JPH09238678A - アルカリフォスファターゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い触媒能を有し、しかも容易に製造するこ
とのできるアルカリフォスファターゼ（ＡｌＰ）及びそ
の製造方法を提供する。 【解決手段】 以下の理化学的性質を有することを特徴
とするアルカリフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．
１）。 （１）作用：下記反応式の反応を触媒する。 【化１】 （２）サブユニット当たりの触媒反応の速度定数：ｐ−
ニトロフェニルリン酸を基質とした場合、６０００／秒
以上（測定温度３７℃）である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルカリフォスフ
ァターゼ（ＥＣ ３．１．３．１）（以下、ＡｌＰと略
記する）及びその製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素は、その反応の安定性や基質
の特異性が着目され、光学的定量化の容易性から、医療
分野や食品分野などで各種成分の分析などに広く利用さ
れている。なかでもＡｌＰは、酵素免疫測定法における
標識酵素として種々の診断に広く用いられている。Ａｌ
Ｐを標識酵素として用いる場合、分析対象となる物質の
抗原、抗体、または目的の分析対象物質に特異的に結合
する物質にＡｌＰを結合させ、これを、検査試料に添加
し分析対象物質と結合させることで、新たに生じた結合
体を分別して該結合体のＡｌＰ活性を測定することによ
り、分析対象物質を定量することができる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この様な分析では、分
析対象物質が、検査試料中に微量にしか存在しない場合
が多く、このため測定感度に優れた分析条件が望まれ
る。ＡｌＰによる標識は、ＡｌＰと上述の物質との分子
間での結合によるため、高い測定感度を得るためには、
ＡｌＰ分子が高い活性を示すことが必要である。そのた
めには、標識酵素であるＡｌＰが高い触媒能を有するこ
とが望ましい。

【０００４】従来、ＡｌＰは、主として大腸菌あるいは
仔ウシ小腸から生産されており、その供給源が限られて
いた。しかし、大腸菌由来のＡｌＰは触媒能が低いた
め、標識酵素としては、主に、仔ウシ小腸由来のＡｌＰ
が用いられている。しかし、仔ウシ小腸由来ＡｌＰは、
臓器からの破砕抽出の際、プロテアーゼや、有機溶剤を
用いる等、煩雑な操作を経た後、数種のカラムを用いて
精製しなければならなかった。

【０００５】このような理由から、高い触媒能を示すＡ
ｌＰを効率よく得るための手段が強く要望されていた。

【０００６】本発明は、高い触媒能を示すＡｌＰ及びそ
の製造方法を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討の結果、ビブリオ属に属す
る微生物の生産するＡｌＰの触媒能が高いということ、
またこのようなＡｌＰ生産能を有する微生物を培養する
ことによりＡｌＰを容易に製造することができるという
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、第１の発明は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とするＡｌＰを要旨とするもの
である。

【０００９】（１）作用 下記反応式の反応を触媒する。

【００１０】

【化２】

【００１１】（２）サブユニット当たりの触媒反応の速
度定数 ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とした場合、６０００
／秒以上（測定温度３７℃）である。

【００１２】また、第２の発明は、ビブリオ（Vibrio）
属に属する上記のアルカリフォスファターゼの生産菌を
培養し、培養物から上記のアルカリフォスファターゼを
採取することを特徴とするアルカリフォスファターゼの
製造方法を要旨とするものである。

【００１３】さらに、第３の発明は、カザミノ酸を含有
する栄養培地で培養する上記の製造方法を要旨とするも
のである。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】まず、本発明のＡｌＰの理化学的性質を以
下に示す。

