JPH04501423A - マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 マトリックスメタロプロティナーゼペプチド：診断および治療における役割 発明の分野 本発明は、メタロブロティナーゼの検出およ−び阻害にび酵素とその基質との相 互作用に関わる酵素のドメインに相当する、ＩＶ型コラ−ゲナーゼの配列から得 られるペプチドに関する。ペプチドに認知される抗体は酵素の検出に有効である 。機能研究により確認された、特定のペプチドはメタロブロティナーゼ阻害剤の 新しい種類を構成する。

発明の背景 同質および基底膜コラーゲンの減成は特定の種類のメタロブロティナーゼ（その マトリックスメタロブロティナーゼは酵素前駆体型として細胞外マトリックスの 中に潜んでいるコラ−ゲナーゼ（ＥＣ３，４，２４，７）としても公知である） によって、開始される。このコラ−ゲナーゼ遺伝子ファミリーの構成物は次のも のを含んでいる。

コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型を減成し、気質の特性と活性の必要条件によ って特徴づけられている間質コラ−ゲナーゼ（ストリックリン、Ｇ、Ｐ、ジェフ リイ。

Ｊ、Ｊ、ローズウィツト、Ｗ、Ｔ、およびアイゼン、Ａ。

Ｚ、”、１９８３．　ニオ　ケ　ミ　ス　ト　リ　イ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）ヘルム、Ｓ、、クーロンバーガー、Ａ、、バウアー、Ｅ。

人、、グランド、Ｇ、Ａ、、およびアイゼン、Ａ、Ｚ、。

５；ハスティ、に、Ａ、、ジェフリイ、Ｊ、Ｊ、、ヒップス、Ｍ、Ｓ、、および ウェルガス、Ｈ，Ｇ、、１９８イールズ、Ｇ、Ｂ、、　ファン　ヮルト、Ｈ，Ｅ 、、およおよびアイゼン、Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、　ローズウィツト、 Ｗ、Ｔ、、およびゴールドバーブ、Ｇ、Ｉ。

プロテオグリカン、グリコプロティンおよびコラーゲン分子の非ラセン部位を減 成するストロメリジン（ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、コリャーム、１．Ｅ、、クー ロンバーガー、Ａ、２アイゼン、　Ａ、　、Ｚ’、　、マーマー、Ｂ。

Ｌ、、グランド、Ｇ、Ａ、、バウアー、Ｅ、Ａ、およびグ　ナチュラル　アカデ ミイ　オブ　サイエンス　Ｕ。

Ｓ、　Ａ、版（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ）　８ ４　、６７２５−６７２９；ホアイトマン、Ｓ、Ｅ、、マーフィー。

Ｇ、、エンジェル、Ｐ、、ラームスフォルフ、Ｈ，Ｊ、。

スミス、Ｂ、Ｊ、、ライオンズ９人、、ハリス、Ｔ、Ｊ。

Ｔ、、レイノルズ、Ｊ、Ｊ、、ヘルリッヒ、Ｐ、、およびドチェーティ、Ａ、Ｊ 、Ｐ、、１９８６．バイオケミおよびペプシン抵抗性−三重ラセンＩＶ型コラー ゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を減成するＩＶ型コラ−ゲナーゼ。

ＴＶ型コラ−ゲナーゼはヒト腫瘍細胞（リオッタ、Ｌ。

Ａ、、クライナーマン、Ｊ、、カタンザロ、Ｐ、、およびリンブランド、Ｄ、、 １９７７、　ジャーナル　オブナチニラル　キャンサー　インスティテユート（ Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）　５８．　１４２７−１４３９ 　；チューペ一二一ミーヒュジャンエン、Ｔ、、およびトリグヴエイソン、に、 、１９８２．インターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサ−（Ｉｎｔ、　 Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ：）　１工上、６６９−６７３．リオッタ、Ｌ、Ａ、、エイ ブ、Ｓ、、ジェーロンーロビイ、Ｐ、、およびマーティン、Ｇ、Ｒ，。

１９７９、プロシーディング　ナチュラル　アカデミイオブ　サイエンス　Ｕ、 Ｓ、Ａ、版（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ夕、Ｌ、Ａ、、）リグヴエイソン、 に、、ガルビサ、Ｓ。

、ハート、１．、フォルツ、Ｃ，Ｍ、、およびシャーフム、Ｓ、Ｍ、、アイゼン 、Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ。

、グランド、Ｇ、Ａ、、シェルツアー、Ｊ、Ｌ、、クーロンバーガー、人、、ヒ ー、、Ｃ，バウアー、Ｂ、Ａ。

内皮細胞（カレビック、Ｔ、、バービサ、ｓ、、　グレーサー、Ｂ、およびリオ ッタ、Ｌ、Ａ、、１９８３．サイエンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２１　、　２ ８１−２８３　）　；骨（マーフィー、Ｇ１．マックアルビン、Ｃ，Ｇ、、ボー ル、Ｃ，Ｔ、、およびレイノルズ、Ｊ、Ｊ、、１９８５゜バイオケミ力　バイオ フィジカ　エト　アクタ　（Ｂｉｏｃｈｅｒａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ ）　８３１．　４９−５８）　：繊維芽細胞（コリア−、］、Ｅ、、ウィルヘル ム、Ｓ。

Ｍ、、アイゼン、Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、グランｌ−，Ｇ、Ａ、、シェ ルツアー、Ｊ、Ｌ、、クーロンバーガー、Ａ、、ピー。ＩＣ−１バウアー、Ｅ、 Ａ、、およびゴールド−バーブ、Ｇ、１．，１９８８．　ジャーナ多形核白血球 （ウィツト、Ｖ、Ｊ、、シュヮルッックス、Ｄ、、およびヴエイスｒ　Ａ−＋　 １９８０．　ヨｏピおよびマクロファージ（ガルビサ、Ｓ、、バリン、Ｍ、。

ダガージオルディニ、Ｄ、、ファステリ、Ｇ、、ナチュレイル２Ｍ、、ネグロ、 Ａ、、セメンザト、Ｇ、、およ２３６９−２３７５）；から確認されている。

この酵素は６８ないし７２キロダルトンの中性メタロプロテイナーゼであり、そ れは酵素前駆体型として潜んでいる（リオッタ、Ｌ、Ａ、、エイプ、Ｓ、、ジェ ーロンーロビイ、Ｐ、、およびマーティン、Ｇ、Ｒ，，１９Ｌ、Ａ、、トリグヴ エイソン、に、、ガルビサ、Ｓ、。

ジェーロンーロビイ、Ｐ、エイプ、Ｓ、、１９８１．バイオケミストリー（Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２０　、　１００−１０４；サロ、Ｔ、、リオッタ、 Ｌ、Ａ、、、）リグヴサッソ加えて、幾つかの他のこのコラ−ゲナーゼ遺伝子フ ァミリーのメンバーは近年、ストロメリジンンの第二型（ストロメリジン−２） 、９２キロダルトン型のＩＶ型コラ−ゲナーゼおよびビュータティヴ　ユータラ インメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ｕｔｅｒｉｎｅ　Ｍｅｔａｌｌ ｏ−ｐｒ。

ｔｅｉｎａｓｅ）：　（ＰＵＭＰ）　−１、低分子量のニータラインコラ−ゲナ ーゼ（ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、コリア−９１、Ｅ、、？−７−Ｉ　Ｂ、Ｌ、、 フイゼ：／、　Ａ、　７．、　。

グランド、Ｇ、Ａ、およびゴールドバーブ、Ｇ、１．。

１９８９、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミスト　リ　−　（Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６４．　１　７２１　３−１　７２２１；ウォエスナー 、Ｊ、Ｆ、およびタルビン、Ｃ，Ｊ、。

１９８　Ｂ、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミスト　リ　−（Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６　３．　１　６　９　１　８−１　６　９２５）を含 めて開示されている。

７０キロダルトンＩＶ型コラ−ゲナーゼは、マウス腫瘍型での腫瘍の転移潜在性 に密接に関係しており、（リオッタ、Ｌ、Ａ、、トリグヴエイソン、に１．ガル ビサ。

Ｓ、、ハート、■、、フォルツ、Ｃ，Ｍ、、およびシャーフィ、Ｓ、、１９８０ ．　ネイチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）、ロンドン、２８４．６７−６８）および 、それに伴い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ−ｒａｓ癌遺伝子を増加させ る（マツシェル、Ｒｏ、ウィリアムス、Ｊ、Ｅ、、　ロウイー、Ｄ、Ｒ，および リオッタ、Ｌ、Ａ、、１９８５゜アメリカン　ジャーナル　オブ　パソコン−（ Ａｍｅｒ、　Ｊ。

Ｐａｔｈｏｌ、）　１２１．　１−８　；ガルビサ、Ｓ、、ポッザッティ、Ｒ１ ，マツシェル、Ｒ，Ｊ、、サツフィオッティ。

トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２０　、　１００−１０４　；　コリア Ｕ、、バリン、Ｍ、、ゴールドファーブ、Ｒ，Ｈ，，ホウリー、Ｇ、およびリオ ッタ、Ｌ、Ａ、、１９８７．±ヤンサー（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）４７．　１５ ２３−１５２８）。

トリプシン処理の結果、潜在酵素の活性化とそれに伴う分子量の減少が起こる（ リオッタ、Ｌ、Ａ、、トリグヴエイソン、に、、ガルビサ、Ｓ、、ジエーロンー ロビイ、Ｐ、エイブ、Ｓ、、１９８１．バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ）　２０．　１００−１０４　）。

有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化を提示し、このことも分子量の減少に関 連づけられる（コリア−２Ｉ。

Ｅ、、ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、アイゼン、Ａ、Ｚ、。

マーマー、Ｂ、Ｌ、、　グランド、Ｇ、Ａ、、　シェルツアー、Ｊ、Ｌ、、クー ロンバーガー、Ａ、、ヒー、ｒ　Ｃ＋　１バウアー、Ｅ、Ａ、、およびゴールド −バーブ、Ｇ、１゜７；マーフィー、Ｇ、、マツクアルビン、Ｃ，Ｇ、、ボール 、Ｃ，Ｔ、、およびレイノルズ、Ｊ、Ｊ、、１９８５、バイオケミ力　バイオフ ィジカ　エト　アクタ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８ ３１．　４９−５８）。

活性化された酵素はＩＶ型コラーゲンを分裂させ、特徴的な１／４アミノ−末端 および３／４カルボキシ−末端のフラグメントを生成させる（リオッタ、Ｌ、Ａ 、。

トリグヴエイソン、に、、ガルビサ、Ｓ、、ジェーロンーロビイ、Ｐ、エイブ、 Ｓ、、１９８１．バイオケミス１１８；マーフィー、Ｇ、、マッファルピン、Ｃ ，Ｇ、。

−，１，Ｅ、、　ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、アイゼン、Ａ。

Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、グランド、Ｇ、Ａ、、シェルツアー、Ｊ、Ｌ、、ク ーロンバーガーＩｌｌ　ヒー、。

