JPH09276843A

JPH09276843A - 微生物の分解活性の増大方法及びこれを用いた土壌浄化方法

Info

Publication number: JPH09276843A
Application number: JP8091518A
Authority: JP
Inventors: Yuji Kawabata; 祐司川畑; Tetsuya Yano; 哲哉矢野; Shinya Furusaki; 眞也古崎; Takeshi Imamura; 剛士今村; Chieko Mihara; 知恵子三原
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1997-10-28

Abstract

(57)【要約】【課題】分解活性を増大させて有機化合物汚染物の微
生物浄化を行なう。【解決手段】微生物の対数増殖期に、増殖速度が低下
する条件とすることで分解活性を向上させて行なう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は有機化合物を分解す
る微生物の活性を増大させる方法、並びにこれを用いた
汚染土壌の浄化方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年の著しい科学技術の進歩においては
人工的な化学物質や化成品などが新しく大量に生産され
ているが、その一方でこれらの一部は環境に漏洩放出し
たり、またはその大部分は年月を経て大量の廃棄物とな
って環境中に蓄積しつつある。環境中に漏洩蓄積したこ
れら化学物質や化成品は自然環境を破壊する大きな原因
となるとともに、人類の負の遺産として早急に解決すべ
き重要な課題となっている。木材などの天然由来の廃棄
物は自然の物質循環システムの中で徐々に分解され消失
していくが、人工の化学物質やプラスチックの多くは自
然に分解することはほとんどなく、環境中に少しずつ蓄
積しながら自然を汚染していく。なかでも、人類の生活
の場である陸圏は人為的汚染の影響を最も受けやすく、
また陸圏の環境汚染はすべての生命存続の脅威となる深
刻な問題である。これまでによく知られた土壌の汚染物
質としては、ガソリンなどの有機化合物、PCBなどの有
機塩素化合物、ダイオキシンなどの催奇性を有する農
薬、あるいはウランやプルトニウムなどの放射性化合物
などが挙げられる。とくにガソリンなどの液体燃料はガ
ソリンスタンドの地下タンクに大量に貯蔵され、タンク
の老朽化あるいはタンクの破損による土壌への漏洩が近
年明らかになっている。また、トリクロロエチレンやテ
トラクロロエチレンなどの有機塩素化合物は精密部品の
洗浄やドライクリーニングにおいてかつて大量に使用さ
れ、その漏洩による土壌や地下水の大規模な汚染の実体
も明らかになりつつある。さらに、これら有機塩素化合
物の催奇性や発がん性が指摘されており、汚染源の遮断
と汚染された土壌や地下水の浄化は早急に解決すべき課
題となっている。

【０００３】これら汚染物質で汚染された土壌の浄化方
法としては、土壌を掘り起こして汚染物質を取り除くた
めの物理化学的な処理を行う方法、土壌に吸引井戸を設
け真空抽出する方法、あるいは汚染物質を分解し無毒化
する微生物を利用して浄化する方法などが挙げられる。
掘り起こした汚染土壌の物理化学的な浄化には、土壌を
通気処理あるいは加熱処理して汚染物質を取り除く方法
や紫外線照射あるいは酸化物添加により汚染物質を分解
する方法などが挙げられる。これらの方法では土壌から
汚染物質をほとんど完全に取り除くことが可能である
が、浄化処理に先だって土壌掘削が必要であるから建造
物下の土壌の浄化処理は困難であり、また掘削及び浄化
処理に要する費用が膨大となるため広範囲な汚染土壌の
浄化には一般に適用困難である。一方、汚染土壌に設け
た井戸を減圧して汚染物質を抽出する方法は揮発性の汚
染物質の効果的な浄化方法である。しかし、数ppm以下
の揮発性汚染物質の除去効率は一般に低く、その浄化処
理に年単位の時間が必要なこともあるため、もっぱら高
濃度汚染の一次浄化処理に適している。微生物による浄
化方法は汚染土壌を掘削する必要がないため建造物下の
浄化が可能であり、また分解活性の高い微生物を利用す
ることにより揮発性汚染物質はもとより有機化合物をも
分解浄化できるので、経済的で効率的な土壌浄化方法と
して近年注目されている。

【０００４】微生物による汚染土壌の浄化は、土壌に元
来生息する土着の分解微生物を利用する方法と土壌に元
来生息しない外来の分解微生物を利用する方法に大別さ
れる。前者の場合は、土着の微生物を増殖させ分解活性
を高めるための栄養素、インデューサ、酸素、あるいは
微生物の生残増殖と汚染物の分解を促進する化学物質を
土壌に注入して浄化処理を行う。また後者の場合は、外
来微生物を土壌に注入するとともに、その微生物を増殖
させ分解活性を高めるための注入工程を行う。どちらの
場合においても、栄養素濃度や酸素濃度などを制御して
微生物の分解活性を最大限に引き出すことにより、最も
効率的な土壌浄化が達成される。一般に、微生物の分解
活性などの代謝活性は微生物が分裂増殖しその個体数を
急激に増大させるとき、つまり増殖速度が大きいときに
強く発現される。また微生物全体としての活性は通常微
生物数に比例して増大することが知られている。しか
し、微生物が対数増殖を終えたあと個体数がほぼ一定に
なる（定常相）までの間（ポスト対数増殖相）におい
て、増殖速度を低下させたときに強く発現する微生物の
分解活性も知られている。

