JPH09313184A - 好塩性古細菌由来のサイクロフィリンタイプｐｐｉアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 変性蛋白質の再生、蛋白質試薬の安定
化、組み換え蛋白質の生産、さらには新規免疫抑制剤、
生理活性物質の開発に有用な酵素であるＰＰＩアーゼを
コードする遺伝子。 【効果】 動物由来のものと同様に、免疫抑制剤サイク
ロスポリンＡに結合性のある、新規なサイクロフィリン
タイプＰＰＩアーゼ遺伝子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、変性蛋白質の再
生、蛋白質試薬の安定化、組み換え蛋白質の生産におけ
る回収率の向上、さらには新規免疫抑制剤、生理活性物
質の開発に有用な酵素であるＰＰＩアーゼ(Peptidyl pr
olyl cis-trans isomerase) をコードする遺伝子に関す
る。本遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微生
物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積さ
れる該蛋白質を採集することにより得られる該蛋白質
は、種々の用途に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質はポリペプチドから成っており、
その構造形成、維持に働く因子が近年注目されている。
その因子として分子シャペロン、ＰＰＩアーゼなどが知
られるようになってきた。

【０００３】遺伝子組み換え技術による有用蛋白質生産
において、大腸菌等の発現系においては過剰生産により
不活性な封入体として目的蛋白質が生産されることがあ
る［例えば微生物学基礎講座８遺伝子工学、pp73-74 、
安藤忠彦／坂口健二編、共立出版、1987］。このような
不活化蛋白質を活性化するには、不活性な封入体を回収
後、変性剤により可溶化し、希釈による再生反応時にこ
れらの因子を共存させる方法、及びこれらの因子をコー
ドする遺伝子とともに目的遺伝子を発現させる方法が考
えられている。一方、蛋白質試薬にはその液状化、およ
び室温保存化が望まれており、これらの因子を共存させ
ることによって達成される可能性が考えられている。

【０００４】一方、ＰＰＩアーゼは免疫抑制剤であるサ
イクロスポリンＡおよびＦＫ５０６のターゲット分子で
あること、また細胞内での蛋白質の折り畳み、細胞内情
報伝達系に関与すること等から、その阻害剤を探索する
ことは、新規免疫抑制剤、その他の生理活性物質の開発
につながると考えられる。

【０００５】これまで市販されているＰＰＩアーゼは、
例えばシグマ社からサイクロフィリン（Cyclophilin 、
サイクロスポリンＡ結合性蛋白質）タイプおよびＦＫＢ
Ｐ（ＦＫ５０６結合性蛋白質）タイプのものがそれぞ
れ、２種類、１種類ずつ上市されている（シグマ社1996
年度カタログP.311 及びP.447 ）が、いずれも動物の臓
器から調製しており、供給源の確保に問題があった。ま
た大腸菌や好熱性真正細菌であるBacillus stearotherm
ophilus 由来のサイクロフィリンタイプＰＰＩアーゼが
報告されている［Journal of Fermentation and Bioeng
ineering, Vol.79, No.2, 87-94, 1995 ］が、いずれも
サイクロスポリンＡに感受性ではないので動物のタイプ
と異なっており、免疫抑制剤探索には利用しにくいと考
えられる。このことから、サイクロスポリンＡに感受性
のある、新規なＰＰＩアーゼの発見が期待されていた。
本発明者らは、古細菌に属する Halobacterium cutirub
rumからサイクロフィリンタイプＰＰＩアーゼを精製
し、サイクロスポリンＡに感受性であることを報告した
［Biochemical and Biophysical Research Communicat
ion, Vol.198, No.2, 87-94, 1994 ］。しかしながら、
本菌の培養には４日を要すること、また菌体破砕後の精
製ステップが５段階必要であることなど、ＰＰＩアーゼ
の取得に問題があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
の手法を用いてサイクロフィリンタイプＰＰＩアーゼを
生産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】サイクロスポリンＡ感受
性サイクロフィリンタイプＰＰＩアーゼ（以下単に「Ｐ
ＰＩアーゼ」という）をコードする遺伝子の全配列を得
るために、精製蛋白質を単離、Ｎ末端アミノ酸配列を決
定し、それらの配列をもとにプライマーを合成しＰＣＲ
法により本遺伝子の断片を取得するとともに、これをプ
ローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グを行い、ＰＰＩアーゼ遺伝子全長をコードするクロー
ンを取得してその塩基配列を決定し、本発明を完成し
た。

