JPH09268148A - 新規物質ｅｇｆ−２４７７類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 優れた細胞増殖抑制作用を有する新規生理活
性物質を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ） （式中、Ｒ¹ およびＲ² は一方がヒドロキシを他方が水
素を表すか、Ｒ¹ およびＲ² が一緒になって酸素を表
す。）で表され、細胞増殖抑制作用を有する新規化合物
ＥＧＦ−２４７７類。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞増殖抑制剤と
して有用な新規化合物ＥＧＦ−２４７７類に関する。

【０００２】

【従来の技術】ナフタレン骨格を有する化合物として
は、ナフタレングルコシドラクトン(Naphtalene glucos
ide lactone)[ ファイトケミストリー(Phytochemistr
y), 30, 4193 (1991)]やジアネリジン(Dianellidine)
[オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー
(Aust. J. Chem.), 14, 637 (1961)]などが知られてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、優れ
た細胞増殖抑制作用を有する化合物を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）

【０００５】

【化２】

【０００６】（式中、Ｒ¹ およびＲ² は一方がヒドロキ
シを他方が水素を表すか、Ｒ¹ およびＲ² が一緒になっ
て酸素を表す。）で表され、細胞増殖抑制作用を有する
新規物質ＥＧＦ−２４７７類が提供される。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
式（Ｉ）で表される化合物の具体例としては、Ｒ¹ およ
びＲ² の一方がヒドロキシを他方が水素を表す化合物
（以下、ＥＧＦ−２４７７−１という）、Ｒ¹ およびＲ
² が一緒になって酸素を表す化合物（以下、ＥＧＦ−２
４７７−２という）などが例示される。また、これらの
化合物をＥＧＦ−２４７７類と総称する。ＥＧＦ−２４
７７類の理化学的性質は以下に示すとおりである。

【０００８】なお、以下のデータは下記の機器により測
定した。 質量分析：日本電子 JMS HX/HX110A 質量分析装置 紫外吸収スペクトル：島津製作所 UV-2200 分光光度計 赤外吸収スペクトル：日本電子 JIR-RFX3001 赤外線分
光光度計 核磁気共鳴スペクトル：日本電子 α400 核磁気共鳴装
置 Bruker AM500 核磁気共鳴装置 旋光度：日本分光工業 DIP-370 型デジタル旋光計

【０００９】ＥＧＦ−２４７７−１の理化学的性質 性状：黒色油状固体 比旋光度：[α]_D ²⁴ = -62°（c =0.018, CH₃OH ） 紫外部吸収スペクトル：λ_max(CH₃OH) nm (ε) 335
(6,600), 321 (5,600), 306 (5,300), 229 (36,200)；1
N HCl添加で変化無し；1N NaOH添加時 345 (9,500), 3
31 (8,000), 230 (30,500) 赤外部吸収スペクトル：ν_max(KBr) cm^-1 3700-2400,
3365, 1637, 1614, 1581, 1394, 1375, 1304, 1061, 1
045, 933, 827, 758 FABマススペクトル： m/z 218 M⁺ 高分解能 FABマススペクトル： m/z 218.0934 M⁺, Δ
-0.9 mmu （ C₁₃H₁₄O₃として）¹ H NMR スペクトル（400MHz, CD₃OD）：δ ppm（積分,
多重度, 結合定数 J(Hz)） 7.18 (1H, m), 7.18 (1H, m), 7.08 (1H, m), 6.63 (1
H, m), 6.61 (1H, d, 1.5), 4.02 (1H, tq, 6.6, 6.
4), 2.83 (1H, dd, 13.3, 6.6), 2.67 (1H, dd, 13.3,
6.6), 1.16 (3H, d, 6.4)¹³ C NMR スペクトル（100MHz, CD₃OD）：δ ppm（多重
度） 155.31 (s), 155.19 (s), 139.07 (s), 138.48 (s), 12
7.73 (d), 120.40 (d),120.04 (d), 114.74 (s), 111.2
0 (d), 108.80 (d), 69.58 (d), 46.75 (t), 22.99(q)

