JPH09243A - 低窒素藻体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 乾燥藻体中の窒素含有率が１．５％以下であ
るボツリオコッカス属に属する微細藻類の低窒素藻体を
製造する方法を提供する。 【構成】 ボツリオコッカス属に属する微細藻類を、培
地に添加される総窒素量が０．１ｇ／Ｌ以下となるよう
に調製された培地中で、藻体の増殖量が低下するまで培
養し、この培地から藻体を回収することにより、乾燥藻
体藻体全量に対する窒素含有率が１．５重量％以下であ
る前記微細藻類の低窒素藻体を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、低窒素藻体の製造方法
に関し、詳しくは、乾燥藻体全量に対する窒素含有率が
１．５重量％以下のボツリオコッカス属に属する微細藻
類の藻体を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＣＯ₂による地球温暖化が問題と
なっている中で、光エネルギーによりＣＯ₂を固定化し
炭化水素に変換する能力を有する微細藻類の利用に対す
る期待が高まっている。この様な特徴を有する微細藻類
の利用方法のうちでも、化石エネルギーの枯渇の懸念か
ら、上記炭化水素を含有する微細藻類の藻体をそのまま
固体燃料等のエネルギー源として利用することに対する
関心が非常に高まっている。

【０００３】ここで、石炭等の固体燃料においては、こ
れを用いたときに発生する排ガス中に含まれるＮＯ_xの
量が問題とされ、その窒素含有量が１．５重量％以下で
あるものが望ましいとされている。しかしながら、上記
炭化水素産生能を有する微細藻類を通常の方法で培養し
て得られた藻体は、含有窒素量が１．５重量％を越え、
これを固体燃料として用いると排ガス中のＮＯ_x量が多
くなるという問題があった。したがって、固形燃料とし
て使用可能な、窒素含有量が乾燥重量で１．５重量％以
下の低窒素藻体が得られるような微細藻類の培養方法が
望まれていた。

【０００４】ところで、クロレラにおいて培地中の窒素
源濃度を低下させることにより、得られる藻体中の脂質
を増加させる方法が知られている（M.A.Borowizka etal
ed.「Micro-algal biotechnology」 p14）。しかし、
この方法では、培地中の窒素量を制限しても、乾燥藻体
中の蛋白は１６．５重量％以上と高いものであり、さら
に、培地の窒素量が制限されているために増殖速度が低
下するという問題があった。

【０００５】一方、ボツリオコッカス属に属する微細藻
類は、上記光エネルギーを用いてＣＯ₂を固定化し炭化
水素を生産する微細藻類のうちでも、炭化水素を生産す
る能力に優れ、藻体全量に対する炭化水素の含有量も乾
燥重量の２０〜４０％と際だって高いことが知られてい
る。しかしながら、このボツリオコッカス属に属する微
細藻類を特定条件の下で培養して低窒素藻体を得ようと
する試みはこれまでになされていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、乾燥藻体中の窒素含有率が１．
５％以下であるボツリオコッカス属に属する微細藻類の
低窒素藻体を製造する方法を提供することを課題とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ボツリオコッカ
ス属に属する微細藻類は、窒素量が制限された培地中で
効率よく増殖することができ、このような培地で培養し
て得られる藻体が、窒素含有率が乾燥重量で１．５重量
％以下の低窒素藻体であることを見出し、本発明を完成
させた。

【０００８】すなわち、本発明は、乾燥藻体全量に対す
る窒素含有率が１．５重量％以下のボツリオコッカス属
に属する微細藻類の藻体を製造する方法であって、前記
微細藻類を、培地に添加される総窒素量が０．１ｇ／Ｌ
以下となるように調製された培地中で、藻体の増殖量が
低下するまで培養し、この培地から藻体を回収すること
を特徴とする方法である。

【０００９】尚、本明細書中で、乾燥藻体全量に対する
窒素含有率が１．５重量％以下の微細藻類の藻体を、
「低窒素藻体」ということがある。以下、本発明を詳細
に説明する。

