JPH09249700A - マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド - Google Patents
マトリックスメタロプロテイナーゼペプチドInfo
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- JPH09249700A JPH09249700A JP8240917A JP24091796A JPH09249700A JP H09249700 A JPH09249700 A JP H09249700A JP 8240917 A JP8240917 A JP 8240917A JP 24091796 A JP24091796 A JP 24091796A JP H09249700 A JPH09249700 A JP H09249700A
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Abstract
(57)【要約】
【課題】不適当な血管形成、関節炎、腫瘍増殖、侵入お
よび転移、および肉芽腫性炎症状態（例，サルコイドー
シス）の治療に有効なマトリックスメタロプロテイナー
ゼ阻害剤の提供。 【解決手段】アミノ酸配列：ＲＫＰＲＣ，ＡＡＨＥまた
はＶＡＨＥをその一部に有し、マトリックスメタロプロ
テイナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋
なペプチド（例，ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮ，ＭＲ
ＫＰＲＣＧ，ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱ等）。
該ペプチドと反応する抗体。該ペプチドを含む製薬組成
物。該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベ
クター、該ベクターで形質転換された宿主、該宿主を用
いるペプチドの製法。
よび転移、および肉芽腫性炎症状態（例，サルコイドー
シス）の治療に有効なマトリックスメタロプロテイナー
ゼ阻害剤の提供。 【解決手段】アミノ酸配列：ＲＫＰＲＣ，ＡＡＨＥまた
はＶＡＨＥをその一部に有し、マトリックスメタロプロ
テイナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋
なペプチド（例，ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮ，ＭＲ
ＫＰＲＣＧ，ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱ等）。
該ペプチドと反応する抗体。該ペプチドを含む製薬組成
物。該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベ
クター、該ベクターで形質転換された宿主、該宿主を用
いるペプチドの製法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、メタロプロテイナ
ーゼの検出および阻害に有効なペプチドに関する。特
に、本発明は酵素活性および酵素とその基質との相互作
用に関わる酵素のドメインに相当する、ＩＶ型コラーゲ
ナーゼの配列から得られるペプチドに関する。ペプチド
に認知される抗体は酵素の検出に有効である。機能研究
により確認された、特定のペプチドはメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の新しい種類を構成する。
ーゼの検出および阻害に有効なペプチドに関する。特
に、本発明は酵素活性および酵素とその基質との相互作
用に関わる酵素のドメインに相当する、ＩＶ型コラーゲ
ナーゼの配列から得られるペプチドに関する。ペプチド
に認知される抗体は酵素の検出に有効である。機能研究
により確認された、特定のペプチドはメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の新しい種類を構成する。
【０００２】［従来の技術］間質および基底膜コラーゲ
ンの減成は特定の種類のメタロプロテイナーゼ（そのマ
トリックスメタロプロテイナーゼは酵素前駆体型として
細胞外マトリックスの中に潜んでいるコラーゲナーゼ
（ＢＣ ３．４．２４．７）としても公知である）によ
って、開始される。このコラーゲナーゼ遺伝子ファミリ
ーの構成物は次のものを含んでいる。コラーゲンＩ，Ｉ
ＩおよびＩＩＩ型を減成し、基質特異性と活性の必要条
件によって特徴づけられている間質コラーゲナーゼ（ス
トリックリン，Ｇ．Ｐ，ジェフリィ，Ｊ．Ｊ，ローズウ
ィット，Ｗ．Ｔ．およびアイゼン，Ａ．Ｚ．，１９８
３，バイオケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
２２，６１−６８；ゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，ウィル
ヘルム，Ｓ．，クーロンバーガー，Ａ．，バゥアー，
Ｅ．Ａ．，グラント，Ｇ．Ａ．，およびアイゼン，Ａ．
Ｚ．，１９８６，ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６１，６
６００−６６０５；ハスティ，Ｋ．Ａ．，ジェフリィ，
Ｊ．Ｊ．，ヒッブス，Ｍ．Ｓ．，およびウェルガス，
Ｈ．Ｇ．，１９８７，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６
２，１００４８−１００５２；フィールズ，Ｇ．Ｂ．，
ファン ワルト，Ｈ．Ｅ．，およびビルケダル−ハンセ
ン，Ｈ．，１９８７，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６
２，６２２１−６２２６；グラント，Ｇ．Ａ．，および
アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，ローズウィ
ット，Ｗ．Ｔ．，およびゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，１
９８７，ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６２，５８８６
−５８８９）；プロテオグリカン、グリコプロテインお
よびコラーゲン分子の非ラセン部位を減成するストロメ
リジン（ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，コリャーム，Ｉ．
Ｅ．，クーロンバーガー，Ａ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，バゥアー，
Ｅ．Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８
７，プロシーディング ナチュラル アカデミィ オブ
サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）８４，６７２５−６７
２９；ホァィトマン，Ｓ．Ｅ．，マーフィー，Ｇ．，エ
ンジェル，Ｐ．，ラームスフォルフ，Ｈ．Ｊ．，スミ
ス，Ｂ．Ｊ．，ライオンズ，Ａ．，ハリス，Ｔ．Ｊ．
Ｔ．，レイノルズ，Ｊ．Ｊ．，ヘルリッヒ，Ｐ．，およ
びドチェーティ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，１９８６，バイオケミ
カル ジャーナル（Ｂｉｏｃｅｍ．Ｊ．）２４０，９１
３−９１６）；およびペプシン抵抗性−三重ラセンＩＶ
型コラーゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を減成
するＩＶ型コラーゲナーゼ。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒ
ト腫瘍細胞（リオッタ，Ｌ．Ａ．，クライナーマン，
Ｊ．，カタンザロ，Ｐ．，およびリンブランド，Ｄ．，
１９７７，ジャーナルオブナチュラル キャンサー イ
ンスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ
ｓｔ．） ５８，１４２７−１４３９；チューペーニー
ミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，およびトリグヴェイソン，
Ｋ．，１９８２，インターナショナルジャーナル オブ
キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ） ３０ｐ，
６６９−６７３；リオッタ，Ｌ．Ａ．，エイブ，Ｓ．，
ジェーロン−ロビィ，Ｐ．，およびマーティン，Ｇ．
Ｒ．，１９７９，プロシーディング ナチュラル アカ
デミィ オブ サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７６，２２６８−２２７２；リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリ
グヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ， Ｓ．，ハート，
Ｉ．，フォルツ，Ｃ．Ｍ．，およびシャーフィ，Ｓ．，
１９８０，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， ロンドン，
２８４，６７−６８；コリアー， Ｉ．Ｅ．，ウィルヘ
ルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．
Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，
クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ，バゥアー，Ｅ．
Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジ
ャーナル オブ バイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６５８
７）；内皮細胞（カレビック，Ｔ．，バービサ，Ｓ．，
グレーサー，Ｂ．およびリオッタ，Ｌ．Ａ．，１９８
３，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２１，２８１−
２８３）；骨 （マーフィー，Ｇ．，マックアルピン，
Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．
Ｊ．，１９８５，バイオケミカ バイオフィジカエト
アクタ （Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）８３１，４９−５８）；繊維芽細胞（コリアー，
Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．
Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェ
ルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒ
ー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．） ２６３，６５７９−６５８７）；多形核白血球
（ウィット，Ｖ．Ｊ．，シュワルツックス，Ｄ．，およ
びヴェイス，Ａ．，１９８０，ヨーロピアン ジャーナ
ル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．） １０５，４０９−４１７）；およびマクロ
ファージ（ガルビサ，Ｓ．，バリン，Ｍ．，ダガ−ジオ
ルディニ，Ｄ．，ファステリ，Ｇ．，ナチュレイル，
Ｍ．，ネグロ，Ａ．，セメンザト，Ｇ．，およびリオッ
タ，Ｌ．Ａ．，１９８６，ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２
６１，２３６９−２３７５）；から確認されている。こ
の酵素は６８ないし７２キロダルトンの中性メタロプロ
テイナーゼであり、それは酵素前駆体型として潜んでい
る（リオッタ，Ｌ．Ａ．，エイブ，Ｓ．，ジェーロン−
ロビィ，Ｐ．，およびマーティン，Ｇ．Ｒ．，１９７
９，プロシーディング ナチュラル アカデミィ オブ
サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７６，２２６８−
２２７２；リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴェイソン，
Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェーロン−ロビィ，Ｐ．エイ
ブ，Ｓ．，１９８１，バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１００−１０４；サロ，Ｔ．，
リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴサッソン，Ｋ．１９８
３，ジャーナル オブ バイオロジカル ケ ミ スト
リ ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５８，３０５
８−３０６３）。加えて、幾つかの他のこのコラーゲナ
ーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは近年、ストロメリジ
ンンの第二型 （ストロメリジン−２）、９２キロダル
トン型のＩＶ型コラーゲナーゼおよびピュータティヴ
ユータラインメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ）：（ＰＵＭＰ）−１、低分子量のユータラインコ
ラーゲナーゼ（ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，コリアー，
Ｉ．Ｅ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
グラント，Ｇ．Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，
１９８９，ジャーナルオブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２ ６４，１７２
１３−１７２２１；ウォエスナー，Ｊ．Ｆ．およびタル
ピン，Ｃ．Ｊ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ
ｍ．）２ ６ ３，１６９１８−１６９２５）を含めて
開示されている。７０キロダルトンＩＶ型コラーゲナー
ゼは、マウス腫瘍型での腫瘍の転移潜在性に密接に関係
しており、（リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴェイソン，
Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ハート，Ｉ．，フォルツ，Ｃ．
Ｍ．，およびシャーフィ，Ｓ．，１９８０，ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），ロンドン，２８４，６７−６８）お
よび、それに伴い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ
−ｒａｓ癌遺伝子を増加させる（マッシェル，Ｒ．，ウ
ィリアムズ，Ｊ．Ｅ．，ロゥイー，Ｄ．Ｒ．およびリオ
ッタ，Ｌ．Ａ．，１９８５，アメリカン ジャーナル
オブ パソロジー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）
１２１，１−８；ガルビサ，Ｓ．，ポッザッティ．
Ｒ．，マッシェル，Ｒ．Ｊ．，サッフィオッティ，
Ｕ．，バリン，Ｍ．，ゴールドファーブ，Ｒ．Ｈ．，ホ
ゥリー，Ｇ．およびリオッタ，Ｌ．Ａ．，１９８７，キ
ャンサー（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７，１５２３−
１５２８）。トリプシン処理の結果、潜在酵素の活性化
とそれに伴う分子量の減少が起こる（リオッタ，Ｌ．
Ａ．，トリグヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェ
ーロン−ロビィ，Ｐ．エイブ，Ｓ．，１９８１，バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１０
０−１０４）。有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化
を提示し、このことも分子量の減少に関連づけられる
（コリアー， Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，ア
イゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，
Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガ
ー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，および
ゴールドーバーグ，Ｇ．Ｉ．，１９８８，ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６５８７；マーフィ
ー，Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．
Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオ
ケミカ バイオフィジカ エト アクタ （Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８３１，４９−５
８）。活性化された酵素はＩＶ型コラーゲンを分裂さ
せ、特徴的な１／４アミノ−末端および３／４カルボキ
シ−末端のフラグメントを生成させる（リオッタ，Ｌ．
Ａ．，トリグヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェ
ーロン−ロビィ，Ｐ．エイブ，Ｓ．，１９８１，バイオ
ケミス トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１
００−１０４；コリアー，Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，
Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，
グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロ
ンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．
Ａ．，およびゴールドーバーグ，Ｇ．Ｉ．，１９８８，
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６
５８７；フェスラー，Ｌ．Ｉ．，ダンカン，Ｋ．Ｇ．，
フェスラー，Ｊ．Ｈ．，サロ，Ｔ．およびトリグベイソ
ン，Ｋ．，１９８４，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２５
９，９７８３−９７８９）。ゼラチン分解活性がこの酵
素に関連することも示されている（コリアー， Ｉ．
Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，
Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，
Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６
３， ６５７９−６５８７；ホィヤ，Ｍ．チューペーニ
ーミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，ステットラー−スティー
ヴンソン，Ｗ．，クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソ
ン，Ｋ．およびリオッタ．Ｌ．Ａ．， １９８８，フェ
ダレイション オブ ヨーロピィアン バイオケミカル
ソサイエティ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） ２３３，１０９−１１３；マーフィー，Ｇ．，マ
ックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，およびレ
イノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオケミカ バイオ
フィジカ エト アクタ （Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ） ８３１，４９−５８）。同様に、
Ｖ型コラーゲン分解活性も示されている（コリアー，
Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．
Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェ
ルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒ
ー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．） ２６３，６５７９−６５８７；マーフィー，
Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，
およびレイノルズ， Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオケミ
カ バイオフィジカ エト アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）８３１，４９−５８）。Ｉ
Ｖ型コラーゲナーゼはヒトメラノーマ細胞から精製され
ており、そして全タンパク質アミノ末端における配列情
報はトリプシン作用のおよび臭化シアンのペプチドフラ
グメントと同様に得られる（ホィヤ，Ｍ．チューペーニ
ーミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，ステットラー−スティー
ヴンソン，Ｗ．，クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソ
ン，Ｋ．およびリオッタ． Ｌ．Ａ．，１９８８，フェ
ダレイション オブ ヨーロピィアン バイオケミカル
ソサイエティ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） ２３３，１ ０９−１１３）。配列情報はＩＶ型
コラーゲナーゼが間質コラーゲナーゼとストーメリジン
の相同の限界配列を示すことによって説明される。最近
の報告ではＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上皮細胞によって隠
されたメタロプロテイナーゼによって特徴付けられた部
分的なｃＤＮＡクローンがある（コリアー，Ｉ．Ｅ．，
ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマ
ー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，
Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バ
ゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，Ｇ．
Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，
６５７９−６５８７）。変性気管上皮酵素は特にＩＶ型
コラーゲンの減成に有効で、そして推定されたアミノ酸
配列は報告されているトリプシン性および臭化シアンの
ヒト腫瘍ＩＶコラーゲナーゼのフラグメントとの一致を
提示する（ホィヤ，Ｍ．チューペーニーミ−ヒュジャン
エン，Ｔ．，ステットラー−スティーヴンソン，Ｗ．，
クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソン，Ｋ．およびリオ
ッタ．Ｌ．Ａ．，１９８８，フェダレイション オブ
ヨーロピィアン バイオケミカル ソサイエティ レタ
ーズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） ２３３，１０９−
１１３）。このように、ヒトメラノーマ細胞のＩＶ型コ
ラーゲナーゼはＨ−ｒａｓ変性気管上細胞の酵素と一致
すると考えられ、それは繊維芽細胞（コリアー，Ｉ．
Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，
Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，
Ｇ．Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６
３，６５７９−６５８７）および骨細胞外植体（マーフ
ィー，Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．
Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオ
ケミカ バイオフィジカ エト アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ） ８３１，４９−５
８）からも発見されている。
ンの減成は特定の種類のメタロプロテイナーゼ（そのマ
トリックスメタロプロテイナーゼは酵素前駆体型として
細胞外マトリックスの中に潜んでいるコラーゲナーゼ
（ＢＣ ３．４．２４．７）としても公知である）によ
って、開始される。このコラーゲナーゼ遺伝子ファミリ
ーの構成物は次のものを含んでいる。コラーゲンＩ，Ｉ
ＩおよびＩＩＩ型を減成し、基質特異性と活性の必要条
件によって特徴づけられている間質コラーゲナーゼ（ス
トリックリン，Ｇ．Ｐ，ジェフリィ，Ｊ．Ｊ，ローズウ
ィット，Ｗ．Ｔ．およびアイゼン，Ａ．Ｚ．，１９８
３，バイオケミストリィ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
２２，６１−６８；ゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，ウィル
ヘルム，Ｓ．，クーロンバーガー，Ａ．，バゥアー，
Ｅ．Ａ．，グラント，Ｇ．Ａ．，およびアイゼン，Ａ．
Ｚ．，１９８６，ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６１，６
６００−６６０５；ハスティ，Ｋ．Ａ．，ジェフリィ，
Ｊ．Ｊ．，ヒッブス，Ｍ．Ｓ．，およびウェルガス，
Ｈ．Ｇ．，１９８７，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６
２，１００４８−１００５２；フィールズ，Ｇ．Ｂ．，
ファン ワルト，Ｈ．Ｅ．，およびビルケダル−ハンセ
ン，Ｈ．，１９８７，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６
２，６２２１−６２２６；グラント，Ｇ．Ａ．，および
アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，ローズウィ
ット，Ｗ．Ｔ．，およびゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，１
９８７，ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６２，５８８６
−５８８９）；プロテオグリカン、グリコプロテインお
よびコラーゲン分子の非ラセン部位を減成するストロメ
リジン（ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，コリャーム，Ｉ．
Ｅ．，クーロンバーガー，Ａ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，バゥアー，
Ｅ．Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８
７，プロシーディング ナチュラル アカデミィ オブ
サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）８４，６７２５−６７
２９；ホァィトマン，Ｓ．Ｅ．，マーフィー，Ｇ．，エ
ンジェル，Ｐ．，ラームスフォルフ，Ｈ．Ｊ．，スミ
ス，Ｂ．Ｊ．，ライオンズ，Ａ．，ハリス，Ｔ．Ｊ．
Ｔ．，レイノルズ，Ｊ．Ｊ．，ヘルリッヒ，Ｐ．，およ
びドチェーティ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，１９８６，バイオケミ
カル ジャーナル（Ｂｉｏｃｅｍ．Ｊ．）２４０，９１
３−９１６）；およびペプシン抵抗性−三重ラセンＩＶ
型コラーゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を減成
するＩＶ型コラーゲナーゼ。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒ
ト腫瘍細胞（リオッタ，Ｌ．Ａ．，クライナーマン，
Ｊ．，カタンザロ，Ｐ．，およびリンブランド，Ｄ．，
１９７７，ジャーナルオブナチュラル キャンサー イ
ンスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ
ｓｔ．） ５８，１４２７−１４３９；チューペーニー
ミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，およびトリグヴェイソン，
Ｋ．，１９８２，インターナショナルジャーナル オブ
キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ） ３０ｐ，
６６９−６７３；リオッタ，Ｌ．Ａ．，エイブ，Ｓ．，
ジェーロン−ロビィ，Ｐ．，およびマーティン，Ｇ．
Ｒ．，１９７９，プロシーディング ナチュラル アカ
デミィ オブ サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７６，２２６８−２２７２；リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリ
グヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ， Ｓ．，ハート，
Ｉ．，フォルツ，Ｃ．Ｍ．，およびシャーフィ，Ｓ．，
１９８０，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， ロンドン，
２８４，６７−６８；コリアー， Ｉ．Ｅ．，ウィルヘ
ルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．
Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，
クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ，バゥアー，Ｅ．
Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジ
ャーナル オブ バイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６５８
７）；内皮細胞（カレビック，Ｔ．，バービサ，Ｓ．，
グレーサー，Ｂ．およびリオッタ，Ｌ．Ａ．，１９８
３，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２１，２８１−
２８３）；骨 （マーフィー，Ｇ．，マックアルピン，
Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．
Ｊ．，１９８５，バイオケミカ バイオフィジカエト
アクタ （Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）８３１，４９−５８）；繊維芽細胞（コリアー，
Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．
Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェ
ルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒ
ー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．） ２６３，６５７９−６５８７）；多形核白血球
（ウィット，Ｖ．Ｊ．，シュワルツックス，Ｄ．，およ
びヴェイス，Ａ．，１９８０，ヨーロピアン ジャーナ
ル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．） １０５，４０９−４１７）；およびマクロ
ファージ（ガルビサ，Ｓ．，バリン，Ｍ．，ダガ−ジオ
ルディニ，Ｄ．，ファステリ，Ｇ．，ナチュレイル，
Ｍ．，ネグロ，Ａ．，セメンザト，Ｇ．，およびリオッ
タ，Ｌ．Ａ．，１９８６，ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２
６１，２３６９−２３７５）；から確認されている。こ
の酵素は６８ないし７２キロダルトンの中性メタロプロ
テイナーゼであり、それは酵素前駆体型として潜んでい
る（リオッタ，Ｌ．Ａ．，エイブ，Ｓ．，ジェーロン−
ロビィ，Ｐ．，およびマーティン，Ｇ．Ｒ．，１９７
９，プロシーディング ナチュラル アカデミィ オブ
サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．版（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７６，２２６８−
２２７２；リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴェイソン，
Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェーロン−ロビィ，Ｐ．エイ
ブ，Ｓ．，１９８１，バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１００−１０４；サロ，Ｔ．，
リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴサッソン，Ｋ．１９８
３，ジャーナル オブ バイオロジカル ケ ミ スト
リ ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５８，３０５
８−３０６３）。加えて、幾つかの他のこのコラーゲナ
ーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは近年、ストロメリジ
ンンの第二型 （ストロメリジン−２）、９２キロダル
トン型のＩＶ型コラーゲナーゼおよびピュータティヴ
ユータラインメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ）：（ＰＵＭＰ）−１、低分子量のユータラインコ
ラーゲナーゼ（ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，コリアー，
Ｉ．Ｅ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
グラント，Ｇ．Ａ．およびゴールドバーグ，Ｇ．Ｉ．，
１９８９，ジャーナルオブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２ ６４，１７２
１３−１７２２１；ウォエスナー，Ｊ．Ｆ．およびタル
ピン，Ｃ．Ｊ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ
ｍ．）２ ６ ３，１６９１８−１６９２５）を含めて
開示されている。７０キロダルトンＩＶ型コラーゲナー
ゼは、マウス腫瘍型での腫瘍の転移潜在性に密接に関係
しており、（リオッタ，Ｌ．Ａ．，トリグヴェイソン，
Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ハート，Ｉ．，フォルツ，Ｃ．
Ｍ．，およびシャーフィ，Ｓ．，１９８０，ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），ロンドン，２８４，６７−６８）お
よび、それに伴い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ
−ｒａｓ癌遺伝子を増加させる（マッシェル，Ｒ．，ウ
ィリアムズ，Ｊ．Ｅ．，ロゥイー，Ｄ．Ｒ．およびリオ
ッタ，Ｌ．Ａ．，１９８５，アメリカン ジャーナル
オブ パソロジー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）
１２１，１−８；ガルビサ，Ｓ．，ポッザッティ．
Ｒ．，マッシェル，Ｒ．Ｊ．，サッフィオッティ，
Ｕ．，バリン，Ｍ．，ゴールドファーブ，Ｒ．Ｈ．，ホ
ゥリー，Ｇ．およびリオッタ，Ｌ．Ａ．，１９８７，キ
ャンサー（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７，１５２３−
１５２８）。トリプシン処理の結果、潜在酵素の活性化
とそれに伴う分子量の減少が起こる（リオッタ，Ｌ．
Ａ．，トリグヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェ
ーロン−ロビィ，Ｐ．エイブ，Ｓ．，１９８１，バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１０
０−１０４）。有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化
を提示し、このことも分子量の減少に関連づけられる
（コリアー， Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，ア
イゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，
Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガ
ー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，および
ゴールドーバーグ，Ｇ．Ｉ．，１９８８，ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６５８７；マーフィ
ー，Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．
Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオ
ケミカ バイオフィジカ エト アクタ （Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８３１，４９−５
８）。活性化された酵素はＩＶ型コラーゲンを分裂さ
せ、特徴的な１／４アミノ−末端および３／４カルボキ
シ−末端のフラグメントを生成させる（リオッタ，Ｌ．
Ａ．，トリグヴェイソン，Ｋ．，ガルビサ，Ｓ．，ジェ
ーロン−ロビィ，Ｐ．エイブ，Ｓ．，１９８１，バイオ
ケミス トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０，１
００−１０４；コリアー，Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，
Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，
グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロ
ンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．
Ａ．，およびゴールドーバーグ，Ｇ．Ｉ．，１９８８，
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，６５７９−６
５８７；フェスラー，Ｌ．Ｉ．，ダンカン，Ｋ．Ｇ．，
フェスラー，Ｊ．Ｈ．，サロ，Ｔ．およびトリグベイソ
ン，Ｋ．，１９８４，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２５
９，９７８３−９７８９）。ゼラチン分解活性がこの酵
素に関連することも示されている（コリアー， Ｉ．
Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，
Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，
Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６
３， ６５７９−６５８７；ホィヤ，Ｍ．チューペーニ
ーミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，ステットラー−スティー
ヴンソン，Ｗ．，クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソ
ン，Ｋ．およびリオッタ．Ｌ．Ａ．， １９８８，フェ
ダレイション オブ ヨーロピィアン バイオケミカル
ソサイエティ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） ２３３，１０９−１１３；マーフィー，Ｇ．，マ
ックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，およびレ
イノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオケミカ バイオ
フィジカ エト アクタ （Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ） ８３１，４９−５８）。同様に、
Ｖ型コラーゲン分解活性も示されている（コリアー，
Ｉ．Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．
Ｚ．，マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェ
ルツァー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒ
ー．，Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．） ２６３，６５７９−６５８７；マーフィー，
Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．Ｔ．，
およびレイノルズ， Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオケミ
カ バイオフィジカ エト アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）８３１，４９−５８）。Ｉ
Ｖ型コラーゲナーゼはヒトメラノーマ細胞から精製され
ており、そして全タンパク質アミノ末端における配列情
報はトリプシン作用のおよび臭化シアンのペプチドフラ
グメントと同様に得られる（ホィヤ，Ｍ．チューペーニ
ーミ−ヒュジャンエン，Ｔ．，ステットラー−スティー
ヴンソン，Ｗ．，クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソ
ン，Ｋ．およびリオッタ． Ｌ．Ａ．，１９８８，フェ
ダレイション オブ ヨーロピィアン バイオケミカル
ソサイエティ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） ２３３，１ ０９−１１３）。配列情報はＩＶ型
コラーゲナーゼが間質コラーゲナーゼとストーメリジン
の相同の限界配列を示すことによって説明される。最近
の報告ではＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上皮細胞によって隠
されたメタロプロテイナーゼによって特徴付けられた部
分的なｃＤＮＡクローンがある（コリアー，Ｉ．Ｅ．，
ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，マーマ
ー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァー，
Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，Ｃ．，バ
ゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，Ｇ．
Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．） ２６３，
６５７９−６５８７）。変性気管上皮酵素は特にＩＶ型
コラーゲンの減成に有効で、そして推定されたアミノ酸
配列は報告されているトリプシン性および臭化シアンの
ヒト腫瘍ＩＶコラーゲナーゼのフラグメントとの一致を
提示する（ホィヤ，Ｍ．チューペーニーミ−ヒュジャン
エン，Ｔ．，ステットラー−スティーヴンソン，Ｗ．，
クルツシェ，Ｈ．，トリグヴェイソン，Ｋ．およびリオ
ッタ．Ｌ．Ａ．，１９８８，フェダレイション オブ
ヨーロピィアン バイオケミカル ソサイエティ レタ
ーズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） ２３３，１０９−
１１３）。このように、ヒトメラノーマ細胞のＩＶ型コ
ラーゲナーゼはＨ−ｒａｓ変性気管上細胞の酵素と一致
すると考えられ、それは繊維芽細胞（コリアー，Ｉ．
Ｅ．，ウィルヘルム，Ｓ．Ｍ．，アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．，グラント，Ｇ．Ａ．，シェルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．，クーロンバーガー，Ａ．，ヒー．，