【００１０】ＥＧＦ−２４７７−２の理化学的性質 性状：黒色不定形固体 融点：82.0〜 83.0 ℃ 紫外部吸収スペクトル：λ_max(CH₃OH) nm (ε) 336
(6,800), 322 (5,800), 230 (35,200)；1N HCl添加時
336 (6,200), 322 (5,400), 306 (5,100), 230 (42,10
0)；1N NaOH添加時 347 (9,200), 334 (7,900), 230
(30,200), 213 (36,000) 赤外部吸収スペクトル：ν_max(KBr) cm^-1 3700-2000,
3344, 1701, 1637, 1612, 1581, 1390, 1373, 1298, 1
161, 1059, 854, 758 FABマススペクトル： m/z 216 M⁺ 高分解能 FABマススペクトル： m/z 216.0787 M⁺, Δ
+0.1 mmu （C₁₃H₁₂O₃ として）¹ H NMR スペクトル（400MHz, CD₃OD）：δ ppm（積分,
多重度, 結合定数 J(Hz)） 7.21 (1H, m), 7.21 (1H, m), 7.11 (1H, m), 6.67 (1
H, m), 6.56 (1H, d, 1.7), 3.75 (2H, s), 2.15 (3H,
s)¹³ C NMR スペクトル（100MHz, CD₃OD）：δ ppm（多重
度） 209.30 (s), 155.80 (s), 155.44 (s), 138.56 (s), 13
4.60 (s), 128.15 (d),120.79 (d), 120.18 (d), 115.0
8 (s), 110.82 (d), 109.40 (d), 51.55 (t), 29.22
(q)

【００１１】次に化合物ＥＧＦ−２４７７類の活性につ
いて試験例で説明する。 試験例 細胞増殖抑制試験 本発明のＥＧＦ−２４７７類について、単球系細胞であ
るＵ９３７細胞の細胞増殖抑制活性を調べた。細胞増殖
抑制効果は³H-チミジンの取り込みを指標に行った。

【００１２】単球系細胞Ｕ９３７を１０％ＦＣＳ添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培養液（ニッスイ社製）に5 ×10⁴ 個/m
l の濃度で懸濁した。これを平底96ウェルプレート（住
友ベークライト社）に100 μl ／ウェル分注する。次に
ＤＭＳＯあるいはメタノールで溶解した化合物ＥＧＦ−
２４７７類を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培養液
（ニッスイ社製）で段階希釈した溶液を100 μ/ ウェル
加えてよく撹拌した。化合物ＥＧＦ−２４７７類の最終
濃度は最高で100 〜10μｇ／ｍｌ となる。対照群とし
ては、化合物ＥＧＦ−２４７７類を含まない培養液を添
加した。37℃で68時間培養後、³H-チミジン（NEN社製）
0.5 μCi（20ml）を各ウェルに加え、さらに4 時間培養
し、ハーベストした。フィルターの放射活性をMatrix 9
6（パッカードジャパン社製）を用い測定した。

【００１３】細胞増殖抑制率は、次式に従って算出し
た。

【００１４】

【数１】

【００１５】試験結果を第１表に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】第１表より、ＥＧＦ−２４７７類はＵ９３
７細胞の細胞増殖抑制を示した。次にＥＧＦ−２４７７
類の製造法について説明する。ＥＧＦ−２４７７類の生
産能を有する微生物としては、ストレプトマイセス属に
属し、ＥＧＦ−２４７７類生産能を有する菌株であれば
いずれの菌株でも用いることができる。また、これらの
菌株の人工的変異方法、たとえば紫外線照射、X 線照
射、変異誘起剤処理などによって変異させた変異株ある
いは自然的に変異した変異株でもＥＧＦ−２４７７類生
産能を有するものであれば本発明に用いることができ
る。

【００１８】具体的に好適な例としては、ストレプトマ
イセス・スピーシーズ（Streptomyces sp.）ＥＧＦ−２
４７７株があげられる。ストレプトマイセス・スピーシ
ーズ（Streptomyces sp.）ＥＧＦ−２４７７株の菌学的
性質については次の通りである。

【００１９】なお、該性質の決定は、国際ストレプトマ
イセス（Streptomyces）プロジェクト（ISP）がストレ
プトマイセス種の特性決定のために推奨する方法 [E.B.
シェリング（E.B. Shirling）および D.ゴットリーブ
（D.Gottlieb）、インターナショナル・ジャーナル・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Int. J. Syst. Ba
cteriol.），16, 313-340（1966）] に従った。全細胞
の加水分解物中のジアミノピメリン酸の異性体はビー・
ベッカー（B.Becker）らの方式 [アプライド・ミクロバ
イオロジー（Appl. Microbiol.），12,421-423（196
4）] によって確認した。形態学的検討は、光学顕微鏡
を用いて行い、とくに胞子表面の形態については走査型
電子顕微鏡を用いて行った。色の名称の割当てには、カ
ラー・ハーモニー・マニュアル（Color Harmony Manua
l）[コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカ
（Container Corporation of America）、第４版（198
5）] を使用した。

【００２０】1.形態的性質 1)菌糸 気菌糸形成；有 気菌糸の分断および運動性；無 基生菌糸の分断および運動性；無 2)胞子 胞子の形成の有無および着生位置；気菌糸に形成 胞子嚢の形成の有無および着生位置；無 胞子柄上で連鎖する胞子の数；10個以上 多数の胞子が連鎖する場合の形状；螺旋状 胞子の特徴 表面構造；とげ状 形状および大きさ；桿形、約0.6〜0.8μm × 1.0〜1.2
μm 運動性および鞭毛の存在；無 3)その他 厚膜胞子；無 集束菌糸；無 疑似胞子嚢；無 菌糸の分裂様式；単純分岐