Ｃ０，バウアー、Ｅ、Ａ、、およびゴールド−バーブ。

Ｇ、１．．１９８８．　ジャーナル　オブ　バイオロジカ６５８７、フェスラー 、Ｌ、１．．　ダンカン、に、Ｇ、。

フエスラー、Ｊ、Ｈ，，サロ、Ｔ、およびトリグベイソゼラチン分解活性がこの 酵素に関連することも示されている（コリア−，１，Ｅ、、ウィルヘルム、Ｓ、 Ｍ、。

アイゼン、Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、グランド。

Ｇ、Ａ、、　シェルツアー、Ｊ、Ｌ、、クーロンバーガー。

Ａ、、ヒー、ｌ　ＣＨＩバウアー、Ｅ、Ａ、、およびゴーミーヒュジャンエン、 Ｔ、、ステットラー−スティーヴンソン、Ｗ１．クルツシェ、Ｈ，、）リグヴエ イソン。

Ｋ、およびリオッタ、Ｌ、Ａ、、１９８８．フェダレイション　オブ　ヨーロピ イアン　バイオケミカル　ソサイエティ　レターズ（ＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ ）　２３３　、　１０９−ボール、Ｃ，Ｔ、、　およびレイノルズ、Ｊ、Ｊ、、 １９８５、バイオケミ力　バイオフィジカ　エト　アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　８３１　、　４９−５８　）。

同様に、■型コラーゲン分解活性も示されている（コリア−，１，Ｅ、、ウィル ヘルム、Ｓ、Ｍ、、アイゼン。

Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、　グランド、Ｇ、Ａ、。

シェルツアー、Ｊ’、Ｌ、　、クーロンバーガー、Ａ、、ヒー＋　ｌ　ＣＨｌバ ウアー、Ｅ、Ａ、、およびゴールド−バフ９−６５８７；マーフィー、Ｇ、、マ ッファルピン。

Ｃ，Ｇ、、ボール、Ｃ，Ｔ、、およびレイノルズ、Ｊ。

ＩＶ型コラ−ゲナーゼはヒトメラノーマ細胞から精製されており、そして全タン パク質アミノ末端における配列情報はトリプシン作用のおよび臭化シアンのペプ チドフラグメントと同様に得られる（ホイヤ１Ｍ、チューペ一二一ミーヒュジャ ンエン、Ｔ、、ステットラーースティーヴンソン、Ｗ、、クルツシエ、Ｈ，，） リグヴエイ０９−１１３）　。

配列情報はＩＶ型コラ−ゲナーゼが間質コラ−ゲナーゼとストーメリジンの相同 の限界配列を示すことによって説明される。最近の報告ではＨ−ｒａｓ変性ヒト 気管上皮細胞によって隠されたメタロブロティナーゼによって特徴付けられた部 分的なｃＤＮＡクローンがある（コリア−，１，Ｅ、、ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、 、アイゼン。

Ａ、Ｚ、、マーマー、Ｂ、Ｌ、、　グランド、Ｇ、Ａ、。

シェルツアー、Ｊ、Ｌ、、クーロンバーガー、Ａ、、ヒ＋　Ｉ　Ｃ＋　＋バウア ー、Ｅ、Ａ、、およびゴールド−バーブ、Ｇ、１．，１９８８．　ジャーナル　 オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６３　 、　６５７９−６５８７）。

変性気管上皮酵素は特にＩＶ型コラーゲンの減成に有効で、そして推定されたア ミノ酸配列は報告されているトリプシン性および臭化シアンのヒト腫瘍ＩＶコラ ーゲナーゼのフラグメントとの一致を提示する（ポイヤ２Ｍ。

チューペ一二一ミーヒュジャンエン、Ｔ、、ステットラーースティーヴンソン、 Ｗ、ｌ　クルッシェ、Ｈ，，）リグヴエイソン、に、およびリオッタ、Ｌ、Ａ、 、１９Ｂこのように、ヒトメラノーマ細胞の１ｖ型コラ−ゲナーゼはＨ−ｒａｓ 変性気管上細胞の酵素と一致すると考えられ、それは繊維芽細胞（コリア−，１ ，Ｅ、、ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、アイゼン、Ａ、Ｚ、、マーマー。

Ｂ、Ｌ、、　グランド、００人、、シェルツアー、Ｊ、Ｌ。

、クーロンバーガー、人、、ヒー＋　Ｉ　Ｃ＋　ｌ　バウアー。

Ｅ、Ａ、、およびゴールド−バーブ、Ｇ、１．，１９８（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、）　２６８．　６５７９−６５８７）および骨細胞外植体（マーフィー、Ｇ 、、マツクアルビン、ｃ。

Ｇ、、ポール、Ｃ，Ｔ、、およびレイノルズ、Ｊ、Ｊ、。

１９８５、バイオケミ力　バイオロジカルタ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、Ａｃｔａ）　８　３　１　、４　９　−　５　８　）　からも発見されてい る。

発明の要約 ヒト黒色腫細胞から精製された■型コラーゲナーゼの酵素前駆体の全アミノ酸配 列が今分析され、そして該酵素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペ プチドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ酵素から切断される ８０残基のアミノ末端；システィンに富む（システィンリッチ）内部ドメイン； ヒスチジン含有領域；およびカルボキシ末端から領域１５９残基を包含する。こ れらのドメインからのペプチドは■型コラーゲナーゼ分子内の特定のドメインに 対する抗体を生成するために使用された。本発明において、抗体、直接アミノ酸 配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合および相互作用に関与する酵素の 領域、およびｂ）有機水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素前 駆体活性化の間に生成される主な■型コラーゲナーゼ変換体の構造を決定するた めに使用された。

有機水銀化合物、ｐＡＰＭＡによる■型コラーゲナーゼプロ酵素活性化は、結果 として６２ｋＤａの安定な活性酵素種を生じるアミノ酸８０個のアミノ末端断片 の自触的除去を伴うことが発見された。さらに、これらのデータは■型コラーゲ ナーゼがその他の細胞外マトリックス分解性メタロプロテイナーゼのアミノ末端 領域と配列相同性だけでなく機能的ドメイン同一性を有することを示す。

下の図８および９に示されるように、アミノ末端ペプチド（残基１−８０）は■ 型コラーゲナーゼ活性化の間に切除される。この発見により、このペプチドが、 活性部位をブロックしそして酵素を不活性にする内在酵素阻害剤を含むという可 能性が高まった。従って、活性化の間の上記アミノ末端セグメントの除去はこの 阻害剤を除去するであろうし、そして活性部位を露出する。この阻害に関与する 重要な領域は対になっていないシスティン残基を含む図１０においてボックスで 囲まれた領域である。この領域はその他のマトリックスメタロプロテイナーゼに おいて保存された性質を示し、そしてＣｈｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎによる分析法に よりベータターンコンホメーションの高い可能性を有する。さらに、この配列内 の対になっていないシスティン残基が酵素の活性部位においてメタロイオンと非 共有結合的に相互作用すると仮定することは正当だった。従って、有機水銀活性 化（ＡＰＭＡがスルフヒドリル残基に結合することは知られている）がこの相互 作用を乱し、そして阻害剤セグメントを活性部位への接近から分離するであろう コンホメーション変化を引き起こすであろう。この全く新しい仮説を試験するた めに、アミノ末端残基１−８７における一連の重複領域に相当する合成ペプチド が調製された。下の図１１および１２ならびに表４に示されるように、対になっ ていないシスティンを含む保存領域を含有するそれらのペプチドだけが０．１ｍ Ｍ未満の濃度で強く阻害性だった。システィンは活性のために必要だった。それ 故に、これらのべ゛　ブチドはメタロブロティナーゼのための阻害剤の全く新し いクラスを構成する。

要するに、この分析に基づく発見はａ）酵素が潜在状態にあるとき該酵素の活性 部位をブロックし得る内在性酵素阻害剤を構成する■型プロコラーゲナーゼのア ミノ末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合および相互作用に関与する酵素の 中央近傍の領域の確認を導いた。これらの領域に相同なペプチドは新規マトリッ クスメタロブロティナーゼ阻害剤を構成する。

図面の簡単な説明 図１は腫瘍細胞により分泌されたヒト■型プロコラーゲナーゼの全アミノ酸配列 を示す。

図２はドメインにまとめられた■型プロコラーゲナーゼとプロストロメリシンと プロコラーゲナーゼエとのアミノ酸相同性の比較を示す。

図３　（Ａ）抗ペプチド抗体Ａｌ−１７のエリザ確認。

■型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし１７に相当する合成ペプチド が合成され、そして抗原として使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合 体はこのエリザにおいて被覆抗原として使用された。

（Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０のエリザ確認。

■型プロコラーゲナーゼの内部残基４７２−４９０に相当する合成ペプチドが合 成され、そして抗原として使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体は このエリザにおいて被覆抗原として使用された。

（Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当なペプチドを用いて行われ た。ペプチド−ウシ血清アルブミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプ チドは競合抗原として使用された。

（Ｄ）粗製およびゼラチンアフィニティ精製■型プロコラ−ゲナーゼのウェスタ ンプロット。Ａｌ−１７とイムノプロットされた粗製■型プロコラーゲナーゼ（ Ａ２０５８黒色腫細胞調整培地２０μｆ、列Ａ）、Ａ４７２−４９０とイムノプ ロットされた精製■型コラーゲナーゼ（３０Ｍｇ、列Ｃ）が示されている。

図４は■型コラーゲナーゼの基質■型コラーゲンに結合する該コラ−ゲナーゼに 対するアッセイを示す。精製■型コラーゲナーゼは、微量滴定ウェルに被覆され たペプシン消化■型コラーゲンへの標識された■型コラーゲナーゼの結合を競合 させるために用いられた（平均値士Ｓ、　Ｄ、　）。結合の飽和は増加する量の 基質を用いる下側の曲線に示されている。

図５は示された合成ペプチドによる■型コラーゲナーゼ阻害のゼラチンチモグラ ムを示す。ゼラチナーゼ活性は約７０ｋＤａの位置に白色の明瞭なバンドとして 可視化されている。この白色の明瞭なバンドは阻害剤の存在下で消失している。

３重の試験が示されている。

図６は示されたペプチドによる■型コラーゲン・＼の標識■型コラーゲナーゼの 結合の阻害の例を示す。ヒスチジン含有ペプチドは図２および５に示された■型 シラーゲナーゼのヒスチジン含有ドメインに相同なフィブロネクチン中の領域か ら誘導される。ヒスチジン残基は結合性競合に必要とされる。

図７はゼラチンチモグラムおよびウェスタンブロッティングにより続けられた■ 型プロコラーゲナーゼの９ＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。Ａ２０５８ 黒色腫細胞調整培地の一部２０μｌは示された時間（分）１．０ｍＭ　ｐＡＰＭ Ａの存在下で活性化された。反応はＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加して停止され、 そして試料はゼラチンを含むか、または含まない９％アクリルアミドゲル上で電 気泳動された。ゼラチンを含むゲルは電気泳動後チモグラムとして現像された。

