JPH093094A - セラチオプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents
セラチオプロテアーゼ阻害剤Info
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- JPH093094A JPH093094A JP7173939A JP17393995A JPH093094A JP H093094 A JPH093094 A JP H093094A JP 7173939 A JP7173939 A JP 7173939A JP 17393995 A JP17393995 A JP 17393995A JP H093094 A JPH093094 A JP H093094A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記式で示されるプロピオキサチンＡからな
るセラチオペプチダーゼ阻害剤、およびその阻害剤を有
効成分として含有する角膜感染症予防剤および／または
治療剤。 【化１】 【効果】 プロピオキサチンＡはセラチオプロテアーゼ
を特異的に阻害するので、セラチア・マルセセンス（Se
rratia marcescens）が生産するセラチオプロテアーゼ
に起因する角膜感染症等の予防や治療に有用であると考
えられる。
るセラチオペプチダーゼ阻害剤、およびその阻害剤を有
効成分として含有する角膜感染症予防剤および／または
治療剤。 【化１】 【効果】 プロピオキサチンＡはセラチオプロテアーゼ
を特異的に阻害するので、セラチア・マルセセンス（Se
rratia marcescens）が生産するセラチオプロテアーゼ
に起因する角膜感染症等の予防や治療に有用であると考
えられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、セラチオプロテアーゼ
阻害剤、および角膜感染症予防および／または治療剤に
関する。さらに詳しくいえば、角膜感染症等の発現に重
要な役割を演じている、セラチア・マルセセンス（Serr
atia marcescens）の生産する分子量56,000のメタルプ
ロテアーゼと免疫学的に同等であるセラチア・ピスカト
ルム（Serratia piscatorum）の生産するセラチオプロ
テアーゼを特異的に阻害し、角膜感染症などの予防や治
療に有用な下記式
阻害剤、および角膜感染症予防および／または治療剤に
関する。さらに詳しくいえば、角膜感染症等の発現に重
要な役割を演じている、セラチア・マルセセンス（Serr
atia marcescens）の生産する分子量56,000のメタルプ
ロテアーゼと免疫学的に同等であるセラチア・ピスカト
ルム（Serratia piscatorum）の生産するセラチオプロ
テアーゼを特異的に阻害し、角膜感染症などの予防や治
療に有用な下記式
【化３】 で示されるプロピオキサチンＡからなるセラチオペプチ
ダーゼ阻害剤、およびその阻害剤を有効成分として含有
する角膜感染症予防および／または治療剤に関する。
ダーゼ阻害剤、およびその阻害剤を有効成分として含有
する角膜感染症予防および／または治療剤に関する。
【０００２】
【従来技術およびその課題】微生物の生産する菌体外プ
ロテアーゼは、多くの細菌感染症における重要な発症源
となっていることが知られている。例えば、感染防御上
重要な免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡなど）の破壊、
血液凝固系の制御に関わる各種プロテアーゼの不活性
化、α2−マクログロブリンとの複合体を介した神経芽
細胞内侵入とプロテアーゼ再活性化による細胞破壊など
が報告されている（H.Maeda, etal., J.Biol. Chem., 2
62, 10946-10950 (1987)）。その原因となるプロテアー
ゼの生産細菌の多くはグラム陽性菌やブドウ球菌等のグ
ラム陽性菌である。これらの細菌の中でもセラチア菌等
は、病因論上の重要性は少ないとされてきたが、今日で
は上記のようにいくつかの疾患の原因菌となっているこ
とが分かってきた。
ロテアーゼは、多くの細菌感染症における重要な発症源
となっていることが知られている。例えば、感染防御上
重要な免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＡなど）の破壊、
血液凝固系の制御に関わる各種プロテアーゼの不活性
化、α2−マクログロブリンとの複合体を介した神経芽
細胞内侵入とプロテアーゼ再活性化による細胞破壊など
が報告されている（H.Maeda, etal., J.Biol. Chem., 2
62, 10946-10950 (1987)）。その原因となるプロテアー
ゼの生産細菌の多くはグラム陽性菌やブドウ球菌等のグ
ラム陽性菌である。これらの細菌の中でもセラチア菌等
は、病因論上の重要性は少ないとされてきたが、今日で
は上記のようにいくつかの疾患の原因菌となっているこ
とが分かってきた。
【０００３】セラチア菌の中でもセラチア・マルセセン
ス（Serratia marcescens）の生産するプロテアーゼ
は、生体内プロテアーゼ阻害剤を分解不活性化し、角膜
感染症等の発現において重要な役割を演じることが明ら
かにされている。このプロテアーゼをマウスの目に投与
すると、短時間（２〜４時間）で角膜炎を誘発し、さら
に数時間後（５〜８時間）には角膜組織の壊死が起こ
り、失明へと至る。
ス（Serratia marcescens）の生産するプロテアーゼ
は、生体内プロテアーゼ阻害剤を分解不活性化し、角膜
感染症等の発現において重要な役割を演じることが明ら
かにされている。このプロテアーゼをマウスの目に投与
すると、短時間（２〜４時間）で角膜炎を誘発し、さら
に数時間後（５〜８時間）には角膜組織の壊死が起こ
り、失明へと至る。
【０００４】セラチア・マルセセンス（Serratia marce
scens）の生産するプロテアーゼには、下記の表に示す
ような分子量の異なる３種類のものが存在することが明
らかにされている（H.Maeda, etal., J. Biol. Chem.,
262, P10946-10950 (1987)；前田浩，宮川真一，最新医
学，43, P790-794 (1988)；前田浩，生化学，第63巻，P
14-21 (1991)；K.Matsumoto, H.Maeda, K.Takata, R.Ok
umura, J. Bacteriol., 157, P225-232 (1984)；K.Naka
mura, etal., Necleic Acids Res., 14, P5843-5855 (1
986)）。
scens）の生産するプロテアーゼには、下記の表に示す
ような分子量の異なる３種類のものが存在することが明
らかにされている（H.Maeda, etal., J. Biol. Chem.,
262, P10946-10950 (1987)；前田浩，宮川真一，最新医
学，43, P790-794 (1988)；前田浩，生化学，第63巻，P
14-21 (1991)；K.Matsumoto, H.Maeda, K.Takata, R.Ok
umura, J. Bacteriol., 157, P225-232 (1984)；K.Naka
mura, etal., Necleic Acids Res., 14, P5843-5855 (1
986)）。
【０００５】
【表１】 セラチア・マルセセンスの生産するプロテアーゼ 分子量 56,000 60,000 73,000 等電点 5.3 4.4 5.3 7.3 至適ｐＨ ５ ５〜８ ６〜９ 阻害剤 ＥＤＴＡ ＋ − − ホスホラミドン − − ＋ ＤＦＰ − − − ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＤＦＰ：ジイソプロピルフルオロリン酸
【０００６】上記３種類のプロテアーゼの中で、プロテ
アーゼ１分子に対して、１つの亜鉛原子を含む分子量5