【００２１】2.培養的性質 ＥＧＦ−２４７７株は、一般に使用されている合成およ
び天然培地で普通もしくは旺盛な成育を示し、基生菌糸
は薄黄色から茶色系を示す。培地により茶色系の可溶性
色素が産生されることもある。

【００２２】各種培地上での28℃、14日間培養した時の
生育および色の特徴を下記に示す。 1)シュクロース・硝酸塩寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；バンブ−(2gc) 気菌糸の着生状態とその色調；普通、ホワイト(a) 可溶性色素；無 2)グルコース・アスパラギン寒天培地 生育状態；普通 基生菌糸の色調；ロ−ズトウプ(5ig)〜ココアブラウン
(5ni) 気菌糸の着生状態とその色調；普通、ダウンブル−(15d
c) 可溶性色素；産生（薄赤色） 3)グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；ライトベ−ジュ(3ec)〜チョコレ−ト
ブラウン(4pn) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、アクアグレ−(19f
e) 可溶性色素；産生（茶色） 4)スターチ・無機塩寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；ライトアイボリ−(2ca)〜シナモンブ
ラウン(3lg) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、モスグレ−(22ih) 可溶性色素；無

【００２３】5)チロシン寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；ダ−クブラウン(6pn) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ダウンブル−(15d
c) 可溶性色素；産生（茶色） 6)栄養寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；マスタ−ドゴ−ルド(2ne) 気菌糸の着生状態とその色調；普通、ホワイト(a) 可溶性色素；無 7)イースト・麦芽寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；ライトマスタ−ドタン(2ie)〜マスタ
−ドブラウン(2ni) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、アクアグレ−(19f
e) 可溶性色素；無 8)オートミール寒天培地 生育状態；旺盛 基生菌糸の色調；ライトマスタ−ドタン(2ie) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ティ−ルグレ−(1
9ih) 可溶性色素；わずかに産生（黄土色）

【００２４】3.生理学的性質 ＥＧＦ−２４７７株の生理的諸性質を以下に示す。１）
については14日間培養後、２）〜６）については28^oC、
2〜3週間培養後の結果を記述する。

【００２５】1)生育温度範囲；10〜38℃ 2)ゼラチンの液化；無 3)スターチの加水分解；有 4)脱脂粉乳の凝固およびペプトン化；無 5)メラニン様色素の生成 (1) ペプトン・イースト・鉄寒天培地；有 (2) チロシン寒天培地；有 6)炭素源の利用性 基礎培地はプリードハム・ゴトリーブ寒天培地を使用し
た。以下、＋は利用することを示す。

【００２６】L-アラビノース ；＋ D-キシロース ；＋ D-グルコース ；＋ シュクロース ；＋ ラフィノース ；＋ D-フルクトース ；＋ ラムノース ；＋ イノシトール ；＋ D-マンニトール ；＋

【００２７】4.化学分類的性質 1)菌体中のジアミノピメリン酸の光学異性体；LL型 2)菌体脂質の主要キノン；MK-9(H8),MK-9(H6) 以上、形態的には気中菌糸に胞子鎖が形成されること、
化学分類的には細胞壁が I型（LL−ジアミノピメリン
酸）であること、および、主要キノンがメナキノン9の4
飽和型(MK-9(H8))及び3飽和型(MK-9(H6))であることか
ら、本菌株は放線菌の中でストレプトマイセス属に分類
される。

【００２８】従って、本菌株をストレプトマイセス・エ
スピー EGF-2477 (Streptomyces sp. EGF-2477)と命名
し、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東1 丁目１番３号）にFERM BP-5480として平成８年３
月２２日付けで寄託した。本発明のＥＧＦ−２４７７類
生産菌の培養に際しては、通常の放線菌の培養方法が適
用される。培地としては、微生物の資化し得る炭素源、
窒素源、無機物および必要な生育あるいは生産促進物質
などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地
いずれでも使用可能である。

【００２９】炭素源としては、グルコース、マンノー
ス、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロ
ース、アラビノース、マンニトール、澱粉、デキストリ
ン、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、
フマール酸などの有機酸、メタノール、エタノールなど
のアルコール、メタン、エタン、プロパン、ｎ−パラフ
ィンなどの炭化水素などが単独または組合せて用いられ
る。

【００３０】窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、
シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・
リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組合せて
用いられる。

