JPH0952843A

JPH0952843A - 急性腎不全治療剤

Info

Publication number: JPH0952843A
Application number: JP7224614A
Authority: JP
Inventors: Fumiyoshi Takemoto; 文美竹本; Toshiya Uchida; 俊也内田; Kazuo Nosaka; 和男野坂; Kiyoshi Kurokawa; 清黒川
Original assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Current assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Priority date: 1995-08-09
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 1997-02-25

Abstract

(57)【要約】【課題】化学的橋かけを介してレシチンに結合したス
ーパーオキシドジスムターゼ（ＰＣ−ＳＯＤ）を有効成
分として含有する急性腎不全治療剤を提供する。【解決手段】次の一般式で示される、化学的橋かけを
介してレシチンに結合したスーパーオキシドジスムター
ゼ（ＰＣ−ＳＯＤ）を有効成分として含有する急性腎不
全治療剤。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m 式中、ＳＯＤはスーパオキシドジスムターゼを、Ｘはグ
リセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、そ
の２位の水酸基の水素原子を除いた残基を示す。ｍは１
以上の整数、ｎは２以上の整数をそれぞれ示す。【効果】経口あるいは非経口投与によって急性腎不全
症状を改善することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レシチン化スーパ
ーオキシドジスムターゼの新規な医薬用途に関する。更
に詳細には、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ
を急性腎不全治療剤として用いる発明に関する。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ＳＯＤと略記することもある）は、動物、植物、微生物
などの生体内に広く分布し、反応性に富む活性酸素であ
るスーパーオキシドアニオンラジカル（以下単にＯ₂ ^-と
略記することもある）を分解する酵素として知られてい
る。薬物の面では、抗リウマチ剤、心筋梗塞または臓器
移植の際の使用、抗血栓剤の使用後に生じるラジカルの
除去など種々の炎症への適用が期待されている。また、
最近では胃粘膜障害への適用も検討され、その効果が期
待されている（過酸化脂質研究、16巻、74頁 (1992
年))。ＳＯＤを静脈内投与した場合、細胞親和性が低
く、かつその血中半減期は僅か４〜６分とされており、
ＳＯＤは速やかに尿中に排泄される。ＳＯＤの血中半減
期を増大させるために、ＳＯＤをフィコール、ポリエチ
レングリコール、ラットアルブミン、デキストラン等で
修飾し、巨大分子化させることが試みられてきた。

【０００３】しかし、フィコールまたはポリエチレング
リコールで修飾されたＳＯＤはＳＯＤの酵素活性が大幅
に低下しかつ細胞親和性が低いこと、またラットアルブ
ミンで修飾されたＳＯＤには抗原性があることが報告さ
れている。また、デキストランによる修飾では、ＳＯＤ
の抗炎症作用の増強が認められるが、免疫原性を抑制す
る効果は認められていない。近年、ＳＯＤのような生物
活性蛋白をレシチン（ホスファチジルコリン。以下ＰＣ
と略記することもある。）で化学修飾した物質が報告さ
れている。このＰＣ結合修飾生物活性蛋白は、細胞親和
性が著しく上昇し、また生物体内分布も著しく異なるこ
とが報告されている。また、生物活性蛋白の薬理活性の
強化、副作用の低下、吸収促進が期待できると報告され
ている。またＰＣ化ＳＯＤ（以下ＰＣ−ＳＯＤと略記す
ることもある）が火傷の治癒を促進する効果を示すこと
が報告されている（特開平3-163100号公報；特開平3-17
0438号公報；米国特許第5,109,118 号明細書) 。更に、
抗原性等の副作用もなく、抗炎症剤として有用であると
いわれている。特開平6-54681 号公報には、Forssman抗
血清による呼吸抵抗に対する効果が挙げられている。ま
た、ＰＣ−ＳＯＤの潰瘍性胃腸障害に対する効果も報告
されている。また、筋萎縮性側索硬化症等の運動ニュー
ロン疾患に対するＰＣ−ＳＯＤの効果も報告されてい
る。

【０００４】近年、腎臓疾患の発症・進展に対する活性
酸素の役割が注目されている。活性酸素の１つであるス
ーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ₂ ^-）は、アラキド
ン酸の代謝過程、あるいは好中球やマクロファージのＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼ系等で産生される。また虚血によ
って血管内皮細胞中のキサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘ
Ｄ）がキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）に変換すると同
時に、ＡＴＰが分解してＸＯの基質となるヒポキサンチ
ンやキサンチンが増加し、そこへ再灌流によってＯ₂が
供給されると大量のＯ₂ ^-を生じ、組織傷害をおこすこと
が知られている。Ｏ₂ ^-はそれ自身が細胞傷害性を持って
いるだけでなくＨ₂Ｏ₂、ＯＨラジカル、さらには過酸化
脂質の発生源であること、最近では血管内皮細胞由来の
ＮＯと反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ^-）
となり、これも細胞傷害に働いていると考えられる。以
上のことより臨床の場においてはＯ₂ ^-を消去することが
重要であると考えられる。

