JPH0930975A

JPH0930975A - 組織への血流回復に伴う白血球による二次的損傷の抑制剤

Info

Publication number: JPH0930975A
Application number: JP20528895A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Yoshida; 研一吉田
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1997-02-04

Abstract

(57)【要約】【目的】血流の障害された組織への血流回復に伴って
白血球により引き起こされる組織の二次的損傷を抑制す
るための薬剤を提供すること。【構成】次式、【化１】〔式中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なって水素原子又
はメチル基を表す。〕でで示されるリン酸ジエステル化
合物又はその薬剤的に許容し得る塩を含有してなる、組
織への血流回復に伴う白血球による組織の二次的損傷の
抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血流の障害された
各種組織への血流の回復に伴って白血球により引き起こ
される該組織の二次的損傷を抑制するための薬剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血流の
障害後の組織損傷の多くの機序が報告されている。例え
ば好中球は、（ａ）スーパオキサイド・アニオン（Ｏ₂
^-1）の産生（Fantone JC et al., The American Journa
l of Pathology, 107: 397-418 (1982) ）、（ｂ）ライ
ソソーム酵素の遊離（Weisman G et al., The New Engl
and Journal of Medicine, 303:27-34 (1980)）、及び
（ｃ）リポキシゲナーゼ産物の遊離（Sasaki K et al.,
Cardiovascular Research, 22: 142-48 (1988))を通じ
て虚血性の組織損傷に関与していると言われている。ま
たラットの左冠状動脈の永久的結紮は、ロイコトリエン
Ｂ₄（ＬＴＢ₄）レベルを上昇させるが、それが心組織
中への多形核白血球の浸潤のピークより前の、結紮後８
時間の時点でピークに達したということが報告されてい
る（Sasaki K et al., Cardiovascular Research, 22:
142-48 (1988))）。ロイコトリエンＢ₄のピーク値はシ
ャム（sham）手術を受けた心臓のそれの８倍であった。
更にまた、ホスホリパーゼＡ₂の活性化は、ライソソー
ム膜の破裂を誘導し、ライソソーム酵素を遊離させる
（Schror K et al., The American Journal of Patholo
gy, 238: H87-H92 (1980))ほか、ミトコンドリアを膨脹
させ（Broekemeier KM et al., The Journal of Bioche
mistry, 260: 105-113 (1985))、アラキドン酸の遊離を
もたらすと言われている。アラキドン酸の遊離は、虚血
損傷を強く増悪させることの示されているロイコトリエ
ン類及びトロンボキサン類の形成をもたらす。

【０００３】α−トコフェロールは、ラジカル・スカベ
ンジャーであることが知られており（McCay PB, Ann Re
v Nutr, 5: 323-340 (1985))、イヌにおいて心筋梗塞サ
イズを減少させたことも報告されている（Tanabe M et
al., The Japanese Journalof Pharmacology, 50: 467-
476 (1989))。しかしながら、この薬剤は、水溶性が低
いこと等から、心筋梗塞症において治療剤としては使用
されていない。

【０００４】アスコルビン酸もまたラジカル・スカベン
ジャーとして知られているが（Nishikimi M et al., Bi
ochemical and Biophysical Research Communications,
63:463-468 (1975) 及びBodannes RS et al., FEBS Le
tters, 105: 195-196 (1979))、ある種の条件下ではそ
の酸化剤的な性質が中心的になってしまうという問題が
ある（Heikkila RE et al., Journal of Neurochemistr
y, 41: 1384-1392 (1983))。

【０００５】一方、アスコルビン酸とトコフェロール類
とをリン酸ジエステル結合により結合させた次式

【０００６】

【化２】

【０００７】〔式中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なっ
て水素原子又はメチル基を表す。〕の化合物及びその塩
は、アスコルビン酸とトコフェロール類との単なる混合
物とは異なった薬理学的プロフィールを有することが知
られている。