【００３１】無機物としては、リン酸一水素カリウム、
リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン
酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガン、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化コバル
ト、炭酸カルシウム、炭酸バリウムなどが用いられる。
その他必要に応じて培地にビタミン、たとえばサイアミ
ンなどの菌体の増殖あるいはＥＧＦ−２４７７類の生産
を促進する物質を加える。また用いる微生物が特定の物
質を要求する場合は、該物質を加える。

【００３２】培養は、液体培養法、特に深部攪拌培養法
などにより、16〜37℃の温度、好ましくは25〜32℃の温
度で、pH 4〜10、好ましくはpH 6〜8 で行われ、培地の
pH調整には、アンモニア水や炭酸アンモニウム溶液な
どが用いられる。通常１〜７日の培養によって、目的化
合物ＥＧＦ−２４７７類が培養物中および菌体中に生成
蓄積され、培養物中のＥＧＦ−２４７７類の生成量が最
大に達し、培養は完了する。

【００３３】培養物中に蓄積したＥＧＦ−２４７７類を
培養物から単離精製するに際しては、通常の微生物代謝
産物を培養物から単離精製するために常用される、例え
ば、抽出、各種クロマトグラフィー等の方法に従って行
われる。例えば、培養物を濾過により培養濾液と菌体と
に分け、菌体をクロロホルム、アセトンあるいは1-プロ
パノールなどの溶剤で抽出する。ついで、抽出液と培養
濾液とを併せて、ポリスチレン系吸着剤、例えばダイヤ
イオン HP20（三菱化学社製）などに通塔して活性成分
を吸着させ、ついでメタノール、アセトンなどで溶出す
る。溶出液を濃縮し、ODS によるカラムクロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー、シリカゲルによる
カラムクロマトグラフィーなどにより、目的化合物ＥＧ
Ｆ−２４７７−１およびＥＧＦ−２４７７−２を得る。
なお、培養、精製操作中のＥＧＦ−２４７７−１および
ＥＧＦ−２４７７−２の検出は、シリカゲル薄層クロマ
トグラフィー、または、高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）による紫外部吸収法を用いることにより行うこ
とができる。

【００３４】以下に実施例を示す。

【００３５】

【実施例】

実施例１．種菌として、ストレプトマイセス・スピーシ
ーズＥＧＦ−２４７７株を用いた。該菌株を300ml 容量
の三角フラスコ中のバクトトリプトン（Difco 社製）5
g/L、酵母エキス 5 g/L、肉エキス 3 g/L、可溶性澱粉
10 g/L、グルコース 10 g/L、リン酸マグネシウム 0.5
g/Lの組成からなる種培地（殺菌前 pH 7.2）50mlに植菌
し、28℃で72時間振盪培養（回転数；200rpm）した。得
られた種培養液を2L容量の三角フラスコ中の下記組成の
発酵培地500ml に10% （容量）の割合で移し、28℃で振
盪培養（回転数；200rpm）を行った。 発酵培地組成：シュクロース 50 g/L、大豆粉 15 g/L、
乾燥酵母 15 g/L、 コーン・スチープ・リカー 3 g/L、
リン酸二水素カリウム 0.5 g/L、硫酸マグネシウム 0.5
g/L、塩化カルシウム 5 g/L、リン酸マグネシウム 0.5
g/L（殺菌前 pH7.0、NaOHで調整）

【００３６】培養中、培地の pH は特に制御せずに、16
8 時間培養した。培養液から菌体を分離し、菌体に1-プ
ロパノール 3 Lを添加して攪拌した後、菌体を除いて、
濾液3 Lを得た。濾液を水で希釈し、ポリスチレン系吸
着剤、ダイヤイオンHP20（三菱化学社製）カラム 1 Lに
通塔して活性物質を吸着させた。脱イオン水および50%
メタノールで不純物を溶出し、メタノールで活性物質を
溶出した。活性画分を水で希釈し、ポリスチレン系吸着
樹脂剤、ダイヤイオンHP20ss（三菱化学社製）カラム 3
00 ml に通塔して活性物質を吸着させた。50 %から100
%の直線濃度勾配メタノール水溶液で溶出した。溶出さ
れた活性画分を濃縮し、 下記の高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）分取条件により単離精製を行ない、ＥＧＦ
−２４７７−１を35.2 mg 、ＥＧＦ−２４７７−２を4
3.9 mg得た。

【００３７】HPLC分取条件 カラム：YMC-Pack SH-343-5AQ（YMC社製） 溶出液：60 %メタノール、0.1 % トリフルオロ酢酸 流速：10 ml/min 検出：220 nmの紫外吸収

【００３８】

【発明の効果】本発明により優れた細胞増殖抑制剤が提
供される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ¹ およびＲ² は一方がヒドロキシを他方が水
   素を表すか、Ｒ¹ およびＲ² が一緒になって酸素を表
   す。）で表される化合物ＥＧＦ−２４７７類。