【０００５】活性酸素の関与が示唆されている疾患の１
つに腎不全がある。Ｏ₂ ^-をはじめとする活性酸素がＸＯ
や好中球により産生され、尿細管を傷害し腎不全を生じ
させること、また腎不全により腎臓中のＳＯＤが減少し
ていることが示唆されている。腎不全とは、腎の血流
障害、機能ネフロンの減少、尿路の閉塞により、窒素代
謝物や水、電解質の排泄が十分にできなくなり、体液の
量的、質的恒常性が維持できなくなった状態をいう。臨
床的には血中の尿素窒素やクレアチニンが持続的に上昇
する状態と定義される。腎不全は、発症の経過により急
性腎不全と慢性腎不全とに分けられる。

【０００６】急性腎不全とは、種々の原因で急激な腎機
能の低下をきたす症候群で、通常、乏尿または無尿を伴
うが、乏尿を伴わず腎機能障害が進行する非乏尿性急性
腎不全もある。急性腎不全はその原因によって、全身的
な循環不全のため糸球体濾過圧が低下することによる腎
前性急性腎不全、腎実質病変による腎性急性腎不全、尿
路の閉塞や外部からの圧迫による腎後性急性腎不全に分
けられる。急性腎不全に対しては、Ｏ₂ ^-消去能を有する
ＳＯＤを投与することが有用であると考えられる。実
際、ＳＯＤを虚血再灌流腎不全モデル（後述）に投与し
た場合有効であった旨の報告がある（J. Clin. Invest.
vol.74, 1156-1164 (1984))。しかしながらＳＯＤは血
中半減期が短く、また細胞親和性が低いため十分な薬理
効果は期待できない。このためＳＯＤを腎不全治療に利
用するには大きな隔たりがあった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、ＰＣ−ＳＯＤを急性腎不全治療剤
として利用することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、急性腎不全のモデルである虚血再灌流
腎不全モデルを用いてＰＣ−ＳＯＤの投与を試み、その
結果急性腎不全症状を改善することを見いだし、本発明
を完成した。すなわち本発明は、ＰＣ−ＳＯＤを有効成
分とする急性腎不全治療剤に関するものであり、本発明
者は、本願において以下の請求項記載の発明を提供す
る。

【０００９】請求項１において、化学的橋かけを介して
レシチンに結合したスーパーオキシドジスムターゼを有
効成分として含む急性腎不全治療剤を提供する。請求項
２において、化学的橋かけを介してレシチンに結合した
スーパーオキシドジスムターゼが下記一般式（１）で表
される請求項１記載の急性腎不全治療剤を提供する。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m ・・・（１）ただし、 SOD ：スーパーオキシドジスムターゼＸ：グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチン
の、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基ｍ：１以上の整数ｎ：２以上の整数をそれぞれ表す。

【００１０】請求項３において、ＳＯＤが、111 位のア
ミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システイン
で示されるヒト由来のＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジ
スムターゼである請求項２記載の急性腎不全治療剤を提
供する。請求項４において、ｎが２〜１０の整数である
請求項２または３記載の急性腎不全治療剤を提供する。
請求項５において、ｎが３である請求項４記載の急性腎
不全治療剤を提供する。請求項６において、ｍが１〜１
６である請求項２〜５のいずれか１項に記載の急性腎不
全治療剤を提供する。請求項７において、ｍが４である
請求項６記載の急性腎不全治療剤を提供する。請求項８
において、急性腎不全が、腎前性急性腎不全である請求
項１〜７のいずれか１項に記載の急性腎不全治療剤を提
供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。〈１〉本発明に用いるＰＣ−ＳＯＤ本明細書において、「レシチン」という用語には、リゾ
レシチンも包含される。本発明の薬剤の有効成分である
ＰＣ−ＳＯＤは、通常、リゾレシチンの残基に化学的橋
かけ剤を結合させたレシチン誘導体を、ＳＯＤに１個以
上結合させて得ることができる。このＰＣ−ＳＯＤは次
式（１）で示される。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m ・・・（１）

【００１２】前記式（１）中のＸは、下記式（２）で表
されるグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチ
ンの、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基であ
る。 -O-CH(CH₂OR)[CH₂OP(O)(O^-)(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃) ］・・・（２）上記式（２）において、Ｒは脂肪酸残基（アシル基）で
あり、特に炭素数１０〜２８の飽和または不飽和の脂肪
酸残基が好ましく、より好ましいＲはミリストイル基、
パルミトイル基、ステアロイル基、その他の炭素数１４
〜２２の飽和脂肪酸残基であり、特に好ましいのは炭素
数１６の飽和脂肪酸残基であるパルミトイル基である。