【００１６】（１）作用 下記反応式の反応を触媒する。

【００１７】

【化３】

【００１８】（２）基質特異性 リン酸モノエステルは、パラニトロフェニルリン酸、５
−クロロ−４−ブロモ−３−インドリルリン酸、４−メ
チルウンベリフェリルリン酸（以下、４−ＭＵＰと略記
する。）、酸化型及び還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸、アデノシンモノリン酸、グアノシ
ンモノリン酸、シチジンモノリン酸、ウリジンモノリン
酸、イノシンモノリン酸、グルコース６リン酸、グリセ
ロール２リン酸、グリセリン酸３リン酸、ピロリン酸な
どである。リン酸モノニトロフェニルリン酸の場合、反
応のミカエリス定数は約１ｍＭである〔１ＭのＤＥＡ緩
衝液（ｐＨ１０．０）中で３７℃で測定〕。

【００１９】（３）サブユニット当たりの触媒反応の速
度定数 ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とした場合、６０００
／秒以上、およそ６０００〜８０００／秒（測定温度３
７℃）である。

【００２０】（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ｐＨ１０．５付近（温度３７℃）に至適ｐＨを有し、ｐ
Ｈ７〜８で安定である。

【００２１】（５）力価の測定法 １０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム（以
下、ＰＮＰＰと略記する。：ナカライテスクより購入、
コードＮｏ．２５０−１９ＧＲ）、１．０ｍＭの塩化マ
グネシウム６水和物（和光純薬より購入、コードＮｏ．
１３５−００１６５）を含む１ＭのＤＥＡ（和光純薬よ
り購入、コードＮｏ．０９３−０３１１５）緩衝液（ｐ
Ｈ１０．０）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、
分光光度計で４０５ｎｍにおける吸光度変化により測定
した。測定は、３７℃で行い、１分間に１マイクロモル
のｐ−ニトロフェノールを生成させる酵素量を１単位
（Ｕ）とした。

【００２２】（６）作用適温の範囲 ３０〜４５℃（ＤＥＡ緩衝液ｐＨ１０．０） （７）精製方法 ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、Ｑ
ＡＥ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー社製）、フェニルセ
ファロール６ＦＦ（ファルマシア社製）及びレッドセフ
ァロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を用いて精製
した。

【００２３】（８）分子量 ウルトロゲルＡＣＡ３４ゲル瀘過クロマトグラフィー法
による測定で約９万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動による測定で約５．８万である。

【００２４】本発明のＡｌＰの製造に用いられる微生物
としては、上記性質を有するＡｌＰを生産し得るもので
あればいかなるものでも使用できるが、具体的にはビブ
リオ属に属する微生物が挙げられる。その中でも好適な
例としては、ビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ
−２株が挙げられる。また、ビブリオ エスピー（Vibr
io sp.）ＳＭＹ−２株の他に、その自然的又は人為的変
異ならびにこれら菌株の遺伝子を導入された各種微生物
も本発明のＡｌＰ生産能を有する限り、本発明に使用す
ることができる。

【００２５】このビブリオ エスピー（Vibrio sp.）Ｓ
ＭＹ−２ならびその類縁と考えられる既存のビブリオ属
菌であるビブリオ スプレンディダス（Vibrio splendi
dusbiovar１及びbiovar２）及びビブリオ ツビアシ（V
ibrio tubiashii）について菌学的性質をまとめたもの
を以下に示す。なお、ｄは菌株によって異なることを、
NDは記載がないことを、FAは通性嫌気性を示す。