ゼラチンを含まないゲルは電気泳動でニトロセルロースに移され、そして次に示 されたアフィニティー精製抗体（１μｇ／ｒＲＩ）で免疫染色された。アミノ末 端抗原ドメインの損失はＩ。

ｋＤａ体から６２ｋＤａ体へのｐＡＰＭＡ誘導変換の間に起こる。ＭＷＭ、前染 色された分子量マーカー。

図８は■型コラーゲン減成アッセイにより続けられた精製■型コラーゲナーゼの ｐＡＰＭＡ活性化の時間経過を示す。精製■型コラーゲナーゼ（２３Ｍｇ／ｒｎ ｉ）の一部１０μｌはｐＡＰＭＡ中に１ｍＭとされ、そして示された時間３７℃ で予備保温された。試料を次に５０ｍＭトリスＨＣ１，０，１５Ｍ　ＮａＣ１， ５ｍＭ　ＣａＣ１＊、ｐ　Ｈ７，６の添加により最終容量６０μ！まで希釈し、 ”Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（二ニー・イングランド・ヌクレアー）を添加し、そし て反応混合物を３７℃で３０分間保温した。試料は次に３重にアッセイされた。

最大活性は３７℃での２．８μｇ減成■型コラーゲン／ｈ／精製酵素μｇに相当 する。

図９は精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決定される■型プロコラーゲナ ーゼの潜在および活性体のアミノ酸配列を示す。ｐＡＰＭＡ活性化の際の自勉作 用の切断部位も示しである。書込みは精製潜在酵素（２０Ｍｇ９列Ａ）および活 性酵素（２０Ｍｇ、列Ｂ）の銀染色ＮａＤｏｄＳＯ４ＰＡＧＥゲルでの明らかな 分子量を示す。

図１０は■型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残基１−１１０）（上段）、間 質プロコラ−ゲナーゼのアミノ末端（中段）およびプロストロメリシンのアミノ 末端（下段）を示す。切断部位かられずかに上流の相同領域はボックス八で示さ れており、ｐＡＰＭＡ活性化に続く切断部位はボックスＢで示されており、そし てシスティン残基には下線を付しである。間質コラ−ゲナーゼおよびストロメリ シンのｐＡＰＭＡ活性化に続（切断のその他の報告された部位は星印により示さ れている。

図１１はペプシン消化■型コラーゲンの精製活性化■型コラーゲナーゼによる切 断の示された合成ペプチドによる投与量依存阻害を示す。ペプチドＴＭＲＫＰＲ ＣＧＮＰＤＶＡＮは０．１ｍＭの濃度で酵素活性の８０％を阻害する。より高い 濃度は全ての酵素活性を消失させる。

図１２は酵素阻害活性が試験されたペプチドの比較を示す。ペプチドは図１０に 示されたアミノ末端配列から誘導された。コア配列ＰＲＣＣ；は、この配列のな いペプチドが顕著な阻害活性を欠（という事実に基づいて阻害活性に必要である 。最少の配列必要条件のさらなる精選は表２に列挙したペプチドを用いて行われ た。

図１３は、活性化に際してヒト■型プロコラーゲナーゼから切断されるアミノ末 端ペプチドの８０個のアミノ酸配列をコ・−ド化するヒト■型プロコラーゲナー ゼのためのヒトｃＤＮＡクローンの部分のヌクレオチド配列を示す。

発明の詳細な説明 マトリックスメタロブロティナーゼを阻害する能力を有するペプチド配列を提供 することが本発明の目的である。

マトリックスメタロブロティナーゼの存在の同定に使用するための抗体を提供す ることが本発明の別の目的でｊ）る。

活性化マトリックスメタｌコブロチ、イナーゼにより引き起こ六ｆするｔＯ織破 壊から生じる組織損優に罹患した患者を治療する方法を提供することが本発明の 別の目的である。

ヒト■型コラーゲナーゼの全アミノ酸配列は図１に示されている。この配列はこ のタンパク質が図２に示される一連のドメインに分割され得ることを示す。約１ ｋｂのセグメントによりコード化されるシスティンリッチ（１２システイン残基 ）ドメインはその他の配列決定されたメタロプロテイナーゼ例えばＩ型コラ−ゲ ナーゼおよびストロメリシンと顕著な相同性がない。しかしながら、このシステ ィンリッチ領域はフィブロネクチンと顕著な相同性を示す。システィンリッチ配 列がメタロプロテイナーゼ活性においてその機能的役割を直接試験されたことは これまで決してなかった。システィンに富む領域（残基２００−３７０）から誘 導されたペプチドは酵素基質結合を阻害し、そして本発明の実施態様と見なされ る。　■型コラーゲナーゼの他の３つのドメインはその他のマトリックスメタロ プロテイナーゼと顕著な相同性を示す（図２）。特に、ｒＭＢＤ」と表記され、 そして図２に示されている残基３７１ないし３８６の領域はサーモリシンを含む ３種全てのマトリックスメタロブロテイカーゼ中に密接な相同配列を存する。実 際の結晶化されたサーモリシンにおいて、この領域は酵素の推定上のＺｎ結合ド メインに関連する。しかしながら、ＭＢＤ配列はメタロプロテイナーゼ活性にお いてその機能的役割を直接試験されたことはこれまで決してなかった。本発明に おいて、（ａ）これらの領域から誘導された合成ペプチドおよび（ｂ）これらの 領域に対して指示されたアフィニティー精製抗体はゼラチナーゼおよび■型コラ ーゲナーゼ活性をブロックする阻害剤を構成する。さらに、概説した■型コラー ゲナーゼドメインに相同なフィブロネクチンから誘導さねたペプチドはまた、そ の基質への■型コラーゲナーゼの結合を阻害する。

本発明のマトリックスメタロブロティナーゼ阻害剤は不適当な血管形成、関節炎 、腫瘍増殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症状態例えばサルコイド−シス の治療に筐用され得る。これらの状態において、産生さた酵素の量および図１１ に示されるような活性酵素を９０％以上阻害するのに必要なペプチド阻害剤の量 を見積もることは可能である。阻害性ペプチドの治療的投与量は１０−２５０ｍ ｇ／ｋｇ／ｄの許容できる薬学的範囲であり、より好ましくは２５−１００ｍｇ ／ｋｇ／ｄの範囲である。投薬される患者の投与量は該患者において産生される 酵素の量、該患者の状態および体格に依存するであろう。阻害剤は注射として、 または血流中に速やかに移行するあらゆる手段により投与され得る。凍結乾燥粉 末は「飲み込まれ」てもよい。経頬または舌下投与のための調剤も与えられ得る 。呼吸器に欠陥を存する患者のために、ペプチドは吸入により投与され得る。エ アロゾルがこの目的のために特に育用である。目の異常に対して、ペプチドは点 眼薬として投与されてもよい。

実施例１ ヒスチジン含有ペプチド阻害剤 タイプＩＶコ５ゲナーゼの残基３７１−３８６（ＭＢＤ領域）に相当する合成ペ プチドは、ゼラチナーゼおよびコラゲナーゼタイプＩＶ活性を廃止する。これは ゼラチン酵素電気永動像を使用した第５図に示されている。

さらに、これらのドメインを認識する親和力精製抗体もまたゼラチナーゼおよび コラゲナーゼタイプＩＶ活性を阻害する。これらのペプチドの作用メカニズムは 、少なくとも一部分、タイプＩＶコラーゲンへのタイプＩＶコラゲナーゼの結合 を完成させるそれらの能力に帰している（第６図）。

メタロブロティナーゼペプチド阻害剤は、タイプＩＶコラゲナーゼの残基３７１ −３８６でのヒスチジン含有ドメインと実質的な相同関係を持つタンパク質ペプ チドを存している。該タンパク質ペプチドは、メタロプロテイナーゼのゼラチン 分解およびコラーゲン分解活性を阻害する。メタロブロティナーゼ阻害剤のタン パク質ペプチドは好ましくは活性のための少なくとも１種のヒスチジン残基を含 有する。メタロプロティナーゼ阻害剤のタンパク質ペプチドの一つの望ましい具 体例は、ヒスチジン含有配列を持ち、該配列は、ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨ ３Ｑ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨ３Ｑ、ＶＡＡＨＥＬＧＨ３ＬＧＬＳＨ３Ｔ 、ＶＡ八へＥＬＧＨ３ＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬＦＨＳＡ、Ｖ ｖＡＨＥＬＴＨＡｖＴＤＹＴ八ＧおよびフィブロネクチへペプチドＡＡＨＥＥ　 Ｉ　ＣＴＴＮＥＧＶＭよりなる群から選択されたメンバーである。後者のペプチ ドが有効でヒスチジン残基を必要としたので、コア配列ＡＨＥは本発明の一主要 具体例の最小抗原決定基（ｍｊｎｉｍｕ＋＋＋　ｄｅｔｅｒｍｉ−ｎａｎｔ）で あることが決定された。

保存された残基領域中にアミノ酸を置換することにより、第５図および第６図に 示すように、ペプチドの阻害活性のためにヒスチジン残基が幾分必要であること が判明した。全３個のヒスチジンがアラニンで置換された場合、ペプチドは完全 に不活性となった。しかしながら、中央のヒスチジンのみがアラニンで置換され た場合、阻害活性は残された。さらに、２個のグルタミン酸（Ｅ）残基をグルタ ミン（Ｑ）で置換することは、ペプチドの阻害活性を改変した。これらの阻害性 ペプチドは、タイプＩＶコラーゲン基質またはゼラチン基質における解裂部位と 相同関係を持たない。それらの作用メカニズムには、金属イオンと相互作用でき るプロテイナーゼの領域内の酵素−基質相互作用の干渉が含まれ、そのような相 互作用は基質解裂にとって必要である。その活性ペプチドは、タイプＩＶコラゲ ナーゼ活性を廃止するペプチド濃度下で、サーモリシンのゼラチン分解活性を部 分的に抑制する。活性ペプチドは、プラスミンおよびトリプシンを含めて試験さ れた多様なセリンおよびチオールプロテアーゼ類または“非メタロプロテイナー ゼ類′を阻害するのに失敗した。

表１は、発明者らによる機能的研究に基づいてまた他のメタロプロテイナーゼと の相同比較に基づいて図１中の配列から選択された、マトリックスメタロプロテ イナーゼの阻害候補として試験されたアミノ酸置換を含む合成ヒスチジン含有ペ プチドのリストである。