6,000のメタルプロテアーゼ（５６Ｋプロテアーゼ）が
生産量および活性ともに生産プロテアーゼの約７０％を
占め、病原性発現にもっとも強く関与していることが明
らかにされている。そこで本発明者らは、５６Ｋプロテ
アーゼに起因する角膜感染症などの病理性発現をそのプ
ロテアーゼの阻害物質により抑制することを考えた。こ
のプロテアーゼは亜鉛原子を含むメタルプロテアーゼで
あるが、既知のメタルプロテアーゼ阻害剤（Ｓ−ＭＰＩ
（Ｓ−メタルプロテアーゼインヒビター），ホスホラミ
ドンなど）によっては阻害されないことが明らかにされ
ており、このプロテアーゼを特異的に阻害する物質は知
られていない。従って、本発明の課題は上記５６Ｋプロ
テアーゼに起因する角膜感染症などの予防および／また
は治療に有効と考えられる５６Ｋプロテアーゼの特異的
阻害剤を提供すること、およびその阻害剤を有効成分と
する角膜感染症予防剤および／または治療剤を提供する
ことにある。
アーゼ１分子に対して、１つの亜鉛原子を含む分子量5
6,000のメタルプロテアーゼ（５６Ｋプロテアーゼ）が
生産量および活性ともに生産プロテアーゼの約７０％を
占め、病原性発現にもっとも強く関与していることが明
らかにされている。そこで本発明者らは、５６Ｋプロテ
アーゼに起因する角膜感染症などの病理性発現をそのプ
ロテアーゼの阻害物質により抑制することを考えた。こ
のプロテアーゼは亜鉛原子を含むメタルプロテアーゼで
あるが、既知のメタルプロテアーゼ阻害剤（Ｓ−ＭＰＩ
（Ｓ−メタルプロテアーゼインヒビター），ホスホラミ
ドンなど）によっては阻害されないことが明らかにされ
ており、このプロテアーゼを特異的に阻害する物質は知
られていない。従って、本発明の課題は上記５６Ｋプロ
テアーゼに起因する角膜感染症などの予防および／また
は治療に有効と考えられる５６Ｋプロテアーゼの特異的
阻害剤を提供すること、およびその阻害剤を有効成分と
する角膜感染症予防剤および／または治療剤を提供する
ことにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、セラチア
・マルセセンス（Serratia marcescens）の生産する５
６Ｋプロテアーゼを阻害する物質を微生物界に求め検索
することにしたが、セラチア・マルセセンス（Serratia
marcescens）の生産するプロテアーゼ自体は病原性が
高く、実験操作上難点があるため、５６Ｋプロテアーゼ
と免疫学的に同等である市販のセラチア・ピスカトルム
（Serratia piscatorum）の生産する表２に性状を記す
セラチオプロテアーゼを用い微生物のスクリーニングを
行なった。
・マルセセンス（Serratia marcescens）の生産する５
６Ｋプロテアーゼを阻害する物質を微生物界に求め検索
することにしたが、セラチア・マルセセンス（Serratia
marcescens）の生産するプロテアーゼ自体は病原性が
高く、実験操作上難点があるため、５６Ｋプロテアーゼ
と免疫学的に同等である市販のセラチア・ピスカトルム
（Serratia piscatorum）の生産する表２に性状を記す
セラチオプロテアーゼを用い微生物のスクリーニングを
行なった。
【０００８】
【表２】 Serratia piscatorumの生産する ５６Ｋプロテアーゼ セラチオプロテアーゼ 分子量 60,000 56,000 等電点 5.0〜5.5 5.3 至適ｐＨ ９ ５ 阻害剤 ＥＤＴＡ ＋ ＋ ホスホラミドン − − Ｓ−ＭＰＩ − ND ＰＣＭＢ − ND ＤＦＰ − − ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 Ｓ−ＭＰＩ：Ｓ−メタルプロテアーゼ阻害剤 ＰＣＭＢ：ｐ−クロロメルクリ安息香酸 ＤＦＰ：ジイソプロピルフルオロリン酸
【０００９】その結果、熊本県下の土壌から分離した一
菌株が上記プロテアーゼの阻害物質を産生し得ることを
確認した。この阻害物質は分析の結果（後記参照）、公
知物質であるプロピオキサチンＡであることが判明し
た。プロピオキサチンＡはエンケファリナーゼＢの阻害
剤であり、鎮痛作用を示す神経伝達物質であるエンケフ
ァリンの非活性化を遅らせる働きをする。このプロピオ
キサチンＡは、放線菌の一種であるキタサトスポリア・
セタエ（Kitasatosporia setae）SANK 60684により生産
されることが報告され、またその構造解析および有機化
学的合成法もなされている（Inaoka,Y., etal., J. Ant
ibiotics, 39, 1368-1385 (1986)）。しかしながら、上
記の文献にはプロピオキサチンＡがセラチア・マルセセ
ンス（Serratia marcescens）の生産する５６Ｋプロテ
アーゼはもとより、その免疫学的同等物であるセラチオ
プロテアーゼを特異的に阻害することについては全く触
れていない。プロピオキサチンＡがセラチオプロテアー
ゼを特異的に阻害し、その免疫学的同等物である５６Ｋ
プロテアーゼを阻害するであろうこと、また５６Ｋプロ
テアーゼに起因する角膜感染症などの病原性の発現を抑
制し得ることは今回初めて明らかにされたことである。
菌株が上記プロテアーゼの阻害物質を産生し得ることを
確認した。この阻害物質は分析の結果（後記参照）、公
知物質であるプロピオキサチンＡであることが判明し
た。プロピオキサチンＡはエンケファリナーゼＢの阻害
剤であり、鎮痛作用を示す神経伝達物質であるエンケフ
ァリンの非活性化を遅らせる働きをする。このプロピオ
キサチンＡは、放線菌の一種であるキタサトスポリア・
セタエ（Kitasatosporia setae）SANK 60684により生産
されることが報告され、またその構造解析および有機化
学的合成法もなされている（Inaoka,Y., etal., J. Ant
ibiotics, 39, 1368-1385 (1986)）。しかしながら、上
記の文献にはプロピオキサチンＡがセラチア・マルセセ
ンス（Serratia marcescens）の生産する５６Ｋプロテ
アーゼはもとより、その免疫学的同等物であるセラチオ
プロテアーゼを特異的に阻害することについては全く触
れていない。プロピオキサチンＡがセラチオプロテアー
ゼを特異的に阻害し、その免疫学的同等物である５６Ｋ
プロテアーゼを阻害するであろうこと、また５６Ｋプロ
テアーゼに起因する角膜感染症などの病原性の発現を抑
制し得ることは今回初めて明らかにされたことである。
【００１０】すなわち、本発明は １） 下記式
【化４】 で示されるプロピオキサチンＡからなるセラチオプロテ
アーゼ阻害剤、および ２） 上記１）記載のプロピオキサチンＡを有効成分と
して含有する角膜感染症予防および／または治療剤を提
供するものである。
アーゼ阻害剤、および ２） 上記１）記載のプロピオキサチンＡを有効成分と
して含有する角膜感染症予防および／または治療剤を提
供するものである。
【００１１】以下、本発明を詳しく説明する。セラチオ
プロテアーゼはメタルプロテアーゼの一種であり、メタ
ルプロテアーゼ阻害剤として知られているエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やｏ−フェナントロリンなどの
金属キレート剤により阻害される。これらの金属キレー
ト剤はその他のメタルプロテアーゼ、例えばサーモリシ
ンなどをも強力に阻害する。他の微生物由来のメタルプ
ロテアーゼ阻害剤としては、ホスホラミドンやタロペプ
チンがあるが、これらはサーモリシンを阻害するがセラ
チオプロテアーゼを阻害しない。
プロテアーゼはメタルプロテアーゼの一種であり、メタ
ルプロテアーゼ阻害剤として知られているエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やｏ−フェナントロリンなどの
金属キレート剤により阻害される。これらの金属キレー
ト剤はその他のメタルプロテアーゼ、例えばサーモリシ
ンなどをも強力に阻害する。他の微生物由来のメタルプ
ロテアーゼ阻害剤としては、ホスホラミドンやタロペプ