【００２６】 Vibrio sp. Vibrio splendidus Vibrio SMY-2 biovar 1 biovar 2 tubiashii （１）形態的特徴 （ａ）細胞の形 桿菌 桿菌 桿菌 桿菌 （ｂ）運動性 有 有 有 有 （ｃ）鞭毛 単極毛 極毛 極毛 極毛 （ｄ）胞子形成能 無 無 無 無 （ｅ）グラム染色性 陰性 陰性 陰性 陰性 （２）生育状態 （ａ）ZoBell 2216b 円形を示し ND ND ND 寒天平板培養 表面は平滑 （ｂ）ゼラチンの液化 有 有 有 有 （３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 無 有 有 有 （ｂ）ＶＰテスト 陰性 陰性 陰性 陰性 （ｃ）オキシダーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｄ）カタラーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｅ）色素の生成 無 無 無 無 （ｆ）発光性 無 有 無 無 （ｇ）デンプンの 有 有 有 有 加水分解 （ｈ）アルギニンの 有 無 無 ｄ 加水分解 （ｉ）塩類要求性 0%NaCl下での生育 無 ND ND ND 2%NaCl下での生育 有 ND ND ND （ｊ）生育の範囲 ４℃での生育 無 ｄ 無 無 ３５℃での生育 有 ｄ 無 ｄ （ｋ）酸素に対する挙動 FA FA FA FA （ｌ）ＯＦテスト Ｆ Ｆ Ｆ Ｆ （ｍ）ＰＨＢの蓄積 無 無 無 ND （ｎ）ＰＨＢの利用能 無 無 無 ｄ （ｏ）リパーゼ活性 陽性 陽性 陽性 陽性 （ｐ）マンニトール 無 有 有 有 資化性 （ｑ）各種炭素源から の酸の生成 Ｄ−グルコース 有 有 有 ND セロビオース 無 有 ｄ 有 Ｄ−ガラクトース 無 有 無 有 グルコン酸 無 ｄ 無 有 Ｌ−グルタミン酸 有 有 ｄ ND グリシン 有 有 ｄ 有 プトレスシン 無 無 無 ｄ シュークロース 有 ｄ 無 有 トレハロース 有 有 有 有 （ｒ）グルコースから 無 無 無 無 のガスの産生 （３）ＤＮＡのＧＣ含量 45 45〜46 45〜46 43〜45 （モル％） 以上のビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株
についての菌学的性質から、バージィのマニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー（Bargey's M
annual of Systematic Bacteriology ）第１巻（１９８
４年）、バージィのマニュアル・オブ・ディターミネイ
ティブ・バクテリオロジィー（Bargey'sMannual of Det
erminative Bacteriology）第９版（１９９４年）、イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー（International Journal of Sys
tematic Bacteriology）第３４巻、１〜４頁（１９８４
年）に記載されている各種細菌の性状から検索した結
果、この菌株はビブリオ（Vibrio）に属する細菌と判明
した。また、この菌株は、上述した文献に記載されてい
るビブリオ属細菌のうち、ビブリオ スプレンディダス
（Vibrio splendidusbiovar１及びbiovar２）及びビブ
リオ ツビアシ（Vibrio tubiashii）とよく似た性状を
示したが、この菌株が硝酸塩の還元能及びマンニトール
の資化性能が無いのに対し、ビブリオ スプレンディダ
ス（Vibrio splendidus ）及びビブリオツビアシ（Vibr
io tubiashii）は、共にその能力を有することから、こ
の菌株はこれらの種とは異なるものであると判断され
た。よって、この菌株は、新菌株と判断できるので、ビ
ブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株と命名
し、平成７年６月２９日付で通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した。その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１５０１７である。

【００２７】本発明のＡｌＰは、このようなＡｌＰ生産
能を有する微生物を培養し、培養終了後、遠心分離や濾
過などの操作で培養液から菌体を回収し、菌体から粗酵
素液を抽出し、精製することによって製造することがで
きる。

【００２８】ＡｌＰ生産菌を培養する栄養培地に添加す
る窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸など
の無機物又は有機物が使用できる。特に、培地にカザミ
ノ酸を添加すると、ＡｌＰ生産性を短時間で高めること
ができるので添加することが好ましい。また、炭素源と
しては、グルコース、シュークロース、デンプンなどが
使用でき、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、
鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、ビタミン類
などを使用してもよい。

【００２９】培養条件としては、好気的あるいは微好気
的条件で行われ、培養温度としては、１０〜３５℃、好
ましくは２０〜３０℃、最適には２５〜３０℃で行う。
培地のｐＨとしては、６．０〜９．５、好ましくは７．
０〜９．０、最適には７．４〜８．６である。このよう
な条件下で３〜４０時間、好ましくは４〜２０時間、最
適には５〜１５時間培養することにより、ＡｌＰ生産能
を有する菌体を得ることができる。