【００１０】本発明の低窒素藻体の製造方法において
は、藻類として、ボツリオコッカス属に属する微細藻類
（以下、「ボツリオコッカス属藻類」という）を用いる
が、この藻類はボツリオコッカス属藻類であれば特に制
限されるものではなく、例えば、ボツリオコッカス・ブ
ラウニー（Botryococcus braunii）等を挙げることがで
きる。さらに具体的には、ボツリオコッカス・ブラウニ
ー ＣＣＡＰ ８０７／１、ボツリオコッカス・ブラウニ
ー ＣＣＡＰ ８０７／２、ボツリオコッカス・ブラウニ
ー ＵＴＥＸＬＢ５７２、ボツリオコッカス・ブラウニ
ー ＵＴＥＸ２４４１等が挙げられる。

【００１１】本発明において用いるボツリオコッカス属
藻類の株は、再現性が高く、長期間安定した培養を可能
とするために、純化株を用いることが好ましい。ボツリ
オコッカス属藻類を純化する方法として、いわゆるパス
ツールピペット洗浄法、すなわちボツリオコッカス属藻
類の培養液から、顕微鏡下でパスツールピペットを用い
て１コロニーづつ、滅菌した培養液に移す操作を繰返し
て純化株を得る方法が一般的であるが、以下に述べる方
法を用いれば、ボツリオコッカス属藻類の純化株を簡便
な操作で短期間に得ることができるので、本発明におい
てはこの方法で得られる純化株を用いることが好ましい
と言える。

【００１２】純化株を得るためのボツリオコッカス属藻
類を含有する試料は、池、湖等からプランクトンネット
により採取することもできるが、Culture collection o
f Algae and Protozoaなどの微生物寄託機関から入手す
ることもできる。このような株として、上記ボツリオコ
ッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ ８０７／１、ボツリオコ
ッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ ８０７／２、ボツリオコ
ッカス・ブラウニーＵＴＥＸＬＢ５７２、ボツリオコッ
カス・ブラウニー ＵＴＥＸ２４４１などが例示され
る。これらは、いずれもボツリオコッカス属藻類以外の
細菌あるいはカビ等の微生物が混在している。

【００１３】まず、上記ボツリオコッカス属藻類を含有
する試料に有効塩素を作用させ、ボツリオコッカス属藻
類以外の微生物を殺菌する。この時、処理されるボツリ
オコッカス属藻類含有試料は、有効塩素処理及びその後
の処理をしやすくするために、予め適当な培地で培養し
て藻体量を増やしておいてもよい。培地としては、ＣＨ
Ｕ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地など無機培地が挙げられ
るが、ボツリオコッカス属藻類の培養に適したものであ
れば、特に制限されない。また、有効塩素で処理するの
は培養液そのものでもよく、培養液から遠心分離等によ
り得た藻体又は濃縮液でもよい。

【００１４】上記ボツリオコッカス属藻類を含む試料に
有効塩素を作用させるには、例えば、次亜塩素酸水溶
液、または次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸カ
ルシウム等の次亜塩素酸塩の水溶液（以下、単に「次亜
塩素酸」という）に前記試料を懸濁させる方法が挙げら
れる。ボツリオコッカス属藻類含有試料の処理に用いる
次亜塩素酸の濃度は、通常、有効塩素の濃度として０．
０１〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．１〜１００ｐｐ
ｍ、さらに好ましくは１〜２０ｐｐｍである。この濃度
が０．０１ｐｐｍよりも低いと雑菌が十分に殺菌されな
いことがあり、また、１０００ｐｐｍを越えるとボツリ
オコッカス属藻類自体が死滅することがある。したがっ
て、上記範囲が好ましいが、最適な濃度はボツリオコッ
カス属藻類の種類、次亜塩素酸の処理時間等によっても
異なるので、処理濃度を変えて予備実験を行うことが好
ましい。

【００１５】また、上記ボツリオコッカス属藻類含有試
料の培養液を次亜塩素酸で処理する場合には、次亜塩素
酸を上記濃度となるように加えればよく、また、藻体を
次亜塩素酸で処理する場合には、上記濃度となるように
希釈した次亜塩素酸水溶液あるいは培養液で希釈した次
亜塩素酸に藻体を懸濁させればよい。

【００１６】上記のようにしてボツリオコッカス属藻類
含有試料を次亜塩素酸で処理した後に、藻体を濾過又は
遠心分離等により分離し、培養液又は緩衝液に懸濁する
操作を繰り返すことなどによって洗浄し、あるいはチオ
硫酸ナトリウム等を加えること等により有効塩素を除去
することが好ましい。加えるチオ硫酸ナトリウムの量
は、加えた次亜塩素酸から生じる有効塩素の全量を除去
するのに必要な量であることが好ましい。