【０００５】たとえば、Appl. Environ. Microbiol., V
ol. 61, No. 9, p. 3323-3328 では大腸菌の組み替え微
生物を用いたトリクロロエチレンやフェノールの分解に
おいて、ポスト対数増殖相において微生物に与える栄養
素を制限して増殖速度を低下することにより、分解活性
が４〜１７倍に増大することが報告されている。この場
合、投入する栄養素の減少に伴いコストが低下するの
で、土壌修復の経済効率も向上する。また、J. Bacteri
ol., Vol. 175, No. 21, p.6902-6907 では、ポスト対
数増殖相において土壌に生存する微生物の酵素活性が強
く発現する例が挙げられている。また、特開平7-289247
では、メタン資化菌について栄養素を十分供給しながら
増殖を抑制して有機塩素化合物の分解活性を再生する方
法が開示されている。この方法は、分解活性を部分的あ
るいは完全に失った微生物の活性を再生する方法であ
り、低濃度の微生物の増殖期における制御を意図したも
のではない。一方、対数増殖相における微生物の活性は
上述のように増殖速度が大きいときに強く発現されるの
が一般的である。従って、土壌中に生息する微生物や土
壌に注入した微生物により土壌中の汚染物質を分解する
場合も、その対数増殖相においては微生物の増殖を促進
するような手段を用い、定常相では微生物数が減少しな
いように制御する手段が用いられる。つまり、微生物を
用いたこれまでの土壌修復では、対数増殖相及び定常相
いずれの微生物フェーズにおいても微生物数をできるだ
け増大させることに注目して高い分解活性を発現維持し
ようとしている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】汚染物質を分解できる
能力を有する微生物を用いて汚染土壌を修復するには、
微生物を土壌に注入し、あるいは注入した微生物あるい
は土着の微生物に対する栄養素、インデューサ、酸素、
その他の化学物質を土壌に注入することが不可欠であ
る。また、外来微生物を利用する場合には微生物を汚染
土壌に大量に注入して土壌を浄化することもできるが、
微生物の自己増殖能を利用して少量の微生物とともに増
殖に必要な栄養素などを混合して土壌に注入するのがむ
しろ経済的である。このとき、土着あるいは注入した微
生物は土壌内の栄養素や酸素などを消費しながら対数増
殖し定常相に至るが、効率的な土壌修復のためには微生
物の活性を高く発現させ維持させることが必要である。
このため従来はその増殖期において十分な栄養素や酸素
などを供給して増殖速度を増大させ、微生物の個体数を
急激に増加させる。また、分解に寄与する微生物のほか
に土壌中には種々の微生物が存在し、これらが供給した
栄養素や酸素などを消費すると分解微生物の増殖が阻害
されるので、分解微生物を選択的に増殖させるような栄
養素などが選ばれる。しかし、微生物の活性は必ずしも
最大の増殖条件で高く発現維持されるものではなく、む
しろ分解メカニズムあるいは利用する分解酵素に応じて
その増殖条件を制御し、高い分解活性を引き出すことが
必要である。

【０００７】微生物が産生する酸化酵素の一つにオキシ
ゲナーゼがあり、フェノールやトルエンを酸化する芳香
族化合物オキシゲナーゼ、メタンやプロパンを酸化する
アルカン化合物オキシゲナーゼ、及びアンモニアを酸化
するアンモニアオキシゲナーゼなどに分けられる。これ
らの酸化酵素は共酸化によりトリクロロエチレンを分解
することが知られており、この機能を利用して土壌を汚
染しているトリクロロエチレンを分解除去することがで
きる。ここで、共酸化とは基質となる有機化合物のほか
に生長のためには本来用いられない有機化合物などが共
存する場合に、後者の有機化合物もオキシゲナーゼによ
って同時に酸化されてしまうことと定義される。この土
壌修復においても、微生物の増殖条件を制御して高い分
解活性を発現させることが望まれる。ところが、オキシ
ゲナーゼによる有機化合物の微生物分解、とくにオキシ
ゲナーゼの共酸化を用いた分解においては、微生物の対
数増殖期に増殖速度を低下させた場合に対数増殖期及び
定常期において強く分解活性が発現することを新たに見
いだした。すなわち、微生物の対数増殖期において栄養
素や酸素など増殖を制限する因子を制御して増殖速度を
低下させることにより、その後の微生物による有機化合
物の分解速度を著しく増大させることができた。この方
法を用いれば、従来とは全く異なる制御方法により微生
物の活性を増大させることが可能である。また、このよ
うにして分解活性を増大した微生物を用いることによ
り、さらに効率よくかつ経済的に土壌の汚染修復が行え
るものと考えられる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、オキシゲナー
ゼを発現する微生物の共酸化による有機化合物の分解に
おいて、微生物の対数増殖期に増殖速度を低下させるこ
とにより対数増殖期及びその後の定常期における分解活
性が増大すること、またこの方法により汚染土壌の汚染
物質を効率よく分解し土壌修復が行えることを見出した
ことに基づく。