【００３０】培養菌体から、ＡｌＰを精製する際の抽出
法としては、超音波破砕、圧破砕、界面活性剤処理、リ
ゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうした処理
後、遠心分離により細胞片を除去し、粗酵素液を得る。
粗酵素液については、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより、目的とするＡｌＰを
単離、精製することができる。イオン交換樹脂にはＱＡ
Ｅ−トヨパール５５０Ｃ（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セ
ファロースＦＦ（ファルマシア社製）など、アフィニテ
ィークロマト用樹脂には、レッドセファロースＣＬ６−
Ｂ、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（以上、ファ
ルマシア社製）など、疎水クロマト用樹脂には、オクチ
ル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア社
製）、フェニルセファロース６ＦＦ（ファルマシア社
製）など、ゲル濾過用担体又は樹脂としては、セファデ
ックスＧ−１００、ウルトロゲルＡＣＡ３４（以上、フ
ァルマシア社製）などが挙げられる。また、これらのカ
ラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシ
ンや硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウ
ム処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。また、
精製の際に用いる緩衝液には、リン酸緩衝液、ほう酸緩
衝液、トリス緩衝液などの他に、ＨＥＰＥＳ（２−［４
−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタ
ンスルホン酸）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝
液などのグッドバッファー系の緩衝液を用いることがで
きる。

【００３１】

【実施例】次に、本発明を実施例によって、具体的に説
明する。

【００３２】実施例１ 酵母エキス０. １％（重量％を表す。以下同様）（オリ
エンタル酵母工業、コードＮｏ．４１２０７０００）、
カザミノ酸（日本製薬、カザミノ酸「ダイゴ」、コード
Ｎｏ．３９８−００６５７）０. ５％、クエン酸鉄（II
I)ｎ水和物（和光純薬、コードＮｏ．０９７−０２４１
５）０. ０１％、塩化ナトリウム（和光純薬、コードＮ
ｏ．１９４−０１６７７）２. ０％、塩化マグネシウム
・６水和物（和光純薬、コードＮｏ．１３５−００１６
５）０. ８８％、硫酸ナトリウム・１０水和物（和光純
薬、コードＮｏ．１９３−０３３２５）０. ３２％、塩
化カルシウム・６水和物（ナカライテスク、コードＮ
ｏ．０６７−３２ＥＰ）０.１８％、塩化カリウム（ナ
カライテスク、コードＮｏ．２８５−１３ＥＰ）０.０
５５％、炭酸ナトリウム（和光純薬、コードＮｏ．１９
６−０１５９５）０.０１６％、硫酸鉄（II）・７水和
物（ナカライテスク、コードＮｏ．１９５−３１ＥＰ）
０. ００１％、臭化カリウム（ナカライテスク、コード
Ｎｏ．２８５−０２ＥＰ）０. ００８％、塩化ストロン
チウム・６水和物（ナカライテスク、コードＮｏ．３２
５−０８ＥＰ）０. ００３４％、ホウ酸（和光純薬、コ
ードＮｏ．０２１−０２１９５）０. ００２２％、ケイ
酸ナトリウム（和光純薬、コードＮｏ．１９０−０３２
１５）０. ０００４％、フッ化ナトリウム（和光純薬、
コードＮｏ．１９６−０１９７５）０. ００２４％、硝
酸ナトリウム（和光純薬、コードＮｏ．１９２−０２５
５５）０. ０００１６％、リン酸２ナトリウム・１２水
和物（ナカライテスク、コードＮｏ．３１７−２２Ｅ
Ｐ）０. ０００８％、ｐＨ７．６よりなる培地２０リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込
み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した後、ビ
ブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５０１７）を接種し、２８℃で１５時間、
０. ５vvm 、３００ｒｐｍで通気・攪拌しながら培養し
た。遠心分離により菌体を採取して約７０ｇの菌体を得
た。得られた菌体中のＡｌＰ含量は、約２６０万Ｕ／ｋ
ｇ湿菌体であった。得られた菌体を凍結状態で保存し
た。

