JPH09304388A

JPH09304388A - ヒトイムノグロブリンｅの定量法および測定キット

Info

Publication number: JPH09304388A
Application number: JP12492096A
Authority: JP
Inventors: Motohito Tamaki; 元人玉木; Yoshie Matsumoto; 美枝松本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 1997-11-28

Abstract

(57)【要約】【課題】非特異的反応による凝集がなく、低濃度域でも
正確な測定が可能な、高感度で迅速なヒトイムノグロブ
リンＥ（ＩｇＥ）の定量法を提供する。【解決手段】抗ＩｇＥ抗体を感作した不溶性担体と試料
を混合し、抗原−抗体凝集反応による反応液の吸光度変
化量を測定し、検量線を用いて未知試料のＩｇＥを定量
するに当り、不溶性担体としてラテックス粒子を用い、
該担体上に感作された抗ＩｇＥ抗体を凝集反応液中の濃
度が２〜４０μｇ／ｍｌになるように用い、抗ＩｇＥ抗
体感作不溶性担体を凝集反応液中の濃度が０．０１〜
０．０８重量％になるように用い、平均分子量３千〜百
万のポリエチレングリコールを凝集反応液中の濃度が
０．１〜５重量％になるように加え、不溶性担体と試料
との反応を５秒〜１５分間恒温で行い、ラテックス凝集
反応の進行に伴う吸光度の増加を測定するＩｇＥの定量
法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は試料中のヒトイムノ
グロブリンＥ（以下ＩｇＥと略記する）の高感度で迅速
な定量法、特にラテックス凝集比濁法を利用する定量法
に関し、また、該ＩｇＥ定量法を利用したＩｇＥ測定用
の免疫学的キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＩｇＥはIshizakaらによってブタクサ花
粉アレルギー患者の血液中に微量に存在する免疫グロブ
リンとして発見された。その後まもなくJohansson らは
ＩｇＥ型骨髄腫を見いだし、その存在を確認した。その
後、これは１９６８年にＷＨＯによりＩｇＥと命名され
た。

【０００３】ＩｇＥは分子量約１９６，０００、沈降係
数７．９Ｓを有し、糖鎖を１０％含む糖タンパクであっ
て、ＩｇＥのＨ鎖とＬ鎖の各２個より形成されている。
ＩｇＥは血清、鼻汁、喀痰、腸液などの体液中に存在
し、アレルギー状態になると全身的あるいは局所的に増
加する。このことからＩｇＥの定量はアトピー性疾患や
寄生虫感染症の診断や経過観察、治療効果の判定などに
有用である。

【０００４】ＩｇＥは他の免疫グロブリンと比較して血
中濃度が極めて低いため、従来、その測定にはラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法やエンザイムイムノアッセイ
（ＥＩＡ）法が用いられてきた。しかしながら、前者は
放射性物質を使用するため大掛かりな設備や厳重な管理
を必要とし、また、後者は迅速性や簡便性に欠ける嫌い
があることが指摘されている（谷川智ら、臨床検査機器
・試薬、第１２巻第４号（１９８９）別冊、９００７〜
９１０頁）。

【０００５】また、最近では反応系の微量化、感度の向
上、反応時間の短縮を目的として、ラテックス凝集によ
る免疫測定法が開発されている。ラテックス凝集による
免疫測定法については、様々なラテックス凝集免疫試薬
が市販されているが、これらはしばしば非特異的反応に
よる凝集を起こし、ＲＩＡ法に比べると、特に低濃度域
では正確な測定ができないなどの問題を有する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来のラテックス凝集
免疫試薬の測定範囲は３０〜１，０００ｎｇ／ｍｌ程度
であった。しかしながら、ＩｇＥの正常値は年齢、性差
によって大きく異なるため、広範な正常値分布をカバー
できる試薬が求められている。特に低濃度域について
は、５ｎｇ／ｍｌ程度までのＩｇＥの検出感度が要求さ
れるようになり、１０〜２０００ｎｇ／ｍｌの範囲で測
定が可能なラテックス凝集免疫試薬が開発されている
が、これらの試薬は高感度を達成するようにしたため特
異性が低下する傾向があるといわれている。特に、この
試薬では非特異的反応による凝集が生じ易く、低濃度域
での正確な定量が困難になっている。