Ｃ．，バゥアー，Ｅ．Ａ．，およびゴールドーバーグ，
Ｇ．Ｉ．，１９８８，ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６
３，６５７９−６５８７）および骨細胞外植体（マーフ
ィー，Ｇ．，マックアルピン，Ｃ．Ｇ．，ポール，Ｃ．
Ｔ．，およびレイノルズ，Ｊ．Ｊ．，１９８５，バイオ
ケミカ バイオフィジカ エト アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ） ８３１，４９−５
８）からも発見されている。
【０００３】［発明が解決しようとする課題］本発明は
マトリックスメタロプロティナーゼ阻害剤として有用
な 特定のアミノ酸配列を有するペプチドの提供を課題
とする。
マトリックスメタロプロティナーゼ阻害剤として有用
な 特定のアミノ酸配列を有するペプチドの提供を課題
とする。
【０００４】［課題を解決するための手段］ 発明の要約 ヒト黒色腫細胞から精製されたＩＶ型コラーゲナーゼの
酵素前駆体の全アミノ酸配列が今分析され、そして該酵
素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペプチ
ドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ
酵素から切断される８０残基のアミノ末端；システイン
に富む（システインリッチ）内部ドメイン；ヒスチジン
含有領域；およびカルボキシ末端から領域１５９残基を
包含する。これらのドメインからのペプチドはＩＶ型コ
ラーゲナーゼ分子内の特定のドメインに対する抗体を生
成するために使用された。本発明において、抗体、直接
アミノ酸配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の領域、およびｂ）有機
水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素
前駆体活性化の間に生成される主なＩＶ型コラーゲナー
ゼ変換体の構造を決定するために使用された。
酵素前駆体の全アミノ酸配列が今分析され、そして該酵
素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペプチ
ドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ
酵素から切断される８０残基のアミノ末端；システイン
に富む（システインリッチ）内部ドメイン；ヒスチジン
含有領域；およびカルボキシ末端から領域１５９残基を
包含する。これらのドメインからのペプチドはＩＶ型コ
ラーゲナーゼ分子内の特定のドメインに対する抗体を生
成するために使用された。本発明において、抗体、直接
アミノ酸配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の領域、およびｂ）有機
水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素
前駆体活性化の間に生成される主なＩＶ型コラーゲナー
ゼ変換体の構造を決定するために使用された。
【０００５】有機水銀化合物、ｐＡＰＭＡによるＩＶ型
コラーゲナーゼプロ酵素活性化は、結果として６２ｋＤ
ａの安定な活性酵素種を生じるアミノ酸８０個のアミノ
末端断片の自触的除去を伴うことが発見された。さら
に、これらのデータはＩＶ型コラーゲナーゼがその他の
細胞外マトリックス分解性メタロプロテイナーゼのアミ
ノ末端領域と配列相同性だけでなく機能的ドメイン同一
性を有することを示す。
コラーゲナーゼプロ酵素活性化は、結果として６２ｋＤ
ａの安定な活性酵素種を生じるアミノ酸８０個のアミノ
末端断片の自触的除去を伴うことが発見された。さら
に、これらのデータはＩＶ型コラーゲナーゼがその他の
細胞外マトリックス分解性メタロプロテイナーゼのアミ
ノ末端領域と配列相同性だけでなく機能的ドメイン同一
性を有することを示す。
【０００６】下の図８および９に示されるように、アミ
ノ末端ペプチド（残基１−８０）はＩＶ型コラーゲナー
ゼ活性化の間に切除される。この発見により、このペプ
チドが、活性部位をブロックしそして酵素を不活性にす
る内在酵素阻害剤を含むという可能性が高まった。従っ
て、活性化の間の上記アミノ末端セグメントの除去はこ
の阻害剤を除去するであろうし、そして活性部位を露出
する。この阻害に関与する重要な領域は対になっていな
いシステイン残基を含む図１０においてボックスで囲ま
れた領域である。この領域はその他のマトリックスメタ
ロプロテイナーゼにおいて保存された性質を示し、そし
てＣｈｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎによる分析法によりベータ
ターンコンホメーションの高い可能性を有する。さら
に、この配列内の対になっていないシステイン残基が酵
素の活性部位においてメタロイオンと非共有結合的に相
互作用すると仮定することは正当だった。従って、有機
水銀活性化（ＡＰＭＡがスルフヒドリル残基に結合する
ことは知られている）がこの相互作用を乱し、そして阻
害剤セグメントを活性部位への接近から分離するであろ
うコンホメーション変化を引き起こすであろう。この全
く新しい仮説を試験するために、アミノ末端残基１−８
７における一連の重複領域に相当する合成ペプチドが調
製された。下の図１１および１２ならびに表４に示され
るように、対になっていないシステインを含む保存領域
を含有するそれらのペプチドだけが０．１ｍＭ未満の濃
度で強く阻害性だった。システインは活性のために必要
だった。それ故に、これらのペプチドはメタロプロテイ
ナーゼのための阻害剤の全く新しいクラスを構成する。
ノ末端ペプチド（残基１−８０）はＩＶ型コラーゲナー
ゼ活性化の間に切除される。この発見により、このペプ
チドが、活性部位をブロックしそして酵素を不活性にす
る内在酵素阻害剤を含むという可能性が高まった。従っ
て、活性化の間の上記アミノ末端セグメントの除去はこ
の阻害剤を除去するであろうし、そして活性部位を露出
する。この阻害に関与する重要な領域は対になっていな
いシステイン残基を含む図１０においてボックスで囲ま
れた領域である。この領域はその他のマトリックスメタ
ロプロテイナーゼにおいて保存された性質を示し、そし
てＣｈｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎによる分析法によりベータ
ターンコンホメーションの高い可能性を有する。さら
に、この配列内の対になっていないシステイン残基が酵
素の活性部位においてメタロイオンと非共有結合的に相
互作用すると仮定することは正当だった。従って、有機
水銀活性化（ＡＰＭＡがスルフヒドリル残基に結合する
ことは知られている）がこの相互作用を乱し、そして阻
害剤セグメントを活性部位への接近から分離するであろ
うコンホメーション変化を引き起こすであろう。この全
く新しい仮説を試験するために、アミノ末端残基１−８
７における一連の重複領域に相当する合成ペプチドが調
製された。下の図１１および１２ならびに表４に示され
るように、対になっていないシステインを含む保存領域
を含有するそれらのペプチドだけが０．１ｍＭ未満の濃
度で強く阻害性だった。システインは活性のために必要
だった。それ故に、これらのペプチドはメタロプロテイ
ナーゼのための阻害剤の全く新しいクラスを構成する。
【０００７】要するに、この分析に基づく発見はａ）酵
素が潜在状態にあるとき該酵素の活性部位をブロックし
得る内在性酵素阻害剤を構成するＩＶ型プロコラーゲナ
ーゼのアミノ末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の中央近傍の領域の確認
を導いた。これらの領域に相同なペプチドは新規マトリ
ックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を構成する。
素が潜在状態にあるとき該酵素の活性部位をブロックし
得る内在性酵素阻害剤を構成するＩＶ型プロコラーゲナ
ーゼのアミノ末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の中央近傍の領域の確認
を導いた。これらの領域に相同なペプチドは新規マトリ
ックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を構成する。
【０００８】
図１は腫瘍細胞により分泌されたヒトＩＶ型プロコラー
ゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。図２はドメインにま
とめられたＩＶ型プロコラーゲナーゼとプロストロメリ
シンとプロコラーゲナーゼＩとのアミノ酸相同性の比較
を示す。 図３ （Ａ）抗ペプチド抗体Ａ１−１７のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし１
７に相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原とし
て使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体は
このエリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼの内部残基４７２−４９０に
相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原として使
用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体はこの
エリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当な
ペプチドを用いて行われた。ペプチドーウシ血清アルブ
ミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプチドは
競合抗原として使用された。 （Ｄ）粗製およびゼラチンアフィニティ精製ＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのウエスタンブロット。Ａ１−１７とイ
ムノブロットされた粗製ＩＶ型プロコラーゲナーゼ（Ａ
２０５８黒色腫細胞調整培地２０μｌ、列Ａ）、Ａ４７
２−４９０とイムノブロットされた精製ＩＶ型コラーゲ
ナーゼ（３０ｎｇ、列Ｃ）が示されている。図４はＩＶ
型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲンに結合する該
コラーゲナーゼに対するアッセイを示す。精製ＩＶ型コ
ラーゲナーゼは、微量滴定ウエルに被覆されたペプシン
消化ＩＶ型コラーゲンへの標識されたＩＶ型コラーゲナ
ーゼの結合を競合させるために用いられた（平均値±
Ｓ．Ｄ．）。結合の飽和は増加する量の基質を用いる下
側の曲線に示されている。図５は示された合成ペプチド
によるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害のゼラチンチモグラム
を示す。ゼラチナーゼ活性は約７０ｋＤａの位置に白色
の明瞭なバンドとして可視化されている。この白色の明
瞭なバンドは阻害剤の存在下で消失している。３重の試
験が示されている。図６は示されたペプチドによるＩＶ
型コラーゲンへの標識ＩＶ型コラーゲナーゼの結合の阻
害の例を示す。ヒスチジン含有ペプチドは図２および５
に示されたＩＶ型コラーゲナーゼのヒスチジン含有ドメ
インに相同なフィブロネクチン中の領域から誘導され
る。ヒスチジン残基は結合性競合に必要とされる。図７
はゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロッティング
により続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐＡＰＭ
Ａ活性化に対する時間経過を示す。Ａ２０５８黒色腫細
胞調整培地の一部２０μｌは示された時間（分）１．０
ｍＭ ｐＡＰＭＡの存在下で活性化された。反応はＥＤ
ＴＡを１０ｍＭまで添加して停止され、そして試料はゼ
ラチンを含むか、または含まない９％アクリルアミドゲ
ル上で電気泳動された。ゼラチンを含むゲルは電気泳動
後チモグラムとして現像された。ゼラチンを含まないゲ
ルは電気泳動でニトロセルロースに移され、そして次に
示されたアフィニティー精製抗体（１μｇ／ｍｌ）で免
疫染色された。アミノ末端抗原ドメインの損失は７０ｋ
Ｄａ体から６２ｋＤａ体へのｐＡＰＭＡ誘導変換の間に
起こる。ＭＷＭ，前染色された分子量マーカー。図８は
ＩＶ型コラーゲン減成アッセイにより続けられた精製Ｉ
Ｖ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化の時間経過を示
す。精製ＩＶ型コラーゲナーゼ（２３μｇ／ｍｌ）の一
部１０μｌはｐＡＰＭＡ中に１ｍＭとされ、そして示さ
れた時間３７℃で予備保温された。試料を次に５０ｍＭ
トリスＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、ｐＨ７．６の添加により最終容量６０μｌまで希
釈し、３Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ニュー・イングランド
・ヌクレアー）を添加し、そして反応混合物を３７℃で
３０分間保温した。試料は次に３重にアッセイされた。
最大活性は３７℃での２．８μｇ減成ＩＶ型コラーゲン
／ｈ／精製酵素μｇに相当する。図９は精製酵素の直接
アミノ酸配列決定法により決定されるＩＶ型プロコラー
ゲナーゼの潜在および活性体のアミノ酸配列を示す。ｐ
ＡＰＭＡ活性化の際の自触作用の切断部位も示してあ
る。書込みは精製潜在酵素（２０ｎｇ，列Ａ）および活
性酵素（２０ｎｇ，列Ｂ）の銀染色ＮａＤｏｄＳＯ４−
ＰＡＧＥゲルでの明らかな分子量を示す。図１０はＩＶ
型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残基１−１１０）
（上段）、間質プロコラーゲナーゼのアミノ末端（中
段）およびプロストロメリシンのアミノ末端（下段）を
示す。切断部位からわずかに上流の相同領域はボックス
Ａで示されており、ｐＡＰＭＡ活性化に続く切断部位は
ボックスＢで示されており、そしてシステイン残基には
下線を付してある。間質コラーゲナーゼおよびストロメ
リシンのｐＡＰＭＡ活性化に続く切断のその他の報告さ
れた部位は星印により示されている。図１１はペプシン
消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性化ＩＶ型コラーゲナー
ゼによる切断の示された合成ペプチドによる投与量依存
阻害を示す。ペプチドＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮは
０．１ｍＭの濃度で酵素活性の８０％を阻害する。より
高い濃度は全ての酵素活性を消失させる。図１２は酵素
阻害活性が試験されたペプチドの比較を示す。ペプチド
は図１０に示されたアミノ末端配列から誘導された。コ
ア配列ＰＲＣＧは、この配列のないペプチドが顕著な阻
害活性を欠くという事実に基づいて阻害活性に必要であ
る。最少の配列必要条件のさらなる精選は表２に列挙し
たペプチドを用いて行われた。図１３は、活性化に際し
てヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼから切断されるアミノ
末端ペプチドの８０個のアミノ酸配列をコード化するヒ
トＩＶ型プロコラーゲナーゼのためのヒトｃＤＮＡクロ
ーンの部分のヌクレオチド配列を示す。
ゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。図２はドメインにま
とめられたＩＶ型プロコラーゲナーゼとプロストロメリ
シンとプロコラーゲナーゼＩとのアミノ酸相同性の比較
を示す。 図３ （Ａ）抗ペプチド抗体Ａ１−１７のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし１
７に相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原とし
て使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体は
このエリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼの内部残基４７２−４９０に
相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原として使
用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体はこの
エリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当な
ペプチドを用いて行われた。ペプチドーウシ血清アルブ
ミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプチドは
競合抗原として使用された。 （Ｄ）粗製およびゼラチンアフィニティ精製ＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのウエスタンブロット。Ａ１−１７とイ
ムノブロットされた粗製ＩＶ型プロコラーゲナーゼ（Ａ
２０５８黒色腫細胞調整培地２０μｌ、列Ａ）、Ａ４７
２−４９０とイムノブロットされた精製ＩＶ型コラーゲ
ナーゼ（３０ｎｇ、列Ｃ）が示されている。図４はＩＶ
型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲンに結合する該
コラーゲナーゼに対するアッセイを示す。精製ＩＶ型コ
ラーゲナーゼは、微量滴定ウエルに被覆されたペプシン
消化ＩＶ型コラーゲンへの標識されたＩＶ型コラーゲナ
ーゼの結合を競合させるために用いられた（平均値±
Ｓ．Ｄ．）。結合の飽和は増加する量の基質を用いる下
側の曲線に示されている。図５は示された合成ペプチド
によるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害のゼラチンチモグラム
を示す。ゼラチナーゼ活性は約７０ｋＤａの位置に白色
の明瞭なバンドとして可視化されている。この白色の明
瞭なバンドは阻害剤の存在下で消失している。３重の試
験が示されている。図６は示されたペプチドによるＩＶ
型コラーゲンへの標識ＩＶ型コラーゲナーゼの結合の阻
害の例を示す。ヒスチジン含有ペプチドは図２および５
に示されたＩＶ型コラーゲナーゼのヒスチジン含有ドメ
インに相同なフィブロネクチン中の領域から誘導され
る。ヒスチジン残基は結合性競合に必要とされる。図７
はゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロッティング
により続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐＡＰＭ
Ａ活性化に対する時間経過を示す。Ａ２０５８黒色腫細
胞調整培地の一部２０μｌは示された時間（分）１．０
ｍＭ ｐＡＰＭＡの存在下で活性化された。反応はＥＤ
ＴＡを１０ｍＭまで添加して停止され、そして試料はゼ
ラチンを含むか、または含まない９％アクリルアミドゲ
ル上で電気泳動された。ゼラチンを含むゲルは電気泳動
後チモグラムとして現像された。ゼラチンを含まないゲ
ルは電気泳動でニトロセルロースに移され、そして次に
示されたアフィニティー精製抗体（１μｇ／ｍｌ）で免
疫染色された。アミノ末端抗原ドメインの損失は７０ｋ
Ｄａ体から６２ｋＤａ体へのｐＡＰＭＡ誘導変換の間に
起こる。ＭＷＭ，前染色された分子量マーカー。図８は
ＩＶ型コラーゲン減成アッセイにより続けられた精製Ｉ
Ｖ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化の時間経過を示
す。精製ＩＶ型コラーゲナーゼ（２３μｇ／ｍｌ）の一
部１０μｌはｐＡＰＭＡ中に１ｍＭとされ、そして示さ
れた時間３７℃で予備保温された。試料を次に５０ｍＭ
トリスＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、ｐＨ７．６の添加により最終容量６０μｌまで希
釈し、３Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ニュー・イングランド
・ヌクレアー）を添加し、そして反応混合物を３７℃で
３０分間保温した。試料は次に３重にアッセイされた。
最大活性は３７℃での２．８μｇ減成ＩＶ型コラーゲン
／ｈ／精製酵素μｇに相当する。図９は精製酵素の直接
アミノ酸配列決定法により決定されるＩＶ型プロコラー
ゲナーゼの潜在および活性体のアミノ酸配列を示す。ｐ
ＡＰＭＡ活性化の際の自触作用の切断部位も示してあ
る。書込みは精製潜在酵素（２０ｎｇ，列Ａ）および活
性酵素（２０ｎｇ，列Ｂ）の銀染色ＮａＤｏｄＳＯ４−
ＰＡＧＥゲルでの明らかな分子量を示す。図１０はＩＶ
型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残基１−１１０）
（上段）、間質プロコラーゲナーゼのアミノ末端（中
段）およびプロストロメリシンのアミノ末端（下段）を
示す。切断部位からわずかに上流の相同領域はボックス
Ａで示されており、ｐＡＰＭＡ活性化に続く切断部位は
ボックスＢで示されており、そしてシステイン残基には
下線を付してある。間質コラーゲナーゼおよびストロメ
リシンのｐＡＰＭＡ活性化に続く切断のその他の報告さ
れた部位は星印により示されている。図１１はペプシン
消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性化ＩＶ型コラーゲナー
ゼによる切断の示された合成ペプチドによる投与量依存
阻害を示す。ペプチドＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮは
０．１ｍＭの濃度で酵素活性の８０％を阻害する。より
高い濃度は全ての酵素活性を消失させる。図１２は酵素
阻害活性が試験されたペプチドの比較を示す。ペプチド
は図１０に示されたアミノ末端配列から誘導された。コ
ア配列ＰＲＣＧは、この配列のないペプチドが顕著な阻
害活性を欠くという事実に基づいて阻害活性に必要であ
る。最少の配列必要条件のさらなる精選は表２に列挙し
たペプチドを用いて行われた。図１３は、活性化に際し
てヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼから切断されるアミノ
末端ペプチドの８０個のアミノ酸配列をコード化するヒ
トＩＶ型プロコラーゲナーゼのためのヒトｃＤＮＡクロ
ーンの部分のヌクレオチド配列を示す。
【０００９】 ［発明の詳細な説明］マトリックスメタロプロテイナー
ゼを阻害する能力を有するペプチド配列を提供すること
が本発明の目的である。マトリックスメタロプロテイナ
ーゼの存在の同定に使用するための抗体を提供すること
が本発明の別の目的である。活性化マトリックスメタロ
プロテイナーゼにより引き起こされる組織破壊から生じ
る組織損傷に罹患した患者を治療する方法を提供するこ
とが本発明の別の目的である。
ゼを阻害する能力を有するペプチド配列を提供すること