【００１３】前記式（１）中、 -C(O)-(CH₂)_n-C(O)-
は、化学的橋かけ剤の残基を表す。この化学的橋かけ剤
の残基は、 HO-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-OHで表される直鎖状
ジカルボン酸、ジカルボン酸の無水物、ジカルボン酸の
エステル、ジカルボン酸のハロゲン化物、ジカルボン酸
の反応性誘導体等の化学的橋かけ剤の両水酸基（反応性
誘導体の場合はジカルボン酸の水酸基に対応する部分）
を除いた残基である。これはＳＯＤとレシチンとを結合
させているもので、本明細書ではこのようなものを総称
して化学的橋かけという。前記式（１）中の化学的橋か
けは、上記リゾレシチン残基と一端でエステル結合で結
合している。またこの化学的橋かけの他端は、ＳＯＤの
アミノ基とアミド結合などにより直接結合していると考
えられる。この式において-(CH₂)_n- は直鎖状アルカン
の両端の炭素原子から１個ずつ水素原子を除いてできる
２価基である。ｎは２以上の整数であり、好ましいｎは
２〜１０であり、特に好ましいｎは３である。また前記
式（１）中のｍは、化学的橋かけを介してＳＯＤ１分子
に結合したレシチンの平均個数を示している。ｍは１以
上の整数であり、ｍが１〜１６のものが好ましく、特に
好ましいのはｍが４のものである。

【００１４】前記式（１）で表されるＳＯＤは特に限定
されるものではないが、医薬品としてヒトに使用するこ
とから、抗原性の問題からみてヒト由来のものが好まし
く、ヒト由来のＣｕ／ＺｎＳＯＤ（以下、ヒトＣｕ／
ＺｎＳＯＤと略記することもある）が最も好ましい。
なお、本明細書において「Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ」とは、
「活性中心に銅と亜鉛を含むＳＯＤ」を意味する。本明
細書において「ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ」には、ヒト組
織から製造された天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤだけで
なく、遺伝子工学的手法により製造された、天然のヒト
Ｃｕ／ＺｎＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有す
る組換えヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤなども包含される。ヒ
トＣｕ／ＺｎＳＯＤとしていずれを用いてもよい。

【００１５】また天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの１１
１位のアミノ酸はシステインであるが、部位特異的変異
法により１１１位をセリンに変換したヒトＣｕ／Ｚｎ
ＳＯＤ（特開昭62-130684 号公報）や、化学的に１１１
位のシステインを修飾したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（特
開平6-199895号公報）が報告されており、いずれを用い
てもよいが、電荷的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活
性が安定である、 111位のシステインを化学修飾して、
例えばＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインと
したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤを用いることが好ましい。
なお、本明細書においては、このようにヒトＣｕ／Ｚｎ
ＳＯＤを部位特異的変異法等により一部のアミノ酸を
変換したものや、ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの一部のアミ
ノ酸を化学的に修飾して得られるものも含めて、単にヒ
トＣｕ／ＺｎＳＯＤという。

【００１６】レシチン誘導体のＳＯＤへの結合は、具体
的には特開平６−５４６８１号公報に記載された方法に
基づいておこなうことができ、これによりＰＣ−ＳＯＤ
が製造される。詳細は製造例に記す。

【００１７】なお本発明に用いるＰＣ−ＳＯＤは、薬学
上許容される塩であっても良い。具体的に用いることが
できる塩は、用いるＰＣ−ＳＯＤ分子の等電点によって
異なる。例えばＰＣ−ＳＯＤ分子の等電点が酸性の場合
はアルカリとの薬学上許容しうる塩が使用できる。ＰＣ
−ＳＯＤ分子の等電点がアルカリ性の場合は酸との薬学
上許容しうる塩が使用できる。例えば、１１１位をセリ
ンに変換したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの等電点は酸性で
あり、該ＳＯＤをＰＣ化して得られるＰＣ−ＳＯＤの等
電点も酸性である。このことから該ＰＣ−ＳＯＤとアル
カリとの塩（例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩、アンモニウム塩等）のうち、薬学上許容しうる塩を
使用することができる。

【００１８】〈２〉本発明の薬剤上記のようなＰＣ−ＳＯＤは、急性腎不全治療剤として
広く利用できる。本発明の急性腎不全治療剤の適応症と
しては、腎前性急性腎不全、腎性急性腎不全、腎後性急
性腎不全等を挙げることができ、特に好ましい適応症は
腎前性急性腎不全である。本発明の急性腎不全治療剤
は、含有するＰＣ−ＳＯＤの働きでこれらの疾患並びに
症状に対して改善作用を有する。なお、ここに挙げた疾
患名は例示であり、かかる例示疾患に本発明の急性腎不
全治療剤の適用範囲が限定されるものではない。また、
本発明の急性腎不全治療剤は、文字どおり急性腎不全の
治療に使用し得るが、純然とした治療目的のみならず、
当該疾患の予防目的にも用いることができる。すなわ
ち、本発明の急性腎不全治療剤は、当該疾患の「予防
剤」の概念をも包含する。

