JPH09295980A - 新規マクロライド系化合物０４０６ - Google Patents
新規マクロライド系化合物０４０６Info
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- JPH09295980A JPH09295980A JP8130633A JP13063396A JPH09295980A JP H09295980 A JPH09295980 A JP H09295980A JP 8130633 A JP8130633 A JP 8130633A JP 13063396 A JP13063396 A JP 13063396A JP H09295980 A JPH09295980 A JP H09295980A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/58—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound through only acyclic carbon atoms to a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. bleomycin, phleomycin
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/365—Nocardia
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 下記化１に示される化学構造式を有する
化合物０４０６又はその医薬的に許容される塩。 【化１】 （式中、Ｒ1は−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ又はＨ、Ｒ2は−Ｃ
Ｏ(ＣＨ2)3ＣＨ3又は−ＣＯ(ＣＨ2)4ＣＨ3又はＨであ
る。） 【効果】 すぐれた免疫抑制作用を有する。
化合物０４０６又はその医薬的に許容される塩。 【化１】 （式中、Ｒ1は−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ又はＨ、Ｒ2は−Ｃ
Ｏ(ＣＨ2)3ＣＨ3又は−ＣＯ(ＣＨ2)4ＣＨ3又はＨであ
る。） 【効果】 すぐれた免疫抑制作用を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規化合物０４０
６、その製造法、生産菌及び用途に関するものである。
新規化合物０４０６は、微生物、特に放線菌の培養物か
ら分離採取された従来未知の新規マクロライド系化合物
であって、すぐれた生理活性、特にすぐれた免疫抑制作
用を有するものである。したがって、本発明に係る新規
マクロライド系化合物は、免疫抑制剤、例えば臓器移
植、皮膚移植における拒絶反応の抑制や自己免疫疾患の
予防及び／又は治療剤として有効に利用することができ
る。
６、その製造法、生産菌及び用途に関するものである。
新規化合物０４０６は、微生物、特に放線菌の培養物か
ら分離採取された従来未知の新規マクロライド系化合物
であって、すぐれた生理活性、特にすぐれた免疫抑制作
用を有するものである。したがって、本発明に係る新規
マクロライド系化合物は、免疫抑制剤、例えば臓器移
植、皮膚移植における拒絶反応の抑制や自己免疫疾患の
予防及び／又は治療剤として有効に利用することができ
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、アレルギー性疾患、膠原病、自己
免疫性疾患あるいは結合組織病と称される一群の病態に
種々の免疫抑制剤が使用されその効果に注目が集まって
いる。同様に肝臓、心臓、腎臓等の臓器移植の際の拒絶
反応抑制にも適用され、年々その重要性を増している。
免疫性疾患あるいは結合組織病と称される一群の病態に
種々の免疫抑制剤が使用されその効果に注目が集まって
いる。同様に肝臓、心臓、腎臓等の臓器移植の際の拒絶
反応抑制にも適用され、年々その重要性を増している。
【０００３】この分野におけるある種の免疫細胞に特異
性及び選択性の高い薬物として開発された物質として、
シクロスポリンＡ（A. Rciegger et al, Agents and Ac
tions, vol.6, pp.468-475(1976)）が開発されており、
シクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞のインターロイキ
ン２（ＩＬ−２）産生を抑制するが、サプレッサーＴ細
胞を抑制せず、その結果移植片の拒絶を阻止することが
明らかにされ、現在、腎臓、骨髄移植等の臓器移植で著
しい成果を上げ、臨床で使用されている。しかし、この
薬物は場合によって急性腎中毒、軽度の神経病変、歯肉
肥厚等の副作用を生じせしめる等の問題が指摘されてい
る。
性及び選択性の高い薬物として開発された物質として、
シクロスポリンＡ（A. Rciegger et al, Agents and Ac
tions, vol.6, pp.468-475(1976)）が開発されており、
シクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞のインターロイキ
ン２（ＩＬ−２）産生を抑制するが、サプレッサーＴ細
胞を抑制せず、その結果移植片の拒絶を阻止することが
明らかにされ、現在、腎臓、骨髄移植等の臓器移植で著
しい成果を上げ、臨床で使用されている。しかし、この
薬物は場合によって急性腎中毒、軽度の神経病変、歯肉
肥厚等の副作用を生じせしめる等の問題が指摘されてい
る。
【０００４】また、１９８４年に発見されたマクロライ
ド抗生物質タクロリムス（tacrorims ; FK506）（T. Ki
no et al, J. Antibiot., vol.40, pp.1249-1255(198
7)）は免疫抑制剤として好ましい結果が得られている。
しかし、生産性が低いことやタクロリムス関連物質が微
量に同時生産されることなどからタクロリムスの生産性
の向上などの問題があり、今後の発展の制約条件となる
可能性が大きいこと、さらに、本剤においても膵臓及び
腎臓への障害があること、また、シクロスポリンＡとの
作用点が類似していることもあり、より安全性の高い、
作用点の異なる新規物質の開発が強く望まれていた。
ド抗生物質タクロリムス（tacrorims ; FK506）（T. Ki
no et al, J. Antibiot., vol.40, pp.1249-1255(198
7)）は免疫抑制剤として好ましい結果が得られている。
しかし、生産性が低いことやタクロリムス関連物質が微
量に同時生産されることなどからタクロリムスの生産性
の向上などの問題があり、今後の発展の制約条件となる
可能性が大きいこと、さらに、本剤においても膵臓及び
腎臓への障害があること、また、シクロスポリンＡとの
作用点が類似していることもあり、より安全性の高い、
作用点の異なる新規物質の開発が強く望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、従来既知の物質よりも更にすぐれた新規物質を開発
する目的でなされたものである。
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、従来既知の物質よりも更にすぐれた新規物質を開発
する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な免
疫抑制剤を得ることを目的として、天然物、特に微生物
の代謝産物について広く検索を行い、より有効な免疫抑
制作用を有する物質について検索を行った結果、本発明
者らは新規な菌株Nocardia brasiliensis IFM0406株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９８）が培養液中に目的とする
性質を有する物質を蓄積することを発見した。そして更
に本物質についてその理化学的性質を詳細に調べ、化学
構造を明らかにしたところ、従来未知の新規物質である
ことが確認された。本物質は請求項１に記載した様に、
一般式（１）で示されるエポキサイドを持つ３２員環マ
クロライド系化合物にデオキシフコースが結合した新規
化合物であった。発明者らは該化合物を０４０６と命名
した。
疫抑制剤を得ることを目的として、天然物、特に微生物
の代謝産物について広く検索を行い、より有効な免疫抑
制作用を有する物質について検索を行った結果、本発明
者らは新規な菌株Nocardia brasiliensis IFM0406株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９８）が培養液中に目的とする
性質を有する物質を蓄積することを発見した。そして更
に本物質についてその理化学的性質を詳細に調べ、化学
構造を明らかにしたところ、従来未知の新規物質である
ことが確認された。本物質は請求項１に記載した様に、
一般式（１）で示されるエポキサイドを持つ３２員環マ
クロライド系化合物にデオキシフコースが結合した新規
化合物であった。発明者らは該化合物を０４０６と命名
した。
【０００７】すなわち本発明は、下記化２に示される一
般式（１）を有する新規な化合物０４０６又は医薬的に
許容し得る塩に関するものである。
般式（１）を有する新規な化合物０４０６又は医薬的に