【０００８】すなわち、それらの化合物は、抗白内障
剤、更年期障害治療・予防剤、美肌作用を有する化粧品
（特公平２−４４４７８号）、抗炎症剤（特公平１−２
７０４４号）、抗潰瘍剤（特開昭６３−２７０６２６
号）、虚血性臓器傷害予防・治療剤（特開平２−１１１
７２２号）などの種々の用途が知られている。

【０００９】また該化合物は、ラット脳ホモジネートに
対しα−トコフェロールより強力な抗酸化作用を示す
が、電子スピン共鳴スペクトロメトリーで見たとき、本
化合物は、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）に対して強力
なスカベンジャー活性を示すことも報告されている（Mo
ri A et al., Neurosciences, 15: 371-76 (1989))。

【００１０】更に該化合物は、mongolian gerbillus で
脳虚血の最中及び後における組織のアシドーシス及びエ
ネルギー障害を緩和することも明らかにされている（Ku
ribayashi Y et al., The Japanese Journal of Pharma
cology, 49: supp. 130P (1989))。

【００１１】該化合物は更に、血清ホスホリパーゼＡ₂
（ＰＬＡ₂）活性を阻害することも確認されている（Ku
ribayashi Y et al., Arzneimittel Forschung/Drug Re
search, 42(II), 9: 1072-1074 (1992))。

【００１２】本発明者は、これらの背景のもとに更に検
討を加えた結果、以下に示す通り、該化合物が組織への
血流回復に伴う白血球によって引き起こされる組織の二
次的損傷を抑制することを見出し、本発明を完成させ
た。

【００１３】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、次
式、

【００１４】

【化３】

【００１５】〔式中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なっ
て水素原子又はメチル基を表す。〕でで示されるリン酸
ジエステル化合物又はその薬剤的に許容し得る塩（以
下、あわせて「本化合物」という。）を含有してなる、
組織への血流回復に伴う白血球による組織の二次的損傷
の抑制剤である。

【００１６】後述の薬効試験の部に示したように、本化
合物がラットの心筋梗塞の成立を抑制し、またラット多
形核白血球のスーパーオキサイド・アニオン産生を抑制
すると共にライソソーム酵素である酸性ホスファターゼ
活性を阻害することが本発明により見出された。これら
の知見に照らし、血流回復に伴う組織損傷に対する本化
合物の効果は、好中球等の白血球が産生するスーパーオ
キサイド・アニオン等の酸素由来ラジカルを除去する活
性とライソソーム酵素である酸性ホスファターゼに対す
る阻害作用との総合的な働きにより、白血球による二次
的損傷を抑制することに基づくものと考えられる。従っ
て、本発明の薬剤は、種々の組織の血流回復に伴う好中
球等の白血球による二次的損傷を抑制するのに有用であ
る。そのような組織損傷の最も一般的な例は、冠動脈閉
塞に起因する心筋壊死である心筋梗塞、並びに脳梗塞で
あり、本発明の薬剤は、これらの組織及び他の組織にお
ける一時的な血流障害後の自然な血流回復や外科的再灌
流等に際して、好中球等の白血球による組織損傷を抑制
するのに用いることができる。

【００１７】本化合物は、例えば特公平２−４４４７８
号公報や特開昭６２−２０５０９１号公報に記載の方法
に準じて合成することができる。

【００１８】本発明の薬剤において、本化合物は、上記
式に示された遊離の形のままでも、又は薬剤的に許容し
得る塩の形でも用いることができる。そのような薬剤的
に許容し得る塩としては、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩等のアルカリ金属塩や、カルシウム塩、マグネシウ
ム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられるが、これら
以外の塩であっても薬剤的に許容し得る限り使用してよ
い。