【００１９】本発明においては、対象となる疾患の性質
や進行段階に応じて、後述する剤形を本発明の急性腎不
全治療剤の剤形として適宜選択することが好ましい。本
発明の薬剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内
等）、経口、吸入等、投与方法によって、経口あるいは
非経口的に投与することができる。薬剤は投与方法に応
じ適宜製剤化することができる。剤形としては、注射剤
（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、ゲル
剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等が挙げら
れる。製剤調製に当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢
剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成
分を使用することができる。また本発明の薬剤において
は、ＰＣ−ＳＯＤと共に、ＰＣ−ＳＯＤの活性に影響を
与えない範囲でこれ以外の急性腎不全治療剤の成分等を
併用することもできる。

【００２０】本発明の急性腎不全治療剤中の有効成分
（ＰＣ−ＳＯＤ）の量および当該製剤の投与量は、当該
製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症
状（疾患の程度）、患者の体重等によって個別的であり
特に限定されないが、臨床量として成人１人１日当り
0.5〜10mg（1500〜30000Ｕ）を例示することができる。
また、上記製剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であ
り、３〜４回に分けて投与することも可能である。なお
本明細書中で１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ７．８、３０
℃下でチトクロームｃ法（キサンチン−キサンチンオキ
シダーゼ−チトクロームｃ系；J. Biol. Chem. vol.24
4, No.22, 6049-6055 (1969))により測定した、チトク
ロームｃの還元速度を５０％阻害するＰＣ−ＳＯＤの酵
素量を表す。

【００２１】以下に、本発明の薬剤の有効成分であるＰ
Ｃ−ＳＯＤの製造例および実施例により本発明を更に具
体的に説明する。しかし、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【製造例】〈１〉ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（111 位のアミノ酸がＳ
−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインで示される
ヒト由来のＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムター
ゼ）の調製該ＳＯＤは、特開平6-199895号公報に記載された方法で
調製した。具体的には次の通り行った。ヒトのＳＯＤの
遺伝子を導入することにより作成された、公知の大腸菌
５４５πＨＲ（ｐＨＴ３５１）を培養し、得られた培養
菌体を破砕し、ヒトＳＯＤの粗抽出液を得た。この粗抽
出液を硫安沈澱、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア
社製）カラム、硫安沈澱の順で精製し、０．２μｍフィ
ルターで濾過した濾液を凍結乾燥して無色の固体（組換
えヒトアポＳＯＤ）を得た。この組換えヒトアポＳＯＤ
を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、ビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド
を加えて、ｐＨを７．０に再調整した後、４℃で２４時
間攪拌した。これにＮａＣｌ、２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）及び０．１ＭＣｕＣｌ₂水溶液を加え、４℃で
１３時間攪拌した。攪拌後ｐＨを７．０に調整し、硫安
沈澱（４℃、１００％飽和）で生じた沈澱を集めた。こ
の沈澱を１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して透析して脱塩した。この画分
をＱ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラムに
通し、ＮａＣｌ濃度を５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５
０ｍＭの順に段階的に上昇させて展開し、ＳＯＤ画分を
集めた。このＳＯＤ画分を硫安沈澱（４℃、１００％飽
和）し、生じた沈澱を集めた。この沈澱を水溶液とし、
０．５ＭＮａＣｌ水溶液に対して透析し、次いで水に
対して透析し、凍結乾燥してヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤを
得た。このヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの111 位のアミノ酸
はＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなっ
ている。

【００２２】〈２〉ＰＣ−ＳＯＤの調製ＰＣ−ＳＯＤは、特開平6-54681 号公報に記載された方
法により調製した。具体的には次の方法で調製した。（１）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リ
ゾレシチンの活性エステル体の合成（１−１）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイ
ル）リゾレシチンの合成グリセロールの２位が水酸基であるリゾレシチンのクロ
ロホルム−ピリジン（８０ｍｌ／２０ｍｌ）懸濁液に、
ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン）、無水グ
ルタル酸を加え、６０℃で１５時間撹拌した。その後反
応液を減圧濃縮し、残渣にクロロホルム：メタノール：
水＝４：５：１を加えて溶解し、同液にて平衡化したイ
オン交換カラム（Dowex 50W-X8, ダウケミカル社) に通
した。ＴＬＣにより目的化合物を分画し、溶媒を減圧濃
縮した後、残渣をＯＤＳ（オクタデシルシラン）を充填
したカラムにより精製して、標記化合物を得た。（１−２）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイ
ル）リゾレシチンの活性エステル体の合成（１−１）で得られたカルボン酸をジクロロメタンに溶
解させて０℃に冷却し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、テトラゾールをこの順で加えた。次にＤＣＣ（１，
３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）をジクロロメタ
ンに溶解した溶液をゆっくり滴下し、室温で１５時間攪
拌した。不溶物をセライトで濾過し、活性エステル体の
ジクロロメタン溶液を得た。