許容し得る塩に関するものである。
【０００８】
【化２】
【０００９】（但し式中、Ｒ1は−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ又
はＨ、Ｒ2は−ＣＯ(ＣＨ2)3ＣＨ3又は−ＣＯ(ＣＨ2)4Ｃ
Ｈ3又はＨである。）
はＨ、Ｒ2は−ＣＯ(ＣＨ2)3ＣＨ3又は−ＣＯ(ＣＨ2)4Ｃ
Ｈ3又はＨである。）
【００１０】また、本発明は、新規マクロライド化合物
０４０６又はその薬理学的に許容される塩を有効成分と
する新規免疫抑制剤にも関するものである。以下、本発
明について詳述する。
０４０６又はその薬理学的に許容される塩を有効成分と
する新規免疫抑制剤にも関するものである。以下、本発
明について詳述する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明に係る化合物０４０６は、
混合物であって、現時点においては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆの６種の化合物が分離されている。これらの化合
物の内、化合物０４０６−Ａは、一般式（１）において
Ｒ1が−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、Ｒ2が−ＣＯ(ＣＨ2)3ＣＨ3
で示される化合物であって、その物理化学的性質は下記
表１、表２に示される。
混合物であって、現時点においては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆの６種の化合物が分離されている。これらの化合
物の内、化合物０４０６−Ａは、一般式（１）において
Ｒ1が−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、Ｒ2が−ＣＯ(ＣＨ2)3ＣＨ3
で示される化合物であって、その物理化学的性質は下記
表１、表２に示される。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】また、化合物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆについて
も、ＦＡＢ−ＭＳ、ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳでの分析を行
い、分子量を測定するとともに、それぞれ分子式を推定
し、請求項に記載した構造式を推定した。その結果を以
下に示す。 ０４０６−Ｂ：Ｃ52Ｈ90Ｏ23（１０８２） ０４０６−Ｃ：Ｃ54Ｈ96Ｏ21（１０８０） ０４０６−Ｄ：Ｃ49Ｈ88Ｏ20（ ９９６） ０４０６−Ｅ：Ｃ58Ｈ100Ｏ24(１１８０） ０４０６−Ｆ：Ｃ55Ｈ98Ｏ21（１０９４）
も、ＦＡＢ−ＭＳ、ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳでの分析を行
い、分子量を測定するとともに、それぞれ分子式を推定
し、請求項に記載した構造式を推定した。その結果を以
下に示す。 ０４０６−Ｂ：Ｃ52Ｈ90Ｏ23（１０８２） ０４０６−Ｃ：Ｃ54Ｈ96Ｏ21（１０８０） ０４０６−Ｄ：Ｃ49Ｈ88Ｏ20（ ９９６） ０４０６−Ｅ：Ｃ58Ｈ100Ｏ24(１１８０） ０４０６−Ｆ：Ｃ55Ｈ98Ｏ21（１０９４）
【００１５】本発明に係る化合物０４０６は、例えば新
規なNocardia brasiliensis IFM 0406株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４９８）によって生産される。
規なNocardia brasiliensis IFM 0406株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４９８）によって生産される。
【００１６】Nocardia brasiliensis IFM 0406株の菌学
的性質は、形態学的にはオートミール寒天培地（ISP N
o.3）で培養した時の、アクチノミセーテス（Actinomyc
etes）の一種に見られる様な、分岐した長い菌糸と気中
菌糸体を有している。培養時間を長くすることによっ
て、気中菌糸の先端に数個の胞子が観察され、さらに栄
養菌糸の断裂が観察された。栄養菌糸の断裂が観察され
たことから形態学的にはNocardia属に属するものと推定
された。各種培地でのNocardia brasiliensis IFM 0406
株の培養的性質を下記表３に示した。また、生理学的性
質について下記表４に示した。
的性質は、形態学的にはオートミール寒天培地（ISP N
o.3）で培養した時の、アクチノミセーテス（Actinomyc
etes）の一種に見られる様な、分岐した長い菌糸と気中
菌糸体を有している。培養時間を長くすることによっ
て、気中菌糸の先端に数個の胞子が観察され、さらに栄
養菌糸の断裂が観察された。栄養菌糸の断裂が観察され
たことから形態学的にはNocardia属に属するものと推定
された。各種培地でのNocardia brasiliensis IFM 0406
株の培養的性質を下記表３に示した。また、生理学的性
質について下記表４に示した。
【００１７】
【表３】
【００１８】
【表４】
【００１９】本菌株を培地（ブレインハート、インフュ
ージョン含２％グルコース）中で、２５０ｒｐｍで３０
℃、７２時間振とう培養した培地中に生育した菌体を遠
心分離（３０００ｒｐｍ×１０分）で集め、蒸留水で２
回洗浄した。更に菌体をエタノールで洗い、次いで、真
空乾燥し、乾燥菌体とした。この乾燥菌体のアミノ酸組
成、糖組成、脂質組成をBergey's Manual of Determina
tive Bacteriology 9th ed, Williams ＆ Willkins, Ba
ltimore, 1993に基づいて測定した。アミノ酸分析結果
よりメソ−ジアミノピメリン酸、糖分析結果よりアラビ
ノース、ガラクトースが検出された。また、脂質分析の
結果からミコール酸の存在が確認され、そのＴｙｐｅは
Nocardia Typeであった。菌体脂質の一部であるイソプ
レノイド・キノンは主たる成分としてＭＫ−８（Ｈ４）
ｃｙｃｌｅ、また微量成分としてＭＫ−８（Ｈ４）、Ｍ
Ｋ−８（Ｈ）、ＭＫ−９（Ｈ２）が確認された。また、
第４表に示したアデニン、カゼイン、ヒポキサンチン、
チロシンの資化性、さらには糖から酸の産出パターン及
び抗菌剤に対する感受性のパターン（Mikami ＆ Yazaw
a, Susceptibility pattern of pathogenic Nocardia t
o some selected antimicrobial agents and their use
fulness in the identification work in a clinical l
aboratory : Bull. JFCC「日本微生物株保存連盟会誌」
５：８９、１９８９）から、本菌株をN. brasiliensis
と同定した。また下記表５に示したＧ＋Ｃ含量及びＤＮ
Ａ相同性の検討結果も、本菌がN. brasiliensisである
ことを強く支持するものであった。
ージョン含２％グルコース）中で、２５０ｒｐｍで３０
℃、７２時間振とう培養した培地中に生育した菌体を遠
心分離（３０００ｒｐｍ×１０分）で集め、蒸留水で２
回洗浄した。更に菌体をエタノールで洗い、次いで、真
空乾燥し、乾燥菌体とした。この乾燥菌体のアミノ酸組
成、糖組成、脂質組成をBergey's Manual of Determina
tive Bacteriology 9th ed, Williams ＆ Willkins, Ba
ltimore, 1993に基づいて測定した。アミノ酸分析結果
よりメソ−ジアミノピメリン酸、糖分析結果よりアラビ
ノース、ガラクトースが検出された。また、脂質分析の
結果からミコール酸の存在が確認され、そのＴｙｐｅは
Nocardia Typeであった。菌体脂質の一部であるイソプ
レノイド・キノンは主たる成分としてＭＫ−８（Ｈ４）
ｃｙｃｌｅ、また微量成分としてＭＫ−８（Ｈ４）、Ｍ
Ｋ−８（Ｈ）、ＭＫ−９（Ｈ２）が確認された。また、
第４表に示したアデニン、カゼイン、ヒポキサンチン、
チロシンの資化性、さらには糖から酸の産出パターン及
び抗菌剤に対する感受性のパターン（Mikami ＆ Yazaw
a, Susceptibility pattern of pathogenic Nocardia t
o some selected antimicrobial agents and their use
fulness in the identification work in a clinical l
aboratory : Bull. JFCC「日本微生物株保存連盟会誌」
５：８９、１９８９）から、本菌株をN. brasiliensis
と同定した。また下記表５に示したＧ＋Ｃ含量及びＤＮ
Ａ相同性の検討結果も、本菌がN. brasiliensisである
ことを強く支持するものであった。
【００２０】
【表５】
【００２１】このように本菌株は、Nocardia brasilien
sisに分類されるが、化合物０４０６を生産することで
きわめて特徴的であるので、これを新菌株としてNocard
ia brasiliensis IFM 0406と命名し、工業技術院生命工