【００１９】本発明の薬剤には、本化合物に包含される
２種以上の化合物を組み合わせて含有させてもよい。

【００２０】本化合物は毒性が非常に低く、安全性に優
れる。例えば、本化合物の一つであるＬ−アスコルビン
酸及びＤＬ−α−トコフェロールとリン酸とのジエステ
ル（式（Ｉ）においてＲ₁＝Ｒ₂＝メチル）のカリウム
塩（以下ＥＰＣ−Ｋと略記する。）のＬＤ₅₀は、５ｇ／
ｋｇ（ラット、経口）以上、及び100 ｍｇ／ｋｇ（ラッ
ト、静注）である。この非常に低い毒性は、本化合物を
本発明の目的に使用するに際して大きな利点である。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の薬剤は、経口的に又は非
経口的（例えば静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、点
滴注入その他）に適宜に使用することができる。製剤形
態としては、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等
の固形製剤、又は注射剤等の液剤のいずれにも慣用の方
法で製剤化することができる。これらの製剤には、通常
用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、吸収促進
剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化
剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調整剤等の各種の添加剤
を適宜使用することができる。

【００２２】本化合物の投与量は、患者の年齢、体重、
性別、症状等によって異なり得るが、例えば、注射剤の
場合は通常、成人１日約0.5 〜200 ｍｇ、好ましくは約
２〜50ｍｇ、内服剤の場合は通常、成人１日数回、１回
約５〜2000ｍｇ、好ましくは約20〜500 ｍｇである。

【００２３】本発明の薬剤には、本発明の目的に反しな
いかぎり、他の同種の薬効を有する成分及び／又は別種
の薬効を奏する成分を含有させてもよい。

【００２４】以下、薬効試験例及び実施例を挙げて本発
明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらによって限
定されるものではない。なお、使用したＥＰＣ−Ｋは、
前記公知方法により製造した。また、統計解析はStuden
t's-t 検定を用いて行い、ｐ＜0.05のときに差が有意で
あるとみなした。

【００２５】〔薬効試験１〕多形核白血球のスーパー
オキサイド・アニオン産生に対するＥＰＣ−Ｋの効果（試験方法）多形核白血球の調製：滅菌食塩水中の１％カゼイン酸
ナトリウム（和光純薬）を体重200 〜400 ｇの雄性Spra
gue-Dawleyラットの腹腔内に注射した。６時間後動物を
屠殺し腹腔内滲出物をプラスチック試験管に集め４℃に
て180 ×ｇで５分間遠心した。混入している赤血球を溶
解させるため、150 ｍＭの塩化アンモニウムを含有する
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.65）中に細胞を懸濁させた
（Carpenter DL et al., The Journal of Pharmacology
and Experimental Therapeutics,251: 983-991 (198
9))。カルシウムイオン不含のHank's平衡緩衝溶液（Ｈ
ＢＳＳ）で多形核白血球を２回洗浄し、次いで細胞２×
10⁷個／ｍｌの割合で再懸濁させた。

【００２６】Ｏ₂ ^-産生アッセイ：Ｏ₂ ^-産生は、フ
ェリチトクロームＣの還元によって測定した（Goldstei
n IM et al., The Journal of Clinical Investigatio
n, 56: 1155-1163 (1975)及びMarkert M et al., Metho
ds in Enzymology, 105: 358-65 (1984) ）。すなわ
ち、ＨＢＳＳ又はＥＰＣ−Ｋ、多形核白血球の懸濁液
（細胞４×10⁶個／ｍｌ）、フェリチトクロームＣ（タ
イプIII 、ウマ心臓由来：Sigma Chem. Co. ,St. Loui
s, MO, USA ）（2.5 ｍｇ／ｍｌ）及びフォルボール−1
2−ミリスチン酸−13−酢酸（ＰＭＡ、和光純薬）（２
μｇ／ｍｌ）を、プラスチックの試験管に順次加えた。
試験管を37℃にてインキュベートし、５分後、試験管を
8000×ｇで30秒間遠心し、上澄の吸光度を、分光光度計
（150-20、日立製作所）を用いて550 ｎｍにて測定し
た。Ｏ₂ ^-の産生量は、次の式に従って計算できる。Ｏ₂ ^-（ｎｍｏｌ）＝47.7×吸光度

【００２７】（結果）結果を表１に掲げる。各データ
は、ＰＭＡによって誘導されたラット多形核白血球によ
るＯ₂ ^-産生に対する、各濃度のＥＰＣ−Ｋの効果を示
している。値は、平均±平均偏差（ｎ＝３）で表されて
おり、括弧内の数字は対照のＯ₂ ^-量に対する抑制率
（％）を表す。