【００３３】次に、得られた凍結菌体約５０ｇを２０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０. ４リットルに懸濁
し、２００Ｗで１０分間超音波処理することにより細胞
を破砕し、遠心分離により細胞片を除去して、ＡｌＰを
含む粗酵素液を得た。

【００３４】この粗酵素液を、予め２０ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ７. ５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製、コードＮｏ．１７−０７０
９−０１）カラム（カラムサイズ、内径３．２ｃｍ、高
さ１２ｃｍ）に通じ、０. ５Ｍの塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）で溶出したとこ
ろ、塩化ナトリウム濃度０. ２〜０. ３Ｍ近くに活性が
溶出した。この溶出画分を、予め２０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７. ５）で平衡化したＱＡＥ−トヨパール５５
０Ｃ（東ソー社製、コードＮｏ．０１４０２６）カラム
（カラムサイズ、内径３．２ｃｍ、高さ５ｃｍ）に通
じ、塩化ナトリウム濃度を徐々に上げて溶出させたとこ
ろ、塩化ナトリウム濃度０．６〜０．８Ｍの近くに活性
画分が溶出した。この溶出画分に、硫酸アンモニウム
（和光純薬、コードＮｏ．０１９−０６７３５）を１.
０Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫酸アンモニウムを
含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化さ
れたフェニルセファロース６ＦＦ（ファルマシア、コー
ドＮｏ．１７−０９７３−０５）カラム（カラムサイ
ズ、内径１．６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に通じ、同緩衝液の
硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて溶出したところ、
硫酸アンモニウム濃度０．３〜０．２Ｍの近くに活性画
分が溶出した。活性画分を集めて脱塩後、２０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）で平衡化したレッドセファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア、コードＮｏ．１７−０
９６１−０２）カラム（カラムサイズ、内径１．６ｃ
ｍ、高さ５ｃｍ）に通じ、塩化ナトリウム濃度を徐々に
上げて溶出したところ、塩化ナトリウム濃度０．６〜
０．８Ｍ付近に活性画分が溶出した。このようにして得
られたＡｌＰは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて単一なバンドとして検出され、精製酵素標品を得る
ことができた。また、活性の収率は約１５％であった。

【００３５】参考例１ 実施例２で得たビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭ
Ｙ−２株由来のＡｌＰについて、ＰＮＰＰに対する反応
性を、種々のＰＮＰＰ濃度下で調べた。

【００３６】ＡｌＰ溶液を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で希釈し、以下の反応に用いた。

【００３７】反応は、１．０ｍＭの塩化マグネシウム６
水和物（和光純薬より購入、コードＮｏ．１３５−００
１６５）を含む１ＭのＤＥＡ（和光純薬より購入、コー
ドＮｏ．０９３−０３１１５）緩衝液（ｐＨ１０．０）
中で行なった。この緩衝液にＰＮＰＰを種々の濃度（０
〜１．０ｍＭ）で添加し、反応測定液を調製した。反応
測定液１．０ｍｌに酵素溶液２．５μｌを加え、緩やか
に混和した後、分光光度計で４０５ｎｍにおける吸光度
変化を測定した。なお、測定は３７℃で行った。その結
果を図１に示す。図１は、本発明のＡｌＰとＰＮＰＰと
を、ＰＮＰＰの濃度を変えて反応させた時の４０５ｎｍ
における１分間の吸光度変化を示す図であり、縦軸は吸
光度変化量を、横軸はＰＮＰＰの濃度を示している。

【００３８】図１から、反応測定液中に添加したＰＮＰ
Ｐの濃度に比例して１分間の吸光度変化が増加し（グラ
フの相関係数０．９９）、ＡｌＰがＰＮＰＰに対し良好
に反応していることがわかる。