チンがあるが、これらはサーモリシンを阻害するがセラ
チオプロテアーゼを阻害しない。
【００１２】これに対して、本発明に係るプロピオキサ
チンＡはセラチオプロテアーゼを強力に阻害するが、サ
ーモリシンを殆ど阻害しない。なお、プロピオキサチン
Ａによるサーモリシンの阻害は、プロピオキサチンＡ分
子中のヒドロキサム酸（−ＮＨ−ＯＨ）のキレート形成
能によって活性が阻害されるものであり、その阻害率は
１０％程度である。また、プロピオキサチンＡは、セリ
ンプロテアーゼであるトリプシン、α−キモトリプシン
およびズブチリシンＢＰＮ′、酸性プロテアーゼである
ペプシン、チオールプロテアーゼであるパパインなどを
全く阻害しない。すなわち、プロピオキサチンＡはセラ
チオプロテアーゼの酵素作用を特異的に阻害する。
チンＡはセラチオプロテアーゼを強力に阻害するが、サ
ーモリシンを殆ど阻害しない。なお、プロピオキサチン
Ａによるサーモリシンの阻害は、プロピオキサチンＡ分
子中のヒドロキサム酸（−ＮＨ−ＯＨ）のキレート形成
能によって活性が阻害されるものであり、その阻害率は
１０％程度である。また、プロピオキサチンＡは、セリ
ンプロテアーゼであるトリプシン、α−キモトリプシン
およびズブチリシンＢＰＮ′、酸性プロテアーゼである
ペプシン、チオールプロテアーゼであるパパインなどを
全く阻害しない。すなわち、プロピオキサチンＡはセラ
チオプロテアーゼの酵素作用を特異的に阻害する。
【００１３】プロピオキサチンＡの製造法：微生物を用
いる方法 プロピオキサチンＡは、本発明者らが熊本県下の土壌か
ら分離した菌株を用いて取得することができる。すなわ
ち、この菌株を適当な培地に接種し、常法に従って培養
すればよい。培地は、前記株菌が増殖し、プロピオキサ
チンＡを生産し得るものならば任意の培地が用いられ
る。例えば、炭素源としては通常グルコース、グリセロ
ール、ラクトース、デンプン等が用いられ、窒素源とし
てはミートエキス、ペプトン、脱脂大豆粉、酵母エキ
ス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
るほか、リン酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグ
ネシウム等の無機塩が添加される。培養は好気的条件
で、例えば通気撹拌法や振とう培養法で行なう。培養温
度は２５〜３５℃が好ましく、ｐＨは５〜８が好まし
い。培養時間は３４〜４２時間程度であり、プロピオキ
サチンＡによる阻害活性が最高に達した時に培養を終了
すればよい。プロピオキサチンＡの精製は、前記培養液
を熱処理およびろ過を行ない菌体を除去した後、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー
等により行なえばよい。
いる方法 プロピオキサチンＡは、本発明者らが熊本県下の土壌か
ら分離した菌株を用いて取得することができる。すなわ
ち、この菌株を適当な培地に接種し、常法に従って培養
すればよい。培地は、前記株菌が増殖し、プロピオキサ
チンＡを生産し得るものならば任意の培地が用いられ
る。例えば、炭素源としては通常グルコース、グリセロ
ール、ラクトース、デンプン等が用いられ、窒素源とし
てはミートエキス、ペプトン、脱脂大豆粉、酵母エキ
ス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
るほか、リン酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグ
ネシウム等の無機塩が添加される。培養は好気的条件
で、例えば通気撹拌法や振とう培養法で行なう。培養温
度は２５〜３５℃が好ましく、ｐＨは５〜８が好まし
い。培養時間は３４〜４２時間程度であり、プロピオキ
サチンＡによる阻害活性が最高に達した時に培養を終了
すればよい。プロピオキサチンＡの精製は、前記培養液
を熱処理およびろ過を行ない菌体を除去した後、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー
等により行なえばよい。
【００１４】また、イナオカらの方法（J. Antibiotic
s, 39, 1368-1385 (1986)）、すなわち工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７５８１
として寄託されているキタサトスポリア・セタエ（Kita
satosporia setae）SANK 60684を用いて上記のように培
養して取得することもできる。
s, 39, 1368-1385 (1986)）、すなわち工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７５８１
として寄託されているキタサトスポリア・セタエ（Kita
satosporia setae）SANK 60684を用いて上記のように培
養して取得することもできる。
【００１５】プロピオキサチンＡの製造法−２：合成化
学的方法 プロピオキサチンＡは、下記の反応工程式の手順に従っ
て公知の方法により合成することもできる（J. Antibio
tics, 39, 1382-1385 (1986)）。
学的方法 プロピオキサチンＡは、下記の反応工程式の手順に従っ
て公知の方法により合成することもできる（J. Antibio
tics, 39, 1382-1385 (1986)）。
【００１６】
【化５】
【００１７】［毒性］本発明にかかるプロピオキサチン
Ａの毒性は非常に低いものであり、医薬として使用する
ために十分安全であると判断できる。
Ａの毒性は非常に低いものであり、医薬として使用する
ために十分安全であると判断できる。
【００１８】［医薬品への適用］プロピオキサチンＡを
角膜感染症などの予防や治療の目的で用いるためには、
通常、溶液剤の形で用いられ、汎用されている技術を用
いて製剤化することができる。例えば点眼液であれば、
滅菌精製水に塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化
剤、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、ポリソルベート８０
等の可溶化剤、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化
ベンザルコニウム等の防腐剤等を必要に応じて適宜選択
して調製することができる。本発明阻害剤を点眼の形で
投与するには、症状、年齢、治療効果、処理時間等によ
り異なるが、通常、0.0001％〜0.5％溶液として用いら
れる。注射剤として非経口投与する場合は、プロピオキ
サチンＡを少なくとも１種の不活性な水性の希釈剤（注
射用蒸留水、生理食塩水等）や不活性な非水性の希釈剤
（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オ
リーブ油、エタノール、ポリソルベート８０（登録商
標）等）と混合して用いられる。これらの注射剤は、さ
らに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解
補助剤のような補助剤を含有していてもよい。上記注射
剤は、通常、バクテリア保留フィルター等を用いるろ
過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化されるか、
またはこれらの処理をした後、凍結乾燥等の方法により
固体組成物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用
希釈剤を加えて使用される。
角膜感染症などの予防や治療の目的で用いるためには、
通常、溶液剤の形で用いられ、汎用されている技術を用
いて製剤化することができる。例えば点眼液であれば、
滅菌精製水に塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化
剤、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、ポリソルベート８０