【００１７】続いて、次亜塩素酸処理を行ったボツリオ
コッカス属藻類含有試料を、ボツリオコッカス属藻類の
培養に適した平板培地、例えば、グルコース等の炭素源
を加えたＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地などの無機
平板培地に塗布して培養を行う。ここで用いる培地に
は、ボツリオコッカス属藻類の生育に影響を与えない抗
生物質等を添加してもよい。また、平板培地に塗布する
際に、塗布量が多すぎると、平板培地に生じるコロニー
が近接し、コロニーを分離しにくくなるので、数段階で
希釈したものを塗布するとよい。

【００１８】培養は、増殖を早めるために、蛍光灯等を
用いて光照射下で行うことが好ましいが、照射照度が高
すぎるとかえって増殖が阻害されるので、通常０〜１０
０μＥ／ｍ²・ｓ、好ましくは５〜３０μＥ／ｍ²・ｓで
照射するのがよい。また、培養温度としては、通常０〜
８０℃、好ましくは１５〜３５℃がよい。

【００１９】培養は、通常１〜６０日、好ましくは１〜
３０日行う。培養中に生じるコロニーが、残存する雑菌
のコロニーであるか、あるいは単一のボツリオコッカス
属藻類のコロニーであるかを判明するにはある程度の培
養期間が必要であり、培養期間が長すぎると雑菌が繁茂
するので、上記期間内で培養するのが好ましいが、培地
や培養条件、雑菌の残存の程度等によっても異なるの
で、培養中にコロニーを観察し、適宜培養を打ち切れば
よい。

【００２０】上記のようにして平板培地上に生じたボツ
リオコッカス属藻類の単一コロニーを採取することによ
り、ボツリオコッカス属藻類の純化株が得られる。平板
培地からコロニーを分離する際には、顕微鏡、好ましく
は実体顕微鏡観察下で行うと、ボツリオコッカス属藻類
のコロニーであることを確認しながら採取できる点で好
ましい。コロニーの採取の方法は特に問わず、例えば滅
菌した白金線でかき取り、あるいはパスツールピペット
で吸い上げればよい。この際、空中の雑菌による汚染を
防止するために、無菌室またはクリーベンチ内で操作を
行うとよい。

【００２１】上記のようにして分離した株を再び培養
し、雑菌が生育しないことを確認することによって、純
化株であることを確認することができる。さらに、得ら
れた純化株が、ボツリオコッカス属藻類のみであること
を顕微鏡観察等により確認しておくとよい。

【００２２】本発明の製造方法においては、上記の微生
物寄託機関から入手可能なボツリオコッカス属藻類の株
や、好ましくは上記のようにして製造されたボツリオコ
ッカス属藻類純化株等を、培地に添加される総窒素量が
０．１ｇ／Ｌ以下となるように調製された培地中で、藻
体の増殖量が低下するまで培養する。

【００２３】この様な本発明の製造方法において培養に
用いる培地は、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した
培地であって、窒素源を窒素濃度で０．１ｇ／Ｌ以下で
含有する培地であれば特に制限されないが、例えば、Ｃ
ＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地などのボツリオコッカ
ス属藻類の培養に適した無機培地中の窒素源の添加量を
窒素濃度が上記条件となるように制限した以外は前記培
地と同様の組成で調製した培地を挙げることができる。
上記窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、
硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム、尿素等、通常ボツ
リオコッカス属藻類の培養に用いられる培地に添加する
ものと同様の窒素源を挙げることができる。

【００２４】本発明においては、この様な培地に、上記
ボツリオコッカス属藻類の純化株等を概ね０．１〜２ｇ
／Ｌの藻体濃度で接種する。培養条件は、培養時間を除
いては、通常のボツリオコッカス属藻類の培養と同様に
設定することが可能である。通常のボツリオコッカス属
藻類の培養においては、培養温度は、１０〜３５℃程度
であり、光照度は、白熱灯、蛍光灯等を用いて１００〜
４００μＥ／ｍ²・ｓ位である。更に、０．０４〜１５
％程度の濃度でＣＯ₂を含有する空気を通気量０．０５
〜１ｖｖｍ程度で培養液中に送り込んでやることが好ま
しい。