【００３９】参考例２ 実施例１で得たビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭ
Ｙ−２株由来のＡｌＰについて、４−ＭＵＰに対する反
応性を、種々の４−ＭＵＰ濃度下で調べた。

【００４０】ＡｌＰ溶液を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で希釈し、ＰＮＰＰを基質とした場合におい
て１００Ｕ／ｍｌになるように調製し、これを、以下の
反応に用いた。

【００４１】反応は、１．０ｍＭの塩化マグネシウム６
水和物（和光純薬より購入、コードＮｏ．１３５−００
１６５）を含む１ＭのＤＥＡ（和光純薬より購入、コー
ドＮｏ．０９３−０３１１５）緩衝液（ｐＨ１０．０）
中で行なった。この緩衝液に４−ＭＵＰ（ナカライテス
クより購入、コードＮｏ．２３２−５３ ＧＲ）を種々
の濃度（０〜２００μＭ）で添加し、反応測定液を調製
した。反応測定液２．５ｍｌに酵素溶液２．５μｌを加
え、３７℃で１０分間反応させた。その後、６ＮのＨＣ
ｌ（和光純薬、コードＮｏ．１８３−２１ ＧＲ）０．
７ｍｌを添加し、反応を停止させた後、４−ＭＵＰから
生じたメチルウンベリフェロンの蛍光を蛍光分析計で測
定した（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）。
その結果を図２に示す。図２は本発明のＡｌＰに４−Ｍ
ＵＰを濃度を変えて反応させた時に生成するメチルウン
ベリフェロンの蛍光強度を示す図であり、縦軸は蛍光強
度を、横軸は４−ＭＵＰの濃度を示している。

【００４２】図２から、反応測定液中に添加した４−Ｍ
ＵＰの濃度に比例してメチルウンベリフェロンの蛍光強
度が増加し（グラフの相関係数０．９９）、ＡｌＰが４
−ＭＵＰに対し良好に反応していることがわかる。

【００４３】参考例３、比較例１、２ 実施例１で得たビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭ
Ｙ−２株由来のＡｌＰ（参考例５）、仔ウシ小腸由来の
ＡｌＰ（ベーリンガーマンハイム社より購入、コードＮ
ｏ．５６７７４４、比較例１）及び大腸菌由来のＡｌＰ
（シグマ社より購入、コードＮｏ．Ｐ−５９３１、比較
例２）について、基質をＰＮＰＰ及び４−ＭＵＰとした
時の、酵素サブユニット当たりの触媒反応定数（以下、
ｋcat と略記する）を求めた。ＡｌＰの分子量は、ビブ
リオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２由来のものは
９００００、仔ウシ小腸由来のものは１４００００、大
腸菌由来のものは９４０００とし、すべて２つのサブユ
ニットからなるものとした。

【００４４】反応は、１．０ｍＭの塩化マグネシウム６
水和物（和光純薬より購入、コードＮｏ．１３５−００
１６５）を含む１ＭのＤＥＡ（和光純薬より購入、コー
ドＮｏ．０９３−０３１１５）緩衝液（ｐＨ１０．０）
中で、ＰＮＰＰ（ナカライテスクより購入、コードＮ
ｏ．２５０−１９ＧＲ）、４−ＭＵＰ（ナカライテスク
より購入、コードＮｏ．２３２−５３ＧＲ）を各々基質
として、３７℃で行なった。基質がＰＮＰＰの際には、
分光光度計で４０５ｎｍにおける吸光度変化を測定し
た。また、基質が４−ＭＵＰの際には、反応により４−
ＭＵＰから生じたメチルウンベリフェロンの蛍光を蛍光
分析計で測定した（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４
０ｎｍ）。kcatは、以下の式から算出した。