【００２８】

【表１】

【００２９】表１より明らかな通り、ＥＰＣ−Ｋは、多
形核白血球によるＯ₂ ^-産生量を濃度依存的に抑制し、
そのＩＣ₅₀は、4.2 ×10^-5Ｍであった。

【００３０】〔薬効試験２〕多形核白血球ライソソー
ム酵素に対するＥＰＣ−Ｋの効果（試験方法）上記薬効試験１と同様にして調製した多形
核白血球の懸濁液中へ、最終濃度が0.2 ％となるように
Triton X-100を添加することによってサンプルを調製し
た。Triton X-100は白血球の全ての酵素活性を懸濁媒質
中へ遊離させるものとされている（Traynor JR et al.,
Biochimica et Biophysica Acta, 665: 571-77 (198
1)）。600 ×ｇでの５分間の遠心の後、得られた上澄を
酵素活性のアッセイに用いた。酸性ホスファターゼ活性
のアッセイは、Bessey等の記述している方法（Bessey O
A et al., The Journal of Biological Chemistry, 16
4: 321-29 (1946))により、ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートを基質として用いて行った。β−グルクロニダー
ゼ活性は、Kato等の記述している方法（Chemical & Pha
rmaceuticalBulletin, 8: 239-42 (1960)) により、ｐ
−ニトロフェニルグルクロニドを基質として用いて測定
した。ミエロペルオキシダーゼ活性は、ｏ−ジアニシジ
ン酸化（Jandle RC et al., The Journal of Clinical
Investigation, 61: 1176-1185(1978))によって測定し
た。酵素活性の１単位は、使用した条件下において１分
間に基質１μｍｏｌを開裂させる酵素活性と定義した。

【００３１】（試験結果）表２は、酸性ホスファターゼ
活性に対する各濃度のＥＰＣ−Ｋの効果を示す。各値は
平均±平均偏差（ｎ＝３）を表し、括弧内の数字は対照
活性に対する阻害率（％）を示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】表２に見られるように、ＥＰＣ−Ｋは酸性
ホスファターゼ活性を濃度依存的に阻害し、ＩＣ₅₀は、
2.4 ×10^-5Ｍであった。しかしながら、β−グルクロニ
ダーゼ及びミエロペルオキシダーゼに対しては影響を与
えなかった（データは示さず）。

【００３４】〔薬効試験３〕ラット心筋梗塞の抑制（試験方法）心筋梗塞の誘導： Selye 等（Angiology, 2: 398-407
(1960)) 及びSasaki等（Cardiovascular Research, 22:
142-48 (1988)) の方法に従って心筋虚血を誘導した。
すなわち、体重240 −280 ｇの雄性Sprague-Dawleyラッ
トをエーテル麻酔し、胸部を開いた。心臓を胸腔から手
早く外転させ、左主冠状動脈をその起点の１〜２ｍｍ下
方の縫合によって結紮した。心臓を胸腔内の元の位置に
戻し直ちに胸部を閉じた。ＥＰＣ−Ｋは、生理食塩水に
溶解させて結紮の５分前に静脈内投与した（５ｍｇ／ｋ
ｇ）。

【００３５】梗塞領域の評価：結紮後12、24及び48時
間の時点で心臓の梗塞領域を、Sasaki等の方法（Cardio
vascular Research, 22: 142-48 (1988)) によって評価
した。すなわち、心臓を速やかに摘出し、２〜2.5 ｍｍ
の幅で４つの横断環（基部から環Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）へ
とスライスした。３つの横断環（環Ｂ，Ｃ及びＤ）を１
％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）溶液中で
37℃にて20分間インキュベートした。ＴＴＣは、電子を
受容することにより赤色のホルマザンへと還元される。
この反応は、ミトコンドリア又は酸化系が障害されてい
る領域においては起こらない。従って、染色の欠如が、
障害のある領域を、障害のない領域から区別する（Klei
n H. et al., Virchows Archiv A. Pathological Anato
my and Histology, 393: 287-297 (1981))。各環の底面
の染色された領域及び染色されていない領域を、ペーパ
ー上に、光学顕微鏡（ＳＺＨ−ＩＬＬＤ、オリンパス光
学工業）に取り付けたドローイング・チューブ（ＳＺＨ
−ＤＡ，オリンパス光学工業）を用いてトレースした。
無染色の領域（すなわち障害のある領域）の面積を、左
心室の全断面積のうちのパーセント（％ＬＶ）として表
した。