等の可溶化剤、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化
ベンザルコニウム等の防腐剤等を必要に応じて適宜選択
して調製することができる。本発明阻害剤を点眼の形で
投与するには、症状、年齢、治療効果、処理時間等によ
り異なるが、通常、0.0001％〜0.5％溶液として用いら
れる。注射剤として非経口投与する場合は、プロピオキ
サチンＡを少なくとも１種の不活性な水性の希釈剤（注
射用蒸留水、生理食塩水等）や不活性な非水性の希釈剤
（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オ
リーブ油、エタノール、ポリソルベート８０（登録商
標）等）と混合して用いられる。これらの注射剤は、さ
らに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解
補助剤のような補助剤を含有していてもよい。上記注射
剤は、通常、バクテリア保留フィルター等を用いるろ
過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化されるか、
またはこれらの処理をした後、凍結乾燥等の方法により
固体組成物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用
希釈剤を加えて使用される。
【００１９】また、本発明予防剤または治療剤を経口投
与する場合には、固体組成物および液体組成物として投
与する。経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸
剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが含まれる。このよ
うな固体組成物においては、プロピオキサチンＡを、少
なくともひとつの不活性な希釈剤（乳糖、マンニトー
ル、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶
セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケ
イ酸アルミル酸マグネシウム等）と混合して用いられ
る。これらの組成物は、不活性な希釈剤以外の添加物、
例えば潤滑剤、崩壊剤、溶解補助剤や安定化剤を含有し
ていてもよい。錠剤または丸剤は、必要により胃溶性ま
たは腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタ
レート等）のフィルムで被覆していてもよい。経口投与
のための液体組成物には、溶液剤、乳濁剤、懸濁剤、シ
ロップ剤、エリキシル剤が含まれる。このような液体組
成物においては、一般的に用いられる不活性な希釈剤
（精製水、エタノール等）が含まれる。これらの組成物
は、不活性な希釈剤以外に、湿潤剤、懸濁剤のような補
助剤、甘味料、風味料、芳香剤、防腐剤を含有していて
もよい。
与する場合には、固体組成物および液体組成物として投
与する。経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸
剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが含まれる。このよ
うな固体組成物においては、プロピオキサチンＡを、少
なくともひとつの不活性な希釈剤（乳糖、マンニトー
ル、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶
セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケ
イ酸アルミル酸マグネシウム等）と混合して用いられ
る。これらの組成物は、不活性な希釈剤以外の添加物、
例えば潤滑剤、崩壊剤、溶解補助剤や安定化剤を含有し
ていてもよい。錠剤または丸剤は、必要により胃溶性ま
たは腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタ
レート等）のフィルムで被覆していてもよい。経口投与
のための液体組成物には、溶液剤、乳濁剤、懸濁剤、シ
ロップ剤、エリキシル剤が含まれる。このような液体組
成物においては、一般的に用いられる不活性な希釈剤
（精製水、エタノール等）が含まれる。これらの組成物
は、不活性な希釈剤以外に、湿潤剤、懸濁剤のような補
助剤、甘味料、風味料、芳香剤、防腐剤を含有していて
もよい。
【００２０】
【発明の効果】本発明はプロピオキサチンＡからなるセ
ラチオプロテアーゼの特異的阻害剤を提供するものであ
り、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）
が生産する病原性プロテアーゼに起因する角膜感染症等
の予防や治療に有用である。
ラチオプロテアーゼの特異的阻害剤を提供するものであ
り、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）
が生産する病原性プロテアーゼに起因する角膜感染症等
の予防や治療に有用である。
【００２１】
【実施例】以下に参考例および実施例を示し本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等
限定されるものではない。なお、参考例において、各精
製工程におけるセラチオプロテアーゼの総活性は以下の
方法により測定した。
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等
限定されるものではない。なお、参考例において、各精
製工程におけるセラチオプロテアーゼの総活性は以下の
方法により測定した。
【００２２】すなわち、各精製工程により得られた溶液
0.02ｍｌをエッペンドルフチューブにいれ、次に５０μ
ｇ／ｍｌ酵素溶液［セラチア・ピスカトルム（Serratia
piscatorum）の生産するセラチオプロテアーゼ，0.1Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ9.0）］0.03ｍｌを混合し、３７℃
で３０分間プレインキュベートした後、基質として４ｍ
ｇ／ｍｌに調製したアゾアルブミン（Azoalbumin）を0.
1ｍｌ［0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ9.0）］混合し、３７
℃で６０分間反応させる。反応後、５０％トリクロロ酢
酸溶液（反応停止液）0.02ｍｌを加え、３７℃で１０分
間放置する。次に遠心分離（7000ｇ×２分）し、その上
清を0.12ｍｌ採取し、予め、0.02ｍｌの１０Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液を各セルに加えたマイクロタイタープレ
ート（９６穴）中にそれぞれ加える。約２０分間放置
後、生じたオレンジ色の呈色をＥＬＳＩＡリーダー（In
ternational Reagents Corporation社製）にて４５０ｎ
ｍにおける吸光度として測定する。また、各精製工程に
より得られた溶液0.02ｍｌの代わりに0.1Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ9.0）を0.02ｍｌ用いたものについて上記と同
様の操作を行ない、６６０ｎｍにおける吸光度を測定す
る。次に以下の式により阻害率Ｉ（％）を求め、５０％
の阻害率を示したときの阻害活性を１ユニットとした。
0.02ｍｌをエッペンドルフチューブにいれ、次に５０μ
ｇ／ｍｌ酵素溶液［セラチア・ピスカトルム（Serratia
piscatorum）の生産するセラチオプロテアーゼ，0.1Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ9.0）］0.03ｍｌを混合し、３７℃
で３０分間プレインキュベートした後、基質として４ｍ
ｇ／ｍｌに調製したアゾアルブミン（Azoalbumin）を0.