【０００９】以下、本発明について詳述する。

【００１０】まず、汚染物質を分解する能力を持つ外来
微生物を土壌に注入する場合、最も簡単なのは高濃度な
微生物溶液を大量に培養し、これを土壌へ注入する方法
である。しかし、砂質土壌において微生物溶液を半径１
ｍで球状に注入する場合、必要となる微生物溶液量はお
よそ１トンに達する。これだけの微生物溶液を培養する
ための培養器及び培養に要する労力と時間を考慮する
と、高濃度の微生物溶液を用いて広大な汚染土壌を修復
するのは非現実的である。一方、微生物は自己増殖能を
有しており、増殖に適した栄養素濃度や酸素濃度などの
環境を与えれば土壌中でおよそ10⁵ 個／g土壌から10⁹
個／g土壌の微生物濃度まで簡単に増殖させることがで
きる。この自己増殖能を利用すれば、必要となる微生物
溶液量は104分の１つまり 0.1 l まで減らすことができ
る。この方法では大容量の培養器は不要となり、かわり
に微生物溶液と栄養素溶液などを混合貯蔵するための大
型タンクを準備すればよい。または、小型のタンクに貯
留した微生物溶液と栄養素溶液などを順次混合しながら
ポンプで注入することも可能である。従って、汚染物質
を分解する能力をもつ外来微生物を利用する場合、この
微生物を増殖させるとともに分解活性を最大限に維持さ
せるように微生物環境及び増殖速度を制御することが望
まれる。また、汚染物質を分解する能力をもつ微生物が
土壌中に元来生存する場合、同様にこの微生物を増殖さ
せるとともに分解活性を最大限に維持させるように制御
する。

【００１１】微生物環境には栄養素濃度、酸素濃度、ｐ
Ｈ、増殖阻害物質濃度、及び温度などがある。はじめ
に、栄養素は微生物のエネルギー源であり、微生物はこ
れを資化して増殖生残することができる。例えば、ブイ
ヨン培地、Ｍ９培地、Ｌ培地、Malt Extract、ＭＹ培
地、硝化菌選択培地などが栄養素を含む培地として一般
的であるが、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、
クエン酸、及びこれら有機酸のナトリウム塩も炭素源と
して有用である。微生物は全ての栄養素を同じように資
化する能力を有しているわけではなく、栄養素の種類に
よって資化しやすいもの（富栄養素）としにくいもの
（貧栄養素）に分けられる。このとき、資化しにくい栄
養素を低濃度の微生物に与えることにより微生物の増殖
速度を低下させることができる。また、一般に栄養素濃
度が低くなると微生物の資化速度が低下し増殖速度も低
下するので、栄養素濃度も増殖を支配する因子となる。
さらに、酸化酵素の活性を発現維持させるためのミネラ
ルなども副次的な栄養素として要求される。次に、酸素
は好気性微生物では必須の因子であり、通常酸素濃度の
低下とともに好気性微生物の増殖は抑制される。また、
嫌気性微生物では酸素濃度の増加に伴い増殖が阻害され
る。さらに微生物にはそれぞれの至適ｐＨ域があり、そ
のｐＨ域以外では微生物の増殖や生育が著しく阻害され
る。微生物の中には至適ｐＨが強酸あるいは強アルカリ
のものもあるが、通常の至適ｐＨは中性域でおよそｐＨ
５〜９程度である。増殖阻害物質としては微生物に対し
て毒性をもつ化合物や抗菌作用を有する化合物などが挙
げられる。毒性の化合物としてはリン酸系の農薬をはじ
め多くのトリクロロエチレンなどの有機化合物、ヒ素な
どの無機化合物がある。また、抗菌作用を持つものとし
ては銅や銀が挙げられる。これらは比較的低濃度でも微
生物の増殖や生育を阻害し、さらに高濃度では微生物を
死に至らしめる。温度もまた微生物増殖の重要な因子で
ある。10℃以下の低温や40℃以上の高温においても生息
する微生物が存在するが、その多くは15 〜 30℃に至適
温度を持っている。従って、この至適温度以外では微生
物の増殖速度は通常著しく低下し、全く増殖しない場合
もある。