学工業技術研究所に国際寄託した（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４９８）。したがって、本発明は、一般式（１）に示し
た新規化合物０４０６を生産する新規菌株Nocardia bra
siliensis IFM 0406株に関するものである。
sisに分類されるが、化合物０４０６を生産することで
きわめて特徴的であるので、これを新菌株としてNocard
ia brasiliensis IFM 0406と命名し、工業技術院生命工
学工業技術研究所に国際寄託した（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４９８）。したがって、本発明は、一般式（１）に示し
た新規化合物０４０６を生産する新規菌株Nocardia bra
siliensis IFM 0406株に関するものである。
【００２２】本発明に係る化合物０４０６は、新規なN.
brasiliensis IFM 0406（ＦＥＲＭＢＰ−５４９８）株
によって生産されるほか、Nocardia属に属する他の菌
株、例えばNocardia transvalensis等によっても生産さ
れることが確認されており、化合物０４０６の生産はこ
れらの微生物のみに限定されるものではない。また、本
発明は、これらの微生物からＸ線照射、紫外線照射、γ
線照射、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリ
ン、エチルメタンスルホネート等の変異処理により取得
できる人工変異株ならびに自然変異株を含めて化合物０
４０６を生産しうるすべての変異株の使用も広く包含す
るものである。
brasiliensis IFM 0406（ＦＥＲＭＢＰ−５４９８）株
によって生産されるほか、Nocardia属に属する他の菌
株、例えばNocardia transvalensis等によっても生産さ
れることが確認されており、化合物０４０６の生産はこ
れらの微生物のみに限定されるものではない。また、本
発明は、これらの微生物からＸ線照射、紫外線照射、γ
線照射、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリ
ン、エチルメタンスルホネート等の変異処理により取得
できる人工変異株ならびに自然変異株を含めて化合物０
４０６を生産しうるすべての変異株の使用も広く包含す
るものである。
【００２３】本発明に係る一般式（１）で示される新規
化合物０４０６は、化学合成法によって製造できるほ
か、上記のように微生物によっても製造することができ
る。
化合物０４０６は、化学合成法によって製造できるほ
か、上記のように微生物によっても製造することができ
る。
【００２４】後者の場合、本発明に係る一般式（１）で
示される新規化合物０４０６はNocardia属に属する該化
合物生産菌、例えばNocardia brasiliensis IFM 0406が
資化しうる炭素源及び窒素源を含む培地で培養して製造
することが出来るが、好気的深部培養条件（例えば振と
う培養、通気攪拌培養等）で生産せしめることが好まし
い。
示される新規化合物０４０６はNocardia属に属する該化
合物生産菌、例えばNocardia brasiliensis IFM 0406が
資化しうる炭素源及び窒素源を含む培地で培養して製造
することが出来るが、好気的深部培養条件（例えば振と
う培養、通気攪拌培養等）で生産せしめることが好まし
い。
【００２５】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、シュークロース、澱粉、デキストリンその他の炭水
化物を使用することが好ましい。窒素源としては、オー
トミール、イースト抽出物、牛肉抽出物、ツナ肉抽出
物、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆ミール、
コーンスティープリカー、乾燥イースト、小麦胚芽、落
花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
が出来る。
ル、シュークロース、澱粉、デキストリンその他の炭水
化物を使用することが好ましい。窒素源としては、オー
トミール、イースト抽出物、牛肉抽出物、ツナ肉抽出
物、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆ミール、
コーンスティープリカー、乾燥イースト、小麦胚芽、落
花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ
酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用すること
が出来る。
【００２６】これらの炭素源及び窒素源は併用すること
が有利であるが、必ずしも純粋なものを使用する必要は
ない。純粋でないものには、生長因子や微量要素が含ま
れるているため、これを使用することが望ましい為であ
る。必要ならば、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような無機
塩類を培地に添加することが出来る。必要ならば、特
に、培地が発泡するのであれば、液体パラフィン、動物
油、植物油、鉱物油、シリコン等の消泡剤を加えること
が出来る。
が有利であるが、必ずしも純粋なものを使用する必要は
ない。純粋でないものには、生長因子や微量要素が含ま
れるているため、これを使用することが望ましい為であ
る。必要ならば、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような無機
塩類を培地に添加することが出来る。必要ならば、特
に、培地が発泡するのであれば、液体パラフィン、動物
油、植物油、鉱物油、シリコン等の消泡剤を加えること
が出来る。
【００２７】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
化合物０４０６の生産工程において菌の生育遅延を防止
するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培
養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこ
で生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用
する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者と
もに同一であってもよいし必要があれば両者を変えても
よい。
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
化合物０４０６の生産工程において菌の生育遅延を防止
するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培
養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこ
で生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用
する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者と
もに同一であってもよいし必要があれば両者を変えても
よい。
【００２８】培養は、通気攪拌条件で行うのが好まし
く、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメ
ンターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み
等既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌し
ておくのが良い。
く、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメ
ンターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み
等既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌し
ておくのが良い。
【００２９】培養温度は、化合物０４０６生産菌が本物
質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常は１０〜４
０℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのがよい。培
養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが、通常
は約１日〜１週間である。
質を生産する範囲で適宜変更しうるが、通常は１０〜４
０℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのがよい。培
養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが、通常
は約１日〜１週間である。
【００３０】発酵終了後、培養物から目的とする化合物
０４０６を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／