【０００７】本発明の目的は、上記のごとき実情に鑑
み、非特異的反応による凝集がなく、低濃度域でも正確
な測定が可能な、高感度で迅速なＩｇＥの定量法および
該ＩｇＥの定量法を利用した免疫学的測定キットを提供
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によるヒトイムノ
グロブリンＥの定量法は、抗ヒトイムノグロブリンＥ抗
体を感作した不溶性担体と試料を混合し、抗原−抗体反
応による凝集反応を生ぜしめ、該反応液の吸光度変化量
を測定し、予め濃度既知のヒトイムノグロブリンＥを試
料として測定し、得られた検量線を用いて、濃度未知の
試料中のヒトイムノグロブリンＥを定量するに当り、
(1) 不溶性担体としてラテックス粒子を用い、(2) 不溶
性担体上に感作された抗ヒトイムノグロブリンＥ抗体
を、凝集反応を生ぜしめる反応液中の濃度が２〜４０μ
ｇ／ｍｌになるように使用し、(3) 抗ヒトイムノグロブ
リンＥ抗体を感作した不溶性担体を、凝集反応を生ぜし
める反応液中の濃度が０．０１〜０．０８重量％になる
ように使用し、(4) 平均分子量３，０００〜１，００
０，０００のポリエチレングリコールを、凝集反応を生
ぜしめる反応液中の濃度が０．１〜５重量％になるよう
に添加し、(5) 不溶性担体と試料との反応を５秒〜１５
分間、恒温で行い、(6) 凝集反応の進行に伴う吸光度の
増加を測定することを特徴とするものである。

【０００９】また、本発明によるヒトイムノグロブリン
Ｅの測定キットは、上記のヒトイムノグロブリンＥの定
量法を利用して、ヒトイムノグロブリンＥを定量するキ
ットであって、(1) 抗ヒトイムノグロブリンＥ抗体を感
作したラテックス粒子と、(2) 平均分子量３，０００〜
１，０００，０００のポリエチレングリコールを含む検
体希釈用希釈液とからなるものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の構成要件について
詳述する。

【００１１】試料としては、血清、血漿などがある。

【００１２】不溶性担体としては、ラテックス粒子を用
いる。粒子としては、粒径が比較的一定であり、一定の
品質、性能を有し、工業的に大量生産できる有機系微粒
子が好ましい。例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリ
ロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタク
リル酸エステルなどのビニル系モノマーの単一重合体お
よび／または共重合体、スチレン−ブタジエン共重合
体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体などの
ブタジエン系共重合体などの微粒子が挙げられる。抗体
の吸着性に優れており、かつ生物学的活性を長期間安定
に保持できるなどの理由から、特にポリスチレン系のラ
テックス粒子が好ましい。不溶性担体への抗ＩｇＥ抗体
の感作は、担体に抗体を物理的または化学的に吸着させ
る方法にて行う。不溶性担体としての粒子の粒径は、
０．０５〜１μｍであるのが好ましいが、特に好ましく
は、０．１〜０．４μｍである。該粒径が０．０５μｍ
未満であると、凍結乾燥を行ったときに粒子の分散が困
難になる。また、該粒径が１μｍを超えると、自己凝集
が進み、分散性が低下する。

【００１３】抗ＩｇＥ抗体は、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗
体の場合、由来の動物種（ヒト、ウサギ、ヤギなど）や
純度（グロブリン画分またはアフィニティ精製画分な
ど）は特に限定されず、また抗体の構造も限定されず、
免疫グロブリン分子自体のほか、Ｆａｂ' やＦ（ａｂ）
₂のような断片であってもよい。

【００１４】不溶性担体上に感作された抗ＩｇＥ抗体
は、凝集反応を生ぜしめる反応液中の濃度が２〜４０μ
ｇ／ｍｌになるように使用する。該抗体の濃度が２μｇ
／ｍｌ未満であると、感度が低く低濃度域での正確な測
定ができない。また、該抗体の濃度が４０μｇ／ｍｌを
超えると、非特異的反応による凝集が生じ、正確な測定
ができない。

【００１５】抗ＩｇＥ抗体を感作した不溶性担体は、凝
集反応を生ぜしめる反応液中の濃度が０．０１〜０．０
８重量％になるように使用する。該濃度が０．０１重量
％未満であると、凝集塊の形成が不十分で、必要な感度
が得られない。また、該濃度が０．０８重量％を超える
と、バックグラウンドとしての吸光度が高すぎ、正確な
定量が行えない。