が本発明の目的である。マトリックスメタロプロテイナ
ーゼの存在の同定に使用するための抗体を提供すること
が本発明の別の目的である。活性化マトリックスメタロ
プロテイナーゼにより引き起こされる組織破壊から生じ
る組織損傷に罹患した患者を治療する方法を提供するこ
とが本発明の別の目的である。
【００１０】ヒトＩＶ型コラーゲナーゼの全アミノ酸配
列は図１に示されている。この配列はこのタンパク質が
図２に示される一連のドメインに分割され得ることを示
す。約１ｋｂのセグメントによりコード化されるシステ
インリッチ（１２システイン残基）ドメインはその他の
配列決定されたメタロプロテイナーゼ例えばＩ型コラー
ゲナーゼおよびストロメリシンと顕著な相同性がない。
しかしながら、このシステインリッチ領域はフィブロネ
クチンと顕著な相同性を示す。システインリッチ配列が
メタロプロテイナーゼ活性においてその機能的役割を直
接試験されたことはこれまで決してなかった。システイ
ンに富む領域（残基２００−３７０）から誘導されたペ
プチドは酵素基質結合を阻害し、そして本発明の実施態
様と見なされる。 ＩＶ型コラーゲナーゼの他の３つの
ドメインはその他のマトリックスメタロプロテイナーゼ
と顕著な相同性を示す（図２）。特に、「ＭＢＤ」と表
記され、そして図２に示されている残基３７１ないし３
８６の領域はサーモリシンを含む３種全てのマトリック
スメタロプロテイナーゼ中に密接な相同配列を有する。
実際の結晶化されたサーモリシンにおいて、この領域は
酵素の推定上のＺｎ結合ドメインに関連する。しかしな
がら、ＭＢＤ配列はメタロプロテイナーゼ活性において
その機能的役割を直接試験されたことはこれまで決して
なかった。本発明において、（ａ）これらの領域から誘
導された合成ペプチドおよび（ｂ）これらの領域に対し
て指示されたアフィニティー精製抗体はゼラチナーゼお
よびＩＶ型コラーゲナーゼ活性をブロックする阻害剤を
構成する。さらに、概説したＩＶ型コラーゲナーゼドメ
インに相同なフィブロネクチンから誘導されたペプチド
はまた、その基質へのＩＶ型コラーゲナーゼの結合を阻
害する。
列は図１に示されている。この配列はこのタンパク質が
図２に示される一連のドメインに分割され得ることを示
す。約１ｋｂのセグメントによりコード化されるシステ
インリッチ（１２システイン残基）ドメインはその他の
配列決定されたメタロプロテイナーゼ例えばＩ型コラー
ゲナーゼおよびストロメリシンと顕著な相同性がない。
しかしながら、このシステインリッチ領域はフィブロネ
クチンと顕著な相同性を示す。システインリッチ配列が
メタロプロテイナーゼ活性においてその機能的役割を直
接試験されたことはこれまで決してなかった。システイ
ンに富む領域（残基２００−３７０）から誘導されたペ
プチドは酵素基質結合を阻害し、そして本発明の実施態
様と見なされる。 ＩＶ型コラーゲナーゼの他の３つの
ドメインはその他のマトリックスメタロプロテイナーゼ
と顕著な相同性を示す（図２）。特に、「ＭＢＤ」と表
記され、そして図２に示されている残基３７１ないし３
８６の領域はサーモリシンを含む３種全てのマトリック
スメタロプロテイナーゼ中に密接な相同配列を有する。
実際の結晶化されたサーモリシンにおいて、この領域は
酵素の推定上のＺｎ結合ドメインに関連する。しかしな
がら、ＭＢＤ配列はメタロプロテイナーゼ活性において
その機能的役割を直接試験されたことはこれまで決して
なかった。本発明において、（ａ）これらの領域から誘
導された合成ペプチドおよび（ｂ）これらの領域に対し
て指示されたアフィニティー精製抗体はゼラチナーゼお
よびＩＶ型コラーゲナーゼ活性をブロックする阻害剤を
構成する。さらに、概説したＩＶ型コラーゲナーゼドメ
インに相同なフィブロネクチンから誘導されたペプチド
はまた、その基質へのＩＶ型コラーゲナーゼの結合を阻
害する。
【００１１】［発明の実施の形態］本発明のマトリック
スメタロプロテイナーゼ阻害剤は不適当な血管形成、関
節炎、腫瘍増殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症
状態例えばサルコイドーシスの治療に使用され得る。こ
れらの状態において、産生さた酵素の量および図１１に
示されるような活性酵素を９０％以上阻害するのに必要
なペプチド阻害剤の量を見積もることは可能である。阻
害性ペプチドの治療的投与量は１０−２５０ｍｇ／ｋｇ
／ｄの許容できる薬学的範囲であり、より好ましくは２
５−１００ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲である。投薬される患
者の投与量は該患者において産生される酵素の量、該患
者の状態および体格に依存するであろう。阻害剤は注射
として、または血流中に速やかに移行するあらゆる手段
により投与され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」て
もよい。経頬または舌下投与のための調剤も与えられ得
る。呼吸器に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸
入により投与され得る。エアロゾルがこの目的のために
特に有用である。目の異常に対して、ペプチドは点眼薬
として投与されてもよい。
スメタロプロテイナーゼ阻害剤は不適当な血管形成、関
節炎、腫瘍増殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症
状態例えばサルコイドーシスの治療に使用され得る。こ
れらの状態において、産生さた酵素の量および図１１に
示されるような活性酵素を９０％以上阻害するのに必要
なペプチド阻害剤の量を見積もることは可能である。阻
害性ペプチドの治療的投与量は１０−２５０ｍｇ／ｋｇ
／ｄの許容できる薬学的範囲であり、より好ましくは２
５−１００ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲である。投薬される患
者の投与量は該患者において産生される酵素の量、該患
者の状態および体格に依存するであろう。阻害剤は注射
として、または血流中に速やかに移行するあらゆる手段
により投与され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」て
もよい。経頬または舌下投与のための調剤も与えられ得
る。呼吸器に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸
入により投与され得る。エアロゾルがこの目的のために
特に有用である。目の異常に対して、ペプチドは点眼薬
として投与されてもよい。
【００１２】［実施例］実施例１ ヒスチジン含有ペプチド阻害剤 タイプＩＶコラゲナーゼの残基３７１−３８６（ＭＢＤ
領域）に相当する合成ペプチドは、ゼラチナーゼおよび
コラゲナーゼタイプＩＶ活性を廃止する。これはゼラチ
ン酵素電気永動像を使用した第５図に示されている。さ
らに、これらのドメインを認識する親和力精製抗体もま
たゼラチナーゼおよひコラゲナーゼタイプＩＶ活性を阻
害する。これらのペプチドの作用メカニズムは、少なく
とも一部分、タイプＩＶコラーゲンへのタイプＩＶコラ
ゲナーゼの結合を完成させるそれらの能力に帰している
（第６図）。メタロプロテイナーゼペプチド阻害剤は、
タイプＩＶコラゲナーゼの残基３７１−３８６でのヒス
チジン含有ドメインと実質的な相同関係を持つタンパク
質ペプチドを有している。該タンパク質ペプチドは、メ
タロプロテイナーゼのゼラチン分解およびコラーゲン分
解活性を阻害する。メタロプロテイナーゼ阻害剤のタン
パク質ペプチドは好ましくは活性のための少なくとも１
種のヒスチジン残基を含有する。メタロプロテイナーゼ
阻害剤のタンパク質ペプチドの一つの望ましい具体例
は，ヒスチジン含有配列を持ち、該配列は、ＶＡＡＨＥ
ＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥ
ＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨ
ＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬ
ＦＨＳＡ，ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびフ
ィブロネクチンペプチドＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭ
よりなる群から選択されたメンバーである。後者のペプ
チドが有効でヒスチジン残基を必要としたので、コア配
列ＡＨＥは本発明の一主要具体例の最小抗原決定基（ｍ
ｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｒｍｉ−ｎａｎｔ）であること
が決定された。保存された残基領域中にアミノ酸を置換
することにより、第５図および第６図に示すように、ペ
プチドの阻害活性のためにヒスチジン残基が幾分必要で
あることが判明した。全３個のヒスチジンがアラニンで
置換された場合、ペプチドは完全に不活性となった。し
かしながら、中央のヒスチジンのみがアラニンで置換さ
れた場合、阻害活性は残された。さらに、２個のグルタ
ミン酸（Ｅ）残基をグルタミン（Ｑ）で置換すること
は、ペプチドの阻害活性を改変した。これらの阻害性ペ
プチドは、タイプＩＶコラーゲン基質またはゼラチン基
質における解裂部位と相同関係を持たない。それらの作
用メカニズムには、金属イオンと相互作用できるプロテ
イナーゼの領域内の酵素−基質相互作用の干渉が含ま
れ、そのような相互作用は基質解裂にとって必要であ
る。その活性ペプチドは、タイプＩＶコラゲナーゼ活性
を廃止するペプチド濃度下で、サーモリシンのゼラチン
分解活性を部分的に抑制する。活性ペプチドは、プラス
ミンおよびトリプシンを含めて試験された多様なセリン
およびチオールプロテアーゼ類または“非メタロプロテ
イナーゼ類”を阻害するのに失敗した。表１は、発明者
らによる機能的研究に基づいてまた他のメタロプロテイ
ナーゼとの相同比較に基づいて図１中の配列から選択さ
れた、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害候補と
して試験されたアミノ酸置換を含む合成ヒスチジン含有
ペプチドのリストである。
領域）に相当する合成ペプチドは、ゼラチナーゼおよび
コラゲナーゼタイプＩＶ活性を廃止する。これはゼラチ
ン酵素電気永動像を使用した第５図に示されている。さ
らに、これらのドメインを認識する親和力精製抗体もま
たゼラチナーゼおよひコラゲナーゼタイプＩＶ活性を阻
害する。これらのペプチドの作用メカニズムは、少なく
とも一部分、タイプＩＶコラーゲンへのタイプＩＶコラ
ゲナーゼの結合を完成させるそれらの能力に帰している
（第６図）。メタロプロテイナーゼペプチド阻害剤は、
タイプＩＶコラゲナーゼの残基３７１−３８６でのヒス
チジン含有ドメインと実質的な相同関係を持つタンパク
質ペプチドを有している。該タンパク質ペプチドは、メ
タロプロテイナーゼのゼラチン分解およびコラーゲン分
解活性を阻害する。メタロプロテイナーゼ阻害剤のタン
パク質ペプチドは好ましくは活性のための少なくとも１
種のヒスチジン残基を含有する。メタロプロテイナーゼ
阻害剤のタンパク質ペプチドの一つの望ましい具体例
は，ヒスチジン含有配列を持ち、該配列は、ＶＡＡＨＥ
ＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥ
ＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨ
ＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬ
ＦＨＳＡ，ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびフ
ィブロネクチンペプチドＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭ
よりなる群から選択されたメンバーである。後者のペプ
チドが有効でヒスチジン残基を必要としたので、コア配
列ＡＨＥは本発明の一主要具体例の最小抗原決定基（ｍ
ｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｒｍｉ−ｎａｎｔ）であること
が決定された。保存された残基領域中にアミノ酸を置換
することにより、第５図および第６図に示すように、ペ
プチドの阻害活性のためにヒスチジン残基が幾分必要で
あることが判明した。全３個のヒスチジンがアラニンで
置換された場合、ペプチドは完全に不活性となった。し
かしながら、中央のヒスチジンのみがアラニンで置換さ
れた場合、阻害活性は残された。さらに、２個のグルタ
ミン酸（Ｅ）残基をグルタミン（Ｑ）で置換すること
は、ペプチドの阻害活性を改変した。これらの阻害性ペ
プチドは、タイプＩＶコラーゲン基質またはゼラチン基
質における解裂部位と相同関係を持たない。それらの作
用メカニズムには、金属イオンと相互作用できるプロテ
イナーゼの領域内の酵素−基質相互作用の干渉が含ま
れ、そのような相互作用は基質解裂にとって必要であ
る。その活性ペプチドは、タイプＩＶコラゲナーゼ活性
を廃止するペプチド濃度下で、サーモリシンのゼラチン
分解活性を部分的に抑制する。活性ペプチドは、プラス
ミンおよびトリプシンを含めて試験された多様なセリン
およびチオールプロテアーゼ類または“非メタロプロテ
イナーゼ類”を阻害するのに失敗した。表１は、発明者
らによる機能的研究に基づいてまた他のメタロプロテイ
ナーゼとの相同比較に基づいて図１中の配列から選択さ
れた、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害候補と
して試験されたアミノ酸置換を含む合成ヒスチジン含有
ペプチドのリストである。
【００１３】
【００１４】方法 ゼラチン酵素電気泳動像 ストック溶液および下記混合操作を用いて、ゼラチナー
ゼ活性の目視のためのゼラチン酵素電気泳動像が作成さ
れた。
ゼ活性の目視のためのゼラチン酵素電気泳動像が作成さ
れた。
【００１５】
【００１６】手順 この実施例のために使用するゼラチンのザイモグラム調
製の手順は，下記の段階と試薬を利用した。 １）ゲルを形成する装置を集める。 ２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する：最終容積４０ｍｌの９％アクリルアミド： ５０ｍｌのフ
ァルコン管に，１２ｍｌの３０％アクリルアミド，０．
８％ビスアクリルアミド ０．４ｍｌの１０％ＳＤＳ ７．５ｍｌの２ＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．８ ４ ｍｌの１％ゼラチン１６ｍｌのｄＨ２Ｏを入れる。 ３）混合後，０．４ｍｌの１０％過硫酸アンモニウムを
添加し，再度混合する。 ４）４０μｌのＴＥＭＥＤで重合を開始し，混合しそし
て３２ｍｌのゲル溶液をゲル型の中に注ぐ。 ５）ブタノールで飽和した水で溶液の上を覆い，３０−
４５分間重合させる。 ６）重合の後，ゲルの表面をｄＨ２で洗浄し，乾燥す
る。 ７）重合のために，ゲルの溶液を積層して準備する：最終容積１０ｍｌの３％アクリルアミド： １５ｍｌのフ
ァルコン管に，２．５ｍｌの０．５ＭＴｒｉｓＨＣｌ，
ｐＨ６．８ ０．１ｍｌの１０％ＳＤＳ １．０ｍｌの３０％アクリルアミド， ０．８％ビスア
クリルアミド ０．１ｍｌの１０％過硫酸アンモニウム ５．３ｍｌのｄＨ２Ｏを添加する。 ８）積層してある（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルの重合を，
４０μｌのＴＥＭＥＤで，開始しそして混合する。 ９）約６ｍｌをゲル型中の重合した流動性のゲルの上に
注ぎ，井戸櫛（ｗｅｌｌ ｃｏｍｂ）を挿入する。 １０）櫛歯の底部から空気泡を除き，必要ならば追加の
ゲル液を添加する。 １１）積み重ねてあるゲルを１５−２０分間重合させ
る。 １２）重合の後，積層してあるゲルから櫛を取り除き，
１ｘ電極緩衝液を両方の電極室に入れる。 １３）空気を，試料井戸（ｗｅｌｌ）とゲルの底部から
取り除く。 １４）試料を添加，３０ミリアンペア／ゲルで電気泳動
する。 １５）電気泳動の終了後，ゲルを，室温でゆっくり攪拌
しながら２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２回換え
て，６０分間にわたり洗浄する。 １６）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液を捨て，ゲルを１
ｘコラーゲン緩衝液中に置き，３７℃で２−４時間にわ
たりまたは室温で一夜にわたり保温する。 １７）保温期間後， ０．１％のアミドブラック中で３
０分間汚染し，次いで約９０分間にわたり脱汚染する。 １８）清浄になっている範囲は，ゼラチン分解活性に該
当する。いろいろな濃度の分離ゲルの調製を下記する。 最終体積４０ｍｌ ６％ ８％ ９％ １０％ ３０％ アクリルアミド ８ｍｌ １０．６ｍｌ １２ｍｌ １３．３ｍｌ ０．８％ビス アクリルアミド ｄＨ２Ｏ ２０ｍｌ １７．４ｍｌ １６ｍｌ １４．７ｍｌ
製の手順は，下記の段階と試薬を利用した。 １）ゲルを形成する装置を集める。 ２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する：最終容積４０ｍｌの９％アクリルアミド： ５０ｍｌのフ
ァルコン管に，１２ｍｌの３０％アクリルアミド，０．
８％ビスアクリルアミド ０．４ｍｌの１０％ＳＤＳ ７．５ｍｌの２ＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．８ ４ ｍｌの１％ゼラチン１６ｍｌのｄＨ２Ｏを入れる。 ３）混合後，０．４ｍｌの１０％過硫酸アンモニウムを
添加し，再度混合する。 ４）４０μｌのＴＥＭＥＤで重合を開始し，混合しそし
て３２ｍｌのゲル溶液をゲル型の中に注ぐ。 ５）ブタノールで飽和した水で溶液の上を覆い，３０−
４５分間重合させる。 ６）重合の後，ゲルの表面をｄＨ２で洗浄し，乾燥す
る。 ７）重合のために，ゲルの溶液を積層して準備する：最終容積１０ｍｌの３％アクリルアミド： １５ｍｌのフ
ァルコン管に，２．５ｍｌの０．５ＭＴｒｉｓＨＣｌ，
ｐＨ６．８ ０．１ｍｌの１０％ＳＤＳ １．０ｍｌの３０％アクリルアミド， ０．８％ビスア
クリルアミド ０．１ｍｌの１０％過硫酸アンモニウム ５．３ｍｌのｄＨ２Ｏを添加する。 ８）積層してある（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルの重合を，
４０μｌのＴＥＭＥＤで，開始しそして混合する。 ９）約６ｍｌをゲル型中の重合した流動性のゲルの上に
注ぎ，井戸櫛（ｗｅｌｌ ｃｏｍｂ）を挿入する。 １０）櫛歯の底部から空気泡を除き，必要ならば追加の
ゲル液を添加する。 １１）積み重ねてあるゲルを１５−２０分間重合させ
る。 １２）重合の後，積層してあるゲルから櫛を取り除き，
１ｘ電極緩衝液を両方の電極室に入れる。 １３）空気を，試料井戸（ｗｅｌｌ）とゲルの底部から
取り除く。 １４）試料を添加，３０ミリアンペア／ゲルで電気泳動
する。 １５）電気泳動の終了後，ゲルを，室温でゆっくり攪拌
しながら２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２回換え
て，６０分間にわたり洗浄する。 １６）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶液を捨て，ゲルを１
ｘコラーゲン緩衝液中に置き，３７℃で２−４時間にわ
たりまたは室温で一夜にわたり保温する。 １７）保温期間後， ０．１％のアミドブラック中で３
０分間汚染し，次いで約９０分間にわたり脱汚染する。 １８）清浄になっている範囲は，ゼラチン分解活性に該
当する。いろいろな濃度の分離ゲルの調製を下記する。 最終体積４０ｍｌ ６％ ８％ ９％ １０％ ３０％ アクリルアミド ８ｍｌ １０．６ｍｌ １２ｍｌ １３．３ｍｌ ０．８％ビス アクリルアミド ｄＨ２Ｏ ２０ｍｌ １７．４ｍｌ １６ｍｌ １４．７ｍｌ
【００１７】溶解性のコラゲナーゼの検定 この実施例の溶解性コラゲナーゼの検定のための手順に
は下記の調製物を利用した。０．５ＭＴｒｉｓ， ２．
０Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５Ｍ ＣａＣｌ２，２％Ｂｒ
ｉｊ ３５の最終濃度を得るように１０ｘコラゲナーゼ
緩衝液を調製する。１ｌを調製するために， ６０．５５ｇの Ｔｒｉｓ １１６．８８ｇの ＮａＣｌ ７．３５ｇの ＣａＣｌ２ ２０ ｇの Ｂｒｉｊ３５ を合わせる。次いで８００ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解し，
濃塩酸を添加してｐＨを７．６に調製する。最終体積を
１ｌにし，ろ過して殺菌する。１０ｘ細菌性コラゲナー
ゼ（陽性対照）を調製して，最終濃度０．５％（ｗ／
ｖ）を得る。これは，１０ｍｇの細菌性のコラゲナーゼ
（シグマ社製＃Ｃ−５１３８）を２ｍｌの１ｘコラゲナ
ーゼ緩衝液に溶解し，１００ｍｌのアリコート（ａｌｉ
ｑｕｏｔｅ）にして−２０℃で貯蔵することを包含す
る。ウシの血清アルブミン（輸送タンパク質）溶液を調
製して１ｘコラーゲナーゼ緩衝液中で０．５％（ｗ／
ｖ）の最終濃度にする。これは１００ｍｇのウシ血清ア
ルブミンを２０ｍｌの１ｘコラゲナーゼ緩衝液に溶解
し，１ｍｌの分割したアリコートにして，−２０℃で保
管する。トリクロロ酢酸−タンニン酸−プロリン溶液
（ＴＣＡＴＡＰ）を調製して，１０％ＴＣＡ，０．５％
タンニン酸，２ｍＭプロリンの最終濃度にする。これ
は，１０ｍｌの１００％トリクロロ酢酸溶液，１０ｍｌ
の５％タンニン酸溶液そして１ｍｌの２００ｍＭのプロ
リン液を合わせ，１００ｍｌの最終容積に希釈し，４℃
で保管し，そしてこの溶液を４週毎に取り替えることを
包含する。
は下記の調製物を利用した。０．５ＭＴｒｉｓ， ２．
０Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５Ｍ ＣａＣｌ２，２％Ｂｒ
ｉｊ ３５の最終濃度を得るように１０ｘコラゲナーゼ
緩衝液を調製する。１ｌを調製するために， ６０．５５ｇの Ｔｒｉｓ １１６．８８ｇの ＮａＣｌ ７．３５ｇの ＣａＣｌ２ ２０ ｇの Ｂｒｉｊ３５ を合わせる。次いで８００ｍｌのｄＨ２Ｏ中に溶解し，
濃塩酸を添加してｐＨを７．６に調製する。最終体積を
１ｌにし，ろ過して殺菌する。１０ｘ細菌性コラゲナー
ゼ（陽性対照）を調製して，最終濃度０．５％（ｗ／
ｖ）を得る。これは，１０ｍｇの細菌性のコラゲナーゼ
（シグマ社製＃Ｃ−５１３８）を２ｍｌの１ｘコラゲナ
ーゼ緩衝液に溶解し，１００ｍｌのアリコート（ａｌｉ
ｑｕｏｔｅ）にして−２０℃で貯蔵することを包含す
る。ウシの血清アルブミン（輸送タンパク質）溶液を調
製して１ｘコラーゲナーゼ緩衝液中で０．５％（ｗ／
ｖ）の最終濃度にする。これは１００ｍｇのウシ血清ア
ルブミンを２０ｍｌの１ｘコラゲナーゼ緩衝液に溶解
し，１ｍｌの分割したアリコートにして，−２０℃で保
管する。トリクロロ酢酸−タンニン酸−プロリン溶液
（ＴＣＡＴＡＰ）を調製して，１０％ＴＣＡ，０．５％
タンニン酸，２ｍＭプロリンの最終濃度にする。これ