【００２５】ここで、本発明の製造方法においては、ボ
ツリオコッカス属藻類の培養時間は、培養開始時から藻
体の増殖量が低下するまでの時間とすることが好まし
い。この「藻体の増殖量が低下するまで」とは、所望の
藻体量が得られるまでということを意味するものであ
り、実質的にはどの時点で培養を終了しても差し支えな
いが、本発明の方法によれば低窒素藻体を効率よく増殖
されることができるので、十分な量の藻体が得られるま
で培養を行うことが好ましい。具体的には直線増殖期か
ら定常期に移行する時点の前後が挙げられる。この様な
条件を満たす培養時間は、培養開始時の藻体濃度や株の
種類、培地に添加した総窒素量等により異なるが、概ね
３〜３０日間である。培養時間が短いと藻体中の窒素含
有量が１．５重量％より高くなることがあり、また、こ
れ以上培養しても藻体濃度は高くならず経済的でない。

【００２６】本発明においては、ボツリオコッカス属藻
類は上記条件で培養されるが、培養開始時に培地に含有
する窒素源の量が窒素量として０．１ｇ／Ｌに達してい
ない場合は、培養中に、適宜、培地に窒素源を、培養開
始時に培地に含有する窒素量と合わせた添加窒素量が合
計で０．１ｇ／Ｌとなるまで添加してやることも可能で
ある。本発明においては、この様に培養開始時と培養中
に培地に添加される窒素源合計量が窒素量として０．１
ｇ／Ｌ以下であれば、窒素源を添加する時期や回数に制
限はなく、培養開始時及び培養中に１度だけでなく数回
に渡って窒素源を添加することも可能である。

【００２７】また、本発明の製造方法においては、培地
に窒素源を全く添加せずに上記培養を行うことも可能で
あり、従って、本発明の製造方法における培地に対する
好ましい総窒素源添加量は、窒素量として、０〜０．１
ｇ／Ｌである。

【００２８】この様に培養して得られた培養液から藻体
を回収する方法は、濾過、遠心分離等の方法で常法に従
って行えばよい。この様な本発明の製造方法により、乾
燥藻体全量に対する窒素含有率が１．５重量％以下であ
るボツリオコッカス属藻類の低窒素藻体が得られる。ま
た、得られた低窒素藻体にその後必要に応じて凍結乾
燥、加熱乾燥等の方法で乾燥する等の処理を施して使用
しやすい形態とすることも可能である。

【００２９】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。まずはじ
めに、ボツリオコッカス属藻類の純化株を製造した。

【００３０】

【製造例】ボツリオコッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ ８
０７／２をＪＭ培地で培養した培養液を試験管に入れ、
これに有効塩素濃度が１０ｐｐｍとなるように次亜塩素
酸ナトリウムを加え、１０分間、室温で静置した。その
後、有効塩素を除去するためにチオ硫酸ナトリウムを、
有効塩素１ｍｇあたり７．１６ｇとなるように加えた。

【００３１】上記処理液を、グルコース０．１％、寒天
１．５％を含むＪＭ培地の平板培地に塗布し、蛍光灯を
光源として約１５μＥ／ｍ²・ｓになるように照射し、
２５℃にて１週間培養した。尚、ＪＭ培地の組成は以下
のとおりである。 〔ＪＭ培地の組成〕下記表１中１〜９のストック溶液１
ｍｌづつを混合し、蒸留水又は脱イオン水を用いて１Ｌ
とし、ｐＨを７付近に調整する。

【００３２】

【表１】

【００３３】培養後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡
（倍率２０倍）を用いて観察しながら単一コロニーを白
金線でかき取り、グルコース０．１％、寒天１．５％を
含むＪＭ平板培地に移植した。これを、蛍光灯による約
１５μＥ／ｍ²・ｓの光照射下で、２５℃で４週間培養
した。

【００３４】得られたボツリオコッカス・ブラウニー
ＣＣＡＰ ８０７／２の藻体を白金線を用いてかき取
り、ＪＭ液体培地に移し、光照射下でさらに２週間培養
した。白金耳で培養液の一部をとり、普通寒天培地（１
Ｌ中に、肉エキス：５ｇ、ペプトン：１０ｇ、塩化ナト
リウム：５ｇ、寒天：１５ｇを含む；ｐＨ７．０）の平
板培地に塗布し、２５℃で７日間培養し、雑菌が生育し
ないことを確認した。また、こうして得られた純化株を
顕微鏡観察し、ボツリオコッカス・ブラウニーのみであ
ることを、コロニー形状等の本藻類特有の性質により確
認した。