【００１６】反応液中に添加するポリエチレングリコー
ルとしては、感度向上または反応促進を目的として、
３，０００〜１，０００，０００の平均分子量を有する
ものを用いる。ポリエチレングリコールの平均分子量が
３，０００未満であると、感度向上または反応促進の効
果が不十分であり、また、ポリエチレングリコールの平
均分子量が１，０００，０００を超えると、媒体へのポ
リエチレングリコールの溶解度が著しく低くなり、溶解
性の点で問題が生じる。平均分子量３，０００〜１，０
００，０００のポリエチレングリコールは、凝集反応を
生ぜしめる反応液中の濃度が０．１〜５重量％になるよ
うに添加して使用する。該ポリエチレングリコール濃度
が０．１重量％未満であると、感度が低く、低濃度域で
の正確な測定ができない。また、該ポリエチレングリコ
ール濃度が５重量％を超えると、非特異的反応による凝
集が生じ、正確な測定ができない。

【００１７】平均分子量３，０００〜１，０００，００
０のポリエチレングリコールは、適当な水性媒体に分散
および溶解して使用するのが好ましい。この場合、前記
の抗体を感作した不溶性担体とポリエチレングリコール
は、同一の媒体に分散または溶解して１液のラテックス
試薬としてもよいし、また、両者を別個に水性媒体に分
散または溶解させて不溶性担体のラテックス試薬とポリ
エチレングリコールの溶液状の試薬（検体希釈用希釈
液）との２液型試薬として使用してもよい。好ましくは
２液型試薬を用いる。

【００１８】ここで、水性媒体としては、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液
などが好ましい。水性媒体のｐＨは、好ましくは５．５
〜８．５、特に好ましくは６．５〜８．０である。

【００１９】上記１液のラテックス試薬中には、さら
に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整用の塩化ナ
トリウムなどを適宜溶解させてもよい。また、ラテック
ス試薬と溶液状の試薬との２液型試薬にも、それぞれに
牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整用の塩化ナトリ
ウムなどを適宜溶解させてもよい。

【００２０】不溶性担体と試料との反応は、抗原−抗体
反応およびそれに伴なうラテックス凝集反応であり、５
秒〜１５分間、恒温で行う。反応時間が５秒未満である
と、正確な測定ができない。また、反応時間が１５分を
超えると、非特異的反応による凝集が生じ、正確な測定
ができない。該反応は、特に２５℃〜３７℃で行うのが
好ましい。

【００２１】吸光度測定について、好ましくは、ラテッ
クス凝集反応の進行に伴う吸光度の増加を測定する。吸
光度測定は、通常５００〜１０００ｎｍ、好ましくは５
００〜８００ｎｍ、特に好ましくは５５０〜６５０ｎｍ
の範囲内で適切な波長を選択して測定される。

【００２２】測定に使用する機器は、経時的に反応液の
吸光度を測定しうるものであればよいが、汎用の生化学
自動分析装置が好ましい。上記の測定波長、検体量、試
薬量などは、装置に合わせて適宜選択できる。

【００２３】ＩｇＥの定量は、ＩｇＥ既知量の試料（例
えば、ＩｇＥ標準血清とその希釈系列）について、前記
の測定を行い、その測定値とＩｇＥ量とから検量線を作
成しておき、ＩｇＥ未知量の試料について同一条件で測
定した測定値から該検量線において対応するＩｇＥ量を
求めることによって行うことができる。

【００２４】

【作用】上記のように、本発明によれば、抗ＩｇＥ抗体
を感作した不溶性担体と試料を混合し、抗原−抗体反応
およびこれに伴なうラテックス凝集反応を生ぜしめ、該
反応液の吸光度変化量を測定し、予め作成した検量線を
用いて、濃度未知の試料中のＩｇＥ量を正確に測定する
ことができる。また、該ＩｇＥの定量法を利用して濃度
未知の試料中のＩｇＥ量を正確に測定するＩｇＥ測定用
免疫学的キットを提供することができる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００２６】実施例１〜４０、比較例１〜４０１）試薬および材料ＩｇＥの定量に用いる試薬および材料は以下の通りであ
る。

【００２７】ラテックス：平均粒径０．３０４μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水
化学社製）を用いた。

【００２８】ラテックス希釈用緩衝液：５０ｍＭのＮａ
₂ＨＰＯ₄と５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ７．５０
になるように混合し、この混合液をラテックス希釈用緩
衝液として用いた。