は，１０ｍｌの１００％トリクロロ酢酸溶液，１０ｍｌ
の５％タンニン酸溶液そして１ｍｌの２００ｍＭのプロ
リン液を合わせ，１００ｍｌの最終容積に希釈し，４℃
で保管し，そしてこの溶液を４週毎に取り替えることを
包含する。
【００１８】手順 １．酵素試料活性化剤（通常は１ｍＭのｐＡＰＭＡ）と
試験液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れる。合わ
せた容積は６０μｌでなければならない。必要ならば１
ｘコラゲナーゼの緩衝液を添加する。必要ならば，前保
温する。 ２．３Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ＮＥＮ♯ＮＥＴ−９３１
ロット＃２５１１−０１８）の貯蔵品をコラゲナーゼ緩
衝液で１：１２０に希釈することによりＩＶ型のコラー
ゲン基質を製造する。５５℃に１０分間加熱し，氷上冷
却する。 ３．希釈した ３Ｈ−ＩＶ型コラーゲンの溶液の５μｌ
を，各々の検定管に入れる。混合するために渦巻き，２
８℃で４時間にわたり保温する。 ４．保温の終了時点で，輸送ＢＳＡの溶液の２μｌとＴ
ＣＡＴＡＰの溶液を添加する。渦巻きにして混合し，少
なくとも１０分間氷上に置く。 ５．速度を６に設定して，１０分間にわたりミクロフー
ゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で遠心分離することにより
沈澱をペレット状にする。ペレットが位置がわかるよう
に，試験管をミクロフーゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）に入
れるときに方向付けする。 ６．遠心分離の直後に，上澄み液の５５μｌを吸い取
り，シンチレーション瓶中に入れる。５７ｍｌのシンチ
レーション混合液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加し，よく
振りそして計数する。
試験液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れる。合わ
せた容積は６０μｌでなければならない。必要ならば１
ｘコラゲナーゼの緩衝液を添加する。必要ならば，前保
温する。 ２．３Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ＮＥＮ♯ＮＥＴ−９３１
ロット＃２５１１−０１８）の貯蔵品をコラゲナーゼ緩
衝液で１：１２０に希釈することによりＩＶ型のコラー
ゲン基質を製造する。５５℃に１０分間加熱し，氷上冷
却する。 ３．希釈した ３Ｈ−ＩＶ型コラーゲンの溶液の５μｌ
を，各々の検定管に入れる。混合するために渦巻き，２
８℃で４時間にわたり保温する。 ４．保温の終了時点で，輸送ＢＳＡの溶液の２μｌとＴ
ＣＡＴＡＰの溶液を添加する。渦巻きにして混合し，少
なくとも１０分間氷上に置く。 ５．速度を６に設定して，１０分間にわたりミクロフー
ゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で遠心分離することにより
沈澱をペレット状にする。ペレットが位置がわかるよう
に，試験管をミクロフーゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）に入
れるときに方向付けする。 ６．遠心分離の直後に，上澄み液の５５μｌを吸い取
り，シンチレーション瓶中に入れる。５７ｍｌのシンチ
レーション混合液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加し，よく
振りそして計数する。
【００１９】実施例 ２ ペプチド阻害剤を含有するシステイン 単一特異性の抗体を製造において使用するために，Ａ２
０５８メラノーマ細胞ＩＶ型プロコラゲナーゼのアミノ
末端配列（残基１−１７，ＡＰＳＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰ
ＫＴＤ）並びに内部領域（残基４７２−４９０，ＤＫＰ
ＭＧＰＬＬＶＡＴＦＮＰＥＬＰＥＫ）のそれを合成し
た。これらは下記の理由で選択された。酵素の直接の配
列で得られる（コリール， Ｉ． Ｅ．，ウィルヘル
ム， Ｓ．Ｍ．， アイゼン，Ａ． Ｚ．， マーマ
ー， Ｂ． Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．， ゼルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．， クローンバーガー， Ａ．，Ｈｅ．，
Ｃ．，バウエル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバーグ，
Ｇ． Ｉ．， １９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２
６３，６５７９−６５８７；ホウチャ，Ｍ．， ターピ
ンニーミ−フジャネン，Ｔ．，ステツラー−スチーブン
ソン，Ｗ．， クルーツシュ，Ｈ．， トルグベイソ
ン，Ｋ．，およびリオッタ， Ｌ．Ａ．，１９８８，Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３３， １０９−１１
３），ｃＤＮＡクローンから予測される配列で確認され
た（コリール， Ｉ． Ｅ．， ウィルヘルム， Ｓ．
Ｍ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．，
グラント，Ｇ．Ａ．， ゼルツァー， Ｊ． Ｌ．，
クローンバーガー，Ａ．，Ｈｅ．，Ｃ．， バウエ
ル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバーグ， Ｇ． Ｉ．，
１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，６５７
９−６５８７），そして他のメタロプロテイナーゼと相
同性を示さない領域から誘導されている。アフィニティ
ー精製抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ）は，直接のＥＬＩＺＡ並びに競合実
験を使用して特徴付けられる。この抗体は，ウシ血清ア
ルプミンまたは無関係のペプチドとの交叉反応性は示さ
なかった。アフィニティー精製抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は，ＩＶ型
プロコラゲナーゼを免疫沈澱する能力がある（ホウチ
ャ，Ｍ．， ターピンニーミ−フジャネン，Ｔ．， ス
テツラー−スチーブンソン，Ｗ．， クルーツシュ，
Ｈ．，トルグベイソン，Ｋ．，およびリオッタ，Ｌ．
Ａ．， １９８８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２３３，
１０９−１１３）。ウエスタンブロット法は，精製ＩＶ
型コラゲナーゼとのウエスタンブロッテイングと同じ
く，両方の抗体が，ＩＶ型プロコラゲナーゼを，Ａ２０
５８で調製した媒体において単一のバンドとして認識し
たということを示した。ｐＡＰＭＡ活性化の時間経過
を，ゼラチンザイモグラム分析，ＩＶ型コラゲナーゼ検
定およびイミュノブロット上の両方のアフィニテー精製
抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ）（図７）を使用して追跡した。Ａ２０５
８メラノーマ細胞ＩＶ型コラゲナーゼのゼラチンザイモ
グラム（図７）分析は，７０ｋＤダルトンの分子量を持
つゼラチン分解活性の単一バンドを示した。１ｍＭのｐ
ＡＰＭＡの存在下における３７℃での保温は，ゼラチン
分解活性のこのバンドのより低い分子量の６２ｋＤへの
漸進的な変換をもたらした。この変換は１０ｍＭのＥＤ
ＴＡの存在下では完全に阻害され，添加するｐＡＰＭＡ
の不在下では起きなかった（図示なし。）。精製したＩ
Ｖ型プロコラゲナーゼのＩＶ型コラゲナーゼ検定は，保
温期間における有機水銀化合物ｐＡＰＭＡの不在下では
コラーゲン分解の活性を示さなかった。ｐＡＰＭＡを使
用する保温により，酵素は活性化できた。コラゲナーゼ
検定により測定されたようにｐＡＰＭＡを使用する前保
温における活性化の時間経過は，完全なコラーゲン分解
活性が得られることを示している（図８）。抗体Ａ４７
２−４９０は，保温により，ゼラチンザイモグラム（図
７）に示されたものに該当する時間依存の分子量減少を
示した。この変換は，６０分迄に５０％完了し，９０分
迄に実質的に完了するように見える。アミノ末端エピト
ープに該当する抗体Ａ１−１７は，ｐＡＰＭＡ活性化の
間のイミュノステイニング（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｉｎ
ｉｎｇ）に於ける直接の減少を示した。これらの結果
は，有機水銀化合物を使用することによる潜在型から安
定な，活性のコラゲナーゼへの変換に従う明白な分子量
の減少は，アミノ末端ペプチド配列の欠失の結果である
ことを示している。ゼラチン−アフィニティ精製ＩＶ型
プロコラケナーゼを，ｐＡＰＭＡ活性化の前後両方の逆
相ＨＰＬＣにより更に精製した。クロマトグラムは，潜
在型または活性型保持時間に顕著な変化のないことを示
した。ピークを集め，ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥによ
り分析した時に，ｐＡＰＭＡ活性化に先立つプロコラゲ
ナーゼのピークは，非還元条件下では約７０ｋＤａダル
トンに単一バンドを示した（図９，挿入）。ｐＡＰＭＡ
活性化（１６時間，３７℃）の後のコラゲナーゼのピー
クは，非還元条件下で６２ｋＤａに単一のバンドを示し
た（図３Ａ）。ｐＡＰＭＡ活性化の前のＨＰＬＣ上のプ
ロコラゲナーゼのピークから得られる物質を，直接のア
ミノ配列分析に処した。この物質はこの酵素のために前
に決めたものとは同一であるアミノ末端配列を与える
（図９）。ＨＰＬＣ精製後のｐＡＰＭＡ活性化物質の直
接の配列分析は，単一の新規のアミノ末端配列を示して
いる（図９）。これは，ｐＡＰＭＡ活性化が約８ｋＤの
分子量低下と共に起こる潜在的酵素からのアミノ末端ペ
プチド断片の自触媒的脱離を伴うことを決定的に示して
いる。この切断は単一の部位においてだけ起こる。とい
うのは，精製，活性化した酵素多数の試料の配列を分析
しても，如何なる他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見出
されず，そしてウエスタンブロッテイングまたはゼラチ
ンザイモグラム分析によって中間体の痕跡が見出されな
いからである。この研究の結果は，ＩＶ型コラゲナーゼ
は，コラーゲン分解活性を得る前に活性化を必要とする
潜在的酵素前駆体の型で分泌されることを示している。
有機水銀化合物ｐＡＰＭＡにはこの活性化の能力があ
る。ＩＶ型プロコラゲナーゼの有機水銀活性化は，酵素
前駆体型の，アミノ末端からの８０個のアミノ酸残基ペ
プチド断片の除去によるより低い分子量の活性化型への
変換を伴う。ｐＡＰＭＡに曝した後，最大のコラーゲン
分解活性が速やかに得られる。安定なより低分子量型へ
の完全な変換に先立つこの活性への到達は，活性である
が不安定種である酵素前駆体における構造転位と一致し
ており，これは間質コラゲナーゼとストロメライシン
（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）で報告されている通りであ
る（ストリクリン，Ｇ． Ｐ．，ジェフリー， Ｊ．
Ｊ．， ロスウィット，Ｗ．Ｔ．，およびアイゼン，
Ａ． Ｚ．， １９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２２，６１−６８；マーフィ， Ｇ．， コクェット，
Ｍ． Ｉ．， ステフェンス， Ｐ． Ｅ．， スミ
ス， Ｂ． Ｊ．，およびドチャーチ，Ａ． Ｊ．
Ｐ．，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２４８，２６
５−２６８）。活性化は高度に精製したＩＶ型コラゲナ
ーゼ酵素前駆体に起こる。かくして，有機水銀化合物の
存在下における活性化は，ｐＡＰＭＡそのものがペプチ
ド結合を切断する能力に欠けるので自己分解的である。
有機水銀化合物による活性化のこの自己触媒的機構は，
間質コラゲナーゼ（グラント， Ｇ．Ａ．， アイゼ
ン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．， ロスヴァイ
ト，Ｗ．Ｔ．，およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，
１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，５８８６
−５８８９）；ウイットマン，Ｓ． Ｅ．， マーフ
ィ， Ｇ．， アンゲル，Ｐ．， ラームスフォルフ，
Ｈ．，−Ｊ．， スミス， Ｂ． Ｊ．，リオンス，
Ａ．， ハリス， Ｔ． Ｊ．Ｔ．， レイノルズ．
Ｊ． Ｊ．， ヘルリッヒ， Ｐ．およびドチャーチ，
Ａ．Ｊ．Ｐ．，１９８６，Ｂｉｏｈｅｍ．Ｊ．２４０，
９１３−９１６），およびストロメライシン（ｓｔｒｏ
ｍｅｌｙｓｉｎ）（ウィルヘルム， Ｓ．Ｍ．，コリエ
ルム， Ｉ．Ｅ．， クロンバーガー，Ａ．，アイゼ
ン，Ａ． Ｚ．，マーマー， Ｂ． Ｌ．， グラン
ト，Ｇ．Ａ．， バイエル， Ｅ．，およびゴルドバー
グ， Ｇ．Ｉ ．，１９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４， ６
７２５−６７２９；ウィットマン， Ｓ．Ｅ．， マー
フィー，Ｇ．， アンゲル， Ｐ．， ラームスフォル
フ，Ｈ．−Ｊ．， スミス， Ｂ．Ｊ．， リオンス，
Ａ．，ハリス， Ｔ． Ｊ． Ｔ．，レイノルズ．
Ｊ． Ｊ．，ヘルリッヒ， Ｐ．，およびドチャーチ，
Ａ．Ｊ． Ｐ．， １９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２
４０，９１３−９１６；マーフィ， Ｇ．， コケッ
ト，Ｍ． Ｉ．， ステフェンス，Ｐ． Ｅ．，スミ
ス， Ｂ． Ｊ．，およびドチャーチ， Ａ．Ｊ．
Ｐ．， １９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８，２６
５−２６８；サンチェス−ロペツ，Ｒ．， ゲンセル，
Ｍ．Ｃ．， マトリジアン， Ｌ．， および ブリー
トナッハ， Ｊ．ブリートナッハ，Ｒ．， １９８８，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３，１１８９２−１１
８９９）．のような他の細胞外マトリックスを分解する
メタロプロテイナーゼで示されている。これらの３種の
メタロプロテイナーゼ，ＩＶ型プロコラゲナーゼ，間質
プロコラゲナーゼおよびプロストロメライシンは，アミ
ノ酸レベルで顕著な相同性を示す（グラント， Ｇ．
Ａ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．，
ロスヴァイト，Ｗ．Ｔ．， およびゴールドバーグ，
Ｇ． Ｉ．， １９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２，５８８６−５８８９；コリール， Ｉ． Ｅ．，
ウィルヘルム， Ｓ．Ｍ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．， ゼル
ツァー， Ｊ．Ｌ．， クローンバーガー，Ａ．，Ｈ
ｅ．，Ｃ．， バウエル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．， １９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２６３，６５７９−６５８７；ウィルヘルム，Ｓ．
Ｍ．， コリエルム， Ｉ．Ｅ．， クロンバーガー，
Ａ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．
Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．，バイエル， Ｅ．，およ
びゴルドバーグ， Ｇ． Ｉ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４，６
７２５−６７２９；サウア， Ｊ．， キノネス，
Ｓ．， オタニ，Ｙ．， ナガセ，Ｈ．，ハリス，
Ｅ．Ｄ．，Ｊｒ．，およびクルキネン，Ｍ．，１９８
８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，６７４２−６７
４５；ウィットマン， Ｓ． Ｅ．， マーフィ，
Ｇ．， アンゲル，ｐ．， ラームスフォルフ，Ｈ．，
−Ｊ．，スミス， Ｂ− Ｊ．，リオンス，Ａ．， ハ
リス，Ｔ． Ｊ．Ｔ．，レイノルズ．Ｊ． Ｊ．， ヘ
ルリッヒ， Ｐ．およびドチャーチ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，１
９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０，９１３−９１
６；サンチェス−ロペツ，Ｒ．， ゲンセル，Ｍ．
Ｃ．， マトリジアン， Ｌ．， および ブリートナ
ッハ， Ｊ．ブリートナッハ，Ｒ．， １９８８，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３，１１８９２−１１８９
９；）。これら酵素のアミノ末端のアミノ酸配列が最大
の相同のために一直線になっている場合（図１０）、二
つの相関性が観察された。第一に、タイプＩＶコラーゲ
ナーゼにおいて ｐＡＰＭＡ（結果として安定な活性酵
素となる。）による活性化の際のタンパク質自動分解の
部位は、プロストロメリシン活性化および間質プロコラ
ーゲナーゼ活性化の主産生物について以前に報告された
のと同一の遺伝子座にて発生する（ホィットマン エ
ス．イー．、マーフィー ジー．、エンジェル ピ
ー．、ラーンスホルフ エィチ．ジェイ．、スミス ビ
ー．ジェイ．、ライアンス エイ．、ハリス ティ．ジ
ェイ．ティ．、レイノルズ ジェイ．ジェイ．、ヘルリ
ッヒ ピー．およびドチェリティ エイ．ジェイ．ピ
ー．、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０、９１３
−９１６ ；マーフィー ジー．、コッケット エム．
アイ．、ステフェン ピー．イー．、スミス ビー．ジ
ェイ．およびドチェリティ エイ．ジェイ．ピー．、１
９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８、２６５−２６
８）。 ｐＡＰＭΛ処理に続くタンパク質自動分解の同
様な部位はプロストロメリシンについて（ウィルムヘル
ム エス．エム．、コリエルム アイ．イー．、クロン
バーガー エイ．、アイゼン エイ．ズィ．、マーマー
ビー．エル．、グラントジー．エイ．、バウアー イ
ー．およびゴールドバーグ ジー．アイ．、１９８７、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８４．６７２５−６７２９）および間質プロコラーゲナ
ーゼについて（グラント ジー．エイ．、アイゼン エ
イ．ズィ．、マーマー ビー．エル．、ロスヴァイト
ダブリュ．ティ．およびゴールドバーグ ジー．ア
イ．、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、５
８８６−５８８９）の他文献により報告されている。第
二に、すべて三つの酵素の活性化の間に除かれるアミノ
末端ペプチド断片は奇数個のシステイン残基を含む。タ
イプＩＶプロコラーゲナーゼにおいて、三種のシステイ
ン残基が除去されたペプチド断片の中に存在する；Ｃｙ
ｓ−３１、Ｃｙｓ−３６およびＣｙｓ−７３。間質プロ
コラーゲナーゼおよびプロストロメリシンにおいては、
タイプＩＶプロコラーゲナーゼにおけるＣｙｓ−７３に
相当する一個のシステイン残基が除去されたペプチド断
片の中に存在する。従って、潜伏メタロプロティナーゼ
における奇数個のシステイン残基から ｐＡＰＭＡ活性
化形態における偶数個のシステイン残基への変換はすべ
て三つの酵素において共通の特徴であると思われる。不
対システインの除去は機能的に重大なものであろう。最
後に、すべて三つの酵素は高度保存領域をアミノ酸配列
ＰＲＣＧＶＰＤＶ よりなる活性化座の直上流に含
む。この配列は、間質コラーゲナーゼおよびストロメリ
シンのプロペプチドにおいて不対システイン残基（ホィ
ットマン エス．イー．、マーフィージー．、エンジェ
ル ピー．、ラーンスホルフ エィチ．ジェイ．、スミ
ス ビー．ジェイ．、ライアンス エイ．、ハリス テ
ィ．ジェイ．ティ．、レイノルズ ジェイ．ジェイ．、
ヘルリッヒ ピー．およびドチェリティ エイ．ジェ
イ．ピー．、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０、
９１３−９１６）そして相同によりタイプＩＶコラーゲ
ナーゼプロペプチドにおいて不対システイン（存在する
三種以外のもの）を含む。最近の報告は、ラット トラ
ンシン（ｒａｔ ｔｒａｎｓｉｎ）の部位特異的突然変
異誘発研究（ヒトストロメリシンの相同）により、この
メタロプロティナーゼ族の自動活性化におけるこの保存
領域の重要性を示している。この配列において突然変異
を含む組換えトランシン形態は本来の配列と比較した場
合より高速度の自発活性化を示した（サンチェズ−ロペ
ズ アール．、コルソン アール．、ゲンセルエム．シ
ー．、マトリシアン エル．およびブリートナッハ ア
ール．、１９８８、ブリートナッハ アール．、１９８
８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１１８９２−１
１８９９）。そこで、本発明者はタイプＩＶプロコラー
ゲナーゼ活性化遺伝子座に関連した多くの小ペプチドを
タイプＩＶコラーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力につ
いて試験するためにゼラチンザイモグラム技術を使用し
た。図１１および図１２に示されるように、不対システ
インを含む保存領域（ＰＲＣＧＶＰＤＶ）を組み入れた
ペプチドのみが０．１ｍＭ未満の濃度にて強く抑制性で
あった。システインは活性を必要とした。表２は、イン
ヒビター活性を保持する最小のペプチド配列は現実には
ペンタペプチド配列 ＲＫＰＲＣであったことを示す。
０５８メラノーマ細胞ＩＶ型プロコラゲナーゼのアミノ
末端配列（残基１−１７，ＡＰＳＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰ
ＫＴＤ）並びに内部領域（残基４７２−４９０，ＤＫＰ
ＭＧＰＬＬＶＡＴＦＮＰＥＬＰＥＫ）のそれを合成し
た。これらは下記の理由で選択された。酵素の直接の配
列で得られる（コリール， Ｉ． Ｅ．，ウィルヘル
ム， Ｓ．Ｍ．， アイゼン，Ａ． Ｚ．， マーマ
ー， Ｂ． Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．， ゼルツァ
ー，Ｊ．Ｌ．， クローンバーガー， Ａ．，Ｈｅ．，
