパク質合成を阻害しつつジャスモン酸で誘導される
ｍＲＮＡを生成させた後、ジャスモン酸処理細胞および
無処理の細胞から、以下に示すようにしてグアニジンチ
オシアネート／ＣｓＣｌ法によりＲＮＡを抽出した。

【００３７】培養細胞それぞれ約１ｇづつを液体窒素中
で粉砕し、それを１４ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネ
ート、１１７ｍＭメルカプトエタノール、２５ｍＭ酢酸
ナトリウム溶液中に入れ、ポリトロンホモジナイザーで
完全に粉砕した。これを、１３，０００×ｇで２５分間
遠心したのち、上清を遠心チューブ内の１．５ｍｌの
５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液上に重層した。これを、１８
２，０００×ｇで２０時間遠心した後、上清を除いた。
沈殿をＴＥ緩衝液に溶かして全ＲＮＡとした。

【００３８】次に、それぞれのＲＮＡを用いて、Ｇｎｅ
Ｈｕｎｔｅｒ社のＲＮＡｍａｐキットを用いてディファ
レンシャルディスプレイ法を行った。ＰＣＲのプライマ
ーは配列番号３〜６に示す４種類のオリゴｄＴプライマ
ー（各配列において、ＶはＧ、Ａ、Ｃが混合されている
ことを示す）と、２０種類の１０マーのランダム配列を
有するプライマーを組み合わせて使用した。これらのプ
ライマーはいずれも前記キットに含まれている。

【００３９】上記のＲＮＡ ０．２μｇを鋳型として、
逆転写酵素（MMLV(Moloney MurineLeukemia Virus) rev
erse transcriptase）を用いてｃＤＮＡを合成した後、
上記のプライマーを加え、９４℃ ３０秒、４０℃ ２
分、７２℃ ３０秒からなる増幅反応を４０サイクル行
った。尚、反応液に、[³⁵S]−ｄＡＴＰを加えて、増幅
産物に[³⁵S]−ｄＡＴＰを取り込ませた。

【００４０】それぞれの反応産物を、シークエンスゲル
（塩基配列決定用ゲル）を用いて電気泳動を行い、オー
トラジオグラムをとった後、ジャスモン酸処理に特異的
に出現するバンドを調べた。ジャスモン酸処理した細胞
由来のＲＮＡから増幅され、無処理の細胞由来のＲＮＡ
からは増幅されなかったＤＮＡのバンドをゲルから切り
出し、ＴＥ緩衝液中でボイリングしてゲル断片からＤＮ
Ａを抽出した。得られたＤＮＡをもとに、初めの反応と
同じプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅し
た。増幅されたＤＮＡは、ｐＣＲII (Invitrogen社製)
ベクターにサブクローニングし、以後の解析に用いた。

【００４１】＜２＞長鎖ｃＤＮＡの単離 上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンの１つをＧ
９と命名した。このＧ９をプローブとするプラークハイ
ブリダイゼーションにより、ジャスモン酸処理した大豆
の培養細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーから、Ｇ
９にハイブリダイズするｃＤＮＡの検索を行った。二本
鎖ｃＤＮＡは、大豆の培養細胞を５０μＭのジャスモン
酸で１時間処理し、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣ
ｌ法により抽出した全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ調製キット
（mRNA Purification Kit (Pharmacia社製)）を用いて
精製したポリ(A)⁺RNAを用い、ｃＤＮＡ合成キット（cDN
A Synthesis Kit (Pharmacia社製)）により作製した。
得られた二本鎖ｃＤＮＡをλＺＡＰII（Stratagene社
製）ベクターに挿入し、得られた組換えベクターでイン
ビトロ・パッケージングを行ってλファージによるｃＤ
ＮＡライブラリーを得た。

【００４２】ハイブリダイゼーション陽性のクローンの
うち最も長いクローンをＧ９−３とし、さらに解析を行
った。

【００４３】＜３＞塩基配列の決定 Ｇ９−３の塩基配列を塩基配列決定キット（BcaBEST Di
deoxy Sequence Kit (宝酒造(株)製）を用いてジデオキ
シ法により決定したところ、このｃＤＮＡは１６５９ｂ
ｐからなり、５０９アミノ酸をコードする１つのオープ
ンリーディングフレームを含んでいることが明らかとな
った。そして、このｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列
についてデータベース検索を行ったところ、この配列
は、アボカドのチトクロームP450 (CYP71A1)、トウモロ
コシのチトクロームP450 (CYP71)、ナスのチトクローム
P450 (CYP71, CYP75)、及びペチュニアのチトクロームP
450(CYP75)と、それぞれ順に41%、33-35%、35-38%、及
び38%のホモロジーがあることがわかり、Ｇ９−３は大
豆のチトクロームP450をコードしていることが示され
た。