【００１２】以上のように、増殖を制御して分解活性を
向上させる微生物としては、例えば種々の有機化合物の
分解活性が確認されている。Saccharomyces, Hansenul
a, Candida, Micrococcus, Staphylococcus, Streptoco
ccus,Leuconostoc, Lactobacillus, Corynebacterium,
Arthrobacter, Bacillus, Clostridium,Neisseria, Esc
herichia, Enterobacter, Serratia, Achromobacter, A
lcaligenes, Flavobacterium,Acetobacter, Nitrosomon
as, Nitrobacter, Thiobacillus, Gluconobacter, Pseu
domonas,Xanthomonas, Vibrio の属の微生物などが挙げ
られる。

【００１３】本発明における有機化合物の分解処理は、
水性媒体中、土壌中、あるいは気相中の有機化合物と分
解活性をもつ微生物とを接触させることにより行うこと
ができる。また、微生物と有機化合物との接触は、バッ
チ法、半連続法、連続法等の種々の方法を用いて実施で
きる。さらに、微生物は適当な担体に固定化して用いる
こともできる。なかでも、土壌中の有機化合物の処理
は、主に土壌中の水性媒体に存在する有機化合物と微生
物を接触させることにより行う。以下に主な利用形態を
述べるが、これらの形態に限られることはなく、いかな
る水性媒体中の有機化合物の分解処理にも用いることが
できる。

【００１４】最も簡便な方法としては、有機化合物によ
って汚染された土壌中に直接微生物を導入する方法であ
る。導入の方法としては、土壌表面に微生物を散布す
る、あるいは地中に設けた井戸から土壌中に注入する、
などの方法がある。さらに、空気や水などによって圧力
をかけ、土壌内で微生物を広範囲に広げると効果的であ
る。また、別の利用形態としては、微生物を適当な担体
に固定したものを反応槽として、この反応槽を汚染土壌
の主に帯水層に入れて分解させる方法がある。反応槽の
形態はフェンス状やフィルム状のような、広範に土壌を
網羅できるものが望ましい。使用する担体は、いかなる
ものでも使用可能であるが、微生物の保持能力に優れ、
通気性を損なわないようなものが望ましい。例えば、微
生物の棲息空間を与えるような材料として、従来より医
薬品工業、食品工業、あるいは廃水処理で利用されてい
る微生物担体が利用できる。より具体的には、多孔質ガ
ラス、セラミクス、金属酸化物、活性炭、カオリナイ
ト、ベントナイト、ゼオライト、シリカゲル、アルミ
ナ、アンスラサイトなどの無機粒子状担体、デンプン、
寒天、キチン、キトサン、ポリビニルアルコール、アル
ギン酸、ポリアクリルアミド、カラギーナン、アガロー
ス、ゼラチンなどのゲル状担体、イオン交換性セルロー
ス、イオン交換樹脂、セルロース誘導体、グルタルアル
デヒド、ポリアクリル酸、ポリウレタン，ポリエステル
などが挙げられる。さらに天然物として綿、麻、紙など
セルロース系のもの、木粉、樹皮などのリグニン系のも
のも利用可能である。

【００１５】以下に、微生物JM1株を使用した実施例を
もって本発明を説明するが、これらは本発明の範囲をな
んら限定するものではない。なお、微生物JM1株につい
ては寄託した時点ではコリネバクテリウムに属するもの
との認識を持っていたが、その後の研究でこれについて
疑惑を生じたので現時点では単にJM1株と呼ぶ。そして
その菌学的性質は次の通りである。 JM1菌学的性質グラム染色性及び形態：グラム陰性桿菌各培地における生育 BHIA：生育良好 MacConkey：生育可能コロニーの色：クリーム色至適温度：２５℃＞３０℃＞３５℃ 運動性：陰性（半流動培地） TSI(slant/butt)：アルカリ／アルカリ、Ｈ₂Ｓ(-) オキシダーゼ：陽性（弱）カタラーゼ：陽性糖の発酵グルコース：陰性シュクロース：陰性ラフィノース：陰性ガラクトース：陰性マルトース：陰性ウレアーゼ：陽性エスクリン加水分解：（β−グルコシダーゼ）：陽性硝酸還元：陰性インドール産生：陰性グルコース酸性化：陰性アルギニンジヒドロラーゼ：陰性ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性各化合物の同化グルコース：陰性 L-アラビノース：陰性 D-マンノース：陰性 D-マンニトール：陰性 N-アセチル-D-グルコサミン：陰性マルトース：陰性グルコン酸カリウム：陰性 n-カプリン酸：陽性アジピン酸：陰性 dl-リンゴ酸：陽性クエン酸ナトリウム：陽性酢酸フェニル：陰性（実施例１）低濃度の富栄養素（ピルビン酸ナトリウム、あるいは乳
酸ナトリウム）による増殖速度の低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 0.2, 0.5, 1.0,2.0 % のピルビン酸ナ
トリウムあるいは乳酸ナトリウムを含む 1.8mlのM9培地
と混合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）し、これ
を上記のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム栓及びア
ルミキャップで密封し、22.5 ℃で 1.8 日間静置培養を
行った。静置培養後、1000 ppmトリクロロエチレン水溶
液 0.2 ml を加え、土壌内のトリクロロエチレン濃度が
10 ppm となるようにした。静置培養開始直後、及びそ
れから 2.10,3.05, 4.70 日後の微生物数をプレートカ
ウントで測定するとともに、バイアル内の気相部分のト
リクロロエチレン濃度を FID 検出器付きのガスクロマ
トグラフで測定し、トリクロロエチレンの分解率を求め
た。これらの結果を図１、２及び図３に示す。これよ
り、栄養素であるピルビン酸ナトリウムあるいは乳酸ナ
トリウムの濃度を 0.5 % とすることにより微生物の増
殖速度が低下し、トリクロロエチレンの分解活性が強く
発現されることがわかった。なお、栄養素濃度が 0.5 %
より小さくなると微生物が十分数まで増殖しなくなり、
トリクロロエチレンの分解率が低下することもわかっ
た。