表１ タイプＩＶコラゲナーゼの阻害について試験された合成ヒスチジン含有ペプチド （Ｎ−＞Ｃ）１、　Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ −ＨｉｒＡｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ２、Ｖａｌ−Ａｌａ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌ ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ３、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌ ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＧｌｒｒＨｉｓ−Ｓｅｔ−Ｇｌｎ ４、　Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａ ｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＨｉＳ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ５、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌ ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ６、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌ ａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇ１＋ｒＨｉｓ−Ｓｅｔ−Ｇｌｎ ７、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅ ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ８、Ｖａｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌ ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ ９、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｌ ａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ １０、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ ｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ １１、　Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ１２、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａ 　ｌ　−Ｍｅ　ｔ １３、Ａｌａ−Ａｌａ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−［１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔ ｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ １４、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａ　１　ａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｐｒ　ｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｙｓ１５、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ −ＡｒｒＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ １６、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ＬｙｒＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−＾５ ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ １７、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ１８、Ｇｌｕ −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ １９、Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔ ｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙ ｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｔｙ　ｒ　−Ｓｅ　ｒ−Ｌｅｕ ゼラチン酵素電気永動像 ストック溶液および下記混合操作を用いて、ゼラチン分解活性の目視のためのゼ ラチン酵素電気永動像が作成された。

ストック溶液　混　合　操　作 ａ）　２Ｍ　トリスＨＣＩ　ｄＨｚｏ　８００ｍ１中にトリス塩基２４２ｇをｐ Ｈ８，８入れ、濃塩酸でｐＨ８，８に調整し。

１１に希釈する。

ｂ）　０．５Ｍ　トリス　ｄＨｔＯ８０ｍ１中にトリス塩基６．０５ｇをｐＨ６ ，８入れ、濃塩酸でｐＨ６，８に調整し。

１００　ｍｌに希釈する。

ｃ）３０％アクリルア　アクリルアミド１００ｇにビスアクリミド＋０．８％ビ ス　ルアミド２．４ｇを加え、水を充分にアクリルアミド　加えてアクリルアミ ドを溶解する。

３３３ｍ１に希釈し、アルミホイール 被覆ボトル中４℃で貯蔵する。

ｄ）１０％ＳＤＳ　ＳＤＳ　１００ｇをｄＨ，０に溶解し、最終容量１１に希釈 する。

ｅ）　１０％過硫酸アン　過硫酸アンモニウム１ｇにｄＨ，０を加モニウム　え て最終容量１０ｍ１にする。４℃で貯蔵。

ｆ）　１０　ｘ電極緩衝　ｄＨｚｏ　６００ｍ１にグリシン１４４ｇを溶解液　 し、２ＭトリスＨＣ１，ｐＨ８，８，１２５ｍ１および１０％ＳＤ３１００ｍ１ を加える。最終容量ＩＩ！に希釈する。

ｇ）５ｘ試料緩衝液　０．５Ｍ　トリスＨＣ１，Ｉ）Ｈ６，８，２，５ｍｌにブ ロモフェノールブルー５０ｍｇを溶 解し、１０％ＳＤＳ　４ｍｌ、グリセロール２．５０１１を加え、４℃で貯蔵す る。

ｈ）　ＴＰ：ＭＥＤ Ｄ　１％ゼラチン　蛇口からの熱水流下で懸濁液を温めることによりｄＨＪ　１ ００ｍ１にゼラチンｌＰｔを溶解する。

ｊ）ゲル染色溶液　３０％メタノール、　１０％酢酸、０．１％アミドブラック １０ ｋ）脱染色溶液　３０％メタノール、　１０％酢酸０．１−の１０％ＳＤＳ 手順 この実施例のために使用するゼラチンのザイモグラム調製の手順は、下記の段階 と試薬を利用した。

１）ゲルを形成する装置を集める。

２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する：最終容積４０−の９％アクリル 了ミド：５０−のファルコン管に。

１２−の３０％アクリルアミド、０．８％ビスアク０．４−の１０％５ＤＳ ７．５−の２ＭＴｒ　ｉ　５Ｈｃ１．ｐＨ８，８４１ｎＩの１％ゼラチン １６ｍ１のｄＨ，Ｏを入れる。

３）混合後、０．４−の１０％過硫酸アンモニウムを添加し、再度混合する。

４）４０μｍのＴＥＭＥＤで重合を開始し、混合しそして３２−のゲル溶液をゲ ル整の中に注ぐ。

５）ブタノールで飽和した水で溶液の上を覆い２３０−４５分間重合させる。

６）重合の後、ゲルの表面をｄＨ，Ｏで洗浄し、乾燥する。

７）重合のために、ゲルの溶液を積層して準備する：最終容積１０１ｎｌの３％ アクリルアミド：１５ｒｌｄ！のファルコン管に。

２．５−の０．５ＭＴｒ　ｉ　５Ｈｃｉ、ｐＨ６，８にわたりまたは室温で一夜 にわたり保温する。

１．０−の３０％アクリルアミド、０，８％ビスアクリルアミド ０．１−の１０％過硫酸アンモニウム ５．３＋ｎＩのｄＨ２０ １７）保温期間後、０．１％のアミドブラック中で３０分間汚染し９次いで約９ ０分間にわたり脱汚染する。

１８）清浄になっている範囲は、ゼラチン分解活性に該当する。

塩酸を添加してｐＨを７．６に調製する。最終体積を１！にし、ろ過して殺菌す る。

１０ｘ細菌性コラゲナーゼ（陽性対照）を調製して。

最終濃度０．５％（ｗ　／　ｖ　）を得る。これは＋　１０　ｍ　ｇの細菌性の コラゲナーゼ（シグマ社製＃Ｃ−５１３８）を２ｄの１ｘコラゲナーゼ緩衝液に 溶解し、１００−のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｅ）にして−２０℃で貯蔵する ことを包含する。

ウシの血清アルブミン（輸送タンパク質）溶液を調製して１ｘコラ−ゲナーゼ緩 衝液中で０．５％（Ｗ　／　Ｖ　）の最終濃度にする。これは１００ｍｇのウシ 血清アルブミンを２０１ｎＩ！の１ｘコラゲナーゼ緩衝液に溶解し、１ｍｊの分 割したアリコートにして、−２０℃で保管する。

トリクロロ酢酸−タンニン酸−プロリン溶液（ＴＣＡＴＡＰ）を調製して、１０ ％ＴＣＡ、０．５％タンニン酸、２ｍＭプロリンの最終濃度にする。これは、１ ｏ−の１００％トリクロロ酢酸溶液、１０−の５％タンニン酸溶液モして１−の ２００ｍＭのプロリン液を合わせ。

１００−の最終容積に希釈し、４℃で保管し、そしてこの溶液を４週毎に取り替 えることを包含する。

手順 １、酵素試料活性化剤（通常は１ｍＭのｐＡＰＭＡ）と試験液を１．５ｍｌのエ ッペンドルフ管に入れる。合わせた容積は６０μｍでなければならない。必要な らばＩＸコラゲナーゼの緩衝液を添加する。必要ならば、山保末端配列（残基１ −１７．ＡＰＳ　Ｉ　ＩＫＦＰＧＤＶＡＰ温する。

２、”Ｈ−■Ｗコ５−’ｌ’：／　（ＮＥＮ＃ＮＥＴ−９３１０ット＃２５１１ −０１８）の貯蔵品をコラゲナーゼ緩衝液で１　二１２０に希釈することにより ■型のコラーゲン基質を製造する。５５℃に１ｏ分間加熱し、氷上冷却する。

８、希釈した”Ｈ−ＩＶ型コラーゲンの溶液の５μｍを。

各々の検定管に入れる。混合するために渦巻き、２８℃で４時間にわたり保温す る。

４、保温の終了時点で、輸送りＳＡの溶液の２μｍとＴＣＡＴＡＰの溶液を添加 する。渦巻きにして混合し。

少なくとも１０分間氷上に置く。

５、速度を６に設定して、１０分間にわたりミクロフーゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ）中で遠心分離することにより沈澱をベレット状にする。ペレットが位置がわか るように、試験管をミクロフーゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）に入れるときに方向付 けり、シンチレーシジン瓶中に入れる。５−のシンチレーション混合液（ｃｏｃ ｋｔａｉｌ）を添加し、よく振りそして計数する。

実施例　２ ペプチド阻害剤を含有するシスティン 単一特異性の抗体を製造において使用するために、Ａ２０５８メラノーマ細胞■ 型プロコラゲナーゼのアミノンまたは無関係のペプチドとの交叉反応性は示さな かっＫＴＤ）並びに内部領域（残基４７２−４９０．ＤＫＰＭＧＰＬＬＶＡＴＦ ＮＰＥＬＰＥＫ）（７）それを合成した。

これらは下記の理由で選択された。

酵素の直接の配列で得られる（コリール、１．Ｅ、。

た。アフィニティー精製抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ）は、■型プロコラゲナーゼを免疫沈澱する能力がある（ホウチャ、 Ｍ、、　タービン二一ミーフジャネン、Ｔ０．　ステツラーースチーブンソンＩ 　Ｗ＋ｌ　クル゛柱下ではコラーゲン分解の活性を示さなかった。ｐＡＰＭＡを 使用する保温により、酵素は活性化できた。コラゲナーゼ検定により測定された ようにｐＡＰＭＡを使用する前保温における活性化の時間経過は、完全なコラー ゲン分解活性が得られることを示している（図８）。

抗体Ａ４７２−４９０は、保温により、ゼラチンザイモグラム（図７）に示され たものに該当する時間依存の了し、９０分迄に実質的に完了するように見える。

アミノ末端エピトープに該当する抗体Ａｌ−１７は。

ｐＡＰＭＡ活性化の間のイミュノステイニング（ｉＨｕｎｏ−ｓｔａｉｎｉｎｇ ）に於ける直接の減少を示した。これらの結果は、有機水銀化合物を使用するこ とによる潜在型から安定な、活性のコラゲナーゼへの変換に従う明白な分子量の 減少は、アミノ末端ペプチド配列の欠失の結果であることを示している。

ゼラチン−・アフィニティ精製■型ブロフラケナーゼを。

ｐΔＰＭＡ活性化の前後両方の逆相ＨＰＬＣにより更に精製した。クロマトグラ ムは、潜在型または活性型保持時間に顕著な変化のないことを示した。ピークを 集め。

Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ＝　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅにより分析し７た時に、ｐＡ Ｐ　ＭＡ活性化に先立つプロコラゲナーゼのピークは、非還元条件下では約７０ １ｃ　Ｄ　ａダルトンに単一バンドを示した（図９．挿入）。ｐＡＰＭＡ活性化 （１６時間、３７℃）の後のコラゲナーゼのピークは２非運元条件下で速やかに 得られる。安定なより低分子量型への完全な変６２ｋＤａに単一のバンドを示し た（図３Ａ）。

ｐへＰＭＡ活性化の前のＨＰＬＣ上のプロコラゲナーゼのピークから得られる物 質を、直接のアミノ配列分析に処した。この物質はこの酵素のために前に決めた ものとは同一であるアミノ末端配列を与える（図９）。

ＨＰＬＣ精製後のｐＡＰＭＡ活性化物質の直接の配列分析は、単一の新規のアミ ノ末端配列を示している（図９）。

これは、ｐＡＰＭＡ活性化が約８ｋＤの分子量低下と共に起こる潜在的酵素から のアミノ末端ペプチド断片の自触媒的脱離を伴うことを決定的に示している。

この切断は単一の部位においてだけ起こる。というのは、精製、活性化した酵素 多数の試料の配列を分析しても、如何なる他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見出 されず、そしてウェスタンブロッティングまたはゼラチンザイモグラム分析によ って中間体の痕跡が見出されないからである。