【００３６】（試験結果）図１に、左主冠状動脈の結紮
後の心臓のＴＴＣ無染色領域の面積の時間的推移を示
す。グラフの各点は平均±平均偏差を表す。冠状動脈の
結紮はＴＴＣで染色されない梗塞領域を生じさせ、図１
に見られるように、それは無治療群において12時間でプ
ラトーに達した。結紮後の12時間、24時間及び48時間の
時点での梗塞領域は、それぞれ50.1±1.7 、45.7±2.2
及び45.5±5.5 ％ＬＶであった。結紮の５分前のＥＰＣ
−Ｋの静脈内注射は、24時間及び48時間における梗塞の
程度を有意に減少させた。阻害率は、12時間、24時間及
び48時間において、それぞれ28.5、54.0及び52.3％であ
った。

【００３７】興味深いことに、ＥＰＣ−Ｋを投与した動
物において、24時間及び48時間における無染色領域が、
12時間のそれより縮小していた。ＴＴＣは実際、十分確
立された壊死を確実に描きだすことができるが、可逆的
障害を受けている組織まで検出される。すなわち前述の
Klein 等（Virchows Archiv A. Pathological Anatomy
and Histology, 393: 287-297 (1981)）は、テトラゾリ
ウム染色では、心筋虚血の初期相におけるＮＡＤ及び／
又はＮＡＤＨの損失のため、大きな梗塞領域が描き出さ
れるものの、組織デヒドロゲナーゼの活性は必ずしも減
少していないということを見出している。本研究におい
て我々が使用したラットモデルにおいては、周囲の正常
組織から虚血領域への血流は結紮後12時間の間に徐々に
回復する。しかしながら、薬物治療を施さない場合、一
旦虚血状態にあった領域は血液供給の回復にもかかわら
ず壊死へと移行する（Sasaki et al., Cardiovascular
Research, 22: 142-48 (1988))。従前の知見及びこの試
験の観察結果並びに前記の薬効試験１、２等の結果を総
合すると、結紮前におけるＥＰＣ−Ｋによる前処置が、
血流回復に伴って浸潤する好中球によってもたらされる
二次的な組織損傷を阻止することによって、可逆的障害
を受けていた組織を回復させたものと考えられる。

【００３８】

【実施例】

〔実施例１〕内服錠ＥＰＣ−Ｋ 100 ｍｇ乳糖 75 ｍｇ澱粉 20ｍｇポリエチレングリコール 6000 5 ｍｇ上記成分を常法により混和し、１錠とする。必要に応じ
て糖衣を施してもよい。

【００３９】〔実施例２〕注射剤ＥＰＣ−Ｋ 200 ｍｇマンニトール 5.0 ｍｇ１Ｎ水酸化ナトリウム適量蒸留水全量 100 ｍｌ上記成分を常法により混和し無菌濾過する。濾液を無菌
的に５ｍｌずつガラスアンプルに充填して熔閉し、注射
剤とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラット左主冠状動脈の結紮後の心臓のＴＴＣ
無染色領域の面積の時間的推移（平均±平均偏差で表
示）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式、【化１】〔式中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なって水素原子又
はメチル基を表す。〕でで示されるリン酸ジエステル化
合物又はその薬剤的に許容し得る塩を含有してなる、組
織への血流回復に伴う白血球による組織の二次的損傷の
抑制剤。
【請求項２】該組織の二次的損傷が心筋組織の壊死であ
る、請求項１の抑制剤。