【００１６】（実施例２）貧栄養素（クエン酸ナトリウム、あるいはリンゴ酸ナト
リウム）による増殖速度の低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終
夜振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウ
ントで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この
培養液 0.2 ml を 2.0 % のクエン酸ナトリウムあるい
はリンゴ酸ナトリウムを含む 1.8 mlのM9培地と混合
（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）し、これを上記
のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム栓及びアルミキ
ャップで密封し、22.5 ℃で 1.8 日間静置培養を行っ
た。静置培養後、1000 ppmトリクロロエチレン水溶液
0.2 ml を加え、土壌内のトリクロロエチレン濃度が10
ppm となるようにした。静置培養開始直後、及び2.10,
3.05, 4.70 日後の微生物数をプレートカウントで測定
するとともに、バイアル内の気相部分のトリクロロエチ
レン濃度を FID 検出器付きのガスクロマトグラフで測
定し、トリクロロエチレンの分解率を求めた。これらの
結果を図４及び図３に示す。これより、クエン酸ナトリ
ウムあるいはリンゴ酸ナトリウムを栄養素とすることに
より微生物の増殖速度が低下し、トリクロロエチレンの
分解活性が強く発現されることがわかった。

【００１７】（比較例１）低濃度の貧栄養素（クエン酸ナトリウム、あるいはリン
ゴ酸ナトリウム）による微生物数の低下と分解活性の低
下滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 0.2, 0.5, 1.0 %のクエン酸ナトリウム
あるいはリンゴ酸ナトリウムを含む 1.8mlのM9培地と混
合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）し、これを上
記のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム栓及びアルミ
キャップで密封し、22.5 ℃で 1.8 日間静置培養を行っ
た。静置培養後、1000 ppmトリクロロエチレン水溶液
0.2 ml を加え、土壌内のトリクロロエチレン濃度が10
ppm となるようにした。静置培養開始直後、及びそれ
から 2.10,3.05, 4.70 日後の微生物数をプレートカウ
ントで測定するとともに、バイアル内の気相部分のトリ
クロロエチレン濃度を FID 検出器付きのガスクロマト
グラフで測定し、トリクロロエチレンの分解率を求め
た。これらの結果を図５及び図３に示す。これより、栄
養素であるクエン酸ナトリウムあるいはリンゴ酸ナトリ
ウムの濃度が 2.0 %より小さくなると微生物が十分数ま
で増殖しなくなり、トリクロロエチレンの分解率が低下
することがわかった。

【００１８】（実施例３）低濃度酸素による増殖速度の低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
40 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を比較例１よりも減少させ
た。次に、寒天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキ
ス0.1 %を含むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中
30 ℃で終夜振盪培養を行った。培養後の微生物数をプ
レートカウントで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであ
った。この培養液 0.2 ml を2.0 % のピルビン酸ナトリ
ウムあるいは乳酸ナトリウムを含む 1.8 mlのM9培地と
混合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）し、これを
上記のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム栓及びアル
ミキャップで密封し、22.5 ℃で 1.8 日間静置培養を行
った。静置培養後、1000 ppmトリクロロエチレン水溶液
0.2 ml を加え、土壌内のトリクロロエチレン濃度が10
ppm となるようにした。静置培養後 2.9日の微生物数
をプレートカウントで測定するとともに、バイアル内の
気相部分のトリクロロエチレン濃度をFID 検出器付きの
ガスクロマトグラフで測定し、トリクロロエチレンの分
解率を求めた。この結果、ピルビン酸ナトリウムでは 3
0%、乳酸ナトリウムでは 20 % のトリクロロエチレンを
分解した。これより、好気性微生物では富栄養素を十
分に与えても、酸素濃度を低下させることにより微生物
の増殖速度が低下し、トリクロロエチレンの分解活性が
強く発現されることがわかった。

