JPH09238676A - ビブリオ エスピー ｓｍｙ−２株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、比活性の高いアルカリフォスファ
ターゼ産生能を有する微生物を提供することを目的とす
る。 【解決手段】 本発明は、ビブリオ（Vibrio）属に属
し、アルカリフォスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．
１）産生能を有するビブリオ エスピー（Vibrio sp.）
ＳＭＹ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１７）を提供す
る。本発明のビブリオエスピー ＳＭＹ−２株の生育は
図１に示すように、培養開始から約８時間後に最大に達
し、また、菌体内のＡｌＰ活性は、培養開始から約５時
間後から急激に上昇し、約８時間後に最大に達し、培養
を終了した約１５時間後まで、その活性は変化しなかっ
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、比活性の高いアル
カリフォスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．１）（以
下、ＡｌＰと略記する）を産生する新規な微生物に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素は、その反応の安定性や基質
の特異性が着目され、光学的定量化の容易性から、医療
分野や食品分野などで各種成分の分析などに広く利用さ
れている。なかでもＡｌＰは、酵素免疫測定法における
標識酵素として種々の診断に広く用いられている。Ａｌ
Ｐを標識酵素として用いる場合、分析対象となる物質の
抗原、抗体、又は目的の分析対象物質に特異的に結合す
る物質にＡｌＰを結合させ、これを検査試料に添加して
分析対象物質と結合させることで新たに生じた結合体を
分別し、この結合体のＡｌＰ活性を測定することによ
り、分析対象物質を定量することができる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この様な分析では、分
析対象物質が、検査試料中に微量にしか存在しない場合
が多く、このため測定感度に優れた分析条件が望まれ
る。ＡｌＰによる標識は、ＡｌＰと上述の物質との分子
間での結合によるため、高い測定感度を得るためには、
ＡｌＰ分子が高い活性を示すことが必要である。そのた
めには、標識酵素であるＡｌＰが高い比活性を有するこ
とが望ましい。

【０００４】従来、ＡｌＰは、主として大腸菌あるいは
仔ウシ小腸から生産されており、その供給源が限られて
いた。しかし、大腸菌由来のＡｌＰは比活性が低いた
め、標識酵素としては、主に、仔ウシ小腸由来のＡｌＰ
が用いられている。しかし、仔ウシ小腸由来ＡｌＰは、
臓器からの破砕抽出の際、プロテアーゼや、有機溶剤を
用いる等、煩雑な操作を経た後、数種のカラムを用いて
精製しなければならなかった。

【０００５】このような理由から、高い比活性を示すＡ
ｌＰを効率よく得るための手段が強く要望されていた。
本発明は、高い比活性を示すＡｌＰを産生する新規な微
生物を提供することを目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために、自然界の微生物を対象に広くスク
リーニングした結果、高い比活性を示すＡｌＰを産生す
るビブリオ属に属する微生物を見出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、ビブリオ（Vibrio）
属に属し、ＡｌＰ産生能を有することを特徴とするビブ
リオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５０１７）を要旨とするものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】まず、本発明の菌株であるビブリオ エス
ピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株と、その類縁と考えら
れる既存のビブリオ属菌であるビブリオ スプレンディ
ダス（Vibrio splendidus biovar 1及びbiovar 2）及び
ビブリオ ツビアシ（Vibriotubiashii）の菌学的性質
について説明する。なお、ｄは菌株によって異なること
を、NDは記載がないことを、FAは通性嫌気性を示す。