【００２３】（２）ＳＯＤ１分子あたりレシチン誘導体
が平均４個結合したＰＣ−ＳＯＤの合成５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた製造
例〈１〉で製造したＳＯＤと、ＳＯＤの全アミノ基に対
して０．８倍モル量の上記（１）で合成した活性エステ
ル体とを次の方法により反応させた。活性エステル体溶
液のジクロロメタンを留去し、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド）に溶解させた。これを５０ｍＭほう酸
緩衝液（ｐＨ８．５）に添加し、不溶物を濾過後同一緩
衝液に溶解して０℃に冷却したＳＯＤ溶液に滴下した。
この時ＳＯＤ溶液にＤＭＦを５０％加えておいた。０℃
で１５時間攪拌後、反応液を濾過し、セファクリルＳ−
３００（ファルマシア社製）を担体としたゲル濾過カラ
ムに付し、反応緩衝液と同一の緩衝液で溶出し、ＰＣ−
ＳＯＤ溶出分画を集め、イオン交換クロマトグラフィー
により精製した。限外濾過により濃縮し、蛋白質濃度を
ローリー法(Lowry, O.h.ら、J. Biol. Chem., 193 巻,
265 頁 (1951年))、ＳＯＤの残存アミノ基をＴＮＢＳ法
（トリニトロベンゼンスルホン酸塩、Goodwin, J. F.
ら、Clin. Chem., 16 巻, 24頁 (1970年))で分析するこ
とにより、ＳＯＤ１分子あたりのレシチン誘導体の結合
数を求めたところ、平均４．０個であった。このＰＣ−
ＳＯＤの性状は青緑色〜緑色の澄明な水溶液であり、ｐ
Ｈは７〜８であった。また、分子量をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により調べたところ、ＰＣ−
ＳＯＤサブユニットのモノマー（ＰＣ−ＳＯＤはサブユ
ニットのホモダイマーである）あたり約１８０００であ
った。

【００２４】

【実施例１】前記製造例により調製したＰＣ−ＳＯＤ
（濃度３０ｍｇ／ｍｌ；比活性 3.07×10³Ｕ／蛋白 m
g)について毒性試験および薬効薬理試験を行った。ＰＣ
−ＳＯＤは５％マンニトール水溶液に終濃度５ｍｇ／ｍ
ｌになるように溶解した溶液（以下、ＰＣ−ＳＯＤ溶液
と略記することもある。）を使用した。このＰＣ−ＳＯ
Ｄ溶液の性状は、無色〜淡青緑色の澄明な溶液であり、
ｐＨは６〜８であった。また、生理食塩液に対する浸透
圧比は約１であった。

【００２５】〈急性毒性試験〉（１）ラットを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液をＳＤ系ラット雌雄各５匹に尾静脈か
ら１００ｍｇ／ｋｇ投与した。投与後１４日間、一般状
態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。１
５日目に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。その
結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖
検所見のいずれにおいても変化は認められなかったこと
から、静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致死量は１００
ｍｇ／ｋｇ以上と推定される。（２）サルを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液を雌のカニクイザル２頭に四肢の静脈
から１００ｍｇ／ｋｇ投与した。投与後１４日間、一般
状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重
のいずれにおいても変化は認められなかったことから、
静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致死量は１００ｍｇ／
ｋｇ以上と推定される。

【００２６】〈薬効薬理試験〉（１）急性腎不全のモデル（以下、虚血再灌流腎不全モ
デルともいう）の作成虚血再灌流腎不全モデルは、雄性
Wisterラット（体重 120〜180g）の右腎臓を摘出後、左
腎動脈を４５分間クランプする（クレンメではさむ）こ
とにより作成した。次に具体的手順を示す。ネンブタール（ダイナボット社製）を 0.1ml／100g体
重となるように腹腔内投与する。開腹する。右腎動静脈を結紮後、右腎を出血させないように摘出
する。左腎動脈をクレンメではさむ（虚血開始）。腹部を縫合し、放置する（虚血状態）。虚血開始から４５分後に左腎動脈のクレンメをはずす
（再灌流開始）。腹部を縫合する。このようにして作成した虚血再灌流腎不全モデルは、急
性腎不全のモデルである。またこのモデルは、腎動脈を
クランプして虚血状態（循環不全）にすることにより作
成することから、腎前性急性腎不全のモデルでもある。
このモデルを用いて、以下の薬効薬理試験を行った。