【００４４】こうして得られたｃＤＮＡが由来する遺伝
子を、ＣＹＰ９３Ａ１と命名した。

【００４５】＜４＞チトクロームP450遺伝子の発現解析 ＣＹＰ９３Ａ１の発現様式を調べるために、ジャスモン
酸処理した大豆培養細胞と無処理の細胞からＲＮＡを抽
出し、Ｇ９（３０９ｂｐ）をプローブとしてハイブリダ
イゼーションを行った。

【００４６】ＲＮＡの抽出は、グアニジンチオシアネー
ト／フェノールクロロホルム法により行った。１．６ｍ
ｌの４．２３Ｍグアニジンチオシアネート，２５ｍＭク
エン酸ナトリウム溶液と、０．２ｍｌの２０％サルコシ
ル溶液と、０．２ｍｌの２−メルカプトエタノール溶液
と、２ｍｌのフェノール／クロロホルム溶液とを混合
し、この混合溶液に培養細胞約１．５ｇを加え、培養細
胞を粉砕した。これを、３，０００ｒｐｍで１０分間遠
心を行い、上清をフェノール／クロロホルムで抽出した
後、さらにクロロホルムで抽出を行った。得られた溶液
にエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させた後、沈殿を１
ｍｌの水に溶解し、２５０μｌの１０ＭＬｉＣｌ溶液を
加えて４℃で２時間以上静置した。これを遠心してＲＮ
Ａの沈殿を回収した。

【００４７】上記のようにして得られたＲＮＡ ２０μ
ｇをアガロースゲルで電気泳動した後、ＲＮＡをナイロ
ンメンブランに移した。Ｇ９を³²Ｐで標識してプローブ
とし、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーションを６０℃で１６時間行い、０．２×
ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ溶液中６０℃で３０分間洗浄
を行った後、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラム
をとった。

【００４８】その結果、ＣＹＰ９３Ａ１は、ジャスモン
酸無処理の細胞では発現が見られず、ジャスモン酸処理
した細胞で特異的に発現していることが明らかとなっ
た。したがって、このＣＹＰ９３Ａ１は、ジャスモン酸
で特異的に誘導されるチトクロームP450の遺伝子である
ことが明らかとなった。

【００４９】

【実施例２】チトクロームP450のセンス遺伝子及びアン
チセンス遺伝子の植物への導入 ＜１＞センス・アンチセンス遺伝子の作成 ＣＹＰ９３Ａ１を植物中で強いプロモーター活性を有す
るカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの
下流に正方向につないだセンス遺伝子、逆方向につない
だアンチセンス遺伝子を作成した。すなわち、センス遺
伝子を作成するためにカリフラワーモザイクウイルス３
５Ｓプロモーターを有するプラスミドｐＢＩ１２１（Cl
ontech社製）のＧＵＳ遺伝子を取り除き、それによって
生じたＳｍａＩ部位とＳａｃＩ部位に、Ｇ９−３ ＤＮ
Ａ断片を正方向に挿入した。

【００５０】また、アンチセンス遺伝子を作成するため
にプラスミドｐＢＩ１２１のＧＵＳ遺伝子の後ろのＳａ
ｃＩ部位にＧ９−３ ＤＮＡの１ｋｂ断片を逆方向に挿
入した。尚、ｐＢＩ１２１は、カナマイシン耐性マーカ
ーを有している。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ
プロモーター、Ｇ９−３にそれぞれ特異的なプライマー
を作成し、得られたプラスミドをもとに特異的なプライ
マーを使ってＰＣＲ反応を行い、Ｇ９−３ ＤＮＡ断片
がプロモーターに対してセンス方向に挿入されたプラス
ミド、及びアンチセンス方向に挿入されたプラスミドを
得た。前者をＣＹＰ９３Ａ１−Ｓと、後者をＣＹＰ９３
Ａ１−Ａと命名した。

【００５１】＜２＞タバコ培養細胞への遺伝子導入 ＣＹＰ９３Ａ１−Ｓ及びＣＹＰ９３Ａ１−Ａを、パーテ
ィクルガンによりタバコ培養細胞ＢＹ−２に導入した。
こうして形質転換された培養細胞を、カナマイシンの入
ったプレートで培養し、遺伝子が導入された細胞を選抜
した。

【００５２】

【発明の効果】本発明のＤＮＡは、新規なチトクローム
P450をコードしている。このチトクーロムP450を植物中
で大量に発現させることにより、病原菌に対する防御物
質を蓄積させると期待できる。