【００１０】 Vibrio sp. Vibrio splendidus Vibrio SMY-2 biovar 1 biovar 2 tubiashii （１）形態的特徴 （ａ）細胞の形 桿菌 桿菌 桿菌 桿菌 （ｂ）運動性 有 有 有 有 （ｃ）鞭毛 単極毛 極毛 極毛 極毛 （ｄ）胞子形成能 無 無 無 無 （ｅ）グラム染色性 陰性 陰性 陰性 陰性 （２）生育状態 （ａ）ZoBell 2216b 円形を示し ND ND ND 寒天平板培養 表面は平滑 （ｂ）ゼラチンの液化 有 有 有 有 （３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 無 有 有 有 （ｂ）ＶＰテスト 陰性 陰性 陰性 陰性 （ｃ）オキシダーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｄ）カタラーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｅ）色素の生成 無 無 無 無 （ｆ）発光性 無 有 無 無 （ｇ）デンプンの 有 有 有 有 加水分解 （ｈ）アルギニンの 有 無 無 ｄ 加水分解 （ｉ）塩類要求性 0%NaCl下での生育 無 ND ND ND 2%NaCl下での生育 有 ND ND ND （ｊ）生育の範囲 ４℃での生育 無 ｄ 無 無 ３５℃での生育 有 ｄ 無 ｄ （ｋ）酸素に対する挙動 FA FA FA FA （ｌ）ＯＦテスト Ｆ Ｆ Ｆ Ｆ （ｍ）ＰＨＢの蓄積 無 無 無 ND （ｎ）ＰＨＢの利用能 無 無 無 ｄ （ｏ）リパーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｐ）マンニトール 無 有 有 有 資化性 （ｑ）各種炭素源から の酸の生成 Ｄ−グルコース 有 有 有 ND セロビオース 無 有 ｄ 有 Ｄ−ガラクトース 無 有 無 有 グルコン酸 無 ｄ 無 有 Ｌ−グルタミン酸 有 有 ｄ ND グリシン 有 有 ｄ 有 プトレスシン 無 無 無 ｄ シュークロース 有 ｄ 無 有 トレハロース 有 有 有 有 （ｒ）グルコースから 無 無 無 無 のガスの産生 （３）ＤＮＡのＧＣ含量 45 45〜46 45〜46 43〜45 （モル％） 以上に示したビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ
−２株についての菌学的性質から、バージィのマニュア
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Barg
ey’s Mannual of Systematic Bacteriology） 第１巻
（１９８４年）、バージィのマニュアル・オブ・ディタ
ーミネイティブ・バクテリオロジィー（Bargey’s Mann
ual of Determinative Bacteriology ） 第９版（１９
９４年）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（International Jo
urnal of Systematic Bacteriology） 第３４巻、１〜
４頁（１９８４年）に記載されている各種細菌の性状か
ら検討した結果、本菌株はビブリオ（Vibrio）属に属す
る細菌と判明した。

【００１１】また、本菌株は、上述した文献に記載され
ているビブリオ属細菌のうち、ビブリオ スプレンディ
ダス（Vibrio splendidus biovar 1及びbiovar 2）及び
ビブリオ ツビアシ（Vibrio tubiashii）とよく似た性
状を示したが、本菌株が硝酸塩の還元能及びマンニトー
ルの資化性能が無いのに対し、ビブリオ スプレンディ
ダス（Vibrio splendidus biovar 1及びbiovar 2）及び
ビブリオ ツビアシ（Vibrio tubiashii）は、共にその
能力を有することから、本菌株はこれらの種とは異なる
ものであると判断された。よって、本菌株は、新菌株と
判断できるので、ビブリオ エスピー（Vibrio sp.）Ｓ
ＭＹ−２株と命名し、平成７年６月２９日付で通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５０１７である。

【００１２】本発明の菌株を培養する際の栄養培地に添
加する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸
などの無機物又は有機物が使用できる。また、炭素源と
しては、グルコース、シュークロース、デンプンなどが
使用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナ
トリウム、鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、
ビタミン類などを使用してもよい。

【００１３】培養条件としては、好気的あるいは微好気
的条件で行われ、培養温度としては、１０〜３５℃で行
われ、好ましくは２０〜３０℃、最適には２５〜３０℃
下で行われる。培地のｐＨとしては、６．０〜９．５、
好ましくは７．０〜９．０、最適には７．４〜８．６で
ある。このような条件下で３〜４０時間、好ましくは４
〜２０時間、最適には５〜１５時間培養することによ
り、ＡｌＰ産生能を有する菌体を得ることができる。

【００１４】このようにして得られた菌株からＡｌＰを
単離・精製する方法としては、例えば、培養終了後、遠
心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収し、菌
体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。抽出法とし
ては、超音波破砕、圧破砕、界面活性剤処理、リゾチー
ム処理などいずれを用いてもよく、こうした処理後、遠
心分離により細胞片を除去し、粗酵素液を得る。粗酵素
液については、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより、目的とするＡｌＰを単離
・精製することができる。イオン交換樹脂としては、Ｑ
ＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−
セファロースＦＦ（ファルマシア社製）など、アフィニ
ティークロマト用樹脂としては、レッドセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（以
上、ファルマシア社製）など、疎水クロマト用樹脂とし
ては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）、フェニルセファロース６ＦＦ（ファル
マシア社製）など、ゲル濾過用担体又は樹脂としては、
セファデックスＧ−１００、ウルトロゲルＡＣＡ３４な
どが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフ
ィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン
処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパ
ク質の塩析を行ってもよい。