【００２７】（２）ＰＣ−ＳＯＤによる血清クレアチニ
ン濃度の用量依存的抑制効果上記のようにして作成した虚血再灌流腎不全モデルを用
いて、下記のようにＰＣ−ＳＯＤを投与した群（以下、
ＰＣ−ＳＯＤ投与群ともいう）、ＰＣ化してないＳＯＤ
（フリーのＳＯＤ）を投与した群（以下、フリーＳＯＤ
投与群ともいう）および、ＰＣ−ＳＯＤやフリーのＳＯ
Ｄを投与しない群（以下、非投与群ともいう）で、血清
クレアチニン濃度を腎臓機能の指標として、ＰＣ−ＳＯ
Ｄの薬効薬理試験を行った。蛋白代謝の終末代謝産物で
ある尿素、クレアチニン、尿酸などの含窒素物質の尿中
への排泄が腎臓の大きな機能の１つであり、糸球体濾過
の低下等により腎臓の機能が低下すると、血清クレアチ
ニン濃度が上昇する。逆に腎臓機能が改善されれば、血
清クレアチニン濃度が低下する。上記の虚血再灌流腎不
全モデルを用いた場合、血清クレアチニン濃度の上昇は
急性腎不全の状態を反映しており、逆に血清クレアチニ
ン濃度の低下は急性腎不全状態の改善を反映している。

【００２８】非投与群虚血開始１時間前に、尾静脈より５％マンニトールを
0.1ml／100g体重となるように投与する群である。用い
たラットは８匹である。フリーＳＯＤ投与群虚血開始１時間前に、尾静脈よりフリーのＳＯＤ（前記
製造例により調製した、ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（111
位のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）シス
テインで示されるヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジ
スムターゼ）を５％マンニトールで溶解したもの）を３
００Ｕ／ｋｇ投与する群（３００Ｕ／ｋｇ投与群；６
匹）、３０００Ｕ／ｋｇ投与する群（３０００Ｕ／ｋｇ
投与群；１０匹）、３００００Ｕ／ｋｇ投与する群（３
００００Ｕ／ｋｇ投与群；７匹）からなる。ＰＣ−ＳＯＤ投与群虚血開始１時間前に、尾静脈よりＰＣ−ＳＯＤ（５％マ
ンニトールで溶解したもの）を３０Ｕ／ｋｇ投与する群
（３０Ｕ／ｋｇ投与群；８匹）、３００Ｕ／ｋｇ投与す
る群（３００Ｕ／ｋｇ投与群；８匹）、３０００Ｕ／ｋ
ｇ投与する群（３０００Ｕ／ｋｇ投与群；７匹）、３０
０００Ｕ／ｋｇ投与する群（３００００Ｕ／ｋｇ投与
群；１０匹）からなる。

【００２９】非投与群、フリーＳＯＤ投与群、ＰＣ−Ｓ
ＯＤ投与群ともに、虚血再灌流腎不全モデルにおいて再
灌流開始２４時間後に、腹部大動脈から２ｍｌ採血し、
血漿中のクレアチニン濃度（本明細書においては「血清
クレアチニン濃度」ともいう）をベックマン・クレアチ
ニン・アナライザー２(Beckman creatinine analyzer2)
により測定し、各群における平均値を求めた。結果を
図１に示す。この結果から、ＰＣ−ＳＯＤ投与による血
清クレアチニン濃度の抑制が認められた。また、ＰＣ−
ＳＯＤ投与群のうち３０００Ｕ／ｋｇを投与した群、３
００００Ｕ／ｋｇを投与した群において、非投与群に比
較して血清クレアチニン濃度の有意な低下（危険率ｐ＜
０．０５）が見られた。また、３０〜３００００Ｕ／ｋ
ｇの範囲においてＰＣ−ＳＯＤが用量依存的に血清クレ
アチニン濃度を低下させることが示唆された。これに対
し、フリーＳＯＤ投与群においては、非投与群に対し血
清クレアチニン濃度の有意な低下は見られなかった。以
上の結果から、ＰＣ−ＳＯＤ投与による血清クレアチニ
ン濃度の低下（すなわち急性腎不全状態の改善）が認め
られ、またＰＣ−ＳＯＤを３０００Ｕ／ｋｇ以上投与す
ることにより、血清クレアチニン濃度を有意に低下させ
る（すなわち急性腎不全状態を有意に改善させる）こと
が示された。また、ＰＣ−ＳＯＤが用量依存的に血清ク
レアチニン濃度を抑制する（すなわち急性腎不全状態を
改善する）ことが示唆された。