1ｍｌ［0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ9.0）］混合し、３７
℃で６０分間反応させる。反応後、５０％トリクロロ酢
酸溶液（反応停止液）0.02ｍｌを加え、３７℃で１０分
間放置する。次に遠心分離（7000ｇ×２分）し、その上
清を0.12ｍｌ採取し、予め、0.02ｍｌの１０Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液を各セルに加えたマイクロタイタープレ
ート（９６穴）中にそれぞれ加える。約２０分間放置
後、生じたオレンジ色の呈色をＥＬＳＩＡリーダー（In
ternational Reagents Corporation社製）にて４５０ｎ
ｍにおける吸光度として測定する。また、各精製工程に
より得られた溶液0.02ｍｌの代わりに0.1Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ9.0）を0.02ｍｌ用いたものについて上記と同
様の操作を行ない、６６０ｎｍにおける吸光度を測定す
る。次に以下の式により阻害率Ｉ（％）を求め、５０％
の阻害率を示したときの阻害活性を１ユニットとした。
【数１】Ｉ（％）＝（（Ｓ−Ｂ）−（Ｔ−Ｂ））／（Ｓ
−Ｂ）×１００ Ｓ：標準液吸光度 Ｔ：試験溶液の吸光度 Ｂ：対照溶液の吸光度
−Ｂ）×１００ Ｓ：標準液吸光度 Ｔ：試験溶液の吸光度 Ｂ：対照溶液の吸光度
【００２３】参考例１：菌株の培養 ５００ｍｌ容量の坂口コルベンにグリセロール 1.0％、
フジプロ−Ｒ 1.5％、酵母エキス 0.2％、Ｎａ2ＨＰＯ4
・12Ｈ2Ｏ 0.3％、アデカノール 0.2％を含有する培地
（ｐＨ６）を５０ｍｌ仕込んだ後、株菌を１白金耳量植
菌し３０℃にて２４時間振盪培養したものを、上記と同
様の培地（ｐＨ６）を２０リットル入れた３０リットル
容量のジャーファーメンターに入れ、３０℃にて２７時
間振盪培養した。
フジプロ−Ｒ 1.5％、酵母エキス 0.2％、Ｎａ2ＨＰＯ4
・12Ｈ2Ｏ 0.3％、アデカノール 0.2％を含有する培地
（ｐＨ６）を５０ｍｌ仕込んだ後、株菌を１白金耳量植
菌し３０℃にて２４時間振盪培養したものを、上記と同
様の培地（ｐＨ６）を２０リットル入れた３０リットル
容量のジャーファーメンターに入れ、３０℃にて２７時
間振盪培養した。
【００２４】参考例２：培養液の熱処理 参考例１で得た培養液に蒸気を送り、培地温度が１００
℃になるように調節し、１５分間熱処理を行なった。こ
のとき培養液は１７リットルとなり、培養液に対する活
性の回収率は９９％であった。
℃になるように調節し、１５分間熱処理を行なった。こ
のとき培養液は１７リットルとなり、培養液に対する活
性の回収率は９９％であった。
【００２５】参考例３：培養液のろ過 参考例２で得た培養液１７リットルからHyfro Super-Ce
ll（ジョーンズ・マンビル社製）をろ過助材に用いて、
東洋ろ紙No.2でのろ過によって菌体を除去した。このと
き培養液は16.2リットルとなり、培養液に対する活性の
回収率は９６％であった。
ll（ジョーンズ・マンビル社製）をろ過助材に用いて、
東洋ろ紙No.2でのろ過によって菌体を除去した。このと
き培養液は16.2リットルとなり、培養液に対する活性の
回収率は９６％であった。
【００２６】参考例４：ＨＰ−２０カラムによる精製 参考例３で得たろ過液16.2リットルにｐＨが３〜3.5に
なるように酢酸を加えて調整し、予め、脱イオン水で平
衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０カラム（φ５×４５c
m；三菱化学株式会社製）に吸着させた後、脱イオン水
によりカラムを洗浄した。次いで６０％メタノールによ
り吸着させた物質を溶出し、活性画分を回収した。この
活性画分は2.55リットルとなり、培養液に対する活性の
回収率は７６％であった。
なるように酢酸を加えて調整し、予め、脱イオン水で平
衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０カラム（φ５×４５c
m；三菱化学株式会社製）に吸着させた後、脱イオン水
によりカラムを洗浄した。次いで６０％メタノールによ
り吸着させた物質を溶出し、活性画分を回収した。この
活性画分は2.55リットルとなり、培養液に対する活性の
回収率は７６％であった。
【００２７】参考例５：Ｄｏｗｅｘ５０Ｗカラムによる
精製 参考例４で得た活性画分2.55リットルをロータリーエバ
ポレーターで0.5リットルまで濃縮し、これを予め脱イ
オン水で洗浄したＤｏｗｅｘ５０Ｗカラム（φ５×１５
cm；ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー製）に通塔させた
後、脱イオン水で洗浄した。通過液にアンモニア水をｐ
Ｈ７になるように加え、濃褐色の色素分を除去した。こ
の操作により活性画分は１リットルとなり、培養液に対
する活性の回収率は６８％であった。
精製 参考例４で得た活性画分2.55リットルをロータリーエバ
ポレーターで0.5リットルまで濃縮し、これを予め脱イ
オン水で洗浄したＤｏｗｅｘ５０Ｗカラム（φ５×１５
cm；ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー製）に通塔させた
後、脱イオン水で洗浄した。通過液にアンモニア水をｐ
Ｈ７になるように加え、濃褐色の色素分を除去した。こ
の操作により活性画分は１リットルとなり、培養液に対
する活性の回収率は６８％であった。
【００２８】参考例６：Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤ
Ｓカラムによる精製 参考例５で得た活性画分１リットルをロータリーエバポ
レーターで0.1リットルまで濃縮し、ｐＨが３〜3.5にな
るように酢酸を加えて調整し、予め、脱イオン水で平衡
化したＯＤＳカラム（φ７×９cm；富士デヴィソン化学
株式会社製）に吸着させた後、脱イオン水によりカラム
を洗浄した。次いで０〜７０％メタノールのリニアグラ
デーションにより吸着させた物質を溶出し、活性画分を
回収した。この活性画分は２５０ｍｌとなり、培養液に
対する活性の回収率は４７％であった。
Ｓカラムによる精製 参考例５で得た活性画分１リットルをロータリーエバポ
レーターで0.1リットルまで濃縮し、ｐＨが３〜3.5にな
るように酢酸を加えて調整し、予め、脱イオン水で平衡
化したＯＤＳカラム（φ７×９cm；富士デヴィソン化学
株式会社製）に吸着させた後、脱イオン水によりカラム
を洗浄した。次いで０〜７０％メタノールのリニアグラ
デーションにより吸着させた物質を溶出し、活性画分を
回収した。この活性画分は２５０ｍｌとなり、培養液に
対する活性の回収率は４７％であった。
【００２９】参考例７：ゲルろ過 参考例６で得た活性画分２５０ｍｌをロータリーエバポ
レーターで２０ｍｌまで濃縮し、これを予め脱イオン水
で洗浄したＢｉｏＧｅｌ Ｐ−２（φ2.2×４５cm；バイ
オ・ラッド社製）にかけ、蒸留脱イオン水で溶出し、活
性画分を回収した。この活性画分は８０ｍｌとなり、培
養液に対する活性の回収率は３５％であった。
レーターで２０ｍｌまで濃縮し、これを予め脱イオン水
で洗浄したＢｉｏＧｅｌ Ｐ−２（φ2.2×４５cm；バイ
オ・ラッド社製）にかけ、蒸留脱イオン水で溶出し、活
性画分を回収した。この活性画分は８０ｍｌとなり、培
養液に対する活性の回収率は３５％であった。
【００３０】参考例８：ＴＳＫゲルＳＡＸ ＨＰＬＣに
よる精製 参考例７で得た活性画分８０ｍｌをロータリーエバポレ
ーターで３０ｍｌまで濃縮し、予め５ｍＭリン酸二ナト
リウムで平衡化したカラムを用い、下記条件のＨＰＬＣ
により精製を行なった。回収した活性画分をロータリー
エバポレーターで３０ｍｌに濃縮した。培養液に対する
活性の回収率は３１％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ＴＳＫゲルＳＡＸ（φ0.78×３０cm；東ソー株
式会社製） 展開溶媒：０〜0.5Ｍ ＮａＣｌ＋５ｍＭリン酸二ナトリ
ウム 流速：1.0ｍｌ／分 圧力：５１kg／cm2 検出：Ａｂｓ２１０ｎｍ カラム温度：２７℃
よる精製 参考例７で得た活性画分８０ｍｌをロータリーエバポレ
ーターで３０ｍｌまで濃縮し、予め５ｍＭリン酸二ナト
リウムで平衡化したカラムを用い、下記条件のＨＰＬＣ
により精製を行なった。回収した活性画分をロータリー
エバポレーターで３０ｍｌに濃縮した。培養液に対する
活性の回収率は３１％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ＴＳＫゲルＳＡＸ（φ0.78×３０cm；東ソー株
式会社製） 展開溶媒：０〜0.5Ｍ ＮａＣｌ＋５ｍＭリン酸二ナトリ
ウム 流速：1.0ｍｌ／分 圧力：５１kg／cm2 検出：Ａｂｓ２１０ｎｍ カラム温度：２７℃
【００３１】参考例９：ＴＳＫゲルオクタデシル２ＰＷ
ＨＰＬＣによる精製 参考例８で得た活性画分３０ｍｌを、予め２０ｍＭリン
酸二ナトリウム−６％メタノールで平衡化したカラムを
用い、下記条件のＨＰＬＣにより精製を行なった。回収
した活性画分をロータリーエバポレーターで３０ｍｌに
濃縮した。培養液に対する活性の回収率は２０％であっ
た。ＨＰＬＣ条件 カラム：ＴＳＫゲルオクタデシル２ＰＷ（φ0.78×３０
cm；東ソー株式会社製） 展開溶媒：２０ｍＭリン酸二ナトリウム−６％メタノー
ル 流速：1.0ｍｌ／分 圧力：１００kg／cm2 検出：Ａｂｓ２２５ｎｍ カラム温度：２５℃
ＨＰＬＣによる精製 参考例８で得た活性画分３０ｍｌを、予め２０ｍＭリン
酸二ナトリウム−６％メタノールで平衡化したカラムを
用い、下記条件のＨＰＬＣにより精製を行なった。回収
した活性画分をロータリーエバポレーターで３０ｍｌに
濃縮した。培養液に対する活性の回収率は２０％であっ
た。ＨＰＬＣ条件 カラム：ＴＳＫゲルオクタデシル２ＰＷ（φ0.78×３０
cm；東ソー株式会社製） 展開溶媒：２０ｍＭリン酸二ナトリウム−６％メタノー
ル 流速：1.0ｍｌ／分 圧力：１００kg／cm2 検出：Ａｂｓ２２５ｎｍ カラム温度：２５℃
【００３２】参考例１０：ニュークレオシルＯＤＳ10Ｃ
18 ＨＰＬＣによる精製 参考例９で得た活性画分３０ｍｌにｐＨが3.5になるよ
うに酢酸を加えて調整し、予め再蒸留水で洗浄したカラ
ムに吸着させた後、再蒸留水で洗浄し、下記ＨＰＬＣ条
件下、０〜６０％メタノールのリニアグラジエントで溶
出し、活性画分を回収した。この活性画分をロータリー
エバポレーターで３０ｍｌに濃縮した。培養液に対する
活性の回収率は１６％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ニュークレオシルＯＤＳ10Ｃ18（φ0.8×１５c
m；ナーゲル社製） 展開溶媒：０〜６０％メタノールのリニアグラジエント 流速：3.0ｍｌ／分 圧力：６５kg／cm2 検出：Ａｂｓ２２５ｎｍ カラム温度：２８℃
18 ＨＰＬＣによる精製 参考例９で得た活性画分３０ｍｌにｐＨが3.5になるよ
うに酢酸を加えて調整し、予め再蒸留水で洗浄したカラ
ムに吸着させた後、再蒸留水で洗浄し、下記ＨＰＬＣ条
件下、０〜６０％メタノールのリニアグラジエントで溶
出し、活性画分を回収した。この活性画分をロータリー
エバポレーターで３０ｍｌに濃縮した。培養液に対する