【０００８】即ち、本発明は、配列番号１で表されるＤ
ＮＡ塩基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有するＰＰＩアー
ゼ遺伝子である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＰＰＩアーゼ遺伝子は、配列番号１で表されるＤＮＡ塩
基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実
質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有する。ここで、「配列
番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮ
Ａ塩基配列」とは、配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列の幾つかのヌクレオチド残基について、欠失、置換、
付加等の変化が生じた配列であって、ＰＰＩアーゼとし
て作用し得るポリペプチドをコードする塩基配列をい
う。

【００１０】本発明遺伝子は以下の手順で得ることがで
きる。まず、ＰＰＩアーゼを生産できる微生物、例え
ば、ハロバクテリウム・クチルブルム（Halobacterium
cutirubrum） DSM669 株などを培養、集菌後菌体を破砕
後、各種クロマトグラフィーによってＰＰＩアーゼを精
製する。この精製酵素をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し、疎水性の膜であるＰＶＤＦ膜等
に電気的に転写する。クマシーブリリアントブルーR-25
0 等の色素で検出されるバンドを切り出した後、プロテ
インシークエンサーによりＮ末端からのアミノ酸配列を
決定する。Ｎ末端アミノ酸配列からＰＣＲに用いるプラ
イマーを設計し、ＰＰＩアーゼを生産できる微生物由来
のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＰＩアー
ゼの部分遺伝子を得ることができる。これを［³²Ｐ］も
しくはジコキシゲニン等の非放射性プローブで標識し、
遺伝子スクリーニングのプローブとして用いる。

【００１１】一方、ＰＰＩアーゼを生産できる微生物の
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、適当なベクタ
ーに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベ
クターにはλファージ由来の各種ベクターたとえばλgt
10やZapll など、あるいはpUC18 やpBR322等のプラスミ
ドベクターを用いることができる。目的の遺伝子を保持
するクローンの選択には、前記プローブを用いてハイブ
リダイゼーションを行い、これに強く結合するクローン
を選択すればよい。また、他の生物由来のサイクロフィ
リンタイプＰＰＩアーゼ遺伝子間のホモロジーの高い領
域のアミノ酸配列から適宜プライマーを合成してＰＣＲ
法によりＤＮＡ断片を取得し、それをプローブにしても
良い。塩基配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバ
ート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手
順により翻訳開始コドンから終止コドンを含むＰＰＩア
ーゼをコードするＤＮＡの全長を単離することができ
る。なお、このＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡを含む
大腸菌pTPE1-15は、工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM P-15621として寄託されている（寄託日平成８年
５月１５日）。単離したＤＮＡは適当な発現ベクターに
挿入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることに
より、当該蛋白質を大量調製することが可能である。

【００１２】

【発明の実施の形態】

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明の範囲はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 DSM 669株由来ＰＰＩアーゼのＮ末端アミ
ノ酸配列の分析 長島らの文献［Biochemical and Biophysical Research
Communication, Vol.198, No.2, 87-94, 1994］記載の
方法に従い、ハロバクテリウム・クチルブルムDSM669
株を培養、ＰＰＩアーゼを精製した。本酵素を14％ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜（ア
プライドバイオシステムズ社) に電気的にブロッティン
グし（日本エードー）、CBB-R250によって染色した。切
り出した31kDa のバンドはプロテインシークエンサーPS
Q-2 （島津製作所）によりそのＮ末端アミノ酸配列33残
基を決定した。配列を以下に示す。 Pro-Val-Asp-Ala-Thr-Val-His-Thr-Ser-Glu-Gly-Glu-Ph
e-Asp-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Glu-Arg-Ala-Pro-Xaa-Thr-
Val-Glu-Asn-Phe-Leu-Xaa-Leu-Ala (Xaa：未同定のアミノ酸）

【００１４】〔実施例２〕 DSM669 株のゲノムＤＮＡの
調製 文献［Biochemcal and Biophysical Research Communic
ation, Vol.198, No.2, 87-94, 1994 ］記載の培地（0.
75% カザミノ酸、 1% 酵母エキス、 0.3% クエン酸、
0.2% 塩化カリウム、 2% 硫酸マグネシウム、 0.005%
硫酸第一鉄、 0.00002% 硫酸マンガン、25% 塩化ナトリ
ウム、pH 7.4）200ml を用いて DSM669 株の培養を行っ
た。