【００３０】（３）ＰＣ−ＳＯＤ投与タイミングによる
血清クレアチニン濃度抑制効果上記（１）により作成した虚血再灌流腎不全モデルを用
いて、ＰＣ−ＳＯＤ１０００Ｕ／ｋｇを下記のタイミン
グで投与した群（以下、投与群ともいう）、ＰＣ−ＳＯ
Ｄを投与しない群（以下、非投与群ともいう）で、血清
クレアチニン濃度を急性腎不全状態の指標として、ＰＣ
−ＳＯＤの薬効薬理試験を行った。非投与群虚血開始１時間前に、尾静脈より５％マンニトールを
０．１ｍｌ／１００ｇ体重となるように投与する群であ
る。用いたラットは４匹である。投与群ＰＣ−ＳＯＤ（５％マンニトールで溶解したもの）１０
００Ｕ／ｋｇを、尾静脈より、虚血開始１時間前に投与
する群（虚血開始１時間前投与群；５匹）、虚血開始直
前に投与する群（虚血開始直前投与群；５匹）、再灌流
開始直後に投与する群（再灌流開始直後投与群；５
匹）、再灌流開始１時間後に投与する群（再灌流開始１
時間後投与群；５匹）からなる。

【００３１】非投与群、ＰＣ−ＳＯＤ投与群ともに、虚
血再灌流腎不全モデルにおいて再灌流開始２４時間後
に、腹部大動脈から２ｍｌ採血し、血清クレアチニン濃
度をベックマン・クレアチニン・アナライザー２（Beck
man creatinine analyzer 2)により測定し、各群におけ
る平均値を求めた。結果を図２に示す。この結果から、
非投与群に比べ、いずれの投与群においても血清クレア
チニン濃度の抑制が認められた。このことから、ＰＣ−
ＳＯＤ投与による急性腎不全状態の改善効果が認められ
た。またＰＣ−ＳＯＤの投与のタイミングが虚血前でも
再灌流後であっても、急性腎不全状態に対して改善効果
を有することが示唆された。なお、非投与群に比較して
虚血開始直前投与群および再灌流開始直後投与群は、危
険率ｐ＜０．０５で血清クレアチニン濃度の有意な低下
が認められた。また非投与群に比較して再灌流開始１時
間後投与群は危険率ｐ＜０．０１で血清クレアチニン濃
度の有意な低下が認められた。また、虚血開始１時間前
投与群に比較して再灌流開始１時間後投与群は、ｐ＜
０．０１の危険率で血清クレアチニン濃度の有意な低下
が認められた。

【００３２】（４）ＰＣ−ＳＯＤ投与による血清クレア
チニン濃度の経時的変化上記（１）により作成した虚血再灌流腎不全モデルを用
いて、ＰＣ−ＳＯＤ３０００Ｕ／ｋｇを下記のように投
与した群（以下、投与群ともいう）、ＰＣ−ＳＯＤを投
与しない群（以下、非投与群ともいう）で、血清クレア
チニン濃度の経時的変化を、急性腎不全状態の経時的変
化の指標として、ＰＣ−ＳＯＤの薬効薬理試験を行っ
た。なお、ここではＰＣ−ＳＯＤの溶解用溶媒として蒸
留水を用いた。非投与群虚血開始１時間前に、頸静脈より蒸留水を０．１ｍｌ／
１００ｇ体重となるように投与する群である。用いたラ
ットは５匹である。投与群ＰＣ−ＳＯＤ（蒸留水で溶解したもの）３０００Ｕ／ｋ
ｇを、頸静脈より、虚血開始１時間前に投与する群であ
る。用いたラットは５匹である。

【００３３】非投与群、ＰＣ−ＳＯＤ投与群ともに、虚
血再灌流腎不全モデルにおいて再灌流開始後０時間目、
２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目に、
腹部大動脈から２ｍｌ採血し、血清クレアチニン濃度を
ベックマン・クレアチニン・アナライザー２(Beckman c
reatinine analyzer 2) により測定し、各群における平
均値を求めた。結果を図３に示す。この結果から、非投
与群での血清クレアチニン濃度は０時間、２４時間、４
８時間、７２時間、９６時間で0.4→1.4→1.3→1.0→0.
4mg／dlと変動し、血清クレアチニン濃度の上昇を示し
たが、投与群では0.4→1.0→0.7→0.7→0.4mg/dlと変動
し、非投与群に比べて血清クレアチニン濃度の抑制が認
められた。このことから、ＰＣ−ＳＯＤ投与による急性
腎不全の改善効果が認められ、経時的には非投与群に比
べ血清クレアチニン濃度が低いまま推移することが示さ
れた。また本実施例で使用した虚血再灌流腎不全モデル
では、４日目には非投与群、投与群ともに血清クレアチ
ニン濃度が当初のレベルまで下がることも示された。以
上の結果から、ＰＣ−ＳＯＤが急性腎不全状態を改善す
ることが示された。

【００３４】

【実施例２】製剤例（１）注射剤前記製造例により調製したＰＣ−ＳＯＤ（３０ｍｇ／ｍ
ｌ）を、終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように５％マンニト
ール水溶液で溶解し、これを無菌濾過した後、２ｍｌづ
つアンプルに分注し密封した。