【００１５】なお、活性の測定は１０ｍＭのｐ−ニトロ
フェニルリン酸ナトリウム（以下、ＰＮＰＰと略記す
る。：ナカライテスクより購入、コードＮｏ．２５０−
１９ＧＲ）、１．０ｍＭの塩化マグネシウム６水和物
（和光純薬より購入、コードＮｏ．１３５−００１６
５）を含む１Ｍのジエタノールアミン（以下、ＤＥＡと
略記する。：和光純薬より購入、コードＮｏ．０９３−
０３１１５）緩衝液（ｐＨ１０．０）に酵素溶液を加
え、緩やかに混和した後、４０５ｎｍにおける吸光度変
化により測定した。なお、測定は、３７℃で行い、１分
間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成させ
る酵素量を１単位（Ｕ）とした。

【００１６】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。

【００１７】［実施例１］酵母エキス０．１％（重量％
を表す。以下同様）（オリエンタル酵母工業、コードＮ
ｏ．４１２０７０００）、カザミノ酸（日本製薬、カザ
ミノ酸「ダイゴ」、コードＮｏ．３９８−００６５７）
０．５％、クエン酸鉄 (III)ｎ水和物（和光純薬、コー
ドＮｏ．０９７−０２４１５）０．０１％、塩化ナトリ
ウム（和光純薬、コードＮｏ．１９４−０１６７７）
２．０％、塩化マグネシウム・６水和物（和光純薬、コ
ードＮｏ．１３５−００１６５）０．８８％、硫酸ナト
リウム・１０水和物（和光純薬、コードＮｏ．１９３−
０３３２５）０．３２％、塩化カルシウム・６水和物
（ナカライテスク、コードＮｏ．０６７−３２ＥＰ）
０．１８％、塩化カリウム（ナカライテスク、コードＮ
ｏ．２８５−１３ＥＰ）０．０５５％、炭酸ナトリウム
（和光純薬、コードＮｏ．１９６−０１５９５）０．０
１６％、硫酸鉄（II）・７水和物（ナカライテスク、コ
ードＮｏ．１９５−３１ＥＰ）０．００１％、臭化カリ
ウム（ナカライテスク、コードＮｏ．２８５−０２Ｅ
Ｐ）０．００８％、塩化ストロンチウム・６水和物（ナ
カライテスク、コードＮｏ．３２５−０８ＥＰ）０．０
０３４％、ホウ酸（和光純薬、コードＮｏ．０２１−０
２１９５）０．０２２％、ケイ酸ナトリウム（和光純
薬、コードＮｏ．１９０−０３２１５）０．０００４
％、フッ化ナトリウム（和光純薬、コードＮｏ．１９６
−０１９７５）０．００２４％、硝酸ナトリウム（和光
純薬、コードＮｏ．１９２−０２５５５）０．０００１
６％、リン酸２ナトリウム・１２水和物（ナカライテス
ク、コードＮｏ．３１７−２２ＥＰ）０．０００８％、
ｐＨ７．６よりなる培地２０リットルを３０リットル容
のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間
オートクレーブ滅菌した後、ビブリオ エスピー（Vibr
io sp.）ＳＭＹ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１７）を
接種し、２８℃で１５時間、０．５vvm 、３００ｒｐｍ
で通気・攪拌しながら培養した。この際、経時的に菌の
生育及び菌体内のＡｌＰ活性を調べた。

【００１８】菌の生育は、培養液の濁度（ＯＤ６６０）
を測定することにより調べた。また、菌体内のＡｌＰ活
性は、以下の手順で測定した。すなわち、培養液１ｍｌ
を遠心分離し、沈殿した菌体を、２０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁し、２００Ｗで１０分間
超音波処理することにより細胞を破砕した。破砕後、遠
心分離により細胞片を除去し、得られた上清中のＡｌＰ
活性を測定した。

【００１９】その結果を図１に示す。図１は、本発明の
ビブリオ エスピー ＳＭＹ−２株を培養したときの、
菌の生育及び菌体内のＡｌＰ活性の経時変化を示す図で
あり、縦軸に菌の生育及び培養液１ｍｌ中の菌体のＡｌ
Ｐ活性を、横軸に培養時間を示している。

【００２０】図１からわかるように、培養開始から約８
時間後に菌の生育は最大に達し、また、菌体内のＡｌＰ
活性は、培養開始から約５時間後から急激に上昇し、約
８時間後に最大に達し、培養を終了した約１５時間後ま
で、その活性は変化しなかった。

【００２１】培養終了後、遠心分離により菌体を採取し
て約７０ｇの菌体を得た。菌体中のＡｌＰ含量を測定し
たところ、約２６０万Ｕ／ｋｇ湿菌体の値を示した。得
られた菌体を凍結状態で保存した。