この研究の結果は、■型コラゲナーゼは、コラーゲン分解活性を得る前に活性化 を必要とする潜在的酵素前駆体の聾で分泌されることを示している。有機水銀化 合物ｐＡＰＭＡにはこの活性化の能力がある。■型ブロコラゲナーぜの有機水銀 活性化は、酵素前駆体型の、アミノ末端からの８０（ＩＩのアミノ酸残基ペプチ ド断片の除去によるより低い分子量の活性化型への変換を伴う。

ｐ　Ａ　Ｐ　Ｍ　Ａに曝した後、最大のコラーゲン分解活性がＭ、、　コリニル ム、１．Ｅ、、クロンバーガー、Ａ、。

換に先立つこの活性への到達は、活性であるが不安定積である酵素前駆体におけ る構造転位と一致しており、これは間質コラゲナーゼとストロメライシン（ｓｔ ｒｏｍｅｌｙｓｊｎ）で報告されている通りである（ストリフリン、Ｇ、Ｐ、。

アイゼン、Ａ、Ｚ、、マーマー、　Ｂ、　１．、、グランド。

Ｇ、Ａ、、バイエル、Ｅ、、およびボルドバーブ、Ｇ。

Ｔ　、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、　８４．６７２５−６７２９； セン１人、Ｚ０．　マーマー、Ｂ、Ｌ、、グランド、Ｇ。

Ａ、、　ゼルツアー、Ｊ、Ｌ、、クローンバーガー、Ａ、。

Ｈｅ　−、Ｃ−＊　バラエル、Ｅ、Ａ、、およびゴールドバーブ。

Ｇ、１．、　１９８８．　Ｊ、鉦虹匹旦り旦ムロ５７９−６５８７　。

ウィルヘルム、Ｓ、Ｍ、、コリエルム、１．Ｅ、、クロンバーガー、Ａ９．　ア イゼン、Ａ、Ｚｌ　マーマー。

Ｂ、Ｌ、、グランド、Ｇ、Ａ、、バイエル、Ｅ、、およびボルドバーブ、　Ｇ、 Ｉ　、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔＪ、ｓ、Ａ、８４．６７２５−６７２９；サウア、Ｊ、、　キノネス、Ｓ０． 　オタニ、Ｙ、、　ナガセ、Ｈ９，ハリス、Ｅ　、　Ｄ　、、Ｊ　ｒ　１および クルキネン。

Ｍ、、１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２６３．６７４２−６７４５；ウ ィツトマン、Ｓ、Ｅ、、マーフィＩ　Ｇ　Ｈｌ　アンゲル。

Ｐ、、　ラームスフｔルフ、Ｈ，，−Ｊ、、スミス、Ｂ、Ｊ、。

リオンス、Ａ０．　ハリス、Ｔ、Ｊ、Ｔ、、レイノルズ、Ｊ、Ｊ、、　ヘルリッ ヒ、Ｐ２およびドチャーチ、Ａ、Ｊ。

Ｐ、、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０．９１３−９１６；サンチ ェスーロベツ、Ｒ０，ゲンセル、Ｍ、Ｃ，，マトリジアン、Ｌ、、　および　プ リートナツバ、Ｊ、プリートナツバ、Ｒ，、１９８８，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、２６３．　１１８９２−１１８９９：）。

これら酵素のアミノ起点のアミノ酸配列が最大の相同のために一直線になってい る場合（図１０）、二つの相関性が観察された。第一に、タイプＩＶコラーゲナ ーゼにおいてｐＡＰＭＡ　（結果として安定な活性酵素となる。）による活性化 の際のタンパク質自動分解の部位は、プロストロメリシン活性化および間質プロ コラ−ゲナーゼ活性化の主産生物について以前に報告されたのと同一の遺伝子座 にて発生する（ホイットマン　ニス、イー９、マーフィー　ジー９、エンジェル 　ビー０、ラーンスホルフエイチ、ジェイ０、スミス　ビー、ジエイ１、ライア ンス　エイ０、ハリス　ティ、ジエイ、ティ０、レイノルズ　ジエイ、ジェイ９ 、ヘルリッヒ　ビー、およびトチエリティ　エイ、ジエイ、ビー、　、１９８６ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ。

２４０　、９１３−９１６　；マーフィー　ジー０、コツケラト　エム、アイ０ 、ステフェン　ビー、イー１、スミス　ビー、ジエイ、およびトチエリティ　エ イ、ジェイ、ビー。

、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４８．２６５−２６８　）。ｐＡＰＭ Ａ処理に続（タンパク質自動分解の同様な部位はプロストロメリシンについて（ ウィルムへルム　ニス、エム０、コリエルム　アイ、イー１、クロンバーガー　 エイ０、アイゼンエイ、エイ０、マーマー　ビー、エル０、クランドジー、エイ ９、バウアー　イー、およびゴールドバークジ−。アイ、　、　１９８７、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

８４、６７２５−６７２９）および間質プロコラ−ゲナーゼについてマーマー　 ビー、エル０、ロスヴアイト　グプリュ、ティ、およびゴールドバーブ　ジー、 アイ、　、　１９８７、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２　、５８８６−５ ８８９　）の他文献により報告されている。第二に、すべて三つの酵素の活性化 の間に除かれるアミノ末端ペプチド断片は奇数個のシスティン残基な含む。タイ プＩＶプロコラーゲナーゼにおいて、三種のシスティン残基が除去されたペプチ ド断片の中に存在する；　Ｃｙｓ−３１、Ｃｙｓ−３６およびＣｙｓ−７３゜間 質プロコラ−ゲナーゼおよびプロストロメリシンにおいては、タイプＩＶプロコ ラーゲナーゼにおけるＣｙｓ−７３に相当する一個のシスティン残基が除去され たペプチド断片の中に存在する。

従って、潜伏メタロブロティナーゼにおける奇数個のシスティン残基からｐＡＰ ＭＡ活性化形態における偶数個のシスティン残基への変換はすべて三つの酵素に おいて共通の特徴であると思われる。不対システィンの除去は機能的に重大なも のであろう。最後に、すべて三つの酵素は高度保存領域をアミノ酸配列ＰＲＣＧ ＶＰＤＶよりなる活性化塵の直上流に含む。この配列は、間質コラ−ゲナーゼお よびストロメリシンのプロペプチドにおいて不対システィン残基（ホイットマン 　ニス、イー１、マーフィージー１、エンジェル　ビー５、ラーンスホルフ　エ イチ、ジエイ０、スミス　ビー、ジェイ０、ライアンス　エイ１、ハリス　ティ 、ジエイ、ティ１、レイノルズ　ジエイ、ジェイ５、ヘルリッヒ　ビー、および トチエリティ　エイ、ジエイ、ピー、　、　１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、 　２４０．９１３−９１６　）そして相同によりタイプＩＶコラーゲナーゼプロ ペプチドにおいて不対システィン（存在する三種以外のもの）を含む。最近の報 告は、ラット　トランシン（ｒａｔ　ｔｒａｎｓｉｎ）の部位特異的突然変異誘 発研究（ヒトストロメリシンの相同）により、このメクロブロティナーゼ族の自 動活性化におけるこの保存領域の重要性を示している。この配列において突然変 異を含む組換えトランシン形態は本来の配列と比較した場合より高速度の自発活 性化を示した（サンチェズーロペズ　アール０、ニコルソン　アール０、ゲンセ ル　エム。シー０、マトリシアン　エル、およびプリートナツバ　アール、　、 １９８８、プリートナツバ　アール、　、１９８８　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　２６３．１１８９２−１１８９９　）。

そこで、本発明者はタイプＩＶプロコラーゲナーゼ活性化遺伝子座に関連した多 くの小ペプチドをタイプＩＶコラーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力について試 験するためにゼラチンザイモグラム技術を使用した。図１１および図１２に示さ れるように、不対システィンを含む保存領域（ＰＲＣＧＶＰＤＶ）を組み入れた ペプチドのみが０．１ｍＭ未満の濃度にて強く抑制性であった。システィンは活 性を必要とした。表２は、インヒビター活性を保持する最小のペプチド配列は現 実にはペンタペプチド配列ＲＫＰＲＣであったことを示す。

タイプＩＶコラーゲナーゼの阻害のための最小ペプチド配列および必須配列 ペプチド＃　【泗　ｌ査（畠） ７４　ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮ　＋７８　ＴＭＲＫＰＲＳＧＮＰＤＶＡＮ 　−８２ＫＰＲＣＧ− ８５ＭＲＫＰＲＣＧ＋ ８６　ＫＰＲＣＧＮＰ− ８８ＲＫＰＲＣ＋ ９３　ＲＱＰＲＣ＋ ９４　ＲＫＡＲＣ＋ ９５　ＱＫＰＲＣ− １０１ＲＫＰＱＣ− １０６ＫＫＰＲＣ＋ １０７　ＲＫＰＫＣ＋ １０８　・ＲＫＬＲＣ＋ （１）阻害活性は、実施例１について記載されたゼラチンザイモグラム技術の変 法を用いて評価した。すべてのペプチドは１　ｍｇ／ｍＬの最終濃度にて試験し た。

さらに表２におけるデータは、ベブチ゛ドインヒビター活性は臨界のシステイニ ル残基をフランキングする特定の荷電配列要素を必要とすることを示す。明確に は、保存領域の二つのアルギニル残基は阻害活性について重大であると思われた 。これらの位置での極性不荷電残基との置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果と なった。しかしながら、これら二個のアルギニル残基の間のブロイル残基および リシル残基はグリシル残基と置き換わることができそしてこれらペプチドは阻害 活性を保持したであろう。このことは、この領域の局所配座にとって重要であり 得る（サンチェズーロベズ等、１９８８）ところのリシル残基およびブロイル残 基は阻害相互作用に直接には関与しないことを示唆する。

従ってタイプＩＶコラーゲナーゼのプロ酵素断片は、マトリックスメタロブロテ ィナーゼ族の他のメンバーにより分けられた保存領域を含む。この配列は活性化 されたクイブＩＶコラーゲナーゼを阻害することが可能である。

このインヒビター配列は、必須システイニル残基に関して位置−１および−４に て荷電された二個の陽性残基な含むところの特定のフランキングペプチド配列の 中に不対システイニル残基の存在を必要とする。このインヒビターによる酵素活 性の阻害は、酵素活性のための二つの要素、定まったペプチド配列の中に不対シ ステイニル残基な必要とする点において特異的であると思われる。

これらのデータは、プロ酵素断片の中に存在するところのＲＫＰＲＣ配列はシス テイニル残基と活性部位にて配位した金属原子との相互作用を通して酵素の内因 性インヒビターとして振舞うという新規な仮説を支持する。さらに、システイニ ル残基に隣接した位置でのアミノ酸置換はペプチドのタイプＩＶコラーゲナーゼ 活性を妨げる能力を廃止することができるので、不対システイニル残基を囲繞す る配列は、この阻害相互作用を促進すると思われる。