【００１９】（実施例４）ｐＨによる増殖速度の低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 0.2, 0.5, 1.0,2.0 % のコハク酸を含
む 1.8 ml のM9培地と混合（微生物数 2 x 10⁷個／ml）
し、そのｐＨを測定したところそれぞれｐＨは 6.8, 6.
4, 5.8, 4.9 であった。この混合液を上記のバイアルに
植え継いだ後、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密封
し、15℃で 1.8 日間静置培養を行った。静置培養後、1
000 ppmトリクロロエチレン水溶液 0.2 mlを加え、土壌
内のトリクロロエチレン濃度が10 ppm となるようにし
た。静置培養開始直後、及びそれから 2.10, 3.05, 4.
70 日後の微生物数をプレートカウントで測定するとと
もに、バイアル内の気相部分のトリクロロエチレン濃度
を FID 検出器付きのガスクロマトグラフで測定し、ト
リクロロエチレンの分解率を求めた。これらの結果を図
６及び図３に示す。これより、0.2 〜 0.5 % 濃度のコ
ハク酸では資化できる栄養素が少なく、微生物が十分数
まで増殖しなくなり、トリクロロエチレンの分解率が低
下することがわかった。また、2.0 % 濃度のコハク酸で
は資化できる栄養素は十分にあるものの、ｐＨの低下に
より微生物の増殖阻害がかかり微生物が十分数まで増殖
しなくなることがわかった。一方、1.0 % 濃度のコハク
酸では資化できる栄養素が適当に存在するとともに、ｐ
Ｈの低下により増殖速度が低下するため、トリクロロエ
チレンの分解活性が強く発現されることがわかった。

【００２０】（実施例５）増殖阻害物質（トリクロロエチレン）による増殖速度の
低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 2.0 % のピルビン酸ナトリウムを含む
1.8 ml のM9培地及び1000 ppmトリクロロエチレン水溶
液0.6 ml と混合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）
し、これを上記のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム
栓及びアルミキャップで密封し、22.5 ℃で 1.8日間静
置培養を行った。静置培養開始直後、及びそれから 2.1
0, 3.05, 4.70 日後の微生物数をプレートカウントで測
定するとともに、バイアル内の気相部分のトリクロロエ
チレン濃度をFID 検出器付きのガスクロマトグラフで測
定し、トリクロロエチレンの分解率を求めた。微生物数
の結果を図７に示す。またトリクロロエチレンの分解率
は 64 % であった。これより、微生物の増殖時に 30 pp
mのトリクロロエチレンが共存することにより増殖阻害
がかかり、微生物の増殖速度が低下するためトリクロロ
エチレンの分解活性が強く発現されることがわかった。

【００２１】（実施例６）増殖阻害物質（過酸化水素）による増殖速度の低下と分
解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 2.0 % のピルビン酸ナトリウムを含む
1.8 ml のM9培地及び10000 ppm過酸化水素水 0.4 ml と
混合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷ 個／ml）し、これを
上記のバイアルに植え継いだ後、ブチルゴム栓及びアル
ミキャップで密封し、22.5 ℃で 1.8 日間静置培養を行
った。静置培養後、 1000 ppmトリクロロエチレン水溶
液 0.2 ml を加え、土壌内のトリクロロエチレン濃度が
10 ppm となるようにした。静置培養開始直後、及びそ
れから 2.10,3.05, 4.70 日後の微生物数をプレートカ
ウントで測定するとともに、バイアル内の気相部分のト
リクロロエチレン濃度を FID 検出器付きのガスクロマ
トグラフで測定し、トリクロロエチレンの分解率を求め
た。微生物数の結果を図７に示す。またトリクロロエチ
レンの分解率は 46 % であった。これより、微生物の増
殖時に 200 ppmの過酸化水素が共存することにより増殖
阻害がかかり、微生物の増殖速度が低下するためトリク
ロロエチレンの分解活性が強く発現されることがわかっ
た。