【００２２】［参考例１］実施例１で得た凍結菌体約５
０ｇを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．４リ
ットルに懸濁し、２００Ｗで１０分間超音波処理するこ
とにより細胞を破砕した。破砕後、遠心分離により細胞
片を除去し、ＡｌＰを含む粗酵素液を得た。 この粗酵
素液を、予め２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ファルマシ
ア、コードＮｏ．１７−０７０９−０１）カラム（カラ
ムサイズ、内径３．２ｃｍ、高さ１２ｃｍ）に通じ、
０．５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で溶出したところ、ＮａＣｌ濃度０．２〜
０．３Ｍ近くに活性が溶出した。

【００２３】この溶出画分を、予め２０ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＱＡＥ−トヨパール５
５０Ｃ（東ソー社製、コードＮｏ．０１４０２６）カラ
ム（カラムサイズ、内径３．２ｃｍ、高さ５ｃｍ）に通
じ、ＮａＣｌ濃度を徐々に上げて溶出させたところ、Ｎ
ａＣｌ濃度０．６〜０．８Ｍの近くに活性画分が溶出し
た。この溶出画分に、硫酸アンモニウム（和光純薬、コ
ードＮｏ．０１９−０６７３５）を１．０Ｍになるよう
に加え、予め１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたフェニルセフ
ァロース６ＦＦ（ファルマシア社製、コードＮｏ．１７
−０９７３−０５）カラム（カラムサイズ、内径１．６
ｃｍ、高さ５ｃｍ）に通じ、同緩衝液の硫酸アンモニウ
ム濃度を徐々に下げて溶出したところ、硫酸アンモニウ
ム濃度０．３〜０．２Ｍの近くに活性画分が溶出した。

【００２４】この活性画分を集めて脱塩後、２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したレッドセファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、コードＮｏ．１７
−０９６１−０２）カラム（カラムサイズ、内径１．６
ｃｍ、高さ５ｃｍ）に通じ、ＮａＣｌ濃度を徐々に上げ
て溶出したところ、ＮａＣｌ濃度０．６〜０．８Ｍ付近
に活性画分が溶出した。このようにして得られたＡｌＰ
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一なバ
ンドとして検出され、精製酵素標品を得ることができ
た。また、活性の収率は約１５％で、酵素１ｍｇ当たり
約８，３００Ｕの比活性を示した。得られたＡｌＰは以
下の理化学的性質を示していた。

【００２５】（１）作用及び基質特異性：アルカリ性で
リン酸モノエステルを加水分解する。リン酸モノエステ
ルがｐ−ニトロフェニルリン酸の場合の反応のミカエリ
ス定数は約１ｍＭである〔１ＭのＤＥＡ緩衝液（ｐＨ１
０．０）中で３７℃で測定〕。

【００２６】（２）至適ｐＨ：１０．５付近（温度３７
℃） （３）安定ｐＨ：７〜８ （４）作用適温の範囲：３０℃から４５℃までの範囲
（ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ１０．０） （５）分子量：約９万（ウルトゲルＡＣＡ３４ゲル濾過
クロマトグラフィー） ［参考例２］参考例１で得たビブリオ エスピー（Vibr
io sp.）ＳＭＹ−２株由来のＡｌＰ及び仔ウシ小腸由来
のＡｌＰ（ベーリンガーマンハイム社より購入、コード
Ｎｏ．５６７７４４）、大腸菌由来のＡｌＰ（シグマ社
より購入、コードＮｏ．Ｐ−５９３１）の蛋白１ｍｇ当
たりの比活性を以下のようにして求めた。

【００２７】すなわち、各ＡｌＰ溶液を、蛋白濃度が
０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、この溶
液中のＡｌＰ活性を測定した。蛋白質の定量は、牛血清
アルブミン（ベーリンガーマンハイム、アルブミンフラ
クションＶ、コードＮｏ．７３５０９４）を標準に、バ
イオ・ラッドラボラトリー社のプロテインアッセイ染色
液（コードＮｏ．５００−０００６）を用いて行なっ
た。その結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】 表１の結果から明らかなように、ビブリオ エスピー
（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株由来のＡｌＰは、仔ウシ小
腸由来のＡｌＰの約２．４倍、大腸菌由来のＡｌＰの約
８８倍の比活性を示した。

【００２９】

【発明の効果】本発明の菌株は、比活性の高いＡｌＰ産
生能を有しているので、この菌株を培養することによ
り、容易に比活性の高いＡｌＰを製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のビブリオ エスピー（Vibrio sp.）Ｓ
ＭＹ−２株を培養した際の、菌の生育及び菌体内のＡｌ
Ｐ活性を経時的に示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 川原 一恵 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 矢野 拓磨 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 岩田 建 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビブリオ（Vibrio）属に属し、アルカリ
   フォスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．１）産生能を有
   することを特徴とするビブリオ エスピー（Vibrio s
   p.）ＳＭＹ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０１７）。