【００５３】また、本発明のＤＮＡまたはその一部をア
ンチセンス遺伝子として植物に導入すれば、グルコシノ
レイトの合成量を抑えることが可能となり、有用な作物
を作出できると期待できる。

【００５４】さらに、チトクロームP450が関与している
二次代謝産物の量を増加あるいは減少させたい場合、上
記チトクロームP450のセンス遺伝子あるいはアンチセン
ス遺伝子を植物に導入することにより、二次代謝産物の
合成量を調節できると期待できる。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1658 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ダイズ 株名：SB-P 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：25..1551 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 TCTCAAGCAA GCTAAGGCAT TATT ATG GCT TAT CAA GTG TTG CTA ATT TGT 51 Met Ala Tyr Gln Val Leu Leu Ile Cys 1 5 TTG GTC TCC ACC ATA GTG TTT GCA TAC ATA CTA TGG AGA AAA CAA AGC 99 Leu Val Ser Thr Ile Val Phe Ala Tyr Ile Leu Trp Arg Lys Gln Ser 10 15 20 25 AAG AAA AAC CTT CCA CCA AGT CCA AAG GCC CTT CCC ATA ATT GGC CAC 147 Lys Lys Asn Leu Pro Pro Ser Pro Lys Ala Leu Pro Ile Ile Gly His 30 35 40 CTC CAC CTT GTG TCC CCA ATT CCC CAC CAA GAT TTT TAC AAG CTC TCA 195 Leu His Leu Val Ser Pro Ile Pro His Gln Asp Phe Tyr Lys Leu Ser 45 50 55 ACC CGC CAC GGA CCC ATC ATG CAA CTT TTC CTT GGC TCA GTC CCT TGT 243 Thr Arg His Gly Pro Ile Met Gln Leu Phe Leu Gly Ser Val Pro Cys 60 65 70 GTG GTG GCT TCC ACC GCA GAA GCC GCC AAA GAG TTC CTT AAA ACC CAC 291 Val Val Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ala Lys Glu Phe Leu Lys Thr His 75 80 85 GAA ATC AAC TTC TCC AAC CGC CCC GGC CAA AAC GTC GCC GTT AAG GGC 339 Glu Ile Asn Phe Ser Asn Arg Pro Gly Gln Asn Val Ala Val Lys Gly 90 95 100 105 TTA GCC TAC GAT TCC CAA GAC TTC CTT TTC GCG TTT GCA CCC TTC GGA 387 Leu Ala Tyr Asp Ser Gln Asp Phe Leu Phe Ala Phe Ala Pro Phe Gly 110 115 120 CCC TAC TGG AAG TTC ATG AAG AAA CTC TGC ATG TCC GAG CTT CTC AGC 435 Pro Tyr Trp Lys Phe Met Lys Lys Leu Cys Met Ser Glu Leu Leu Ser 125 130 135 GGC CGA ATG ATG GAC CAG TTC CTT CCC GTG AGG CAG CAA GAG ACC AAG 483 Gly Arg Met Met Asp Gln Phe Leu Pro Val Arg Gln Gln Glu Thr Lys 140 145 150 AGA TTC ATC AGC CGC GTG TTC CGA AAA GGA GTC GCC GGC GAG GCC GTG 531 Arg Phe Ile Ser Arg Val Phe Arg Lys Gly Val Ala Gly Glu Ala Val 155 160 165 GAT TTC GGA GAC GAG CTC ATG ACA CTC TCC AAC AAC ATC GTA TCC AGA 579 Asp Phe Gly Asp Glu Leu Met Thr Leu Ser Asn Asn Ile Val Ser Arg 170 175 180 185 ATG ACG CTG AGT CAG AAG ACT TCT GAG AAC GAC AAC CAG GCT GAG GAG 627 Met Thr Leu Ser Gln Lys Thr Ser Glu Asn Asp Asn Gln Ala Glu Glu 190 195 200 ATG AAG AAG CTC GTG TCG AAT ATC GCG GAG CTC ATG GGG AAG TTC AAC 675 Met Lys Lys Leu Val Ser Asn Ile Ala Glu Leu Met Gly Lys Phe Asn 205 210 215 GTT TCG GAC TTC ATT TGG TAC CTG AAG CCT TTC GAT TTG CAG GGG TTC 723 Val Ser Asp Phe Ile Trp Tyr Leu Lys Pro Phe Asp Leu Gln Gly Phe 220 225 230 AAC AGA AAA ATC AAG GAG ACT CGG GAC AGG TTT GAC GTT GTG GTG GAC 771 Asn Arg Lys Ile Lys Glu Thr Arg Asp Arg