【００２２】（実施例７）温度変化による増殖速度の低下と分解活性の増大滅菌した細砂を風乾し、これに蒸留水を加えて含水比11
%の土壌（砂の密度 1.7 g/cm³）を調製した。この土壌
20 g をガラスバイアル（内容積 68 ml）に入れ、バイ
アル内の気相部分（酸素量）を十分確保した。次に、寒
天培地上のＪＭ１株のコロニーを酵母エキス0.1 %を含
むM9培地100 mlに接種し、坂口フラスコ中 30 ℃で終夜
振盪培養を行った。培養後の微生物数をプレートカウン
トで測定したところ、2 x 10⁸ 個／mlであった。この培
養液 0.2 ml を 0.2, 0.5, 1.0,2.0 % のピルビン酸ナ
トリウムあるいは乳酸ナトリウム（いずれも富栄養
素）、0.2, 0.5, 1.0, 2.0 % のクエン酸ナトリウムあ
るいはリンゴ酸ナトリウム（いずれも貧栄養素）を含む
1.8 ml のM9培地と混合（ｐＨ７、微生物数 2 x 10⁷個
／ml）し、これを上記のバイアルに植え継いだ後、ブチ
ルゴム栓及びアルミキャップで密封し、15 ℃で 1.8 日
間静置培養を行った。静置培養後、 1000 ppmトリクロ
ロエチレン水溶液 0.2ml を加え、土壌内のトリクロロ
エチレン濃度が10 ppm となるようにした。静置培養開
始直後、及びそれから 2.10, 3.05, 4.70 日後の微生物
数をプレートカウントで測定するとともに、バイアル内
の気相部分のトリクロロエチレン濃度を FID 検出器付
きのガスクロマトグラフで測定し、トリクロロエチレン
の分解率を求めた。1 % 濃度の栄養素について微生物数
の結果を図８に、またトリクロロエチレンの分解率を図
９に示す。これより、微生物環境の温度を低下させて増
殖速度を低下させることにより、貧栄養素はもとより富
栄養素でもトリクロロエチレンの分解活性が強く発現さ
れることがわかった。

【００２３】

【発明の効果】本発明によって、微生物の分解活性を強
く発現させるとともに、汚染土壌の効率的な浄化が可能
となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ピルビン酸塩の濃度と菌数の消長を示す図