活性の回収率は１６％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ニュークレオシルＯＤＳ10Ｃ18（φ0.8×１５c
m；ナーゲル社製） 展開溶媒：０〜６０％メタノールのリニアグラジエント 流速：3.0ｍｌ／分 圧力：６５kg／cm2 検出：Ａｂｓ２２５ｎｍ カラム温度：２８℃
【００３３】参考例１１：ヒタチゲル ＃３０１９ Ｈ
ＰＬＣによる精製 参考例１０で得た活性画分にはシリカゲルを担体とする
逆相クロマトによってカラムからの漏出物が認められた
のでポーラスポリマー系逆相カラムを用いてシリカ等の
漏出物の除去を行なった。すなわち、参考例１０で得た
活性画分３０ｍｌをロータリーエバポレーターで１０ｍ
ｌに濃縮し、予め再蒸留水で洗浄したカラムに吸着させ
た後、再蒸留水で洗浄し、下記ＨＰＬＣ条件下、６０％
メタノールで溶出し、活性画分を回収した。この活性画
分を凍結乾燥し、78.89ｍｇの白色粉末を得た。培養液
に対する活性の回収率は11.8％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ヒタチゲル ＃３０１９（φ0.8×15.5cm；日立
化成株式会社製） 展開溶媒：６０％メタノール 流速：2.0ｍｌ／分 圧力：７０kg／cm2 検出：Ａｂｓ２１０ｎｍ カラム温度：２８℃
ＰＬＣによる精製 参考例１０で得た活性画分にはシリカゲルを担体とする
逆相クロマトによってカラムからの漏出物が認められた
のでポーラスポリマー系逆相カラムを用いてシリカ等の
漏出物の除去を行なった。すなわち、参考例１０で得た
活性画分３０ｍｌをロータリーエバポレーターで１０ｍ
ｌに濃縮し、予め再蒸留水で洗浄したカラムに吸着させ
た後、再蒸留水で洗浄し、下記ＨＰＬＣ条件下、６０％
メタノールで溶出し、活性画分を回収した。この活性画
分を凍結乾燥し、78.89ｍｇの白色粉末を得た。培養液
に対する活性の回収率は11.8％であった。ＨＰＬＣ条件 カラム：ヒタチゲル ＃３０１９（φ0.8×15.5cm；日立
化成株式会社製） 展開溶媒：６０％メタノール 流速：2.0ｍｌ／分 圧力：７０kg／cm2 検出：Ａｂｓ２１０ｎｍ カラム温度：２８℃
【００３４】表３に上記参考例２〜１１までの精製工程
毎における活性等を示す。
毎における活性等を示す。
【表３】 精製段階 総活性（Ｕ） 収率（％） 参考例１ 培養液 180,000,000 １００ 参考例２ 加熱処理 179,000,000 ９９ 参考例３ セライトろ過 172,000,000 ９６ 参考例４ DIAION HP-20 136,000,000 ７６ 参考例５ Dowex 50W 122,000,000 ６８ 参考例６ Chromatorex ODS 83,800,000 ４７ 参考例７ Bio Gel P-2 62,500,000 ３５ 参考例８ TSK ゲルSAX 56,600,000 ３１ 参考例９ TSK ゲルオクタデシル2PW 36,700,000 ２０ 参考例10 ニュークレオシル 29,300,000 １６ 参考例11 ヒタチゲル#3019 21,300,000 １２
【００３５】以上により製造および精製されたプロピオ
キサチンＡの物性を下記に示す。 (1) 元素分析 計算値：Ｃ7.82，Ｈ54.99，Ｎ11.32（Ｃ17Ｈ29Ｎ3Ｏ6） 測定値：Ｃ7.77，Ｈ53.52，Ｎ11.02 (2) 質量分析 ＦＡＢ−ＭＳ(m/z)：３７２(M+H)+（Pog.）グリセリン
マトリックス ＦＡＢ−ＭＳ(m/z)：３７０(M-H)-（Neg.）グリセリン
マトリックス (3) ＩＲ 3000-2900, 1760-1700, 1700-1580, 1580-1490, 1490-1
400, 1260-1160cm-1 (4) 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ（ppm） 4.32(1H,dd,J=5.5Hz,8.4Hz), 4.08(1H,d,J=5.9Hz), 3.7
0-3.53(2H,m), 3.05-2.95(1H,m), 2.29-2.18(2H,m), 2.
18-2.00(2H,m), 1.91-1.77(3H,m), 1.48-1.25(2H,m),
1.24-1.14(2H,m), 0.88-0.81(6H,m), 0.75(3H,t,J=7.3H
z) (5) 13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ（ppm） ＣＯ ：175.9, 175.5, 174.2, 170.7 ＣＨ3：18.3, 17.2, 13.2 ＣＨ2：48.3, 34.6, 34.0, 29.2, 24.3, 19.4 ＣＨ ：60.0, 58.5, 39.4, 29.8 (6) 融点 ８５〜８６℃ (7) 旋光度 −90.2゜（ｃ＝0.1，２８℃，水）
キサチンＡの物性を下記に示す。 (1) 元素分析 計算値：Ｃ7.82，Ｈ54.99，Ｎ11.32（Ｃ17Ｈ29Ｎ3Ｏ6） 測定値：Ｃ7.77，Ｈ53.52，Ｎ11.02 (2) 質量分析 ＦＡＢ−ＭＳ(m/z)：３７２(M+H)+（Pog.）グリセリン
マトリックス ＦＡＢ−ＭＳ(m/z)：３７０(M-H)-（Neg.）グリセリン
マトリックス (3) ＩＲ 3000-2900, 1760-1700, 1700-1580, 1580-1490, 1490-1
400, 1260-1160cm-1 (4) 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ（ppm） 4.32(1H,dd,J=5.5Hz,8.4Hz), 4.08(1H,d,J=5.9Hz), 3.7
0-3.53(2H,m), 3.05-2.95(1H,m), 2.29-2.18(2H,m), 2.