【００３５】

【実施例１】上記製造例で得られたボツリオコッカス・
ブラウニー ＣＣＡＰ ８０７／２（純化株）を、ＣＨＵ
−１３＊２培地から硝酸カリウム（１．６ｇ／Ｌ）を除
いた培地、すなわち表２に組成を示す培地（ｐＨ７）
に、藻体濃度が乾燥重量換算で０．７ｇ／Ｌになるよう
に接種した。培養条件は温度２５℃、通気量０．５ｖｖ
ｍ（５％ＣＯ₂）、照度３５０μＥ／ｍ²・ｓとした。７
日間の培養で藻体濃度は、２．８ｇ／Ｌになった。藻体
を濾過で回収し、１０５℃で乾燥した。乾燥藻体につい
てＣＨＮレコーダーで元素組成を分析した結果、窒素含
有率は１．０％であった。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】

【実施例２】上記実施例１において用いた培地に硝酸カ
リウムを０．１６ｇ／Ｌ添加した以外は、全く実施例１
と同様にしてボツリオコッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ
８０７／２（純化株）の培養を行った。７日間の培養で
藻体濃度は、４．３ｇ／Ｌになった。その後、実施例１
と同様に処理して得られた乾燥藻体についてＣＨＮレコ
ーダーを用いて元素組成を分析した結果、窒素含有率は
１．０％であった。

【００３９】

【実施例３】上記実施例１において用いた培地に硝酸カ
リウムを０．３２ｇ／Ｌ添加した以外は、全く実施例１
と同様にしてボツリオコッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ
８０７／２（純化株）の培養を行った。９日間の培養で
藻体濃度は、５．８ｇ／Ｌになった。その後、実施例１
と同様に処理して得られた乾燥藻体についてＣＨＮレコ
ーダーを用いて元素組成を分析した結果、窒素含有率は
１．２％であった。

【００４０】

【実施例４】上記製造例で得られたボツリオコッカス・
ブラウニー ＣＣＡＰ ８０７／２（純化株）を、実施例
１で用いた培地と同じ培地に藻体濃度が０．７ｇ／Ｌに
なるように接種した。培養温度、通気量、照度について
は、上記実施例１と同様にして培養を行った。培養２日
目に藻体濃度が２ｇ／Ｌになったところで、硝酸カリウ
ムを１日当たり０．０７ｇ／Ｌ添加しながら更に７日間
培養した。その結果、培養開始から８日目の藻体濃度は
６．９ｇ／Ｌとなった。その後、実施例１と同様に処理
して得られた乾燥藻体についてＣＨＮレコーダーを用い
て元素組成を分析した結果、窒素含有率は１．３％であ
った。

【００４１】

【比較例１】上記製造例で得られたボツリオコッカス・
ブラウニー ＣＣＡＰ ８０７／２（純化株）を、実施例
１で用いた培地に硝酸カリウムを１．６ｇ／Ｌ添加した
培地、すなわちＣＨＵ−１３＊２培地に、藻体濃度が
０．７ｇ／Ｌになるように接種し、上記実施例１と同様
の培養条件で培養を行った。７日間の培養で藻体濃度
は、６．３ｇ／Ｌになった。その後、実施例１と同様に
処理して得られた乾燥藻体についてＣＨＮレコーダーを
用いて元素組成を分析した結果、窒素含有率は３．５％
であった。

【００４２】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、乾燥藻体中
の窒素含有率が１．５重量％以下であるボツリオコッカ
ス属に属する微細藻類の低窒素藻体を製造することがで
きる。また、本発明の製造方法により得られる前記藻類
の低窒素藻体は、燃焼させたときに発生するＮＯxの量
が少ないので、固体燃料として非常に有用である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乾燥藻体全量に対する窒素含有率が１．
   ５重量％以下のボツリオコッカス属に属する微細藻類の
   藻体を製造する方法であって、 前記微細藻類を、培地に添加される総窒素量が０．１ｇ
   ／Ｌ以下となるように調製された培地中で、藻体の増殖
   量が低下するまで培養し、この培地から藻体を回収する
   ことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 培養中に培地に窒素を分割添加し、その
   総添加量を０．１ｇ／Ｌ以下とすることを特徴とする請
   求項１記載の方法。