【図２】乳酸塩の濃度と菌数の消長を示す図

【図３】有機酸塩の濃度とＴＣＥ分解率を示す図

【図４】貧栄養素存在培地における菌数の消長を示す
図

【図５】低濃度貧栄養存在培地における菌数の消長を
示す図

【図６】コハク酸の濃度と菌数の消長を示す図

【図７】増殖阻害物質存在培地における菌数の消長を
示す図

【図８】低温度環境における菌数の消長を示す図

【図９】低温度環境におけるＴＣＥ分解率を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者今村剛士東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者三原知恵子東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）
を発現する微生物の酸化による有機化合物の分解におい
て、該微生物の対数増殖期に増殖速度を低下させること
を特徴とする分解活性の増大方法。
【請求項２】オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）
を発現する微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ノカルジ
ア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）
属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎａｕｓ）
属、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、ベ
ルキア（Ｗｅｌｃｈｉａ）属、メチロシスチス（Ｍｅｔ
ｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属、ニトロゾモナス（Ｎｉｔｒ
ｏｓｏｍｏｎａｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、
トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、モラクセラ
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属に属する微生物のうち少なく
とも一種類であることを特徴とする請求項１に記載の分
解活性の増大方法。
【請求項３】微生物が JM1（生命工学工業技術研究所
受託番号FERM P-14727号,国際受託番号:FERM BP-5352
号）であることを特徴とする請求項１に記載の活性増大
方法。
【請求項４】有機化合物が有機塩素化合物であること
を特徴とする請求項１に記載の分解活性の増大方法。
【請求項５】有機塩素化合物がトリクロロエチレンで
あることを特徴とする請求項４に記載の分解活性の増大
方法。
【請求項６】栄養素の濃度を減少させて微生物の増殖
速度を低下させることを特徴とする請求項１に記載の分
解活性の増大方法。
【請求項７】低下させた後の栄養素の濃度が０〜２％
であることを特徴とする請求項６に記載の分解活性の増
大方法。
【請求項８】栄養素が有機酸であることを特徴とする
請求項６に記載の分解活性の増大方法。
【請求項９】有機酸が乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、
コハク酸、クエン酸、及びこれら有機酸の塩の１つ、あ
るいはこれらの混合物からなることを特徴とする請求項
８に記載の分解活性の増大方法。
【請求項１０】貧栄養素を用いて微生物の増殖速度が
低下させることを特徴とする請求項１に記載の分解活性
の増大方法。
【請求項１１】貧栄養素が有機酸であることを特徴と
する請求項１０に記載の分解活性の増大方法。
【請求項１２】有機酸がリンゴ酸、クエン酸、及びこ
れら有機酸のナトリウム塩の１つ、あるいはこれらの混
合物からなることを特徴とする請求項１１に記載の分解
活性の増大方法。
【請求項１３】酸素濃度を変化させて微生物の増殖速
度を低下させることを特徴とする請求項１に記載の分解
活性の増大方法。
【請求項１４】低下させた後の酸素濃度が０〜２０％
であることを特徴とする請求項１３に記載の分解活性の
増大方法。
【請求項１５】ｐＨを変化させて微生物の増殖速度を
低下させることを特徴とする請求項１に記載の分解活性
の増大方法。
【請求項１６】変化させた後のｐＨが６以下あるいは
８以上であることを特徴とする請求項１５に記載の分解
活性の増大方法。
【請求項１７】増殖阻害をおこす物質を添加して微生
物の増殖速度を低下させることを特徴とする請求項１に
記載の分解活性の増大方法。
【請求項１８】増殖阻害をおこす物質が有機塩素化合
物であることを特徴とする請求項１７に記載の分解活性
の増大方法。
【請求項１９】有機塩素化合物がトリクロロエチレン
であることを特徴とする請求項１８に記載の分解活性の
増大方法。
【請求項２０】増殖阻害をおこす物質が過酸化水素で
あることを特徴とする請求項１８に記載の分解活性の増
大方法。
【請求項２１】温度を変化させて微生物の増殖速度を
低下させることを特徴とする請求項１に記載の分解活性
の増大方法。
【請求項２２】変化させた後の温度が１５℃以下ある
いは３０℃以上であることを特徴とする請求項２１に記
載の分解活性の増大方法。
【請求項２３】オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｅｎａｓ
ｅ）を発現する微生物を用いる汚染土壌の浄化におい
て、該微生物の対数増殖期に増殖速度を低下させること
を特徴とする汚染土壌の浄化方法。
【請求項２４】オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｅｎａｓ
ｅ）を発現する微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ノカ
ルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ
ｅｒ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）
属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎａｕｓ）
属、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、ベ
ルキア（Ｗｅｌｃｈｉａ）属、メチロシスチス（Ｍｅｔ
ｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）属、ニトロゾモナス（Ｎｉｔｒ
ｏｓｏｍｏｎａｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、
トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、モラクセラ
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属に属する微生物のうち少なく
とも一種類であることを特徴とする請求項２３に記載の
汚染土壌の浄化方法。
【請求項２５】微生物が JM1（生命工学工業技術研究
所受託番号:FERM BP-5352号）であることを特徴とする
請求項２３に記載の汚染土壌の浄化方法。
【請求項２６】有機化合物が有機塩素化合物であるこ
とを特徴とする請求項２３に記載の汚染土壌の浄化方
法。
【請求項２７】有機塩素化合物がトリクロロエチレン
であることを特徴とする請求項２６に記載の汚染土壌の
浄化方法。
【請求項２８】栄養素の濃度を減少させて微生物の増
殖速度を低下させることを特徴とする請求項２３に記載
の汚染土壌の浄化方法。
【請求項２９】低化させた後の栄養素の濃度が０〜２
％であることを特徴とする請求項２８に記載の汚染土壌
の浄化方法。
【請求項３０】栄養素が有機酸であることを特徴とす
る請求項２８に記載の汚染土壌の浄化方法。
【請求項３１】有機酸が乳酸、リンゴ酸、ピルビン
酸、コハク酸、クエン酸、及びこれら有機酸の塩の１
つ、あるいはこれらの混合物からなることを特徴とする
請求項３０に記載の汚染土壌の浄化方法。
【請求項３２】貧栄養素を用いて微生物の増殖速度を
低下させることを特徴とする請求項２３に記載の汚染土
壌の浄化方法。
【請求項３３】貧栄養素が有機酸であることを特徴と
する請求項３１に記載の汚染土壌の浄化方法。
【請求項３４】有機酸がリンゴ酸、クエン酸、及びこ
れら有機酸の塩の１つ、あるいはこれらの混合物からな
ることを特徴とする請求項３２に記載の汚染土壌の浄化
方法。
【請求項３５】酸素濃度を変化させて微生物の増殖速
度を低下させることを特徴とする請求項２３に記載の汚
染土壌の浄化方法。
【請求項３６】変化させた後の酸素濃度が０〜２０％
であることを特徴とする請求項３５に記載の汚染土壌の
浄化方法。
【請求項３７】ｐＨを変化させて微生物の増殖速度を
低下させることを特徴とする請求項２３に記載の汚染土
壌の浄化方法。
【請求項３８】変化させた後のｐＨが６以下あるいは
８以上であることを特徴とする請求項３７に記載の汚染
土壌の浄化方法。
【請求項３９】増殖阻害をおこす物質を添加して微生
物の増殖速度を低下させることを特徴とする請求項２３
に記載の汚染土壌の浄化方法。
【請求項４０】増殖阻害をおこす物質が有機塩素化合
物であることを特徴とする請求項３９に記載の汚染土壌
の浄化方法。
【請求項４１】有機塩素化合物がトリクロロエチレン
であることを特徴とする請求項４０に記載の汚染土壌の
浄化方法。
【請求項４２】増殖阻害をおこす物質が過酸化水素で
あることを特徴とする請求項３９に記載の汚染土壌の浄
化方法。
【請求項４３】温度を変化させて微生物の増殖速度を
低下させることを特徴とする請求項２３に記載の汚染土
壌の浄化方法。
【請求項４４】変化させた後の温度が１５℃以下ある
いは３０℃以上であることを特徴とする請求項４３に記
載の汚染土壌の浄化方法。