これらの結果は潜伏コラ−ゲナーゼ遺伝子族酵素の構造およびそれらの活性につ いて統一する仮説に統合することができる。ザイモゲン形態は酵素活性部位との 相互作用をして触媒的活性を阻止する保存配列ＭＲＫＰＲＣＧＮ　（Ｖ）ＰＤＶ を含むプロ酵素セグメントの結果である。この相互作用は亜鉛原子の配位を通し てシステイニル残基の不対スルフヒドリル側鎖により安定化される。従って、シ ステイニル残基−金属原子配位を妨げるところのすべての因子は結果としてプロ 酵素断片の酵素活性およびこれに続く自動触媒的除去に帰する。これは、金属原 子−スルフヒドリル配位のために直接競争する試薬、例えば有機水銀試薬により 成し遂げられる。また金属原子配位の崩壊に帰する臨界のシステイニル残基を囲 繞するプロ酵素断片の立体配座を妨げるところのカオトロピック因子によっても 成し遂げられよう。また非タンパク質分解組織活性物質例えば夕１′り一等、１ ９８１　（Ａｒｃｈｉｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２０８．４４０−４４３）により記載されたものは、これら の酵素を、申し述べたのとに同様の誘発配座転位の機構により活性化する。

本発明の別の好ましい態様は、タイプＩＶプロコラーゲナーゼ酵素のプロペプチ ド配列１−８０により具体化される。これは不対システィン残基を組み入れた内 因性インヒビター配列ＲＫＰＲＣを含む。加えて、この８ｏアミノ酸ペプチドの アミン末端は内部ジスルフィド結合を含み、そしてこのペプチドはまた腫瘍細胞 表面結合部位を含む。

８０ｍｅｒペプチドは、例えば、合成化学によりまたは組換え手段により作られ るが、従って少な（とも三つの理由のためにインヒビターとしての利点を有する 。第一に、その阻害活性は、阻害配列の二次構造が速やかに再生されるので、モ ルベースでペプチドよりも高くあり得る。

第二に組換え８０ｍｅｒタンパク質はアミノ起点でのジスルフィド結合の存在に よりより大きいインビボ安定性（より長い半減期）を有する。第三に、８０ｍｅ ｒは細胞結合部位を含むので、有害なタンパク質分解の出来事が起きる腫瘍細胞 の表面を標的とすることができる。図１３は、活性化の際ヒトタイプＩＶプロコ ラーゲナーゼから開裂するところのアミノ末端ペプチドの８０アミノ酸配列をエ ンコードするところのヒトタイプＩＶプロコラーゲナーゼについてヒトｃＤＮＡ クローンの部分のヌクレオチド配列を図示する。このヌクレオチド配列（または 普遍的遺伝子コードに従い同一のアミノ酸配列を特定するすべての他の配列）を 有するＤＮＡセグメントは種々の組換えタンパク質産生システムにおいてマトリ ックスメタロブロティ゛ナーゼのインヒビクーとしての用途のために８０ｍｅｒ を産生ずるために使用することができる。あるいは、このヌクレオチド配列を有 するＤＮＡセグメントは、ヒトゲノムに由来するが、咄乳動物の中に組換え表現 ベクターの部分としてマトリックスメタロブロティナーゼの８０ｍａｒインヒビ インヒビクー内部遺伝子源を産生ずるために配することができる。

亙迭 虱１方恭 ヒトＡ２０５ｇ黒色腫細胞を、１０％ウシ胎児血清を入れたＤＭＥＭ中において ８０％集密にまで増殖した。その後培地を血清の含まないＤＭＥＭと置き換えそ して培養を２４時間続行した。血清の含まないならし培地を集めそして、−２０ ’Ｃでの貯蔵の前に超濾過（Ａｍｉｃｏｎ　ＹＭ　３０　ｍｅｍｂｒａｎｅ）に より濃縮した。

タイプＩＶプロコラーゲナーゼの　１ タイプＩＶプロコラ−ゲナーゼをヒトＡ２０５８黒色腫細胞濃縮ならし培地から 直接、０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　、０．００５　ＭＣａＣｌｚ　、’　 ０．５　Ｍ　ＮａＣ１，０，０２％Ｂｒ１ｊ　３５　（Ｓｉｇｍａ）を含むｐＨ ７，６緩衝液（ＴＣＳ　ｂｕｆｆｅｒｊ中のゼラチン−セファロース（Ｓｉｇｍ ａ）アフィニティクロマトグラフィにより精製した。　０．０２％Ｂｒ１ｊと７ ％ジメチルスルホキシドとを含むＴＣＳ緩衝液を使用して酵素を溶離した。その 後試料を濃縮しそして同じ緩衝液中で一７０℃にて使用するまで保存した。さら にタイプＩＶプロコラーゲナーゼをアミノ酸配列分析の前に、０．１％トリフル オロ酢酸中で平衡にされた０、４６　ｘ　１０ｃｍ　ＲＰ　３００カラム（Ｐｉ ｅｒｃｅ　Ｃｏ、製）を備えたＤｉｏｎｅｘ　Ａ　１４００　ｓｙｓｔｅｍで逆 相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは６０％アセトニトリルに対して線形勾配と なるように溶離した。

Ａ　ペプチドに・　る　の１゛告 免疫感作において使用されたペプチドをＢｉｏｓｅａｒｃｈ９６００　ｐｅｐｔ ｉｄｅ　５ｙｎｔ、ｈｅｓｉｚｅｒにより合成した。抗体を実施例３に記載した ように製造しそして精製した。抗体製剤は図３に示すように市販のＥＬＩＳＡキ ット（Ｋｊ、ｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）　Ｉｍｍｕｌｏｎ　２プレート　（Ｄｙｎａｔｅａｈ、　Ｉｎｃ、　）を使用 してＥＬＩＳＡにより特徴付けた。

１１水里豆Ｊ擾クイブＩＶス旦ユラーゲナ−埜Δ孟二孔０．０５　Ｎ　ＮａＯＨ 中の０．０１　Ｍ　ｐ−ＡＰＭＡの貯蔵溶液を毎日新たに製造した。プロ酵素試 料を最終濃度０．５または１．０ｍＭ　ｐ−ＡＰＭＡで時間を変えて（０−１６ 時間）３７℃にてインッキュベートした。インキュベーションに続いて、試料を 直接、０．１％ゼラチンを含む９％ア′クリルアミドゲル−７ヒでＮａＤｏｄＳ Ｏ４−ＰＡＧＥにより分析した（ゼラチンザイモグラム）。あるいは、試料を９ ％ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡ、ＧＥ上で走査しそしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　ｍ ｅｔｎｂｒａｎｅｓ　（Ｍｉｌ、１ｉｐｏｒｅ）の上に電気的に斑点付けした。

。 タイプＴＶコラー：盈−Ｚ立■話上辺３逝タイプＩＶコラ−ゲナーゼ活性を実施 例１に記載されているように阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した基質は ３Ｈ−プロピニル化ヒトタイプＩＶコラーゲン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅａｒｌである。反応は２８℃にて４ないし１６時間の間貸なった。

実施例３ アミン末端（残部１−１７）からカルボキシ末端（残部４７２−４９０）近傍の 内部領域に伸びるタイプ■プロコラーゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチ ド（図１１表３）は、本来のタイプ■プロコラーゲナーゼに対してそれらの個々 の領域を認識した親和性精製ポリクローナル抗体を生ずる抗原として使用された 。

表３ １０．　Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｍｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔ’ｒｐ−Ｇｌｕ− Ｈｉｓ−Ｇｌｙｉｌ、　Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕ−Ｔｈｒ−人１ａ１２、　Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−人ｓｎ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ１ｍ１４、Ｖａｎ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｌｇ−λｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ｇｉｎ １５、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ固相合成ペプチドに結合した抗体は液相 ペプチドにより競合される可能性があるということを示すために酵素結合イムノ ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が使用すれ、そして各々の親和性精製抗体は 単一特異性であった（図３）。育種水銀活性法の経時的なウェスターンイムノブ ロッティング研究は、抗体は精製形態における、又は培養液中で腫瘍細胞により 隠された蛋白質の複合混合物中の、固相酵素を認識したということを示した（図 ３）。ウェスターンブロッティングは、低分子量形態への変換中のアミノ末端領 域（残部１−８０）の直接的損失も示した（図７）。それ故、最初の１−８ｏア ミノ末末端部中のペプチド領域を認識する抗体は、酵素の活性形態から潜伏体を 区別するために使用することができる。

表８中・′のペプチドを認識する抗体は、ヒト血清及びヒト尿中のタイプ■コラ ーゲナーゼ抗体を検出するための固相又は液相直接又は競合イムノアッセイにお いて有用であることが示された。その様な抗体アッセイは、局部又は転移′癌の 診断のために有用である。抗−ペプチド抗体は、ｉ！疫組織学によるヒト結腸癌 の診断のために有用であるこ、とも示された（表４）。

表４１は、表３のペプチドを指示する抗体は悪性腫瘍細胞に結合した酵素抗原を 同定するために使用することができるということを示すヒト結腸癌例における免 疫組織学例の要約である。

表４ タイプ■コラーゲナーゼの免疫学的活性抗ペプチド抗体 組織　正／全体 正常胃粘膜　０／２０ 胃癌 粘膜に限定　１８／２０’ 粘膜下に侵入　２０／２０” 全厚に侵入　２０／２０” 正常結腸直腸粘膜　０／１０ 腫瘍性の結腸ポリブ　１／１゜ 結腸直腸癌 粘膜に限定　１／１０” 粘膜下に侵入　８／１０” 全厚に侵入　１Ｂ／２０”” １０−３０％腫瘍細胞活性 ”’　５０−８０％腫瘍細胞活性 蛋白質ペプチドの合成は、標準メリフィールド固相ペプチド抱合体を使用して、 バイオサーチモデル９６００ペプチド合成装置により行った。合成された最初の 配列は、図１に示す様にヒトタイプ■コラーゲナーゼにおける残部３７１−３８ ６に正確に相当するＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱであった。３個のＨｉｓ 残部及び２個のＧｌｕ残部はＡｌａ残部を用いた種々の組み合わせで置換され、 そしてタイプ■コラーゲナーゼに関するこの置換、の効果及びザイモグラムゲラ チナーゼ活性が検討抗ペプチド抗体の調製は、下記工程を用いた。

ＢＳＡに対するペプチドの結合：ペプチド抗原性を形成するために、ＢＳＡ又は 他の抗原性蛋白質に共有結合的に結合させなければならない。ペプチド２ｍｇに ＰＢＳｌｍｌを加え、次いでＢＳＡ６ｍｇにＰＢＳ４ｍｌを加える。これらの溶 液を混合し、次いで０．２５％グルタルアルデヒド溶液５ｍｌをこの混合物に加 える。この結果得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで室温で一晩ＰＢＳ　 １リツトルにより透析した。翌日、この溶液を６ｍｌに濃縮し、次いで免疫化の ために１ｍｌアリコツトに分けた。