【００４５】

【数１】

【００４６】その結果を表１に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１から明らかなように、ビブリオ エス
ピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株由来のＡｌＰは、基質
をＰＮＰＰとした場合は、仔ウシ小腸由来のＡｌＰの約
１．６倍、大腸菌由来のＡｌＰの約８８倍のｋcat を、
また、基質を４−ＭＵＰとした場合は、仔ウシ小腸由来
のＡｌＰの約１．９倍、大腸菌由来のＡｌＰの約８２倍
のｋcat を示した。この結果から、本発明のＡｌＰは触
媒能が高いことがわかる。

【００４９】実施例２ ＤＩＦＣＯ社製マリンブロス２２１６培地（ＤＩＦＣ
Ｏ、コードＮｏ．０７９１−０１−２）１００ｍｌ（５
００ｍｌ三角フラスコ中）にビブリオ エスピー（Vibr
io sp.）ＳＭＹ−２株を接種し、２８℃で１２時間種培
養した。

【００５０】実施例１に記載の培地に、カザミノ酸（日
本製薬、カザミノ酸「ダイゴ」、コードＮｏ．３９８−
００６５７）、ペプトン（極東製薬工業、コードＮｏ．
０１０１２）、肉エキス（極東製薬工業、エルリッヒ肉
エキス、コードＮｏ．０１２００）、コーンスティープ
リカー（以下、ＣＳＬと略記する。：サンエイ糖化、コ
ードＮｏ．０３６０２）をそれぞれ０．５％ずつ添加
し、それぞれの培地を５００ｍｌ三角フラスコに１００
ｍｌずつ分注し、これらの培地に、上記のＤＩＦＣＯ社
製マリンブロス２２１６培地で培養したビブリオ エス
ピー（Vibrio sp.）ＳＭＹ−２株の培養液５ｍｌずつを
接種して２７℃で８時間振盪培養した。培養終了後、各
培養液を遠心分離し、菌体から粗酵素液を調製し、Ａｌ
Ｐ活性を測定した。

【００５１】その結果を表２に示す。

【００５２】

【表２】

【００５３】表２から明らかなように、カザミノ酸を添
加した培地を用いて培養した菌体はペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカーを添加した培地を用いた場
合の約１．６〜２．８倍のＡｌＰ生産性（湿菌体１Ｋｇ
当たりのＡｌＰ活性）を示した。このことから、ＡｌＰ
を大量に得る場合には、ビブリオ エスピー（Vibrio s
p.）ＳＭＹ−２株の培養培地中にカザミノ酸を添加する
ことが有効であることが確認された。

【００５４】また、このようにして得られたＡｌＰは実
施例１で得られたＡｌＰと同じ理化学的性質を有してい
た。

【００５５】

【発明の効果】本発明のＡｌＰは、高い触媒能を有して
いるので、各種測定用試薬に広く利用することができ
る。また、本発明によれば、このようなＡｌＰを容易に
製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＡｌＰとＰＮＰＰとを、ＰＮＰＰの濃
度を変えて反応させた際の、４０５ｎｍにおける１分間
の吸光度変化を示す図である。

【図２】本発明のＡｌＰと４−ＭＵＰとを、４−ＭＵＰ
の濃度を変えて反応させた際に、反応により生成するメ
チルウンベリフェロンの蛍光強度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩田 建 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 鈍寳 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有することを特徴
   とするアルカリフォスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．
   １）。 （１）作用 下記反応式の反応を触媒する。 【化１】 （２）サブユニット当たりの触媒反応の速度定数 ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とした場合、６０００
   ／秒以上（測定温度３７℃）である。
2. 【請求項２】 ビブリオ（Vibrio）属に属する請求項１
   記載のアルカリフォスファターゼの生産菌を培養し、培
   養物から請求項１記載のアルカリフォスファターゼを採
   取することを特徴とするアルカリフォスファターゼの製
   造方法。
3. 【請求項３】 カザミノ酸を含有する栄養培地で培養す
   る請求項２記載の製造方法。