Phe Asp Val Val Val Asp 235 240 245 GGA ATC ATA AAG CAG CGT CAA GAG GAA AGA AGG AAA AAC AAA GAA ACG 819 Gly Ile Ile Lys Gln Arg Gln Glu Glu Arg Arg Lys Asn Lys Glu Thr 250 255 260 265 GGC ACA GCA AAA CAG TTT AAG GAC ATG CTT GAT GTT TTA TTG GAC ATG 867 Gly Thr Ala Lys Gln Phe Lys Asp Met Leu Asp Val Leu Leu Asp Met 270 275 280 CAC GAA GAT GAG AAT GCT GAA ATC AAA TTA GAC AAA AAA AAC ATT AAG 915 His Glu Asp Glu Asn Ala Glu Ile Lys Leu Asp Lys Lys Asn Ile Lys 285 290 295 GCC TTC ATC ATG GAC ATA TTT GTT GCT GGG ACT GAC ACG TCA GCT GTA 963 Ala Phe Ile Met Asp Ile Phe Val Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ala Val 300 305 310 AGC ATA GAA TGG GCT ATG GCA GAG TTA ATC AAC AAT CCA GAT GTG TTG 1011 Ser Ile Glu Trp Ala Met Ala Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asp Val Leu 315 320 325 GAG AAG GCA AGG CAA GAG ATA GAT GCG GTG GTT GGA AAA AGT AGA ATG 1059 Glu Lys Ala Arg Gln Glu Ile Asp Ala Val Val Gly Lys Ser Arg Met 330 335 340 345 GTA GAA GAA TCA GAT ATT GCC AAC CTT CCT TAC TTG CAA GCC ATT GTT 1107 Val Glu Glu Ser Asp Ile Ala Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Val 350 355 360 AGA GAA ACA CTT AGG CTT CAC CCA GGT GGT CCA TTG GTT GTT AGA GAA 1155 Arg Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Gly Gly Pro Leu Val Val Arg Glu 365 370 375 TCA TCA AAA AGT GCG GTG GTT TGT GGG TAT GAT ATT CCA GCA AAG ACT 1203 Ser Ser Lys Ser Ala Val Val Cys Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Lys Thr 380 385 390 CGA TTA TTT GTC AAT GTT TGG GCT ATT GGT AGG GAT CCC AAT CAC TGG 1251 Arg Leu Phe Val Asn Val Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn His Trp 395 400 405 GAG AAA CCT TTT GAG TTT AGG CCA GAG AGG TTT ATC AGA GAT GGG CAA 1299 Glu Lys Pro Phe Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Ile Arg Asp Gly Gln 410 415 420 425 AAT CAA TTG GAT GTT AGG GGA CAA CAT TAT CAT TTT ATT CCA TTC GGG 1347 Asn Gln Leu Asp Val Arg Gly Gln His Tyr His Phe Ile Pro Phe Gly 430 435 440 AGT GGA AGA AGA ACG TGC CCT GGT GCT TCT CTA GCG TGG CAG GTT GTG 1395 Ser Gly Arg Arg Thr Cys Pro Gly Ala Ser Leu Ala Trp Gln Val Val 445 450 455 CCT GTG AAT CTG GCT ATA ATT ATT CAA TGT TTC CAA TGG AAG CTT GTT 1443 Pro Val Asn Leu Ala Ile Ile Ile Gln Cys Phe Gln Trp Lys Leu Val 460 465 470 GGT GGC AAT GGC AAG GTG GAC ATG GAA GAG AAG TCT GGC ATC ACT CTT 1491 Gly Gly Asn Gly Lys Val Asp Met Glu Glu Lys Ser Gly Ile Thr Leu 475 480 485 CCG AGG GCT AAC CCC ATA ATT TGT GTC CCT GTT CCA AGG ATT AAC CCA 1539 Pro Arg Ala Asn Pro Ile Ile Cys Val Pro Val Pro Arg Ile Asn Pro 490 495 500 505 TTC CCT ACT ATT TGATTGTGAC TCCGAATGTT ATTCAATAAC CAGTGAGAGA 1591 Phe Pro Thr Ile AAAAAATAAT AATAAACAAT ATGATCTGAT AAGAGAAAAA TAATAAAGCC AGTTTCTTTC 1651 TTAAAAA 1658