ラビットの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保するため、全ての免疫化は 完全フロインドアジュバントを使用して行うべきである。最初の２回の注射のた めに、ＢＳＡ−ペプチド抱合体１ｍｌ及びＣＦＡｌｍｌを乳化し、次いで２匹の ラビットの背中の約３０箇所に乳化剤１ｍｌを用いて皮下注射する。第二の注射 後、抱合体溶液０．５ｍｌをＰＢＳｏ、５ｍｌを用いて希釈して乳化剤を調製す る。免疫化は２週間ごとに行う；採血は免疫化の前、及び第三又は第四の注射を 始めるまでの注射の間の週に行う。

ペプチド抗体親和性樹脂の調製ニー反抗ペプチド抗体血清が使用可能となれば、 次工程は親和性精製工程を行うためのものである。第一工程において、ペプチド 抗体親和性樹脂を調製する。アフィーゲル１０（バイオラッド株式会社）約１０ −１２ｍ１を、冷ＰＢ３４０ｍｌを用いて３回素早（洗浄し、次いで袴ＰＢＳに 再懸濁して全容量約２０ｍ１を得る。同時に、ペプチド２ｍｇをＰＢＳｌｍｌに 溶解し、次いで中程度に攪拌しながらアフィーゲル懸濁液に加える。この結果得 られた混合物を冷却状態で一晩穏やかに攪拌する。翌日、０．２Ｍ溶液をｙ４！ ！ｉ！するために充分なＩＭＦリスＨＣＩ　（ｐＨ８，（１）を加え、次いでこ のゲルを冷却状態で更に４時間撹拌する。このゲルは、ＰＢ８４０ｍｌを用いて ３回洗浄後は抗体吸着が容易である。

担体の親和性精製：担体含有血清を３０分間５６°Ｃに加熱し、冷却し、次いで ペプチド樹脂（これは、予め準備され、且つ注入された過剰のＰ’ＢＳを含んで いた）と混合する。冷却状態で一晩穏やかに攪拌後、ゲル懸濁液をカラムに注入 し、次いで冷ＩＭ酢酸をゲル容積の２倍用い、続いてＰＢＳをゲル容積の１倍用 いて洗浄する。

抗体溶出液を６　Ｎ　Ｎ　ａ　ＯＨを用いて約ｐＨ７，０に調整し、次いでこの 結果得られた溶液を約５ｍｌにダイアフロ（ＹＭ−３０）濃縮し、緩衝液をＰＢ Ｓに変える。

樹脂への抗体のカップ９２１２１時間前にのみトリスを反応を停止させるために 加え、次いで未使用の活性サイトを封止することにより抗体のカップリングを進 めること以外は、手順は上記と全く同一である。

イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセイ、ウェスターンブロッティ ング研究、及び免疫組織学は、標準的な慣用法を使用して行った。

上記の如く選択され次いで精製されたペプチドに対するポリクローナル又はモノ クローナル抗体は、慣用の方法により適する放射性酵素又は蛍光標識を用いて標 識化することが可能であり、これは当業者には明らかであろう。本文中に記載さ れたペプチド及び抗体を用いる免疫学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し且 つ非標識化、結合性又は非結合性抗体又はペプチドの手段を用いることにより、 体液、組織抽出物又は組織部分を包含する何れかのタイプの生物学的試料に対し て適用することができる。抗体又はペプチドは、適する同相例えば支持体例えば ミクロ滴定ウェルに結合させることができる。タイプ■コラーゲナーゼのための 前記抗ペプチド抗体は、自然の全酵素に対して作られた抗体を上回る充分な利点 を有する（トリッグヴアソン、ケイ、及びリオッタ、エル。

エイ、アメリカ合衆国特許第４６７７０５８号）。第一に、それらはタイプ■コ ラーゲナーゼ（これは、他の広く用いられているメタロプロティナーゼと同族で はない）に特有の特定領域を認識する。こ第１は非自明のことであり、且つタイ プ■コラーゲナーゼのアミノ酸配列の大部分は図２に示される様に他のメタロプ ロティナーゼと非常に同族的であるか又は同一でさえあるどうことに関する多く の問題を克服する。抗体は表３のペプチドに対して他のメタロプロテイナーゼか ら異なるタイプ■コラーゲナーゼを作り、且つ更に潜酵素により異なって活性化 され得る。この後者の特徴は、活性化酵素に対する潜伏体の比率が病気の診断又 は予後における決定因子である場合に病的状態が存在し得るので非常に重要であ る。

前述の発明において、明確性及び理解の目的のために幾つかの細部が述べられた 。形態及び細部についての種々の変化及び組み合わせが、本発明の範囲から離れ ることなく成し得るということも当業者には自明であろう。

特に、本文中に記載されたペプチド抑制剤の側面配列における変性はメクロプロ テイナーゼ類の個々の構成具に対する安定性、活性又は特異性を変え得るという ことは当業者には自明である。例えば、図１０に示される活性化結合開裂サイト の左側に対する特定配列の選択は、タイプ■コラーゲナーゼに比べてストロメリ シン又はタイプＩシラーゲナーゼを好ましく抑制するための抑制剤を生じさせ得 る。これは、前記配列のこの領域は異なるマトリックスメタロプロテイナーゼタ イプの間で幾つかの変異性を示すからである。非臨界領域におけるアミノ酸の一 定置換基の選択は、ペプチドの抑制性を充分には変えないであろうということも 更に明らかである。マトリックスメタロプロテイナーゼに対して特異的な抗体の ための免疫原又は抗原として使用すべき合成ペプチドの場合において、当業者は 抗体結合サイドによる認識表現における特異的アミノ酸配列は、４ないし６個の アミノ酸〔これは、抗体を使用すべき環境（例えば、人間の生物学的検体）にお いて他の蛋白質中に存在することは知られていない〕の配列からなるということ を理解するであろう。最後に、組み換え蛋白質ペプチドは自然のペプチド又は合 成ペプチドに比べて活性を有し得るということは従来技術においで知られている 。本発明の態様は、それ故明らかな如く、合成ペプチド化学により適する発現ベ クター中に具合良く挿入された適り゛るＤＮＡセグメント又は利用し得る自然源 からの単離物を使用して調製された。幾つかの場合には、本発明のペプチドは、 従来技術において良く知られている標準法の変法に基づいて精製し得る。

ネ　＊　＊ 背景の記載及び本開示を完全にする目的で、本明細書においで今までに確認した 出版物、特許及び特許願の各々は、それ故参考文献として本明細書に加入されて いる。

■型コラーゲナーゼ 基質結合競合 Ｍｔ合■’ＪＩＨラーゲナーゼ（ｎｇ）　ＦＩＧ、４ＡＭＢＣ合成ペプチド阻害 剤 ゼラチンチモグラ４１ＭＧ／ＭＬ　ＩＨＲ非活性ペプチド０３日　活性ペプチド ０２６Ｆ７Ｇ、　５ 結合■型コラーゲナーゼ（ｃｐｍ） ■型コラーゲナーゼ活性（％）口 潜在　：ＡＰＳＰＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰ活性化　：ＹＮＦＦＰＲＫＰＫＷＤＫＮ ＱＷＭＡＢ ＦＩＧ、　９ ■型コラーゲナーゼ活性（％最大） Ｑ　−Φ　ト　０△ ←シ　（声　＜：ｔ　（２（− ロ　←　（り＜ −〇　（Φ　０ くロ　１−一　←−＜　Ｏ（Ｊ　＜ Φ　←　”　Ｃ−Ｉ　ＣＤ ＣＪ　ＣＪ　υ　−− 〇こ　（Ｚ　（口 Ｑ　＜　。　巳−くロ　ｔつ Φ　ｍ− 望 ン 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、国際出願番号　ＰＣＴ／Ｕ Ｓ　９０１０１０６０２、発明の名称 マトリックスメタロプロティナーゼペプチド：診断および治療における役割 ３、特許出願人　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東京都千代田区神田駿河台１の６お茶の水スクエア　Ｂ館　電話（２９１ ）９７２１〜４５、補正書の提出年月日 １９９０年１月２３日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 請求の範囲 １、式ａａＩ　ａａ２　ａａｓ−ａａ４　Ｃ（ａａ、はＲ及びＫからなる基から 選ばれた塩基性アミノ酸；ａａ２はに、Ｑ及びＮからなる基から選ばれた極性ア ミノ酸；ａａｌはＰ、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｉ及びＶからなる基から選ばれた無極性アミ ノ酸：ａａ４はＲまたはＫからなる基から選ばれた塩基性アミノ酸；そしてＣは 遊離スルフヒドリル基を有するシスティンである）有するアミノ酸配列から本質 的になり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する能力をさらに有す る実質的に純粋なペプチド。

２、アミノ酸配列がＲＫＰＲＣである請求項１記載のペプチド。

３、アミ、ノ酸配列がＲＱＰＲＣ，ＲＫＡＲＣ，ＫＫＰＲＣ，ＲＫＰＫＣおよび ＲＫＬＲＣからなる基から選ばれた請求項１記載のペプチド。

４、ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮおよびＭＲＫＰＲＣＧからなる群から選ばれ たアミノ酸配列から本質的になり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼを阻 害する能力をさらに有する実質的に純粋なペプチド。

５、腫瘍細胞に特異的な結合部位を有し、アミノ酸配列ＡＰＳＰ　Ｉ　Ｉ　ＫＦ ＰＧＤＶＡＰＫＴＤＫＥＬＡＶＱＹＬＮＴＦＹＧＣＰＫＥＳＣＮＬＦＶＬＫＤＴ ＬＫＫＭＱＫＦＦＧＬＰＱＴＧＤＬＤＱＮＴ　Ｉ　ＥＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶ ＡＮＹＮＦＦＰから本質的になり、かっマトリックスメタロブロティナーゼを阻 害する能力をさらに有する実質的に純粋なペプチド。

６、アミノ酸配列ＡＡＨＥまたはアミノ酸配列ＶＡＨＥから本質的になり、かつ マトリックスメタロブロティナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋 なペプチド。

７、マトリックスメタロブロティナーゼを阻害する能力を有し、ＶＡＡＨＥＦＧ ＨＡＭＧＬＥＨ３Ｑ。

ＶＡＡＨＥＦＧＡ人ＭＧＬＥＨ３Ｑ。

ＶＡＡ、ＨＥＬＧＨ３ＬＧＬＳＨ３Ｔ。

ＶＡＡＨＥ　ＩＧＨ３ＬＧＬＦＨＳＡ。

ｖｖ人ＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびＡＡＨＥＥ　Ｉ　ＣＴＴＮＥＧＶＭか ラナル群カラ選ハしたアミノ酸配列から本質的になる実質的に純粋なペプチド。

８、図１に示されたアミノ酸残基２００〜３７０に相当するアミノ酸配列から本 質的になり、かつマトリックスメタロプロティナーゼを阻害する能力をさらに有 する実質的に純粋なペプチド。