18-2.00(2H,m), 1.91-1.77(3H,m), 1.48-1.25(2H,m),
1.24-1.14(2H,m), 0.88-0.81(6H,m), 0.75(3H,t,J=7.3H
z) (5) 13Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ（ppm） ＣＯ ：175.9, 175.5, 174.2, 170.7 ＣＨ3：18.3, 17.2, 13.2 ＣＨ2：48.3, 34.6, 34.0, 29.2, 24.3, 19.4 ＣＨ ：60.0, 58.5, 39.4, 29.8 (6) 融点 ８５〜８６℃ (7) 旋光度 −90.2゜（ｃ＝0.1，２８℃，水）
【００３６】実施例：阻害活性の測定 以上により得られたプロピオキサチンＡの各種酵素に対
する阻害率を測定した。酵素としては、セラチア・ピス
カトルム（Serratia piscatorum）の生産するセラチオ
プロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリチンＢＮＰ′、
α−キモトリプシン、トリプシン、ペプシンおよびパパ
インを用いた。結果を表４に示す。なお、阻害率は以下
のハマルステインカゼイン法にて測定した。
する阻害率を測定した。酵素としては、セラチア・ピス
カトルム（Serratia piscatorum）の生産するセラチオ
プロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリチンＢＮＰ′、
α−キモトリプシン、トリプシン、ペプシンおよびパパ
インを用いた。結果を表４に示す。なお、阻害率は以下
のハマルステインカゼイン法にて測定した。
【００３７】［阻害率の測定方法］ （１）セラチオプロテアーゼ ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
9.0））0.3ｍｌと参考例で得たプロピオキサチンＡの２
μｇ／ｍｌ溶液0.2ｍｌとを、３７℃で３０分間プレイ
ンキュベートした後、0.7％ハマルステインカゼイン溶
液（同ｐＨ）1.5ｍｌを加え、３７℃で２０分間反応さ
せる。反応後、５０％トリクロロ酢酸２ｍｌを加えて反
応を停止させ、室温で２０分間放置後、東洋ろ紙No.2を
用いてろ過し、そのろ液0.5ｍｌを分取する。これに0.4
4Ｍ炭酸ナトリウム1.5ｍｌと、１Ｎフォーリン試薬0.5
ｍｌを加え、３７℃で２０分間反応させた後、６６０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する。プロピオキサチンＡを加
えずに同様に測定した吸光度を対照として、阻害率を算
出する。 （２）サーモリシン １０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
7.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （３）ズブチリチンＢＮＰ′ ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （４）α−キモトリプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （５）トリプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （６）ペプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
2.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （７）パパイン ３０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５ｍＭシステインと１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ7.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同
様に阻害率を算出する。
9.0））0.3ｍｌと参考例で得たプロピオキサチンＡの２
μｇ／ｍｌ溶液0.2ｍｌとを、３７℃で３０分間プレイ
ンキュベートした後、0.7％ハマルステインカゼイン溶
液（同ｐＨ）1.5ｍｌを加え、３７℃で２０分間反応さ
せる。反応後、５０％トリクロロ酢酸２ｍｌを加えて反
応を停止させ、室温で２０分間放置後、東洋ろ紙No.2を
用いてろ過し、そのろ液0.5ｍｌを分取する。これに0.4
4Ｍ炭酸ナトリウム1.5ｍｌと、１Ｎフォーリン試薬0.5
ｍｌを加え、３７℃で２０分間反応させた後、６６０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する。プロピオキサチンＡを加
えずに同様に測定した吸光度を対照として、阻害率を算
出する。 （２）サーモリシン １０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
7.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （３）ズブチリチンＢＮＰ′ ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （４）α−キモトリプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （５）トリプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
8.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （６）ペプシン ５０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
2.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同様に阻害率を算出す
る。 （７）パパイン ３０μｇ／ｍｌ酵素溶液（５ｍＭシステインと１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ7.0））0.3ｍｌを用い、上記１と同
様に阻害率を算出する。
【００３８】
【表４】 酵 素 濃度（μg/ml） ｐＨ 阻害率（％） セラチオプロテアーゼ ５０ 9.0 ８９ サーモリシン １０ 7.0 １０ ズブチリチンＢＮＰ′ ５０ 8.0 ０ α−キモトリプシン ５０ 8.0 ０ トリプシン ５０ 8.0 ０ ペプシン ５０ 2.0 ０ パパイン ３０ 7.0 ０
【００３９】表４から明らかなように、プロピオキサチ
ンＡはセラチオプロテアーゼに対して強力な阻害作用を
有する。セラチオプロテアーゼと同じメタルプロテアー
ゼに分類されるサーモリシンに対しても多少の阻害作用
を示すが、これはプロピオキサチンＡが分子中に有する
ヒドロキサム酸（−ＮＨ−ＯＨ）のキレート形成能によ
り活性が阻害されるものと考えられ、その阻害効果は弱
い。また、セリンプロテアーゼであるトリプシン、α−
キモトリプシンおよびズブチリシンＢＰＮ′、酸性プロ
テアーゼであるペプシン、チオールプロテアーゼである
パパインなどを全く阻害しない。
ンＡはセラチオプロテアーゼに対して強力な阻害作用を
有する。セラチオプロテアーゼと同じメタルプロテアー
ゼに分類されるサーモリシンに対しても多少の阻害作用
を示すが、これはプロピオキサチンＡが分子中に有する
ヒドロキサム酸（−ＮＨ−ＯＨ）のキレート形成能によ
り活性が阻害されるものと考えられ、その阻害効果は弱
い。また、セリンプロテアーゼであるトリプシン、α−
キモトリプシンおよびズブチリシンＢＰＮ′、酸性プロ
テアーゼであるペプシン、チオールプロテアーゼである
パパインなどを全く阻害しない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:43）
Claims (2)
- 【請求項１】 下記式 【化１】 で示されるプロピオキサチンＡからなるセラチオプロテ
アーゼ阻害剤。 - 【請求項２】 下記式 【化２】 で示されるプロピオキサチンＡを有効成分として含有す
る角膜感染症予防および／または治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7173939A JPH093094A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | セラチオプロテアーゼ阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7173939A JPH093094A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | セラチオプロテアーゼ阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH093094A true JPH093094A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15969874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7173939A Pending JPH093094A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | セラチオプロテアーゼ阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH093094A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001044179A1 (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | Versicor, Inc. | Novel succinate compounds, compositions and methods of use and preparation |
| US6444791B1 (en) * | 1999-10-27 | 2002-09-03 | K-Quay Enterprises, Llc | Methods and compositions for the treatment of keratoconus using protease inhibitors |
| WO2002028829A3 (en) * | 2000-09-25 | 2003-12-24 | Questcor Pharmaceuticals Inc | Peptide deformylase inhibitors |
| US6797820B2 (en) | 1999-12-17 | 2004-09-28 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Succinate compounds, compositions and methods of use and preparation |
-
1995
- 1995-06-19 JP JP7173939A patent/JPH093094A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6444791B1 (en) * | 1999-10-27 | 2002-09-03 | K-Quay Enterprises, Llc | Methods and compositions for the treatment of keratoconus using protease inhibitors |
| WO2001044179A1 (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | Versicor, Inc. | Novel succinate compounds, compositions and methods of use and preparation |
| JP2003534239A (ja) * | 1999-12-17 | 2003-11-18 | ヴァージコア・インコーポレーテッド | 新規なスクシナート化合物、組成物、並びに使用及び調製方法 |
| US6797820B2 (en) | 1999-12-17 | 2004-09-28 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Succinate compounds, compositions and methods of use and preparation |
| WO2002028829A3 (en) * | 2000-09-25 | 2003-12-24 | Questcor Pharmaceuticals Inc | Peptide deformylase inhibitors |
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