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：509 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Tyr Gln Val Leu Leu Ile Cys Leu Val Ser Thr Ile Val Phe 1 5 10 15 Ala Tyr Ile Leu Trp Arg Lys Gln Ser Lys Lys Asn Leu Pro Pro Ser 20 25 30 Pro Lys Ala Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Val Ser Pro Ile 35 40 45 Pro His Gln Asp Phe Tyr Lys Leu Ser Thr Arg His Gly Pro Ile Met 50 55 60 Gln Leu Phe Leu Gly Ser Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Ala Glu 65 70 75 80 Ala Ala Lys Glu Phe Leu Lys Thr His Glu Ile Asn Phe Ser Asn Arg 85 90 95 Pro Gly Gln Asn Val Ala Val Lys Gly Leu Ala Tyr Asp Ser Gln Asp 100 105 110 Phe Leu Phe Ala Phe Ala Pro Phe Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Met Lys 115 120 125 Lys Leu Cys Met Ser Glu Leu Leu Ser Gly Arg Met Met Asp Gln Phe 130 135 140 Leu Pro Val Arg Gln Gln Glu Thr Lys Arg Phe Ile Ser Arg Val Phe 145 150 155 160 Arg Lys Gly Val Ala Gly Glu Ala Val Asp Phe Gly Asp Glu Leu Met 165 170 175 Thr Leu Ser Asn Asn Ile Val Ser Arg Met Thr Leu Ser Gln Lys Thr 180 185 190 Ser Glu Asn Asp Asn Gln Ala Glu Glu Met Lys Lys Leu Val Ser Asn 195 200 205 Ile Ala Glu Leu Met Gly Lys Phe Asn Val Ser Asp Phe Ile Trp Tyr 210 215 220 Leu Lys Pro Phe Asp Leu Gln Gly Phe Asn Arg Lys Ile Lys Glu Thr 225 230 235 240 Arg Asp Arg Phe Asp Val Val Val Asp Gly Ile Ile Lys Gln Arg Gln 245 250 255 Glu Glu Arg Arg Lys Asn Lys Glu Thr Gly Thr Ala Lys Gln Phe Lys 260 265 270 Asp Met Leu Asp Val Leu Leu Asp Met His Glu Asp Glu Asn Ala Glu 275 280 285 Ile Lys Leu Asp Lys Lys Asn Ile Lys Ala Phe Ile Met Asp Ile Phe 290 295 300 Val Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ala Val Ser Ile Glu Trp Ala Met Ala 305 310 315 320 Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asp Val Leu Glu Lys Ala Arg Gln Glu Ile 325 330 335 Asp Ala Val Val Gly Lys Ser Arg Met Val Glu Glu Ser Asp Ile Ala 340 345 350 Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Val Arg Glu Thr Leu Arg Leu His 355 360 365 Pro Gly Gly Pro Leu Val Val Arg Glu Ser Ser Lys Ser Ala Val Val 370 375 380 Cys Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Lys Thr Arg Leu Phe Val Asn Val Trp 385 390 395 400 Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn His Trp Glu Lys Pro Phe Glu Phe Arg 405 410 415 Pro Glu Arg Phe Ile Arg Asp Gly Gln Asn Gln Leu Asp Val Arg Gly 420 425 430 Gln His Tyr His Phe Ile Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Thr Cys Pro 435 440 445 Gly Ala Ser Leu Ala Trp Gln Val Val Pro Val Asn Leu Ala Ile Ile 450 455 460 Ile Gln Cys Phe Gln Trp Lys Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Asp 465 470 475 480 Met Glu Glu Lys Ser Gly Ile Thr Leu Pro Arg Ala Asn Pro Ile Ile 485 490 495 Cys Val Pro Val Pro Arg Ile Asn Pro Phe Pro Thr Ile 500 505

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他のＤＮＡ．．合成ＤＮＡ 配列 TTTTTTTTTT TTVG 14

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他のＤＮＡ．．合成ＤＮＡ 配列 TTTTTTTTTT TTVA 14

【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他のＤＮＡ．．合成ＤＮＡ 配列 TTTTTTTTTT TTVT 14

【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他のＤＮＡ．．合成ＤＮＡ 配列 TTTTTTTTTT TTVC 14

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 太田 啓之 神奈川県横浜市緑区長津田4259 東京工業 大学生命理工学部内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列
   を有し、チトクロームP450としての活性を実質的に害さ
   ない限り１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又
   は転移を有してもよいチトクロームP450をコードするＤ
   ＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示す塩基配列にお
   いて、塩基番号２５〜１５５１で表される塩基配列を有
   する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩
   基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡで形質転換された
   植物体。
5. 【請求項５】 請求項３記載のＤＮＡで形質転換された
   植物体。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列
   を有し、酸素添加活性を実質的に害さない限り１以上の
   アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は転移を有しても
   よいチトクロームP450。