【００２９】抗ＩｇＥ抗体：ヤギの抗血清からイムノグ
ロブリン分画にまで精製したヤギ抗ＩｇＥ抗体（７．７
ｍｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ社製）を用いた。

【００３０】抗体希釈用緩衝液：上記ラテックス希釈用
緩衝液を抗体希釈用緩衝液としても用いた。

【００３１】ブロッキング用緩衝液：１００ｍＭのＮａ
₂ＨＰＯ₄と１００ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ７．４
０になるように混合し、この混合液にウシ血清アルブミ
ン（Bovine serum albumin Fraction V 、Reagent Grad
e 、Miles Corp. 社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよう
に、またＮａＮ₃（試薬特級、ナカライテスク社製）を
０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ブロ
ッキング用緩衝液として用いた。

【００３２】血清検体：アレルギー疾患を有する患者お
よび健常人の血清を用いた。

【００３３】ＩｇＥ陽性ヒト血清：ヒトプール血清から
調製されたＩｇＥ陽性ヒト血清（ＷＨＯ準拠、２，００
０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、協和メデックス社製）を用い、生理
食塩水にて２，０００、１００、１００、１０、５ｎｇ
／ｍｌにそれぞれ希釈して使用した。また、ＩｇＥ陽性
ヒト血清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ／
ｍｌとして用いた。

【００３４】検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：ブロッキン
グ用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均
分子量７，５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）に
なるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１液）
として用いた。

【００３５】ＩｇＥ測定用ラジオイムノアッセイキッ
ト：市販のラジオイムノアッセイキット（シオノリアＩ
ｇＥ、塩野義製薬社製）を用いた。

【００３６】ＩｇＥ測定用ラテックス凝集免疫試薬：市
販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＩｇＥ、
ダイアヤトロン社製）を用いた。

【００３７】(1) ラテックス試薬の調製平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ）１容に、ラテックス希釈用緩衝液
で３容を添加し、２．５％ラテックス液を得た。抗Ｉｇ
Ｅ抗体は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになるよ
うに抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体液とした。上記
２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液２００μｌを２５℃の
インキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌し
ながら、ここへ上記抗体液８００μｌを素早く添加し、
２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩
衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌
した。次にこの混合液を１５℃、１５，０００ｒｐｍに
て１５分間遠心分離した。得られた沈澱にブロッキング
用緩衝液４．０ｍｌを添加し、上記と同様に遠心分離を
することにより、沈澱を洗浄した。洗浄操作は３回行っ
た。この沈澱にブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加
し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬を得
た。このようにして調製したラテックス試薬を４℃にて
保存した。

【００３８】(2) ラテックス試薬によるＩｇＥ量の測定ラテックス試薬によるＩｇＥ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記操作(1) で得られた固形分０．２５％（Ｗ／
Ｖ）のラテックス試薬をそのままＲ２液（固形分０．２
５％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りであ
る。

【００３９】検体容量２０μｌ検体希釈用希釈液（Ｒ１液）２１０μｌラテックス試薬（Ｒ２液）３０μｌ測定波長５７０ｎｍ測定温度３７℃ 試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後の吸光度と約
３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）を測定し、こ
の吸光度の差を１０，０００倍したものを吸光度変化量
とした。

【００４０】検体の代わりに既知濃度のＩｇＥ陽性ヒト
血清を用いて上記と同様の測定を行って、予め検量線を
作成しておき、上清検体の吸光度変化量を上記検量線に
外挿して、検体中のＩｇＥ量を算出した。

【００４１】(3) ラジオイムノアッセイ法によるＩｇＥ
量の測定上記操作(2) で測定したすべての検体について、市販の
ラジオイムノアッセイキット（シオノリアＩｇＥ、塩野
義製薬社製）を用いて、検体中のＩｇＥ量を測定した。
測定方法は、キット添付の操作法に従って行った。

【００４２】(4) 市販のラテックス凝集免疫試薬による
ＩｇＥ量の測定上記操作(2) で測定したすべての検体について、市販の
ラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＩｇＥ、ダイ
アヤトロン社製）を用いて、検体中のＩｇＥ量を測定し
た。測定方法は、キット添付の操作法に従い、生化学用
自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行
った。