９、請求項１ないし３のいずれかに記載されたペプチドの投与に応じて引き出さ れた抗体。

１０、請求項４記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。

１１、請求項５記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。

１２ｙ請求項６記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。

１３、請求項７記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。

１４、請求項８記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。

１５、マトリックスメタロブロティナーゼを阻害するために有効な量の請求項１ ないし５のいずれかに記載されたペプチド、および製薬的に許容可能な担体を含 有する製薬組成物。

１６、吸入用に製剤化された請求項１５記載の組成物。

１７、凍結乾燥された粉末である請求項１５記載の組成物。

１８、経口または舌下投与に適する包接錯体である請求項１５記載の組成物。

１９、マトリックスメタロブロティナーゼを阻害するために有効な量の請求項６ および７のいずれかに記載されたペプチド、および製薬的に許容可能な担体を含 有する製薬組成物。

２０、マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するために有効な量の請求項８ に記載されたペプチド、および製薬的に許容可能な担体を含有する製薬組成物。

２１、請求項１のペプチド、またはそれらの変異体をコード化する単離されたＤ ＮＡ配列。

２２、請求項２１記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。

請求項８３記載の形質転換された微生物宿主を培養し、２３、請求項２２記載の ベクターにより形質転換される微生物宿主。

２４、請求項１記載のペプチドの発現に適当な条件下で請求項２３記載の形質転 換された微生物宿主を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請求項 １記載のペプチド製造方法。

２５、請求項２４記載の方法により製造される請求項１記載のペプチド。

２６、請求項４のペプチド、またはそれらの変異体をコード化する単離されたＤ ＮＡ配列。

２７、請求項２６記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。

２８、請求項２７記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。

２９、請求項４記載のペプチドの発現に適当な条件下で請求項２８記載の形質転 換された微生物宿主を培養し、そして該ペプチドを回収することからなる請求項 ４記載のペプチド製造方法。

３０、請求項２９記載の方法により製造される請求項４記載のペプチド。

３１、請求項５のペプチド、またはそれらの変異体をコード化する単離されたＤ ＮＡ配列。

８２、請求項３１記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。

３３、請求項８２記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。

３４、請求項５記載のペプチドの発現に適当な条件下で４５、請求項４４記載の 方法により製造される請求項７そして該ペプチドを回収することからなる請求項 ５記載のペプチド製造方法。

３５、請求項３４記載の方法により製造される請求項５記載のペプチド。

記載のペプチド。

４６、請求項８のペプチド、またはそれらの変異体をコード化する単離されたＤ ＮＡ配列。

４７、請求項４６記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。

５５、変性過程が呼吸器系で生じ、そしてマトリックスメタロプロティナーゼ阻 害組成物が吸入により投与される請求項５３記載の方法。

５６、マトリックスメタロブロティナーゼ阻害組成物が静脈注射で投与される請 求項５８記載の方法。

５７、請求項１記載のペプチドのマトリックスメタロブロティナーゼ阻害量の投 与からなる哺乳動物におけるマトリックスメタロブロティナーゼの阻害方法にお いて、マトリックスメタロブロティナーゼ阻害ペプチドは請求項２２記載のベク ターを投与することにより投与され、該ベクターはペプチドを作るために発現す るすることからなる方法。

５８、請求項５記載のペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量の投 与からなる哺乳動物におけるマトリックスメタロブロティナーゼの阻害方法にお いて、マトリックスメタロブロティナーゼ阻害ペプチドは請求項３２記載のベク ターを投与することにより投与され、該ベクターはペプチドを作るために発現す ることからなる方法。

５９、請求項１５．１９および２ｏのいずれかに記載された組成物のマトリック スメタロブロティナーゼ阻害量を、哺乳動物のマトリックスメタロブロティナー ゼ阻害方法において使用する方法。

６０、請求項１５．１９および２０のいずれかに記載された組成物のマトリック スメタロブロティナーゼ阻害量を、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性か ら起きた変成過程のために哺乳動物を処理する方法において使用する方法。

６１、マトリックスメタロブロティナーゼ阻害組成物が舌下または経口で投与さ れる請求項６０記載の方法。

６２、変性過程が呼吸器系で生じ、そしてマトリックスメタロプロテイナーゼ阻 害組成物が吸入により投与される請求項６０記載の方法。

６３、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害組成物が静脈注射で投与される請 求項６０記載の方法。

６４、請求項２２記載のベクターを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害方法において請求項１記載のペプチド のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量を、使用する方法であって、該ベク ターはマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害ペプチドを作るために発現するも のであることを特徴とする方法。

６５、請求項３２記載のベクターを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害方法において請求項５記載のペプチド のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量を、使用する方法であって、該ベク ターはマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害ペプチドを作るために発現するも のであることを特徴とする方法。

悶瞭調査報告 ：１頁の続き ［相］Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　９１９９０年 ２月に日［相］米国（Ｕ　Ｓ　）＠４８８，４６０発　明　者　ステットラーー ステイーブンソ　アメリカ合衆国、メン、ウィリアム　イト　バーン　コー 発　明　者　クルツシュ、ヘンリー　アメリカ合衆国、メライブ　９７０４ 特表千４−５０１４２３　（２３） しり一ランド　２０８７９．ゲイザースバーグ、ホワ−＝）　１４２２７ しり一ランド　２０８１７．ベテスダ、デボール　ド

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．式ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−Ｃ（ａａ１はＲ及びＫからなる基から 選ばれた塩基性アミノ酸；ａａ２はＫ，Ｑ及びＮからなる基から選ばれた極性ア ミノ酸；ａａ，はＰ，Ａ，Ｇ，Ｌ，１及びＶからなる基から選ばれた無極性アミ ノ酸；ａａ４はＲまたはＫからなる基から選ばれた塩基性アミノ酸；そしてＣは 遊離スルフヒドリル基を有するシステインである）を有するアミノ酸配列から本 質的になり、かつマトリックスメタロプロティナーゼを阻害する能力をさらに有 するペプチド。
2. ２．アミノ酸配列がＲＫＰＲＣである請求項１記載のペプチド。
3. ３．アミノ酸配列が【配列があります】およびＲＫＬＲＣからなる基から選ばれ た請求項１記載のペプチド。
4. ４．アミノ酸配列の少なくとも１個の独特な部分【配列があります】を有するマ トリックスメタロプロティナーゼを阻害する精製されたペプチド。
5. ５．腫瘍細胞に特異的な結合部位を有する請求項４記載のペプチド。
6. ６．少なくとも５個のアミノ酸を有する請求項４記載のペプチド。
7. ７．アミノ酸配列ＡＡＨＥまたはアミノ酸配列ＶＡＨＥから本質的になり、かつ マトリックスメタロプロティナーゼを阻害する能力を更に有するペプチド。
8. ８．【配列があります】および ＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭからなる基から選ばれたアミノ酸配列を有する請 求項７記載のペプチド。
9. ９．製薬的に許容可能な担体中でマトリックスメタロプロティナーゼを阻害する ために十分な量の請求項１または請求項４記載のペプチドを有する物質の組成物 。
10. １０．吸入用に製剤化された請求項９記載の組成物。
11. １１．凍結乾燥された粉末である請求項９記載の組成物。
12. １２．口内または舌下投与に適合する包接錯体である請求項９記載の組成物。
13. １３．ペプチドが活性メタロプロティナーゼか、または活性メタロプロティナー ゼを作るためにチモーゲンからわかれたプロ配列のどちらも含有しないという条 件で、マトリックスメタロプロテイナーゼチモーゲン分子の独特な部位のアミノ 酸配列を含有する精製されたペプチド。
14. １４．マトリックスメタロプロテイナーゼチモーゲン分子の配列番号１ないし１ ７の範囲内で見出される少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する請 求項１３記載のペプチド。
15. １５．アミノ酸配列ＡＰＳＰＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰＫＴＤを有する請求項１４記 載のペプチド。
16. １６．マトリックスメタロプロテイナーゼチモーゲン分子の配列番号４７２ない し４９０の範囲内で見出される少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含有 する請求項１３記載のペプチド。
17. １７．アミノ酸配列ＤＫＰＭＧＰＬＬＶＡＴＦＮＰＥＬＰＥＫを有する請求項１ ６記載のペプチド。
18. １８．請求項１３記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。
19. １９．マトリックスメタロプロティナーゼを阻害する能力を有する請求項１８記 載の抗体。
20. ２０．請求項１４記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。
21. ２１．請求項１５記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。
22. ２２．請求項１６記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。
23. ２３．請求項１７記載のペプチドの投与に応じて引き出された抗体。
24. ２４．製薬的に許容可能な担体と一緒に免疫応答を引き出すため十分な量で、請 求項１３記載ペプチドを含有する物質の組成物。
25. ２５．ペプチドが免疫担体プロテインに共有結合されている請求項２４記載の物 質の組成物。
26. ２６．固体担体と結び付いた請求項１８記載の抗体を含有する物質の組成物。
27. ２７．製薬的に許容可能な担体中でマトリックスメタロプロティナーゼを阻害す るために十分な量で請求項１９記載の抗体を含有する物質の組成物。
28. ２８．固体担体と結び付いた少なくとも１個の請求項１８記載の抗体である物質 の組成物。
29. ２９．固体担体がマイクロタイタープレートである請求項２８記載の物質の組成 物。
30. ３０．セグメントが請求項１記載のペプチドをコード化するＤＮＡセグメント。
31. ３１．図１３に示されたヌクレオチド配列、またはそれらの独特な部分を有する 請求項２７記載のＤＮＡセグメント。
32. ３２．請求項３０記載のＤＮＡセグメント、及びベクターを含有する組み換えＤ ＮＡ分子。
33. ３３．請求項３２記載の組み換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞の培養。
34. ３４．請求項９記載の組成物のマトリックスメタロプロティナーゼ阻害量の投与 からなる哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼを阻害する方法。
35. ３５．請求項９記載の組成物のマトリックスメタロプロティナーゼ阻害量の投与 からなるマトリックスメタロプロティナーゼの活性から起きる変質過程のために 哺乳動物を処理する方法。
36. ３６．マトリックスメタロプロティナーゼ阻害組成物が舌下または口内で投与さ れる請求項３５記載の方法。
37. ３７．変性過程が呼吸器系で生じ、そしてマトリックスメタロプロティナーゼ阻 害組成物が吸入により投与される請求項３５記載の方法。
38. ３８．マトリックスメタロプロティナーゼ阻害組成物が静脈注射で投与される請 求項３５記載の方法。
39. ３９．請求項１または請求項４記載のペプチドのマトリックスメタロプロティナ ーゼ阻害量の投与からなる哺乳動物におけるマトリックスメタロプロティナーゼ の阻害方法において、マトリックスメタロプロティナーゼ阻害ペプチドは請求項 ３０記載の組み換えＤＮＡ分子の投与することにより投与され、該ＤＮＡ分子は 前記ペプチドを作るために発現することからなる方法。
40. ４０．セグメントが請求項４記載のペプチドをコード化するＤＮＡセグメント。