又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又
は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又
は有機溶媒で抽出した後、既法に従って回収、精製す
る、培養液の場合は、直接、溶媒で抽出してもよいし、
また、培養液の濾過又は遠心分離後、減圧濃縮、凍結乾
燥、ｐＨ調節、アニオン又はカチオン交換樹脂、活性
炭、粉末セルロース、シリカゲル、アルミナ、吸着性樹
脂等の担体に接触させて化合物０４０６を吸着させた
後、これを担体から溶出すればよい。
０４０６を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／
又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又
は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又
は有機溶媒で抽出した後、既法に従って回収、精製す
る、培養液の場合は、直接、溶媒で抽出してもよいし、
また、培養液の濾過又は遠心分離後、減圧濃縮、凍結乾
燥、ｐＨ調節、アニオン又はカチオン交換樹脂、活性
炭、粉末セルロース、シリカゲル、アルミナ、吸着性樹
脂等の担体に接触させて化合物０４０６を吸着させた
後、これを担体から溶出すればよい。
【００３１】回収、精製方法としては、抗生物質採取の
際の常法が適宜利用され、例えば、水、有機溶媒これら
の混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一
溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独である
いは組合わせて使用できる。
際の常法が適宜利用され、例えば、水、有機溶媒これら
の混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単一
溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独である
いは組合わせて使用できる。
【００３２】化合物０４０６の回収、精製は上記の様に
既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の様にして
もよい。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜で処理す
ることによって菌体を除いた後、疎水性の吸着樹脂に吸
着させ、吸着画分をメタノールで溶出し、この溶出画分
を減圧濃縮し、更に、シリカゲルクロマトグラフィーに
供し、吸着させ、クロロホルム−メタノール溶液で段階
的溶出操作を行い、分画し、更に分画画分を逆相クロマ
トグラフィーにより分画精製し、必要があれば凍結乾燥
すればよい。
既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の様にして
もよい。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜で処理す
ることによって菌体を除いた後、疎水性の吸着樹脂に吸
着させ、吸着画分をメタノールで溶出し、この溶出画分
を減圧濃縮し、更に、シリカゲルクロマトグラフィーに
供し、吸着させ、クロロホルム−メタノール溶液で段階
的溶出操作を行い、分画し、更に分画画分を逆相クロマ
トグラフィーにより分画精製し、必要があれば凍結乾燥
すればよい。
【００３３】本発明化合物０４０６を医薬として投与す
る場合、本発明化合物０４０６は水溶性である為製剤化
する際有利であり、本発明化合物をそのまま又は医薬的
に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば、
０．１％〜９９．５％好ましくは０．５％〜９０％含有
する医薬組成物として投与される。
る場合、本発明化合物０４０６は水溶性である為製剤化
する際有利であり、本発明化合物をそのまま又は医薬的
に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば、
０．１％〜９９．５％好ましくは０．５％〜９０％含有
する医薬組成物として投与される。
【００３４】担体としては、固形、半固形、又は液状の
希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が
用いられる。医薬組成物は、投与単位形態で投与するこ
とが望ましい。本発明医薬組成物は、経口投与、組織内
投与、局所投与（経皮投与等）、又は経直腸的に投与す
る事ができるが、外用剤としても使用できる。これらの
投与方法に適した剤型で投与されるのはもちろんであ
る。
希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が
用いられる。医薬組成物は、投与単位形態で投与するこ
とが望ましい。本発明医薬組成物は、経口投与、組織内
投与、局所投与（経皮投与等）、又は経直腸的に投与す
る事ができるが、外用剤としても使用できる。これらの
投与方法に適した剤型で投与されるのはもちろんであ
る。
【００３５】免疫抑制剤としての用量は、年齢、体重等
の患者の状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮し
た上で調整することが望ましいが、通常は、成人に対し
て本発明の有効成分量として、一日当たり、１０〜２０
０ｍｇ範囲が一般的である。場合によっては、これ以下
で足りるしまた逆にこれ以上の用量を必要とする事もあ
る。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与す
ることが望ましい。
の患者の状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮し
た上で調整することが望ましいが、通常は、成人に対し
て本発明の有効成分量として、一日当たり、１０〜２０
０ｍｇ範囲が一般的である。場合によっては、これ以下
で足りるしまた逆にこれ以上の用量を必要とする事もあ
る。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与す
ることが望ましい。
【００３６】経口投与は固形又は液状の用量単位、例え
ば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ
剤、舌下錠その他の剤型によって行う事ができる。
ば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ
剤、舌下錠その他の剤型によって行う事ができる。
【００３７】末剤は、活性物質を適当な細かさにする事
により製造される。散剤は活性物質を適当な細かさと成
し、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱
粉、マンニトールの如き可食性炭水化物その他と混合す
ることにより製造される。必要に応じて風味剤、保存
剤、分散剤、着色剤、香料その他のものを混じても良
い。
により製造される。散剤は活性物質を適当な細かさと成
し、次いで同様に細かくした医薬用担体、例えば、澱
粉、マンニトールの如き可食性炭水化物その他と混合す
ることにより製造される。必要に応じて風味剤、保存
剤、分散剤、着色剤、香料その他のものを混じても良
い。
【００３８】カプセル剤は、まず粉末状となった末剤や
散剤あるいは顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセ
ルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造
される。滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状のシリ
カ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
カルシウム、固形のポリエチレングリコールの如きもの
を粉末状態のものに混合し、然るのちに充填操作を行う
事もできる。崩壊剤や可溶化剤、例えばカルボキシメチ
ルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加
すれば、カプセル剤が摂取された時の医薬の有効性を改
善できる。また、本品の微粉末を植物油、ポリエチレン
グリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、
これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤とすること
もできる。
散剤あるいは顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセ
ルのようなカプセル外皮の中へ充填することにより製造
される。滑沢剤や流動化剤、例えばコロイド状のシリ
カ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
カルシウム、固形のポリエチレングリコールの如きもの
を粉末状態のものに混合し、然るのちに充填操作を行う
事もできる。崩壊剤や可溶化剤、例えばカルボキシメチ
ルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムを添加