【００４３】３）試験と結果 (1) 実施例１〜４０アレルギー疾患を有する患者および健常人の血清を検体
として、上記２）の操作(2) 「ラテックス試薬によるＩ
ｇＥ量の測定」に従って、検体中のＩｇＥ量を測定し
た。また、上記２）の操作(3) 「ラジオイムノアッセイ
法によるＩｇＥ量の測定」に従って、検体中のＩｇＥ量
を測定した。これらの測定結果は、表１に示すとおりで
ある。また、表１に示したラテックス試薬によるＩｇＥ
量とラジオイムノアッセイ法によるＩｇＥ量との相関を
図１に示す。

【００４４】(2) 比較例１〜４０上記のアレルギー疾患を有する患者および健常人の血清
を検体として、上記２）の操作(4) 「市販のラテックス
凝集免疫試薬によるＩｇＥ量の測定」に従って、検体中
のＩｇＥ量を測定した。これらの測定結果は、表２に示
すとおりである。また、表２に示した市販のラテックス
凝集免疫試薬によるＩｇＥ量と表１に示したラジオイム
ノアッセイ法によるＩｇＥ量との相関を図２に示す。

【００４５】表１および表２、図１および図２から明ら
かなように、本発明のラテックス試薬によって測定され
たＩｇＥ量は、ラジオイムノアッセイ法によるＩｇＥ量
と、低濃度域においてもよく一致したが、市販のラテッ
クス凝集免疫試薬によるＩｇＥ量は、ラジオイムノアッ
セイ法によるＩｇＥ量と、低濃度域および高濃度域にお
いて、必ずしも一致しなかった。

【００４６】以上の結果から、本発明によるＩｇＥ定量
法は、従来のラテックス凝集免疫試薬よりも高感度で、
しかもラジオイムノアッセイ法よりも迅速、簡便な優れ
た定量法であることが確認された。

【００４７】

【表１】

【表２】

【００４８】

【発明の効果】本発明のＩｇＥの定量法および該ＩｇＥ
の定量法を利用した免疫学的キットの構成は上記の通り
であるので、従来のラテックス凝集免疫試薬で見られた
ような検体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、
かつ低濃度域でもラジオイムノアッセイ法と同様の検出
感度を示すＩｇＥの定量法を提供することができ、ま
た、該ＩｇＥの定量法を利用したＩｇＥ測定用免疫学的
キットを提供することができる。このキットは、迅速か
つ簡便にヒト検体中のＩｇＥを正確に定量することが可
能であり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定な
どに有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜４０に使用された検体中の、ラテッ
クス試薬によるＩｇＥ量とラジオイムノアッセイ法によ
るＩｇＥ量との相関を示す図である。

【図２】比較例１〜４０に使用された検体中の、市販の
ラテックス試薬によるＩｇＥ量とラジオイムノアッセイ
法によるＩｇＥ量との相関を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗ヒトイムノグロブリンＥ抗体を感作し
た不溶性担体と試料を混合し、抗原−抗体反応による凝
集反応を生ぜしめ、該反応液の吸光度変化量を測定し、
予め濃度既知のヒトイムノグロブリンＥを試料として測
定し、得られた検量線を用いて、濃度未知の試料中のヒ
トイムノグロブリンＥを定量するに当り、 (1) 不溶性担体としてラテックス粒子を用い、 (2) 不溶性担体上に感作された抗ヒトイムノグロブリン
Ｅ抗体を、凝集反応を生ぜしめる反応液中の濃度が２〜
４０μｇ／ｍｌになるように使用し、 (3) 抗ヒトイムノグロブリンＥ抗体を感作した不溶性担
体を、凝集反応を生ぜしめる反応液中の濃度が０．０１
〜０．０８重量％になるように使用し、 (4) 平均分子量３，０００〜１，０００，０００のポリ
エチレングリコールを、凝集反応を生ぜしめる反応液中
の濃度が０．１〜５重量％になるように添加し、 (5) 不溶性担体と試料との反応を５秒〜１５分間、恒温
で行い、 (6) 凝集反応の進行に伴う吸光度の増加を測定すること
を特徴とするヒトイムノグロブリンＥの定量法。
【請求項２】請求項１記載のヒトイムノグロブリンＥ
の定量法を利用して、ヒトイムノグロブリンＥを定量す
るキットであって、 (1) 抗ヒトイムノグロブリンＥ抗体を感作したラテック
ス粒子と、 (2) 平均分子量３，０００〜１，０００，０００のポリ
エチレングリコールを含む検体希釈用希釈液とからなる
ヒトイムノグロブリンＥの測定キット。