【００３５】（２）錠剤前記製造例により製造したＰＣ−ＳＯＤの凍結乾燥物１
００ｍｇ、乳糖６７０ｍｇ、バレイショデンプン１５０
ｍｇ、結晶セルロース６０ｍｇ、及び軽質無水ケイ酸５
０ｍｇを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース
３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロ
ピルセルロース１０重量％）を加えて練合造粒した。次
にこれを径０．８ｍｍのスクリーンで押出して顆粒状に
し、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５ｍｇを
加えて圧縮成型し、２００ｍｇの錠剤とした。

【００３６】（３）カプセル剤前記製造例により製造したＰＣ−ＳＯＤの凍結乾燥物１
００ｍｇ、バレイショデンプン１５０ｍｇ、軽質無水ケ
イ酸５０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１０ｍｇ、及
び乳糖７６５ｍｇを均一に混合し、この２００ｍｇを分
取して硬カプセルに充填した。

【００３７】

【発明の効果】本発明のＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする
薬剤は、腎前性急性腎不全をはじめとする急性腎不全症
状を改善する作用を持つため、急性腎不全治療剤として
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の虚血再灌流腎不全モデルにおけるＰ
Ｃ−ＳＯＤの抑制効果を示す。虚血開始１時間前にＰＣ
−ＳＯＤまたはフリーＳＯＤを投与した群及び非投与群
の再灌流開始２４時間後の血清クレアチニン濃度の平均
値を示す。

【符号の説明】

（Ａ）非投与群（Ｂ）ＰＣ−ＳＯＤ３０Ｕ／ｋｇ投与群（Ｃ）ＰＣ−ＳＯＤ３００Ｕ／ｋｇ投与群（Ｄ）ＰＣ−ＳＯＤ３０００Ｕ／ｋｇ投与群（Ｅ）ＰＣ−ＳＯＤ３００００Ｕ／ｋｇ投与群（Ｆ）フリーＳＯＤ３００Ｕ／ｋｇ投与群（Ｇ）フリーＳＯＤ３０００Ｕ／ｋｇ投与群（Ｈ）フリーＳＯＤ３００００Ｕ／ｋｇ投与群図中のバーは標準誤差を、また＊は非投与群に対してｐ
＜０．０５の危険率で有意差があることを示す。

【図２】実施例１の虚血再灌流腎不全モデルにおけるＰ
Ｃ−ＳＯＤの投与時期の影響を示す。虚血開始の前後に
ＰＣ−ＳＯＤを１０００Ｕ／ｋｇ投与した群及び非投与
群の再灌流開始２４時間後の血清クレアチニン濃度の平
均値を示す。

【符号の説明】

（Ａ）非投与群（Ｂ）虚血開始１時間前投与群（Ｃ）虚血開始直前投与群（Ｄ）再灌流開始直後投与群（Ｅ）再灌流開始１時間後投与群図中の●は血清クレアチニン濃度の実測値を、−は平均
値を示す。またｐ＜は有意差の危険率を示す。

【図３】実施例１の虚血再灌流腎不全モデルにおけるＰ
Ｃ−ＳＯＤ投与後の血清クレアチニン濃度の経時的変化
を示す。ＰＣ−ＳＯＤ非投与群（−ＰＣ−ＳＯＤ）及び
虚血開始１時間前にＰＣ−ＳＯＤ３０００Ｕ／ｋｇを
投与した群（＋ＰＣ−ＳＯＤ）の再灌流開始後０時間、
２４時間、４８時間、７２時間、９６時間における血清
クレアチニン濃度の平均値を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学的橋かけを介してレシチンに結合し
たスーパーオキシドジスムターゼを有効成分として含む
急性腎不全治療剤。
【請求項２】化学的橋かけを介してレシチンに結合し
たスーパーオキシドジスムターゼが下記一般式（１）で
表される請求項１記載の急性腎不全治療剤。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m ・・・（１）ただし、 SOD ：スーパーオキシドジスムターゼＸ：グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチン
の、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基ｍ：１以上の整数ｎ：２以上の整数をそれぞれ表す。
【請求項３】ＳＯＤが、111 位のアミノ酸がＳ−（２
−ヒドロキシエチルチオ）システインで示されるヒト由
来のＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼである
請求項２記載の急性腎不全治療剤。
【請求項４】ｎが２〜１０の整数である請求項２また
は３記載の急性腎不全治療剤。
【請求項５】ｎが３である請求項４記載の急性腎不全
治療剤。
【請求項６】ｍが１〜１６である請求項２〜５のいず
れか１項に記載の急性腎不全治療剤。
【請求項７】ｍが４である請求項６記載の急性腎不全
治療剤。
【請求項８】急性腎不全が、腎前性急性腎不全である
請求項１〜７のいずれか１項に記載の急性腎不全治療
剤。