すれば、カプセル剤が摂取された時の医薬の有効性を改
善できる。また、本品の微粉末を植物油、ポリエチレン
グリコール、グリセリン、界面活性剤中に懸濁分散し、
これをゼラチンシートで包んで軟カプセル剤とすること
もできる。
【００３９】錠剤は粉末混合物を作り、顆粒化若しくは
スラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打錠
することにより製造される。
スラグ化し、次いで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打錠
することにより製造される。
【００４０】粉末混合物は、適当に粉末化された物質を
上述の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤（例
えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン
酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコールなど）、溶解遅延化剤（例えばパラフィンな
ど）、再吸収剤（例えば四級塩）及び／又は吸着剤（例
えばベントナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムな
ど）を併用してもよい。粉末混合物は、まずシロップ、
でんぷん糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子
物質溶液などの結合剤で湿らせ、次いで篩を強制通過さ
せて顆粒とする事ができる。このように粉末を顆粒化す
るかわりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全
な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能であ
る。
上述の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤（例
えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン
酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコールなど）、溶解遅延化剤（例えばパラフィンな
ど）、再吸収剤（例えば四級塩）及び／又は吸着剤（例
えばベントナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムな
ど）を併用してもよい。粉末混合物は、まずシロップ、
でんぷん糊、アラビアゴム、セルロース溶液又は高分子
物質溶液などの結合剤で湿らせ、次いで篩を強制通過さ
せて顆粒とする事ができる。このように粉末を顆粒化す
るかわりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全
な形態のスラグを破砕して顆粒にすることも可能であ
る。
【００４１】このようにして作れる顆粒は、滑沢剤とし
てステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオ
イルその他を添加することにより、互いに付着する事を
防ぐ事ができる。このような滑沢化された混合物を、次
いで打錠する。また薬物は、上述のように顆粒化やスラ
グ化の工程を経ることなく、流動性の不活性担体と結合
したのちに直接打錠しても良い。シェラックの密閉被膜
からなる透明又は半透明の保護被膜、糖や高分子材料の
被覆、及びワックスよりなる磨上被覆の如きも用いう
る。
てステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、ミネラルオ
イルその他を添加することにより、互いに付着する事を
防ぐ事ができる。このような滑沢化された混合物を、次
いで打錠する。また薬物は、上述のように顆粒化やスラ
グ化の工程を経ることなく、流動性の不活性担体と結合
したのちに直接打錠しても良い。シェラックの密閉被膜
からなる透明又は半透明の保護被膜、糖や高分子材料の
被覆、及びワックスよりなる磨上被覆の如きも用いう
る。
【００４２】他の経口投与剤型、例えば溶液、シロッ
プ、エリキシルなどもまたその一定量が含有するように
用量単位形態にする事ができる。シロップは、化合物を
適当な香味化水溶液に溶解して製造され、またエリキシ
ルは非毒性のアルコール性担体中に分散させることによ
り処方される。可溶化剤や乳化剤（例えばエトキシ化さ
れたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレン
ソルビトールエステル類、保存剤、風味賦与剤（例えば
ペパミント油、サッカリン）その他もまた必要に応じて
添加できる。必要とあれば、経口投与のための用量単位
処方はマイクロカプセル化してもよい。該処方はまた被
覆をしたり、高分子、ワックス等中にうめ込んだりする
ことにより作用時間の延長や持続放出をもたらす事もで
きる。
プ、エリキシルなどもまたその一定量が含有するように
用量単位形態にする事ができる。シロップは、化合物を
適当な香味化水溶液に溶解して製造され、またエリキシ
ルは非毒性のアルコール性担体中に分散させることによ
り処方される。可溶化剤や乳化剤（例えばエトキシ化さ
れたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレン
ソルビトールエステル類、保存剤、風味賦与剤（例えば
ペパミント油、サッカリン）その他もまた必要に応じて
添加できる。必要とあれば、経口投与のための用量単位
処方はマイクロカプセル化してもよい。該処方はまた被
覆をしたり、高分子、ワックス等中にうめ込んだりする
ことにより作用時間の延長や持続放出をもたらす事もで
きる。
【００４３】非経口的投与は、皮下・筋肉内又は静脈内
注射用としたところの液状用量単位形態、例えば溶液や
懸濁剤の形態を用いることによって行いうる。これらの
ものは、化合物の一定量を、注射の目的に適合する非毒
性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は
溶解し、次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより
製造される。あるいは化合物の一定量をバイアルにと
り、然るのち該バイアルとその内容物を滅菌し密閉して
も良い。投与直前に溶解又は混合するために、粉末又は
凍結乾燥した有効成分に添えて、予備的なバイアルや担
体を準備しても良い。注射液を等張にするために非毒性
の塩や塩溶液を添加しても良い。さらに安定剤、保存
剤、乳化剤の如きものを併用する事もできる。
注射用としたところの液状用量単位形態、例えば溶液や
懸濁剤の形態を用いることによって行いうる。これらの
ものは、化合物の一定量を、注射の目的に適合する非毒
性の液状担体、例えば、水性や油性の媒体に懸濁し又は
溶解し、次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより
製造される。あるいは化合物の一定量をバイアルにと
り、然るのち該バイアルとその内容物を滅菌し密閉して
も良い。投与直前に溶解又は混合するために、粉末又は
凍結乾燥した有効成分に添えて、予備的なバイアルや担
体を準備しても良い。注射液を等張にするために非毒性
の塩や塩溶液を添加しても良い。さらに安定剤、保存
剤、乳化剤の如きものを併用する事もできる。
【００４４】直腸投与は、化合物を低融点の固体、例え
ばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級エステル類
（例えばパルミチン酸ミリスチルエステル）及びそれら
の混合物を混じた座剤を用いることによって行いうる。
ばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級エステル類
（例えばパルミチン酸ミリスチルエステル）及びそれら
の混合物を混じた座剤を用いることによって行いうる。
【００４５】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明するが、本発明は実施例によって限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は実施例によって限定されるもので
はない。
【００４６】
【実施例１】 （１）発酵生産 Nocardia brasiliensis IFM 0406株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４９８）をグリセロール２％、ポリペプトン（日本製
薬株式会社）１％、Ｔｕｎａ肉エキス０．５％、ｐＨ
７．０からなる基本培地１０ｍｌを５０ｍｌ三角フラス
コに分注したものに接種し３０℃、７２時間振とう培養
した。これを更に、同培地１．５Ｌを５Ｌのフラスコに
分注した培地に１％ｖ／ｖで前記種培養物を接種し、同
様前培養を行った。この前培養液を同培地１５０Ｌを入
れた２００Ｌタンク培養槽に接種し、通気量毎分１５０
Ｌ攪拌数２００ｒｐｍ ３０℃、９０時間培養した。
５４９８）をグリセロール２％、ポリペプトン（日本製
薬株式会社）１％、Ｔｕｎａ肉エキス０．５％、ｐＨ
７．０からなる基本培地１０ｍｌを５０ｍｌ三角フラス