Ｃ．，バウエル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバーグ，
Ｇ． Ｉ．， １９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２
６３，６５７９−６５８７；ホウチャ，Ｍ．， ターピ
ンニーミ−フジャネン，Ｔ．，ステツラー−スチーブン
ソン，Ｗ．， クルーツシュ，Ｈ．， トルグベイソ
ン，Ｋ．，およびリオッタ， Ｌ．Ａ．，１９８８，Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３３， １０９−１１
３），ｃＤＮＡクローンから予測される配列で確認され
た（コリール， Ｉ． Ｅ．， ウィルヘルム， Ｓ．
Ｍ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．，
グラント，Ｇ．Ａ．， ゼルツァー， Ｊ． Ｌ．，
クローンバーガー，Ａ．，Ｈｅ．，Ｃ．， バウエ
ル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバーグ， Ｇ． Ｉ．，
１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，６５７
９−６５８７），そして他のメタロプロテイナーゼと相
同性を示さない領域から誘導されている。アフィニティ
ー精製抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ）は，直接のＥＬＩＺＡ並びに競合実
験を使用して特徴付けられる。この抗体は，ウシ血清ア
ルプミンまたは無関係のペプチドとの交叉反応性は示さ
なかった。アフィニティー精製抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は，ＩＶ型
プロコラゲナーゼを免疫沈澱する能力がある（ホウチ
ャ，Ｍ．， ターピンニーミ−フジャネン，Ｔ．， ス
テツラー−スチーブンソン，Ｗ．， クルーツシュ，
Ｈ．，トルグベイソン，Ｋ．，およびリオッタ，Ｌ．
Ａ．， １９８８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２３３，
１０９−１１３）。ウエスタンブロット法は，精製ＩＶ
型コラゲナーゼとのウエスタンブロッテイングと同じ
く，両方の抗体が，ＩＶ型プロコラゲナーゼを，Ａ２０
５８で調製した媒体において単一のバンドとして認識し
たということを示した。ｐＡＰＭＡ活性化の時間経過
を，ゼラチンザイモグラム分析，ＩＶ型コラゲナーゼ検
定およびイミュノブロット上の両方のアフィニテー精製
抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ）（図７）を使用して追跡した。Ａ２０５
８メラノーマ細胞ＩＶ型コラゲナーゼのゼラチンザイモ
グラム（図７）分析は，７０ｋＤダルトンの分子量を持
つゼラチン分解活性の単一バンドを示した。１ｍＭのｐ
ＡＰＭＡの存在下における３７℃での保温は，ゼラチン
分解活性のこのバンドのより低い分子量の６２ｋＤへの
漸進的な変換をもたらした。この変換は１０ｍＭのＥＤ
ＴＡの存在下では完全に阻害され，添加するｐＡＰＭＡ
の不在下では起きなかった（図示なし。）。精製したＩ
Ｖ型プロコラゲナーゼのＩＶ型コラゲナーゼ検定は，保
温期間における有機水銀化合物ｐＡＰＭＡの不在下では
コラーゲン分解の活性を示さなかった。ｐＡＰＭＡを使
用する保温により，酵素は活性化できた。コラゲナーゼ
検定により測定されたようにｐＡＰＭＡを使用する前保
温における活性化の時間経過は，完全なコラーゲン分解
活性が得られることを示している（図８）。抗体Ａ４７
２−４９０は，保温により，ゼラチンザイモグラム（図
７）に示されたものに該当する時間依存の分子量減少を
示した。この変換は，６０分迄に５０％完了し，９０分
迄に実質的に完了するように見える。アミノ末端エピト
ープに該当する抗体Ａ１−１７は，ｐＡＰＭＡ活性化の
間のイミュノステイニング（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｉｎ
ｉｎｇ）に於ける直接の減少を示した。これらの結果
は，有機水銀化合物を使用することによる潜在型から安
定な，活性のコラゲナーゼへの変換に従う明白な分子量
の減少は，アミノ末端ペプチド配列の欠失の結果である
ことを示している。ゼラチン−アフィニティ精製ＩＶ型
プロコラケナーゼを，ｐＡＰＭＡ活性化の前後両方の逆
相ＨＰＬＣにより更に精製した。クロマトグラムは，潜
在型または活性型保持時間に顕著な変化のないことを示
した。ピークを集め，ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥによ
り分析した時に，ｐＡＰＭＡ活性化に先立つプロコラゲ
ナーゼのピークは，非還元条件下では約７０ｋＤａダル
トンに単一バンドを示した（図９，挿入）。ｐＡＰＭＡ
活性化（１６時間，３７℃）の後のコラゲナーゼのピー
クは，非還元条件下で６２ｋＤａに単一のバンドを示し
た（図３Ａ）。ｐＡＰＭＡ活性化の前のＨＰＬＣ上のプ
ロコラゲナーゼのピークから得られる物質を，直接のア
ミノ配列分析に処した。この物質はこの酵素のために前
に決めたものとは同一であるアミノ末端配列を与える
（図９）。ＨＰＬＣ精製後のｐＡＰＭＡ活性化物質の直
接の配列分析は，単一の新規のアミノ末端配列を示して
いる（図９）。これは，ｐＡＰＭＡ活性化が約８ｋＤの
分子量低下と共に起こる潜在的酵素からのアミノ末端ペ
プチド断片の自触媒的脱離を伴うことを決定的に示して
いる。この切断は単一の部位においてだけ起こる。とい
うのは，精製，活性化した酵素多数の試料の配列を分析
しても，如何なる他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見出
されず，そしてウエスタンブロッテイングまたはゼラチ
ンザイモグラム分析によって中間体の痕跡が見出されな
いからである。この研究の結果は，ＩＶ型コラゲナーゼ
は，コラーゲン分解活性を得る前に活性化を必要とする
潜在的酵素前駆体の型で分泌されることを示している。
有機水銀化合物ｐＡＰＭＡにはこの活性化の能力があ
る。ＩＶ型プロコラゲナーゼの有機水銀活性化は，酵素
前駆体型の，アミノ末端からの８０個のアミノ酸残基ペ
プチド断片の除去によるより低い分子量の活性化型への
変換を伴う。ｐＡＰＭＡに曝した後，最大のコラーゲン
分解活性が速やかに得られる。安定なより低分子量型へ
の完全な変換に先立つこの活性への到達は，活性である
が不安定種である酵素前駆体における構造転位と一致し
ており，これは間質コラゲナーゼとストロメライシン
（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）で報告されている通りであ
る（ストリクリン，Ｇ． Ｐ．，ジェフリー， Ｊ．
Ｊ．， ロスウィット，Ｗ．Ｔ．，およびアイゼン，
Ａ． Ｚ．， １９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２２，６１−６８；マーフィ， Ｇ．， コクェット，
Ｍ． Ｉ．， ステフェンス， Ｐ． Ｅ．， スミ
ス， Ｂ． Ｊ．，およびドチャーチ，Ａ． Ｊ．
Ｐ．，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２４８，２６
５−２６８）。活性化は高度に精製したＩＶ型コラゲナ
ーゼ酵素前駆体に起こる。かくして，有機水銀化合物の
存在下における活性化は，ｐＡＰＭＡそのものがペプチ
ド結合を切断する能力に欠けるので自己分解的である。
有機水銀化合物による活性化のこの自己触媒的機構は，
間質コラゲナーゼ（グラント， Ｇ．Ａ．， アイゼ
ン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．， ロスヴァイ
ト，Ｗ．Ｔ．，およびゴールドバーグ，Ｇ． Ｉ．，
１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，５８８６
−５８８９）；ウイットマン，Ｓ． Ｅ．， マーフ
ィ， Ｇ．， アンゲル，Ｐ．， ラームスフォルフ，
Ｈ．，−Ｊ．， スミス， Ｂ． Ｊ．，リオンス，
Ａ．， ハリス， Ｔ． Ｊ．Ｔ．， レイノルズ．
Ｊ． Ｊ．， ヘルリッヒ， Ｐ．およびドチャーチ，
Ａ．Ｊ．Ｐ．，１９８６，Ｂｉｏｈｅｍ．Ｊ．２４０，
９１３−９１６），およびストロメライシン（ｓｔｒｏ
ｍｅｌｙｓｉｎ）（ウィルヘルム， Ｓ．Ｍ．，コリエ
ルム， Ｉ．Ｅ．， クロンバーガー，Ａ．，アイゼ
ン，Ａ． Ｚ．，マーマー， Ｂ． Ｌ．， グラン
ト，Ｇ．Ａ．， バイエル， Ｅ．，およびゴルドバー
グ， Ｇ．Ｉ ．，１９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４， ６
７２５−６７２９；ウィットマン， Ｓ．Ｅ．， マー
フィー，Ｇ．， アンゲル， Ｐ．， ラームスフォル
フ，Ｈ．−Ｊ．， スミス， Ｂ．Ｊ．， リオンス，
Ａ．，ハリス， Ｔ． Ｊ． Ｔ．，レイノルズ．
Ｊ． Ｊ．，ヘルリッヒ， Ｐ．，およびドチャーチ，
Ａ．Ｊ． Ｐ．， １９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２
４０，９１３−９１６；マーフィ， Ｇ．， コケッ
ト，Ｍ． Ｉ．， ステフェンス，Ｐ． Ｅ．，スミ
ス， Ｂ． Ｊ．，およびドチャーチ， Ａ．Ｊ．
Ｐ．， １９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８，２６
５−２６８；サンチェス−ロペツ，Ｒ．， ゲンセル，
Ｍ．Ｃ．， マトリジアン， Ｌ．， および ブリー
トナッハ， Ｊ．ブリートナッハ，Ｒ．， １９８８，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３，１１８９２−１１
８９９）．のような他の細胞外マトリックスを分解する
メタロプロテイナーゼで示されている。これらの３種の
メタロプロテイナーゼ，ＩＶ型プロコラゲナーゼ，間質
プロコラゲナーゼおよびプロストロメライシンは，アミ
ノ酸レベルで顕著な相同性を示す（グラント， Ｇ．
Ａ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．Ｌ．，
ロスヴァイト，Ｗ．Ｔ．， およびゴールドバーグ，
Ｇ． Ｉ．， １９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２，５８８６−５８８９；コリール， Ｉ． Ｅ．，
ウィルヘルム， Ｓ．Ｍ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．，
マーマー，Ｂ．Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．， ゼル
ツァー， Ｊ．Ｌ．， クローンバーガー，Ａ．，Ｈ
ｅ．，Ｃ．， バウエル，Ｅ．Ａ．，およびゴールドバ
ーグ，Ｇ． Ｉ．， １９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２６３，６５７９−６５８７；ウィルヘルム，Ｓ．
Ｍ．， コリエルム， Ｉ．Ｅ．， クロンバーガー，
Ａ．， アイゼン，Ａ．Ｚ．， マーマー，Ｂ．
Ｌ．， グラント，Ｇ．Ａ．，バイエル， Ｅ．，およ
びゴルドバーグ， Ｇ． Ｉ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４，６
７２５−６７２９；サウア， Ｊ．， キノネス，
Ｓ．， オタニ，Ｙ．， ナガセ，Ｈ．，ハリス，
Ｅ．Ｄ．，Ｊｒ．，およびクルキネン，Ｍ．，１９８
８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，６７４２−６７
４５；ウィットマン， Ｓ． Ｅ．， マーフィ，
Ｇ．， アンゲル，ｐ．， ラームスフォルフ，Ｈ．，
−Ｊ．，スミス， Ｂ− Ｊ．，リオンス，Ａ．， ハ
リス，Ｔ． Ｊ．Ｔ．，レイノルズ．Ｊ． Ｊ．， ヘ
ルリッヒ， Ｐ．およびドチャーチ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，１
９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０，９１３−９１
６；サンチェス−ロペツ，Ｒ．， ゲンセル，Ｍ．
Ｃ．， マトリジアン， Ｌ．， および ブリートナ
ッハ， Ｊ．ブリートナッハ，Ｒ．， １９８８，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３，１１８９２−１１８９
９；）。これら酵素のアミノ末端のアミノ酸配列が最大
の相同のために一直線になっている場合（図１０）、二
つの相関性が観察された。第一に、タイプＩＶコラーゲ
ナーゼにおいて ｐＡＰＭＡ（結果として安定な活性酵
素となる。）による活性化の際のタンパク質自動分解の
部位は、プロストロメリシン活性化および間質プロコラ
ーゲナーゼ活性化の主産生物について以前に報告された
のと同一の遺伝子座にて発生する（ホィットマン エ
ス．イー．、マーフィー ジー．、エンジェル ピ
ー．、ラーンスホルフ エィチ．ジェイ．、スミス ビ
ー．ジェイ．、ライアンス エイ．、ハリス ティ．ジ
ェイ．ティ．、レイノルズ ジェイ．ジェイ．、ヘルリ
ッヒ ピー．およびドチェリティ エイ．ジェイ．ピ
ー．、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０、９１３
−９１６ ；マーフィー ジー．、コッケット エム．
アイ．、ステフェン ピー．イー．、スミス ビー．ジ
ェイ．およびドチェリティ エイ．ジェイ．ピー．、１
９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８、２６５−２６
８）。 ｐＡＰＭΛ処理に続くタンパク質自動分解の同
様な部位はプロストロメリシンについて（ウィルムヘル
ム エス．エム．、コリエルム アイ．イー．、クロン
バーガー エイ．、アイゼン エイ．ズィ．、マーマー
ビー．エル．、グラントジー．エイ．、バウアー イ
ー．およびゴールドバーグ ジー．アイ．、１９８７、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８４．６７２５−６７２９）および間質プロコラーゲナ
ーゼについて（グラント ジー．エイ．、アイゼン エ
イ．ズィ．、マーマー ビー．エル．、ロスヴァイト
ダブリュ．ティ．およびゴールドバーグ ジー．ア
イ．、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、５
８８６−５８８９）の他文献により報告されている。第
二に、すべて三つの酵素の活性化の間に除かれるアミノ
末端ペプチド断片は奇数個のシステイン残基を含む。タ
イプＩＶプロコラーゲナーゼにおいて、三種のシステイ
ン残基が除去されたペプチド断片の中に存在する；Ｃｙ
ｓ−３１、Ｃｙｓ−３６およびＣｙｓ−７３。間質プロ
コラーゲナーゼおよびプロストロメリシンにおいては、
タイプＩＶプロコラーゲナーゼにおけるＣｙｓ−７３に
相当する一個のシステイン残基が除去されたペプチド断
片の中に存在する。従って、潜伏メタロプロティナーゼ
における奇数個のシステイン残基から ｐＡＰＭＡ活性
化形態における偶数個のシステイン残基への変換はすべ
て三つの酵素において共通の特徴であると思われる。不
対システインの除去は機能的に重大なものであろう。最
後に、すべて三つの酵素は高度保存領域をアミノ酸配列
ＰＲＣＧＶＰＤＶ よりなる活性化座の直上流に含
む。この配列は、間質コラーゲナーゼおよびストロメリ
シンのプロペプチドにおいて不対システイン残基（ホィ
ットマン エス．イー．、マーフィージー．、エンジェ
ル ピー．、ラーンスホルフ エィチ．ジェイ．、スミ
ス ビー．ジェイ．、ライアンス エイ．、ハリス テ
ィ．ジェイ．ティ．、レイノルズ ジェイ．ジェイ．、
ヘルリッヒ ピー．およびドチェリティ エイ．ジェ
イ．ピー．、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０、
９１３−９１６）そして相同によりタイプＩＶコラーゲ
ナーゼプロペプチドにおいて不対システイン（存在する
三種以外のもの）を含む。最近の報告は、ラット トラ
ンシン（ｒａｔ ｔｒａｎｓｉｎ）の部位特異的突然変
異誘発研究（ヒトストロメリシンの相同）により、この
メタロプロティナーゼ族の自動活性化におけるこの保存
領域の重要性を示している。この配列において突然変異
を含む組換えトランシン形態は本来の配列と比較した場
合より高速度の自発活性化を示した（サンチェズ−ロペ
ズ アール．、コルソン アール．、ゲンセルエム．シ
ー．、マトリシアン エル．およびブリートナッハ ア
ール．、１９８８、ブリートナッハ アール．、１９８
８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１１８９２−１
１８９９）。そこで、本発明者はタイプＩＶプロコラー
ゲナーゼ活性化遺伝子座に関連した多くの小ペプチドを
タイプＩＶコラーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力につ
いて試験するためにゼラチンザイモグラム技術を使用し
た。図１１および図１２に示されるように、不対システ
インを含む保存領域（ＰＲＣＧＶＰＤＶ）を組み入れた
ペプチドのみが０．１ｍＭ未満の濃度にて強く抑制性で
あった。システインは活性を必要とした。表２は、イン
ヒビター活性を保持する最小のペプチド配列は現実には
ペンタペプチド配列 ＲＫＰＲＣであったことを示す。
【００２０】
【００２１】さらに表２におけるデータは、ペプチドイ
ンヒビター活性は臨界のシスティニル残基をフランキン
グする特定の荷電配列要素を必要とすることを示す。明
確には、保存領域の二つのアルギニル残基は阻害活性に
ついて重大であると思われた。これらの位置での極性不
荷電残基との置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果とな
った。しかしながら、これら二個のアルギニル残基の間
のプロリル残基およびリシル残基はグリシル残基と置き
換わることができそしてこれらペプチドは阻害活性を保
持したであろう。このことは、この領域の局所配座にと
って重要であり得る（サンチェズ−ロペズ等、１９８
８）ところのリシル残基およびプロリル残基は阻害相互
作用に直接には関与しないことを示唆する。従ってタイ
プＩＶコラーゲナーゼのプロ酵素断片は、マトリックス
メタロプロティナーゼ族の他のメンバーにより分けられ
た保存領域を含む。この配列は活性化されたタイプＩＶ
コラーゲナーゼを阻害することが可能である。このイン
ヒビター配列は、必須システィニル残基に関して位置−
１および−４にて荷電された二個の陽性残基を含むとこ
ろの特定のフランキングペプチド配列の中に不対システ
ィニル残基の存在を必要とする。このインヒビターによ
る酵素活性の阻害は、酵素活性のための二つの要素、定
まったペプチド配列の中に不対システィニル残基を必要
とする点において特異的であると思われる。これらのデ
ータは、プロ酵素断片の中に存在するところの ＲＫＰ
ＲＣ配列はシスティニル残基と活性部位にて配位した金
属原子との相互作用を通して酵素の内因性インヒビター
として振舞うという新規な仮説を支持する。さらに、シ
スティニル残基に隣接した位置でのアミノ酸置換はペプ
チドのタイプＩＶコラーゲナーゼ活性を妨げる能力を廃
止することができるので、不対システィニル残基を囲繞
する配列は、この阻害相互作用を促進すると思われる。
これらの結果は潜伏コラーゲナーゼ遺伝子族酵素の構造
およびそれらの活性について統一する仮説に統合するこ
とができる。ザイモゲン形態は酵素活性部位との相互作
用をして触媒的活性を阻止する保存配列 ＭＲＫＰＲＣ
ＧＮ（Ｖ）ＰＤＶ を含むプロ酵素セグメントの結果で
ある。この相互作用は亜鉛原子の配位を通してシスティ
ニル残基の不対スルフヒドリル側鎖により安定化され
る。従って、システィニル残基−金属原子配位を妨げる
ところのすべての因子は結果としてプロ酵素断片の酵素
活性およびこれに続く自動触媒的除去に帰する。これ
は、金属原子−スルフヒドリル配位のために直接競争す
る試薬、例えば有機水銀試薬により成し遂げられる。ま
た金属原子配位の崩壊に帰する臨界のシスティニル残基
を囲繞するプロ酵素断片の立体配座を妨げるところのカ
オトロピック因子によっても成し遂げられよう。また非
タンパク質分解組織活性物質例えばタイリー等、１９８
１（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｌｏｐｈｙｓ．
２０８、４４０−４４３）により記載されたものは、こ
れらの酵素を、申し述べたのとに同様の誘発配座転位の
機構により活性化する。本発明の別の好ましい態様は、
タイプＩＶプロコラーゲナーゼ酵素のプロペプチド配列
１−８０により具体化される。これは不対システイン残
基を組み入れた内因性インヒビター配列 ＲＫＰＲＣを
含む。加えて、この８０アミノ酸ペプチドのアミノ末端
は内部ジスルフィド結合を含み、そしてこのペプチドは
また腫瘍細胞表面結合部位を含む。８０ｍｅｒペプチド
は、例えば、合成化学によりまたは組換え手段により作
られるが、従って少なくとも三つの理由のためにインヒ
ビターとしての利点を有する。第一に、その阻害活性
は、阻害配列の二次構造が正確に再生されるので、モル
ベースでペプチドよりも高くあり得る。第二に組換え８
０ｍｅｒタンパク質はアミノ末端でのジスルフィド結合
の存在によりより大きいインビボ安定性（より長い半減
期）を有する。第三に、８０ｍｅｒ は細胞結合部位を
含むので、有害なタンパク質分解の出来事が起きる腫瘍
細胞の表面を標的とすることができる。図１３は、活性
化の際ヒトタイプＩＶプロコラーゲナーゼから開裂する
ところのアミノ末端ぺプチドの８０アミノ酸配列をエン
コードするところのヒトタイプＩＶプロコラーゲナーゼ
についてヒト ｃＤＮＡ クローンの部分のヌクレオチ
ド配列を図示する。このヌクレオチド配列（または普遍
的遺伝子コードに従い同一のアミノ酸配列を特定するす
べての他の配列）を有する ＤＮＡセグメントは種々の
組換えタンパク質産生システムにおいてマトリックスメ
タロプロティナーゼのインヒビターとしての用途のため
に８０ｍｅｒ を産生するために使用することができ
る。あるいは、このヌクレオチド配列を有する ＤＮＡ
セグメントは、ヒトゲノムに由来するが、哺乳動物の中
に組換え表現ベクターの部分としてマトリックスメタロ
プロティナーゼの８０ｍｅｒ インヒビターの産生の内
部遺伝子源を産生するために配することができる。
ンヒビター活性は臨界のシスティニル残基をフランキン
グする特定の荷電配列要素を必要とすることを示す。明
確には、保存領域の二つのアルギニル残基は阻害活性に
ついて重大であると思われた。これらの位置での極性不
荷電残基との置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果とな
った。しかしながら、これら二個のアルギニル残基の間
のプロリル残基およびリシル残基はグリシル残基と置き
換わることができそしてこれらペプチドは阻害活性を保
持したであろう。このことは、この領域の局所配座にと
って重要であり得る（サンチェズ−ロペズ等、１９８
８）ところのリシル残基およびプロリル残基は阻害相互
作用に直接には関与しないことを示唆する。従ってタイ
プＩＶコラーゲナーゼのプロ酵素断片は、マトリックス
メタロプロティナーゼ族の他のメンバーにより分けられ
た保存領域を含む。この配列は活性化されたタイプＩＶ
コラーゲナーゼを阻害することが可能である。このイン
ヒビター配列は、必須システィニル残基に関して位置−
１および−４にて荷電された二個の陽性残基を含むとこ
ろの特定のフランキングペプチド配列の中に不対システ
ィニル残基の存在を必要とする。このインヒビターによ
る酵素活性の阻害は、酵素活性のための二つの要素、定
まったペプチド配列の中に不対システィニル残基を必要
とする点において特異的であると思われる。これらのデ
ータは、プロ酵素断片の中に存在するところの ＲＫＰ
ＲＣ配列はシスティニル残基と活性部位にて配位した金
属原子との相互作用を通して酵素の内因性インヒビター
として振舞うという新規な仮説を支持する。さらに、シ
スティニル残基に隣接した位置でのアミノ酸置換はペプ
チドのタイプＩＶコラーゲナーゼ活性を妨げる能力を廃
止することができるので、不対システィニル残基を囲繞
する配列は、この阻害相互作用を促進すると思われる。
これらの結果は潜伏コラーゲナーゼ遺伝子族酵素の構造
およびそれらの活性について統一する仮説に統合するこ
とができる。ザイモゲン形態は酵素活性部位との相互作
用をして触媒的活性を阻止する保存配列 ＭＲＫＰＲＣ
ＧＮ（Ｖ）ＰＤＶ を含むプロ酵素セグメントの結果で
ある。この相互作用は亜鉛原子の配位を通してシスティ
ニル残基の不対スルフヒドリル側鎖により安定化され
る。従って、システィニル残基−金属原子配位を妨げる
ところのすべての因子は結果としてプロ酵素断片の酵素
活性およびこれに続く自動触媒的除去に帰する。これ
は、金属原子−スルフヒドリル配位のために直接競争す
る試薬、例えば有機水銀試薬により成し遂げられる。ま
た金属原子配位の崩壊に帰する臨界のシスティニル残基
を囲繞するプロ酵素断片の立体配座を妨げるところのカ
オトロピック因子によっても成し遂げられよう。また非
タンパク質分解組織活性物質例えばタイリー等、１９８
１（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｌｏｐｈｙｓ．
２０８、４４０−４４３）により記載されたものは、こ
れらの酵素を、申し述べたのとに同様の誘発配座転位の
機構により活性化する。本発明の別の好ましい態様は、
タイプＩＶプロコラーゲナーゼ酵素のプロペプチド配列
１−８０により具体化される。これは不対システイン残
基を組み入れた内因性インヒビター配列 ＲＫＰＲＣを
含む。加えて、この８０アミノ酸ペプチドのアミノ末端
は内部ジスルフィド結合を含み、そしてこのペプチドは
また腫瘍細胞表面結合部位を含む。８０ｍｅｒペプチド
は、例えば、合成化学によりまたは組換え手段により作
られるが、従って少なくとも三つの理由のためにインヒ
ビターとしての利点を有する。第一に、その阻害活性
は、阻害配列の二次構造が正確に再生されるので、モル
ベースでペプチドよりも高くあり得る。第二に組換え８
０ｍｅｒタンパク質はアミノ末端でのジスルフィド結合
の存在によりより大きいインビボ安定性（より長い半減
期）を有する。第三に、８０ｍｅｒ は細胞結合部位を
含むので、有害なタンパク質分解の出来事が起きる腫瘍
細胞の表面を標的とすることができる。図１３は、活性
化の際ヒトタイプＩＶプロコラーゲナーゼから開裂する
ところのアミノ末端ぺプチドの８０アミノ酸配列をエン
コードするところのヒトタイプＩＶプロコラーゲナーゼ
についてヒト ｃＤＮＡ クローンの部分のヌクレオチ
ド配列を図示する。このヌクレオチド配列（または普遍
的遺伝子コードに従い同一のアミノ酸配列を特定するす
べての他の配列）を有する ＤＮＡセグメントは種々の
組換えタンパク質産生システムにおいてマトリックスメ
タロプロティナーゼのインヒビターとしての用途のため
に８０ｍｅｒ を産生するために使用することができ
る。あるいは、このヌクレオチド配列を有する ＤＮＡ
セグメントは、ヒトゲノムに由来するが、哺乳動物の中
に組換え表現ベクターの部分としてマトリックスメタロ
プロティナーゼの８０ｍｅｒ インヒビターの産生の内
部遺伝子源を産生するために配することができる。
【００２２】方法 培養方法 ヒトＡ２０５８黒色腫細胞を、１０％ウシ胎児血清を入
れたＤＭＥＭ中において８０％集密にまで増殖した。そ
の後培地を血清の含まないＤＭＥＭと置き換えそして培
養を２４時間続行した。血清の含まないならし培地を集
めそして、−２０℃での貯蔵の前に限外濾過（Ａｍｉｃ
ｏｎ ＹＭ ３０ ｍｅｍｂｒａｎｅ）により濃縮し
た。タイプＩＶプロコラーゲナーゼの精製 タイプＩＶプロコラーゲナーゼをヒト Ａ２０５８黒色
腫細胞濃縮ならし培地から直接、０．０５ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ、０．００５ ＭＣａＣｌ２、０．５ Ｍ
ＮａＣｌ、０．０２％ Ｂｒｉｊ ３５（Ｓｉｇｍａ）
を含む ｐＨ７．６緩衝液（ＴＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）中
のゼラチン−セファロース（Ｓｉｇｍａ）アフィニティ
クロマトグラフィにより精製した。０．０２％ Ｂｒｉ
ｊと７％ジメチルスルホキシドとを含むＴＣＳ 緩衝液
を使用して酵素を溶離した。その後試料を濃縮しそして
同じ緩衝液中で−７０℃にて使用するまで保存した。さ
らにタイプＩＶプロコラーゲナーゼをアミノ酸配列分析
の前に、０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡にされた
０．４６ ｘ １０ｃｍ ＲＰ ３００カラム（Ｐｉｅ
ｒｃｅ Ｃｏ．製）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ａ １４０
０ ｓｙｓｔｅｍで逆相 ＨＰＬＣ により精製した。
カラムは６０％アセトニトリルに対して線形勾配となる
ように溶離した。合成ペプチドに対する抗体の製造 免疫感作において使用されたペプチドを Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ９６００ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒにより合成した。抗体を実施例３に記載したように
製造しそして精製した。抗体製剤は図３に示すように市
販の ＥＬＩＳＡキット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ ２ プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を
使用してＥＬＩＳＡにより特徴付けた。有機水銀によるタイプＩＶプロコラーゲナーゼの活性化 ０．０５ Ｎ ＮａＯＨ 中の ０．０１ Ｍ ｐ−Ａ
ＰＭＡの貯蔵溶液を毎日新たに製造した。プロ酵素試料
を最終濃度 ０．５または １．０ｍＭ ｐ−ＡＰＭＡ
で時間を変えて（０−１６時間）３７℃にてインッキ
ュベートした。インキュベーションに続いて、試料を直
接、０．１％ゼラチンを含む ９％アクリルアミドゲル
上で ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥにより分析した（ゼ
ラチンザイモグラム）。あるいは、試料を ９％ Ｎａ
ＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥ上で走査しそして Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｏｎ Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）の上に電気的に斑点付けした。タイプＩＶコラーゲン分解活性の分析 タイプＩＶコラーゲナーゼ活性を実施例１に記載されて
いるように阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した
基質は ３Ｈ−プロピニル化ヒトタイプＩＶコラーゲン
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）である。反
応は２８℃にて４ないし１６時間の間行なった。
れたＤＭＥＭ中において８０％集密にまで増殖した。そ
の後培地を血清の含まないＤＭＥＭと置き換えそして培
養を２４時間続行した。血清の含まないならし培地を集
めそして、−２０℃での貯蔵の前に限外濾過（Ａｍｉｃ
ｏｎ ＹＭ ３０ ｍｅｍｂｒａｎｅ）により濃縮し
た。タイプＩＶプロコラーゲナーゼの精製 タイプＩＶプロコラーゲナーゼをヒト Ａ２０５８黒色
腫細胞濃縮ならし培地から直接、０．０５ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ、０．００５ ＭＣａＣｌ２、０．５ Ｍ
ＮａＣｌ、０．０２％ Ｂｒｉｊ ３５（Ｓｉｇｍａ）
を含む ｐＨ７．６緩衝液（ＴＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）中
のゼラチン−セファロース（Ｓｉｇｍａ）アフィニティ
クロマトグラフィにより精製した。０．０２％ Ｂｒｉ
ｊと７％ジメチルスルホキシドとを含むＴＣＳ 緩衝液
を使用して酵素を溶離した。その後試料を濃縮しそして
同じ緩衝液中で−７０℃にて使用するまで保存した。さ
らにタイプＩＶプロコラーゲナーゼをアミノ酸配列分析
の前に、０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡にされた
０．４６ ｘ １０ｃｍ ＲＰ ３００カラム（Ｐｉｅ
ｒｃｅ Ｃｏ．製）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ａ １４０
０ ｓｙｓｔｅｍで逆相 ＨＰＬＣ により精製した。
カラムは６０％アセトニトリルに対して線形勾配となる
ように溶離した。合成ペプチドに対する抗体の製造 免疫感作において使用されたペプチドを Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ９６００ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒにより合成した。抗体を実施例３に記載したように
製造しそして精製した。抗体製剤は図３に示すように市
販の ＥＬＩＳＡキット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ ２ プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を
使用してＥＬＩＳＡにより特徴付けた。有機水銀によるタイプＩＶプロコラーゲナーゼの活性化 ０．０５ Ｎ ＮａＯＨ 中の ０．０１ Ｍ ｐ−Ａ
ＰＭＡの貯蔵溶液を毎日新たに製造した。プロ酵素試料
を最終濃度 ０．５または １．０ｍＭ ｐ−ＡＰＭＡ
で時間を変えて（０−１６時間）３７℃にてインッキ
ュベートした。インキュベーションに続いて、試料を直
接、０．１％ゼラチンを含む ９％アクリルアミドゲル
上で ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥにより分析した（ゼ
ラチンザイモグラム）。あるいは、試料を ９％ Ｎａ
ＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥ上で走査しそして Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｏｎ Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）の上に電気的に斑点付けした。タイプＩＶコラーゲン分解活性の分析 タイプＩＶコラーゲナーゼ活性を実施例１に記載されて
いるように阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した
基質は ３Ｈ−プロピニル化ヒトタイプＩＶコラーゲン
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）である。反
応は２８℃にて４ないし１６時間の間行なった。
【００２３】実施例３ 抗体認識メタロプロテイナーゼペプチド アミノ末端（残部１−１７）からカルボキシ末端（残部
４７２−４９０）近傍の内部領域に伸びるタイプＩＶプ
ロコラーゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチド
（図１，表３）は、本来のタイプＩＶプロコラーゲナー
ゼに対してそれらの個々の領域を認識した親和性精製ポ
リクローナル抗体を生ずる抗原として使用された。
４７２−４９０）近傍の内部領域に伸びるタイプＩＶプ
ロコラーゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチド
（図１，表３）は、本来のタイプＩＶプロコラーゲナー
ゼに対してそれらの個々の領域を認識した親和性精製ポ
リクローナル抗体を生ずる抗原として使用された。
【００２４】
【００２５】固相合成ペプチドに結合した抗体は液相ペ
プチドにより競合される可能性があるということを示す
ために酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）が使用され、そして各々の親和性精製抗体は単一特
異性であった（図３）。有機水銀活性法の経時的なウェ
スターンイムノブロッティング研究は、抗体は精製形態
における、又は培養液中で腫瘍細胞により隠された蛋白
質の複合混合物中の、固相酵素を認識したということを
示した（図３）。ウェスターンブロッティングは、低分
子量形態への変換中のアミノ末端領域（残部１−８０）
の直接的損失も示した（図７）。それ故、最初の１−８
０アミノ末端残部中のペプチド領域を認識する抗体は、
酵素の活性形態から潜伏体を区別するために使用するこ
とができる。表３中のペプチドを認識する抗体は、ヒト
血清及びヒト尿中のタイプＩＶコラーゲナーゼ抗体を検
出するための固相又は液相直接又は競合イムノアッセイ
において有用であることが示された。その様な抗体アッ
セイは、局部又は転移癌の診断のために有用である。抗
−ペプチド抗体は、免疫組織学によるヒト結腸癌の診断
のために有用であることも示された（表４）。表４は、
表３のペプチドを指示する抗体は悪性腫瘍細胞に結合し
た酵素抗原を同定するために使用することができるとい
うことを示すヒト結腸癌例における免疫組織学例の要約
である。
プチドにより競合される可能性があるということを示す
ために酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）が使用され、そして各々の親和性精製抗体は単一特
異性であった（図３）。有機水銀活性法の経時的なウェ
スターンイムノブロッティング研究は、抗体は精製形態
における、又は培養液中で腫瘍細胞により隠された蛋白
質の複合混合物中の、固相酵素を認識したということを
示した（図３）。ウェスターンブロッティングは、低分
子量形態への変換中のアミノ末端領域（残部１−８０）
の直接的損失も示した（図７）。それ故、最初の１−８
０アミノ末端残部中のペプチド領域を認識する抗体は、
酵素の活性形態から潜伏体を区別するために使用するこ
とができる。表３中のペプチドを認識する抗体は、ヒト
血清及びヒト尿中のタイプＩＶコラーゲナーゼ抗体を検
出するための固相又は液相直接又は競合イムノアッセイ
において有用であることが示された。その様な抗体アッ
セイは、局部又は転移癌の診断のために有用である。抗
−ペプチド抗体は、免疫組織学によるヒト結腸癌の診断
のために有用であることも示された（表４）。表４は、
表３のペプチドを指示する抗体は悪性腫瘍細胞に結合し
た酵素抗原を同定するために使用することができるとい
うことを示すヒト結腸癌例における免疫組織学例の要約
である。
【００２６】
【００２７】方法 蛋白質ペプチド 蛋白質ペプチドの合成は、標準メリフィールド固相ペプ
チド合成書を使用して、バイオサーチモデル９６００ペ
プチド合成装置により行った。合成された最初の配列
は、図１に示す様にヒトタイプＩＶコラーゲナーゼにお
ける残部３７１−３８６に正確に相当するＶＡＡＨＥＦ
ＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱであった。３個のＨｉｓ残部及び
２個のＧｌｕ残部はＡｌａ残部を用いた種々の組み合わ
せで置換され、そしてタイプＩＶコラーゲナーゼに関す
るこの置換の効果及びザイモグラムゲラチナーゼ活性が
検討された。
チド合成書を使用して、バイオサーチモデル９６００ペ
プチド合成装置により行った。合成された最初の配列
は、図１に示す様にヒトタイプＩＶコラーゲナーゼにお
ける残部３７１−３８６に正確に相当するＶＡＡＨＥＦ
ＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱであった。３個のＨｉｓ残部及び
２個のＧｌｕ残部はＡｌａ残部を用いた種々の組み合わ
せで置換され、そしてタイプＩＶコラーゲナーゼに関す
るこの置換の効果及びザイモグラムゲラチナーゼ活性が
検討された。
【００２８】抗ペプチド抗体の調製 抗ペプチド抗体の調製は、下記工程を用いた。 ＢＳＡに対するペプチドの結合：ペプチド抗原性を形成
するために、ＢＳＡ又は他の抗原性蛋白質に共有結合的
に結合させなければならない。ペプチド２ｍｇにＰＢＳ
１ｍｌを加え、次いでＢＳＡ６ｍｇにＰＢＳ４ｍｌを加
える。これらの溶液を混合し、次いで０．２５％グルタ
ルアルデヒド溶液５ｍｌをこの混合物に加える。この結
果得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで室温で一
晩ＰＢＳ１リットルにより透析した。翌日、この溶液を
６ｍｌに濃縮し、次いで免疫化のために１ｍｌアリコッ
トに分けた。 ラビットの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保す
るため、全ての免疫化は完全フロイントアジュバントを
使用して行うべきである。最初の２回の注射のために、
ＢＳＡ−ペプチド抱合体１ｍｌ及びＣＦＡ１ｍｌを乳化
し、次いで２匹のラビットの背中の約３０箇所に乳化剤
１ｍｌを用いて皮下注射する。第二の注射後、抱合体溶
液０．５ｍｌをＰＢＳ０．５ｍｌを用いて希釈して乳化
剤を調製する。免疫化は２週間ごとに行う；採血は免疫
化の前、及び第三又は第四の注射を始めるまでの注射の
間の週に行う。 ペプチド抗体親和性樹脂の調製：一度抗ペプチド抗体血
清が使用可能となれば、次工程は親和性精製工程を行う
ためのものである。第一工程において、ペプチド抗体親
和性樹脂を調製する。アフィーゲル１０（バイオラッド
株式会社）約１０−１２ｍｌを、冷ＰＢＳ４０ｍｌを用
いて３回素早く洗浄し、次いで冷ＰＢＳに再懸濁して全
容量約２０ｍｌを得る。同時に、ペプチド２ｍｇをＰＢ
Ｓ１ｍｌに溶解し、次いで中程度に攪拌しながらアフィ
ーゲル懸濁液に加える。この結果得られた混合物を冷却
状態で一晩穏やかに攪拌する。翌日、０．２Ｍ溶液を調
製するために充分な１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を
加え、次いでこのゲルを冷却状態で更に４時間攪拌す
る。このゲルは、ＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回洗浄後は
抗体吸着が容易である。 担体の親和性精製：担体含有血清を３０分間５６℃に加
熱し、冷却し、次いでペプチド樹脂（これは、予め準備
され、且つ注入された過剰のＰＢＳを含んでいた）と混
合する。冷却状態で一晩穏やかに攪拌後、ゲル懸濁液を
カラムに注入し、次いで冷１Ｍ酢酸をゲル容積の２倍用
い、続いてＰＢＳをゲル容積の１倍用いて洗浄する。抗
体溶出液を６ＮＮａＯＨを用いて約ｐＨ７．０に調整
し、次いでこの結果得られた溶液を約５ｍｌにダイアフ
ロ（ＹＭ−３０）濃縮し、緩衝液をＰＢＳに変える。 樹脂への抗体のカップリング：１時間前にのみトリスを
反応を停止させるために加え、次いで未使用の活性サイ
トを封止することにより抗体のカップリングを進めるこ
と以外は、手順は上記と全く同一である。 イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセイ、
ウェスターンブロッティング研究、及び免疫組織学は、
標準的な慣用法を使用して行った。 上記の如く選択され次いで精製されたペプチドに対する
ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、慣用の方法
により適する放射性酵素又は蛍光標識を用いて標識化す
ることが可能であり、これは当業者には明らかであろ
う。本文中に記載されたペプチド及び抗体を用いる免疫
学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し且つ非標識
化、結合性又は非結合性抗体又はペプチドの手段を用い
ることにより、体液、組織抽出物又は組織部分を包含す
る何れかのタイプの生物学的試料に対して適用すること
ができる。抗体又はペプチドは、適する固相例えば支持
体例えばミクロ滴定ウェルに結合させることができる。
タイプＩＶコラーゲナーゼのための前記抗ペプチド抗体
は、自然の全酵素に対して作られた抗体を上回る充分な
利点を有する（トリッグヴァソン，ケイ．及びリオッ
タ，エル．エイ．アメリカ合衆国特許第４６７７０５８
号）。第一に、それらはタイプＩＶコラーゲナーゼ（こ
れは、他の広く用いられているメタロプロテイナーゼと
同族ではない）に特有の特定領域を認識する。これは非
自明のことであり、且つタイプＩＶコラーゲナーゼのア
ミノ酸配列の大部分は図２に示される様に他のメタロプ
ロテイナーゼと非常に同族的であるか又は同一でさえあ
るとうことに関する多くの問題を克服する。抗体は表３
のペプチドに対して他のメタロプロテイナーゼから異な
るタイプＩＶコラーゲナーゼを作り、且つ更に潜酵素に
より異なって活性化され得る。この後者の特徴は、活性
化酵素に対する潜伏体の比率が病気の診断又は予後にお
ける決定因子である場合に病的状態が存在し得るので非
常に重要である。前述の発明において、明確性及び理解
の目的のために幾つかの細部が述べられた。形態及び細
部についての種々の変化及び組み合わせが、本発明の範
囲から離れることなく成し得るということも当業者には
自明であろう。特に、本文中に記載されたペプチド抑制
剤の側面配列における変性はメタロプロテイナーゼ類の
個々の構成員に対する安定性、活性又は特異性を変え得
るということは当業者には自明である。例えば、図１０
に示される活性化結合開裂サイトの左側に対する特定配
列の選択は、タイプＩＶコラーゲナーゼに比べてストロ
メリシン又はタイプＩコラーゲナーゼを好ましく抑制す
るための抑制剤を生じさせ得る。これは、前記配列のこ
の領域は異なるマトリックスメタロプロテイナーゼタイ
プの間で幾つかの変異性を示すからである。非臨界領域
におけるアミノ酸の一定置換基の選択は、ペプチドの抑
制性を充分には変えないであろうということも更に明ら
かである。マトリックスメタロプロテイナーゼに対して