コに分注したものに接種し３０℃、７２時間振とう培養
した。これを更に、同培地１．５Ｌを５Ｌのフラスコに
分注した培地に１％ｖ／ｖで前記種培養物を接種し、同
様前培養を行った。この前培養液を同培地１５０Ｌを入
れた２００Ｌタンク培養槽に接種し、通気量毎分１５０
Ｌ攪拌数２００ｒｐｍ ３０℃、９０時間培養した。
【００４７】（２）回収精製 得られた培養物１５０Ｌを０．４５μｍのポアサイズを
有する膜（ミリポア社製ペリコンカセットシステム）で
濾過することにより除菌した。この濾液画分をダイヤイ
オンＨＰ２０カラム（三菱樹脂株式会社）１５×１００
ｃｍに吸着させ、５０％メタノールで十分洗浄し、夾雑
物を除き、１００％メタノール２０Ｌで溶出した。化合
物０４０６はAspergillus nigerに対し特異的に阻害活
性を示すことから（最小阻止濃度２５μｇ／ｍｌ）、溶
出画分の化合物の検出はＡ．ｎｉｇｅｒを被検菌とする
ペーパーディスク法によるサブローデキストロース培地
上での生育阻害活性を指標として行った。
有する膜（ミリポア社製ペリコンカセットシステム）で
濾過することにより除菌した。この濾液画分をダイヤイ
オンＨＰ２０カラム（三菱樹脂株式会社）１５×１００
ｃｍに吸着させ、５０％メタノールで十分洗浄し、夾雑
物を除き、１００％メタノール２０Ｌで溶出した。化合
物０４０６はAspergillus nigerに対し特異的に阻害活
性を示すことから（最小阻止濃度２５μｇ／ｍｌ）、溶
出画分の化合物の検出はＡ．ｎｉｇｅｒを被検菌とする
ペーパーディスク法によるサブローデキストロース培地
上での生育阻害活性を指標として行った。
【００４８】この溶出画分を減圧真空乾燥機で１Ｌに濃
縮した。この濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー５
ｃｍ×５０ｃｍカラムを用い吸着させ、クロロホルム：
メタノール：水＝（ａ）４：１：０ （ｂ）１：１：０
（ｃ）１．５：１：０．１の溶離液各４Ｌで溶出し
た。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）各画分について高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で更に分画精製を行っ
た。ＨＰＬＣによる分画精製にはＣａｐｃｅｌｌ ｐａ
ｃｋ Ｃ１８ ＳＧ１２０（株式会社資生堂）５×２５
０ｍｍカラムを用いて行った。各画分をカラムに吸着さ
せた後アセトニトリル２０％〜５０％で濃度勾配溶出を
行った。１tube１０ｍｌを１フラクションとして集め、
各tubeのA.nigerに対する生育阻害活性を指標とし、活
性画分を集めた。
縮した。この濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー５
ｃｍ×５０ｃｍカラムを用い吸着させ、クロロホルム：
メタノール：水＝（ａ）４：１：０ （ｂ）１：１：０
（ｃ）１．５：１：０．１の溶離液各４Ｌで溶出し
た。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）各画分について高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で更に分画精製を行っ
た。ＨＰＬＣによる分画精製にはＣａｐｃｅｌｌ ｐａ
ｃｋ Ｃ１８ ＳＧ１２０（株式会社資生堂）５×２５
０ｍｍカラムを用いて行った。各画分をカラムに吸着さ
せた後アセトニトリル２０％〜５０％で濃度勾配溶出を
行った。１tube１０ｍｌを１フラクションとして集め、
各tubeのA.nigerに対する生育阻害活性を指標とし、活
性画分を集めた。
【００４９】各活性画分を凍結乾燥することにより集
め、各々精製品として０４０６−Ａ２ｇ、Ｂ １５０ｍ
ｇ、Ｃ ３００ｍｇ、Ｄ ２００ｍｇ、Ｅ ２５ｍｇ、
Ｆ１５ｍｇを得た。０４０６−Ａを例にとると、０４０
６−Ａは白色粉末であり、その構造式及び理化学的性質
は既述したとおりであり、免疫抑制作用を有する物質で
ある。０４０６−Ａを免疫抑制作用を有する既知の物質
及び既知の抗生物質を比較したが構造式が同じものは見
当たらない新規物質と同定された。
め、各々精製品として０４０６−Ａ２ｇ、Ｂ １５０ｍ
ｇ、Ｃ ３００ｍｇ、Ｄ ２００ｍｇ、Ｅ ２５ｍｇ、
Ｆ１５ｍｇを得た。０４０６−Ａを例にとると、０４０
６−Ａは白色粉末であり、その構造式及び理化学的性質
は既述したとおりであり、免疫抑制作用を有する物質で
ある。０４０６−Ａを免疫抑制作用を有する既知の物質
及び既知の抗生物質を比較したが構造式が同じものは見
当たらない新規物質と同定された。
【００５０】
【実施例２】マウスリンパ球混合培養反応におけるｉｎ
ｖｉｔｒｏ免疫抑制活性をＴ細胞増殖阻害活性で示
す。
ｖｉｔｒｏ免疫抑制活性をＴ細胞増殖阻害活性で示
す。
【００５１】（１）試料調製 上述ＨＰＬＣで製造した精製０４０６−Ａを１ｍｇ／ｍ
ｌ濃度で滅菌水に溶かした。
ｌ濃度で滅菌水に溶かした。
【００５２】（２）検 定 マウスリンパ球混合培養反応（ＭＬＲ）は、反応細胞と
してＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）の脾臓細胞由来Ｔ細胞
を、刺激細胞としてＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２d）の脾臓細
胞をマイトマイシンＣ処理したものを用い混合培養する
ことによって行った。
してＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）の脾臓細胞由来Ｔ細胞
を、刺激細胞としてＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２d）の脾臓細
胞をマイトマイシンＣ処理したものを用い混合培養する
ことによって行った。
【００５３】反応細胞の調製は以下の方法で行った。５
〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスより脾臓を摘出し、１
０％熱処理不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）を加え氷冷Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地中でホモゲナイズ後、ガーゼ濾過す
ることで単細胞浮遊液を得た。遠心により回収後、塩化
アンモニウム溶液で４℃、１分間処理し、混在する赤血
球細胞を除いた。ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて遠心洗
浄を行い脾臓細胞浮遊液を得、さらにＴ細胞の分離をLa
rge Murine T-cell Enrichment Column（フナコシ株式
会社）を使用して行った。ＲＰＭＩ１６４０培地で遠心
洗浄後５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５．６×１０6
／ｍｌに調製し、反応細胞浮遊液とした。
〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスより脾臓を摘出し、１
０％熱処理不活性化牛胎児血清（ＦＣＳ）を加え氷冷Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地中でホモゲナイズ後、ガーゼ濾過す
ることで単細胞浮遊液を得た。遠心により回収後、塩化
アンモニウム溶液で４℃、１分間処理し、混在する赤血
球細胞を除いた。ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて遠心洗
浄を行い脾臓細胞浮遊液を得、さらにＴ細胞の分離をLa
rge Murine T-cell Enrichment Column（フナコシ株式
会社）を使用して行った。ＲＰＭＩ１６４０培地で遠心
洗浄後５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５．６×１０6
／ｍｌに調製し、反応細胞浮遊液とした。
【００５４】刺激細胞の調製は５〜６週齢のＢＡＬＢ／
Ｃマウスより脾臓を摘出し同様の方法で調製した脾臓細
胞浮遊液を５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３７
℃、３０分間処理した。３回洗浄後、５０μＭ２−メル
カプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて５．６×１０6／ｍｌに調製し、刺激細
胞浮遊液とした。
Ｃマウスより脾臓を摘出し同様の方法で調製した脾臓細
胞浮遊液を５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３７
℃、３０分間処理した。３回洗浄後、５０μＭ２−メル
カプトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４
０培地を用いて５．６×１０6／ｍｌに調製し、刺激細
胞浮遊液とした。
【００５５】反応細胞９０μｌと刺激細胞９０μｌおよ
び被検体液２０μｌを９６穴丸底マイクロプレートに加
え、３７℃、５％ＣＯ2−９５％空気の条件下、９６時
間培養を行った。Ｔリンパ球の幼若化はトリチウム化チ
ミジンの取り込みの測定で調べた。９６時間培養後細胞