特異的な抗体のための免疫原又は抗原として使用すべき
合成ペプチドの場合において、当業者は抗体結合サイト
による認識表現における特異的アミノ酸配列は、４ない
し６個のアミノ酸〔これは、抗体を使用すべき環境（例
えば、人間の生物学的検体）において他の蛋白質中に存
在することは知られていない〕の配列からなるというこ
とを理解するであろう。最後に、組み換え蛋白質ペプチ
ドは自然のペプチド又は合成ペプチドに比べて活性を有
し得るということは従来技術において知られている。本
発明の態様は、それ故明らかな如く、合成ペプチド化学
により適する発現ベクター中に具合良く挿入された適す
るＤＮＡセグメント又は利用し得る自然源からの単離物
を使用して調製された。幾つかの場合には、本発明のペ
プチドは、従来技術において良く知られている標準法の
変法に基づいて精製し得る。
するために、ＢＳＡ又は他の抗原性蛋白質に共有結合的
に結合させなければならない。ペプチド２ｍｇにＰＢＳ
１ｍｌを加え、次いでＢＳＡ６ｍｇにＰＢＳ４ｍｌを加
える。これらの溶液を混合し、次いで０．２５％グルタ
ルアルデヒド溶液５ｍｌをこの混合物に加える。この結
果得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで室温で一
晩ＰＢＳ１リットルにより透析した。翌日、この溶液を
６ｍｌに濃縮し、次いで免疫化のために１ｍｌアリコッ
トに分けた。 ラビットの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保す
るため、全ての免疫化は完全フロイントアジュバントを
使用して行うべきである。最初の２回の注射のために、
ＢＳＡ−ペプチド抱合体１ｍｌ及びＣＦＡ１ｍｌを乳化
し、次いで２匹のラビットの背中の約３０箇所に乳化剤
１ｍｌを用いて皮下注射する。第二の注射後、抱合体溶
液０．５ｍｌをＰＢＳ０．５ｍｌを用いて希釈して乳化
剤を調製する。免疫化は２週間ごとに行う；採血は免疫
化の前、及び第三又は第四の注射を始めるまでの注射の
間の週に行う。 ペプチド抗体親和性樹脂の調製：一度抗ペプチド抗体血
清が使用可能となれば、次工程は親和性精製工程を行う
ためのものである。第一工程において、ペプチド抗体親
和性樹脂を調製する。アフィーゲル１０（バイオラッド
株式会社）約１０−１２ｍｌを、冷ＰＢＳ４０ｍｌを用
いて３回素早く洗浄し、次いで冷ＰＢＳに再懸濁して全
容量約２０ｍｌを得る。同時に、ペプチド２ｍｇをＰＢ
Ｓ１ｍｌに溶解し、次いで中程度に攪拌しながらアフィ
ーゲル懸濁液に加える。この結果得られた混合物を冷却
状態で一晩穏やかに攪拌する。翌日、０．２Ｍ溶液を調
製するために充分な１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を
加え、次いでこのゲルを冷却状態で更に４時間攪拌す
る。このゲルは、ＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回洗浄後は
抗体吸着が容易である。 担体の親和性精製：担体含有血清を３０分間５６℃に加
熱し、冷却し、次いでペプチド樹脂（これは、予め準備
され、且つ注入された過剰のＰＢＳを含んでいた）と混
合する。冷却状態で一晩穏やかに攪拌後、ゲル懸濁液を
カラムに注入し、次いで冷１Ｍ酢酸をゲル容積の２倍用
い、続いてＰＢＳをゲル容積の１倍用いて洗浄する。抗
体溶出液を６ＮＮａＯＨを用いて約ｐＨ７．０に調整
し、次いでこの結果得られた溶液を約５ｍｌにダイアフ
ロ（ＹＭ−３０）濃縮し、緩衝液をＰＢＳに変える。 樹脂への抗体のカップリング：１時間前にのみトリスを
反応を停止させるために加え、次いで未使用の活性サイ
トを封止することにより抗体のカップリングを進めるこ
と以外は、手順は上記と全く同一である。 イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセイ、
ウェスターンブロッティング研究、及び免疫組織学は、
標準的な慣用法を使用して行った。 上記の如く選択され次いで精製されたペプチドに対する
ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、慣用の方法
により適する放射性酵素又は蛍光標識を用いて標識化す
ることが可能であり、これは当業者には明らかであろ
う。本文中に記載されたペプチド及び抗体を用いる免疫
学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し且つ非標識
化、結合性又は非結合性抗体又はペプチドの手段を用い
ることにより、体液、組織抽出物又は組織部分を包含す
る何れかのタイプの生物学的試料に対して適用すること
ができる。抗体又はペプチドは、適する固相例えば支持
体例えばミクロ滴定ウェルに結合させることができる。
タイプＩＶコラーゲナーゼのための前記抗ペプチド抗体
は、自然の全酵素に対して作られた抗体を上回る充分な
利点を有する（トリッグヴァソン，ケイ．及びリオッ
タ，エル．エイ．アメリカ合衆国特許第４６７７０５８
号）。第一に、それらはタイプＩＶコラーゲナーゼ（こ
れは、他の広く用いられているメタロプロテイナーゼと
同族ではない）に特有の特定領域を認識する。これは非
自明のことであり、且つタイプＩＶコラーゲナーゼのア
ミノ酸配列の大部分は図２に示される様に他のメタロプ
ロテイナーゼと非常に同族的であるか又は同一でさえあ
るとうことに関する多くの問題を克服する。抗体は表３
のペプチドに対して他のメタロプロテイナーゼから異な
るタイプＩＶコラーゲナーゼを作り、且つ更に潜酵素に
より異なって活性化され得る。この後者の特徴は、活性
化酵素に対する潜伏体の比率が病気の診断又は予後にお
ける決定因子である場合に病的状態が存在し得るので非
常に重要である。前述の発明において、明確性及び理解
の目的のために幾つかの細部が述べられた。形態及び細
部についての種々の変化及び組み合わせが、本発明の範
囲から離れることなく成し得るということも当業者には
自明であろう。特に、本文中に記載されたペプチド抑制
剤の側面配列における変性はメタロプロテイナーゼ類の
個々の構成員に対する安定性、活性又は特異性を変え得
るということは当業者には自明である。例えば、図１０
に示される活性化結合開裂サイトの左側に対する特定配
列の選択は、タイプＩＶコラーゲナーゼに比べてストロ
メリシン又はタイプＩコラーゲナーゼを好ましく抑制す
るための抑制剤を生じさせ得る。これは、前記配列のこ
の領域は異なるマトリックスメタロプロテイナーゼタイ
プの間で幾つかの変異性を示すからである。非臨界領域
におけるアミノ酸の一定置換基の選択は、ペプチドの抑
制性を充分には変えないであろうということも更に明ら
かである。マトリックスメタロプロテイナーゼに対して
特異的な抗体のための免疫原又は抗原として使用すべき
合成ペプチドの場合において、当業者は抗体結合サイト
による認識表現における特異的アミノ酸配列は、４ない
し６個のアミノ酸〔これは、抗体を使用すべき環境（例
えば、人間の生物学的検体）において他の蛋白質中に存
在することは知られていない〕の配列からなるというこ
とを理解するであろう。最後に、組み換え蛋白質ペプチ
ドは自然のペプチド又は合成ペプチドに比べて活性を有
し得るということは従来技術において知られている。本
発明の態様は、それ故明らかな如く、合成ペプチド化学
により適する発現ベクター中に具合良く挿入された適す
るＤＮＡセグメント又は利用し得る自然源からの単離物
を使用して調製された。幾つかの場合には、本発明のペ
プチドは、従来技術において良く知られている標準法の
変法に基づいて精製し得る。
【００２９】背景の記載及び本開示を完全にする目的
で、本明細書において今までに確認した出版物、特許及
び特許願の各々は、それ故参考文献として本明細書に加
入されている。
で、本明細書において今までに確認した出版物、特許及
び特許願の各々は、それ故参考文献として本明細書に加
入されている。
【図１】腫瘍細胞により分泌されたヒトＩＶ型プロコラ
ーゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。
ーゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。
【図２】ドメインにまとめられたＩＶ型プロコラーゲナ
ーゼとプロストロメリシンとプロコラーゲナーゼＩとの
アミノ酸相同性の比較を示す。
ーゼとプロストロメリシンとプロコラーゲナーゼＩとの
アミノ酸相同性の比較を示す。
【図３】（Ａ）抗ペプチド抗体Ａ１−１７のエリザ確認
を示すグラフ。（Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０
のエリザ確認を示すグラフ。（Ｃ）競合エリザアッセイ
の結果を示すグラフ。（Ｄ）粗製およびゼラチンアフィ
ニティ精製ＩＶ型プロコラーゲナーゼのウエスタンブロ
ット。
を示すグラフ。（Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０
のエリザ確認を示すグラフ。（Ｃ）競合エリザアッセイ
の結果を示すグラフ。（Ｄ）粗製およびゼラチンアフィ
ニティ精製ＩＶ型プロコラーゲナーゼのウエスタンブロ
ット。
【図４】ＩＶ型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲン
に結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイの結果を
示す。
に結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイの結果を
示す。
【図５】合成ペプチドによるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害
のゼラチンチモグラムを示す。
のゼラチンチモグラムを示す。
【図６】ペプチドによるＩＶ型コラーゲンへの標識ＩＶ
型コラーゲナーゼの結合の阻害の例を示す。
型コラーゲナーゼの結合の阻害の例を示す。
【図７】ゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロッテ
ィングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐ
ＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。
ィングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐ
ＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。
【図８】ＩＶ型コラーゲン減成アッセイにより続けられ
た精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化に対す
る時間経過を示す。
た精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化に対す
る時間経過を示す。
【図９】精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決定
されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体の
アミノ酸配列を示す。
されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体の
アミノ酸配列を示す。
【図１０】ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残
基１−１１０）（上段）、間質プロコラーゲナーゼのア
ミノ末端（中段）およびプロストロメリシンのアミノ末
端（下段）を示す。
基１−１１０）（上段）、間質プロコラーゲナーゼのア
ミノ末端（中段）およびプロストロメリシンのアミノ末
端（下段）を示す。
【図１１】ペプシン消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性化
ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプチ
ドによる投与量依存阻害を示す。
ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプチ
ドによる投与量依存阻害を示す。
【図１２】酵素阻害活性が試験されたペプチドを対比し
て示す。
て示す。
【図１３】活性化に際しヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼ
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの一部のヌクレオチド配列を
示す。
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの一部のヌクレオチド配列を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 16/38 16/38 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/99 15/09 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/99 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (72)発明者 ステットラー−スティーブンソン，ウィリ アム アメリカ合衆国，メリーランド 20879, ゲイザースバーグ，ホワイト バーン コ ート 11227 (72)発明者 クルッシュ，ヘンリー アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベテスダ，デポール ドライブ 9704
Claims (47)
- 【請求項１】 ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮおよびＭ
ＲＫＰＲＣＧからなる群から選択されるアミノ酸配列か
ら本質的になり、かつマトリックスメタロプロテイナー
ゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋なペプチ
ド。 - 【請求項２】 腫瘍細胞に特異的な結合部位を有し、ア
ミノ酸配列ＡＰＳＰＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰＫＴＤＫＥＬ
ＡＶＱＹＬＮＴＦＹＧＣＰＫＥＳＣＮＬＦＶＬＫＤＴＬ
ＫＫＭＱＫＦＦＧＬＰＱＴＧＤＬＤＱＮＴＩＥＴＭＲＫ
ＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮＹＮＦＦＰから本質的になり、か
つマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する能力を
さらに有する実質的に純粋なペプチド。 - 【請求項３】 アミノ酸配列ＡＡＨＥまたはアミノ酸配
列ＶＡＨＥから本質的になり、かつマトリックスメタロ
プロテイナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に
純粋なペプチド。 - 【請求項４】 マトリックスメタロプロテイナーゼを阻
害する能力を有し、ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳ
Ｑ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＬ
ＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬＦＨ
ＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびＡＡＨ
ＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭからなる群から選択されるアミ
ノ酸配列から本質的になる実質的に純粋なペプチド。 - 【請求項５】 図１に示されたアミノ酸残基２００〜３
７０に相当するアミノ酸配列から本質的になり、かつマ
トリックスメタロプロテイナーゼを阻害する能力をさら
に有する実質的に純粋なペプチド。 - 【請求項６】 請求項１記載のペプチドと反応する抗
体。 - 【請求項７】 請求項２記載のペプチドと反応する抗
体。 - 【請求項８】 請求項３記載のペプチドと反応する抗
体。 - 【請求項９】 請求項４記載のペプチドと反応する抗
体。 - 【請求項１０】 請求項５記載のペプチドと反応する抗
体。 - 【請求項１１】 マトリックスメタロプロテイナーゼを
阻害するために有効な量の請求項１または２のいずれか
に記載のペプチド、および製薬的に許容される担体を含
有するマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するた
めの製薬組成物。 - 【請求項１２】 吸入用に製剤化された請求項１１記載
の組成物。 - 【請求項１３】 凍結乾燥された粉末である請求項１１
記載の組成物。 - 【請求項１４】 経口または舌下投与に適する包接錯体
である請求項１１記載の組成物。 - 【請求項１５】 マトリックスメタロプロテイナーゼを
阻害するために有効な量の請求項３または４のいずれか
に記載のペプチド、および製薬的に許容される担体を含
有する製薬組成物。 - 【請求項１６】 マトリックスメタロプロテイナーゼを
阻害するために有効な量の請求項５に記載のペプチド、
および製薬的に許容される担体を含有する製薬組成物。 - 【請求項１７】 請求項１記載のペプチドまたはそれら
の変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項１８】 請求項１７記載のＤＮＡ配列を含有す
るベクター。 - 【請求項１９】 請求項１８記載のベクターにより形質
転換された微生物宿主。 - 【請求項２０】 請求項１記載のペプチドの発現に適当
な条件下で請求項１９記載の形質転換された微生物宿主
を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請
求項１記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項２１】 請求項２０記載の方法により製造され
る請求項１記載のペプチド。 - 【請求項２２】 請求項２記載のペプチドまたはそれら
の変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項２３】 請求項２２記載のＤＮＡ配列を含有す
るベクター。 - 【請求項２４】 請求項２３記載のベクターにより形質
転換された微生物宿主。 - 【請求項２５】 請求項２記載のペプチドの発現に適当
な条件下で請求項２４記載の形質転換された微生物宿主
を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請
求項２記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項２６】 請求項２５記載の方法により製造され
る請求項２記載のペプチド。 - 【請求項２７】 請求項３記載のペプチドまたはそれら
の変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項２８】 請求項２７記載のＤＮＡ配列を含有す
るベクター。 - 【請求項２９】 請求項２８記載のベクターにより形質
転換された微生物宿主。 - 【請求項３０】 請求項３記載のペプチドの発現に適当
な条件下で請求項２９記載の形質転換された微生物宿主
を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請
求項３記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項３１】 請求項３０記載の方法により製造され
る請求項３記載のペプチド。 - 【請求項３２】 請求項４記載のペプチドまたはそれら
の変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項３３】 請求項３２記載のＤＮＡ配列を含有す
るベクター。 - 【請求項３４】 請求項３３記載のベクターにより形質
転換された微生物宿主。 - 【請求項３５】 請求項４記載のペプチドの発現に適当
な条件下で請求項３４記載の形質転換された微生物宿主
を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請
求項４記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項３６】 請求項３５記載の方法により製造され
る請求項４記載のペプチド。 - 【請求項３７】 請求項５記載のペプチドまたはそれら
の変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列。 - 【請求項３８】 請求項３７記載のＤＮＡ配列を含有す
るベクター。 - 【請求項３９】 請求項３８記載のベクターにより形質
転換された微生物宿主。 - 【請求項４０】 請求項５記載のペプチドの発現に適当
な条件下で請求項３９記載の形質転換された微生物宿主
を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請
求項５記載のペプチドの製造方法。 - 【請求項４１】 請求項４０記載の方法により製造され
る請求項５記載のペプチド。 - 【請求項４２】 請求項１１、１５または１６のいずれ
か１項に記載の組成物のマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ阻害量からなる哺乳動物のためのマトリックスメタ
ロプロテイナーゼ阻害剤。 - 【請求項４３】 請求項１１、１５または１６のいずれ
か１項に記載の組成物のマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ阻害量からなるマトリックスメタロプロテイナーゼ
の活性に起因する変性過程に対する哺乳動物処置剤。 - 【請求項４４】 舌下または経口投与のための製剤にお
ける請求項１１、１５または１６のいずれか１項に記載
の組成物。 - 【請求項４５】 吸入のための製剤における請求項１
１、１５または１６のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項４６】 静脈注射のための製剤における請求項
１１、１５または１６のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項４７】 マトリックスメタロプロテイナーゼ阻
害量の請求項２３記載のベクターを含有するマトリック
スメタロプロテイナーゼ阻害剤。
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2000
- 2000-05-01 JP JP2000132398A patent/JP3252283B2/ja not_active Expired - Fee Related
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