をトリチウム標識チミジンで０．５μＣｉ／穴ずつパル
ス標識した。更に７時間インキュベート後、マルチプル
試料収集機を用い、グラスファイバー濾紙上に培養物を
集めた。個々の穴に対応する濾紙ディスクの放射活性を
基本的液体シンチレーション測定法により測定した（ベ
ータカウンター）。重複して検定した穴毎の１分間のカ
ウント数（ｃｐｍ）の平均を計算し、結果は以下の如く
トリチウム化チミジン取り込み（幼若化）の阻害の度合
をＩＣ50で表６に表示した。対象としてアスコマイシ
ン、シクロスポリンＡ、ラパマイシンの結果をも示し
た。
び被検体液２０μｌを９６穴丸底マイクロプレートに加
え、３７℃、５％ＣＯ2−９５％空気の条件下、９６時
間培養を行った。Ｔリンパ球の幼若化はトリチウム化チ
ミジンの取り込みの測定で調べた。９６時間培養後細胞
をトリチウム標識チミジンで０．５μＣｉ／穴ずつパル
ス標識した。更に７時間インキュベート後、マルチプル
試料収集機を用い、グラスファイバー濾紙上に培養物を
集めた。個々の穴に対応する濾紙ディスクの放射活性を
基本的液体シンチレーション測定法により測定した（ベ
ータカウンター）。重複して検定した穴毎の１分間のカ
ウント数（ｃｐｍ）の平均を計算し、結果は以下の如く
トリチウム化チミジン取り込み（幼若化）の阻害の度合
をＩＣ50で表６に表示した。対象としてアスコマイシ
ン、シクロスポリンＡ、ラパマイシンの結果をも示し
た。
【００５６】
【表６】
【００５７】
【実施例３】 （１）実施例２で示した０４０６−Ａについて、培養細
胞に対する毒性試験の結果を下記表７に示した。
胞に対する毒性試験の結果を下記表７に示した。
【００５８】
【表７】
【００５９】ＨＥＫ−２９７、Ｃｏｓ−１、ＨｅＬａ細
胞はMinimum Essential Medium（ＭＥＭ）ダルベッコ液
体培地で、ＣＨＯ細胞はα−ＭＥＭで、ＹＡＣ−１細胞
はＲＰＭＩ１６４０培地（いずれも１０％牛血清を含
む）を使用し、細胞浮遊液（５．６×１０6ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）を調製した。被検体（０４０６Ａ、シクロスポ
リン、アスコマイシン）は各培地を用いて１ｍｇ／ｍｌ
濃度から２倍希釈を順次くり返し、調製した。細胞浮遊
液１８０μｌと被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレ
ートに分注し、５％ＣＯ2−９５％空気の湿潤環境下、
３７℃で培養した。９６時間培養後3Ｈ−チミジン
（０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加し４時間培養を行い
ＹＡＣ−１を除く細胞株についてはトリプシン処理後セ
ルハーベスターによりガラス繊維濾紙上に細胞を回収し
細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーション
カウンターで測定した。被検体無添加ｗｅｌｌの放射活
性（ｃ）、それぞれの被検体を添加したｗｅｌｌの放射
活性（ｔ）から１００−ｔ／ｃ×１００（％）の式によ
り生育阻害率を求め、この結果からＩＣ50を算出した。
胞はMinimum Essential Medium（ＭＥＭ）ダルベッコ液
体培地で、ＣＨＯ細胞はα−ＭＥＭで、ＹＡＣ−１細胞
はＲＰＭＩ１６４０培地（いずれも１０％牛血清を含
む）を使用し、細胞浮遊液（５．６×１０6ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）を調製した。被検体（０４０６Ａ、シクロスポ
リン、アスコマイシン）は各培地を用いて１ｍｇ／ｍｌ
濃度から２倍希釈を順次くり返し、調製した。細胞浮遊
液１８０μｌと被検体液２０μｌを９６穴マイクロプレ
ートに分注し、５％ＣＯ2−９５％空気の湿潤環境下、
３７℃で培養した。９６時間培養後3Ｈ−チミジン
（０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加し４時間培養を行い
ＹＡＣ−１を除く細胞株についてはトリプシン処理後セ
ルハーベスターによりガラス繊維濾紙上に細胞を回収し
細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーション
カウンターで測定した。被検体無添加ｗｅｌｌの放射活
性（ｃ）、それぞれの被検体を添加したｗｅｌｌの放射
活性（ｔ）から１００−ｔ／ｃ×１００（％）の式によ
り生育阻害率を求め、この結果からＩＣ50を算出した。
【００６０】本発明にかかる０４０６−Ａの細胞毒性
は、対照として用いた市販免疫抑制剤より低いことが確
認された。
は、対照として用いた市販免疫抑制剤より低いことが確
認された。
【００６１】（２）Ｉｎ ｖｉｔｒｏに於ける細胞障害
活性（ＣＴＬ） （マウス同種リンパ球混合培養により誘導される同種細
胞傷害性Ｔ−細胞に対する抑制効果）
活性（ＣＴＬ） （マウス同種リンパ球混合培養により誘導される同種細
胞傷害性Ｔ−細胞に対する抑制効果）
【００６２】実施例２と同様の方法にて調製したＢＡＬ
Ｂ／Ｃ（Ｈ−２d）の脾臓細胞浮遊液（５．５×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）０．９ｍｌとあらかじめマイトマイシ
ンＣ処理したＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２6）の脾臓細胞浮
遊液（５．５ｘ１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）０．９ｍｌ及び
被検体０．２ｍｌを２４穴マルチディシュに加え、３７
℃、５％ＣＯ2−９５％空気の条件下で５日間培養を行
った。培養終了後遠心により細胞を回収し、１０％牛血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したエフェクター
細胞として用いた。
Ｂ／Ｃ（Ｈ−２d）の脾臓細胞浮遊液（５．５×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）０．９ｍｌとあらかじめマイトマイシ
ンＣ処理したＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２6）の脾臓細胞浮
遊液（５．５ｘ１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）０．９ｍｌ及び
被検体０．２ｍｌを２４穴マルチディシュに加え、３７
℃、５％ＣＯ2−９５％空気の条件下で５日間培養を行
った。培養終了後遠心により細胞を回収し、１０％牛血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したエフェクター
細胞として用いた。
【００６３】標的細胞としては刺激細胞と同系（Ｈ−２
b）のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＬ−４細胞を用い
た。ＥＬ−４細胞１０6個を０．１μＣｉのＮａ2 51Ｃｒ
Ｏ4を用いて３７℃で３時間インキュベートすることに
より、51Ｃｒを細胞内に取り込ませた後、洗浄し、２×
１０5個／ｍｌに調製し、標的細胞として用いた。
b）のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＬ−４細胞を用い
た。ＥＬ−４細胞１０6個を０．１μＣｉのＮａ2 51Ｃｒ
Ｏ4を用いて３７℃で３時間インキュベートすることに
より、51Ｃｒを細胞内に取り込ませた後、洗浄し、２×
１０5個／ｍｌに調製し、標的細胞として用いた。
【００６４】細胞傷害活性の測定はエフェクター細胞浮
遊液１００μｌと標的細胞浮遊液１００μｌを９６穴丸
底マイクロプレートに加え、３７℃にて４時間培養した
後、上清中に放出される51Ｃｒ量を測定し、以下の数１
で示される式より細胞傷害活性を算出した。
遊液１００μｌと標的細胞浮遊液１００μｌを９６穴丸
底マイクロプレートに加え、３７℃にて４時間培養した
後、上清中に放出される51Ｃｒ量を測定し、以下の数１
で示される式より細胞傷害活性を算出した。
【００６５】
【数１】
【００６６】細胞傷害性Ｔ−細胞の活性はＬｙｔｉｃ
Ｕｎｉｔ（ＬＵ）にて表示した。ＬＵは標的細胞２×１
０4個を２０％破壊するのに必要なエフェクター細胞を
１ＬＵとしたときのエフェクター細胞１０7個あたりの
ＬＵで示した。得られた結果を下記表８に示した。その
結果から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ
において対照としたシクロスポリンＡと比べ非常に低い
値を示していることが確認された。
Ｕｎｉｔ（ＬＵ）にて表示した。ＬＵは標的細胞２×１
０4個を２０％破壊するのに必要なエフェクター細胞を
１ＬＵとしたときのエフェクター細胞１０7個あたりの
ＬＵで示した。得られた結果を下記表８に示した。その
結果から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ
において対照としたシクロスポリンＡと比べ非常に低い
値を示していることが確認された。
【００６７】
【表８】
【００６８】
【実施例４】 （１）実施例１で製造した物質０４０６−Ａ ２０ｇ、
（２）ラクトース ８０ｇ、（３）コーンスターチ ３
０ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム ２ｇを原料と
して用い錠剤を製造した。すなわち（１）、（２）及び
（３）（但し１５ｇ）を混合し、（３）（但し１０ｇ）
から調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆
粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えよく混合し、こ
の混合物を圧縮錠剤機により圧縮し、１錠剤当り有効成
分（１）を２５ｍｇ含有する錠剤８００個を製造した。
（２）ラクトース ８０ｇ、（３）コーンスターチ ３
０ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム ２ｇを原料と
して用い錠剤を製造した。すなわち（１）、（２）及び
（３）（但し１５ｇ）を混合し、（３）（但し１０ｇ）
から調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆
粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えよく混合し、こ
の混合物を圧縮錠剤機により圧縮し、１錠剤当り有効成
分（１）を２５ｍｇ含有する錠剤８００個を製造した。
【００６９】
【発明の効果】本発明は化合物０４０６を提供するもの
であるが、本化合物は新規物質であって、すぐれた生理
活性を有し、免疫抑制剤等として各種の医薬品に利用す
ることができる。
であるが、本化合物は新規物質であって、すぐれた生理
活性を有し、免疫抑制剤等として各種の医薬品に利用す
ることができる。
【図１】化合物０４０６−Ａの1Ｈ ＮＭＲのデータ
（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
【図２】化合物０４０６−Ａの13Ｃ ＮＭＲのデータ
（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
（ＣＤ3ＯＤ）を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 下記化１に示される一般式（１）を有す
る化合物０４０６又はその医薬的に許容される塩。 【化１】 （式中、Ｒ1は−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ又はＨ、Ｒ2は−Ｃ
Ｏ(ＣＨ2)3ＣＨ3又は−ＣＯ(ＣＨ2)4ＣＨ3又はＨであ
る。） - 【請求項２】 Ｒ1が−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、Ｒ2が−Ｃ
Ｏ(ＣＨ2)3ＣＨ3で示されることを特徴とする請求項１
記載の化合物０４０６−Ａ。 - 【請求項３】 Ｒ1が−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、Ｒ2がＨで
示されることを特徴とする請求項１記載の化合物０４０
６−Ｂ。 - 【請求項４】 Ｒ1がＨ、Ｒ2が−ＣＯ(ＣＨ2)3ＣＨ3で
示されることを特徴とする請求項１記載の化合物０４０
６−Ｃ。 - 【請求項５】 Ｒ1がＨ、Ｒ2がＨで示されることを特徴
とする請求項１記載の化合物０４０６−Ｄ。 - 【請求項６】 Ｒ1が−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、Ｒ2が−Ｃ
Ｏ(ＣＨ2)4ＣＨ3で示されることを特徴とする請求項１
記載の化合物０４０６−Ｅ。 - 【請求項７】 Ｒ1がＨ、Ｒ2が−ＣＯ(ＣＨ2)4ＣＨ3で
示されることを特徴とする請求項１記載の化合物０４０
６−Ｆ。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化
合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とす
る免疫抑制剤。 - 【請求項９】 臓器移植、皮膚移植における拒絶反応抑
制や自己免疫疾患の治療に用いる請求項８記載の免疫抑
制剤。 - 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれか１項に記載さ
れる少なくとも１つ以上の化合物を生産する能力を有す
る新規Nocardia brasiliensis。 - 【請求項１１】 Nocardia属に属する請求項１〜７のい
ずれか１項に記載の化合物生産菌を培養し、培養物より
該化合物を採取することを特徴とする請求項１〜７のい
ずれか１項に記載の化合物またはその塩の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8130633A JPH09295980A (ja) | 1996-04-30 | 1996-04-30 | 新規マクロライド系化合物０４０６ |
| US08/847,413 US6004995A (en) | 1996-04-30 | 1997-04-24 | Macrolide compound 0406 |
| EP97107089A EP0808843B1 (en) | 1996-04-30 | 1997-04-29 | Novel macrolide compound 0406 |
| DE69720101T DE69720101T2 (de) | 1996-04-30 | 1997-04-29 | Makrolid Verbindung 0406 |
| US09/239,812 US6090610A (en) | 1996-04-30 | 1999-01-29 | Macrolide compound 0406 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8130633A JPH09295980A (ja) | 1996-04-30 | 1996-04-30 | 新規マクロライド系化合物０４０６ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09295980A true JPH09295980A (ja) | 1997-11-18 |
Family
ID=15038921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8130633A Pending JPH09295980A (ja) | 1996-04-30 | 1996-04-30 | 新規マクロライド系化合物０４０６ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6004995A (ja) |
| EP (1) | EP0808843B1 (ja) |
| JP (1) | JPH09295980A (ja) |
| DE (1) | DE69720101T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3688446B2 (ja) * | 1997-01-23 | 2005-08-31 | ヒゲタ醤油株式会社 | 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ |
| WO2000032604A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Sankyo Company, Limited | Macrolide compounds and method for evaluating immunosuppressants |
-
1996
- 1996-04-30 JP JP8130633A patent/JPH09295980A/ja active Pending
-
1997
- 1997-04-24 US US08/847,413 patent/US6004995A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-29 DE DE69720101T patent/DE69720101T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-29 EP EP97107089A patent/EP0808843B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-01-29 US US09/239,812 patent/US6090610A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6090610A (en) | 2000-07-18 |
| EP0808843A3 (en) | 1998-09-30 |
| EP0808843A2 (en) | 1997-11-26 |
| DE69720101D1 (de) | 2003-04-30 |
| DE69720101T2 (de) | 2004-02-19 |
| EP0808843B1 (en) | 2003-03-26 |
| US6004995A (en) | 1999-12-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051122 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060404 |