【００１５】湿潤菌体0.６g を10mlの3.９M ＮａＣｌ溶
液で２回洗浄後、0.1mM ＥＤＴＡを含む１mMトリス塩酸
緩衝液10mlに懸濁し、室温で４時間振盪して溶菌を行っ
た。ついで温度を50℃にしてプロテイナーゼＫ溶液（20
mg／ml）を50μｌ添加し４時間振盪した。フェノール処
理、クロロホルム処理後（溶液量10ml）、１mlの３Mの
酢酸ナトリウム溶液（pH 5.2）、25mlのエタノールを添
加し、−20℃で２時間放置した。その後高速遠心機で遠
心しＤＮＡを沈澱させ、70％エタノール溶液３mlで沈澱
を洗浄、遠心エバポレーターで乾固させて、ＴＥ緩衝液
1.５mlに溶解した。RNase A 溶液（0.５mg／ml）を50μ
ｌ添加し、37℃で２時間放置した。10％ＳＤＳ溶液を0.
15ml、プロテイナーゼＫ溶液（20mg／ml）を４μｌ添加
し50℃で２時間放置した。再びフェノール、クロロホル
ム処理、エタノール沈澱を行った後、70％エタノール溶
液で沈澱を洗浄、遠心エバポレーターで乾固させて、Ｔ
Ｅ緩衝液１mlに溶解した。この操作により約0.１mgのゲ
ノムＤＮＡが得られた。

【００１６】〔実施例３〕ＰＣＲによるＰＰＩアーゼ遺
伝子断片の増幅およびその塩基配列の決定 実施例１で得られたＰＰＩアーゼのＮ末端アミノ酸配列
から以下のＤＮＡプライマーを合成した。Hppi-1s はア
ミノ酸配列His-Thr-Ser-Glu-Gly-Glu-Phe-Aspに相当す
る位置を、Hppi-1a はアミノ酸配列Glu-Asn-Phe-Leu-Xa
a-Leu-Ala に相当する位置を反対鎖として設計した。Hp
pi-1a の配列の中の未同定のアミノ酸(Xaa) はAla とし
て設計した。 Hppi-1s : CA(TC)AC(ATCG)(AT)(CG)(ATCG)GA(AG)GG(ATC
G)GA(AG)TT(TC)GA Hppi-1a : GC(ATCG)A(AG)(ATCG)GC(ATCG)A(AG)(AG)AA(A
G)TT(TC)TC

【００１７】実施例２に従って調製した DSM 669株のゲ
ノムＤＮＡを鋳型としてPCR Amplification kit(宝酒
造）を用いたＰＣＲ反応を行った。アニーリングの温度
を決定する条件としてプライマーのＴｍ値があり、これ
より５℃程度低い温度に設定するのが好ましいと言われ
ている（例えば、ＰＣＲ法の最新技術、林健志編、羊土
社、1995年）が、共にミックスプライマーのため、1sで
は76℃〜60℃、1aでは66℃〜50℃の幅があった。そこ
で、まずアニーリング温度を53℃、50℃で行ったが、Ｄ
ＮＡ断片の増幅は見られなかった。次に45℃で行ったと
ころ予想された長さ（80bp）の断片が増幅された。一
方、37℃では増幅断片は４〜５本に増加した。従って45
℃で増幅させた断片を用いて配列の解析を行うこととし
た。

【００１８】上記80bpのＤＮＡ断片を低融点アガロース
を用いた方法（ラボマニュアル遺伝子工学増補版、p28
（村松正実編、丸善、1990年）により回収し、pCR-Scri
ptSK(+) Cloning Kit を使用してpCR-ScriptSK(+) ベク
ター（Stratagene社）に連結し、コンピテントセルE.co
li JM109を用いて形質転換した。陽性クローンを選択
し、挿入断片のあることを確認後、25mlのＬＢ培地（50
μｇ／mlのアンピシリンを含む）に植菌し、一晩37℃で
振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、主にラボ
マニュアル遺伝子工学増補版pp.51-52（村松正美編、丸
善、1990年）記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを調
製した。この操作により約20μg のＤＮＡを調製した。
１サンプルあたり0.５μg のＤＮＡを鋳型として、Dye
Terminatorcycle sequencing kit(パーキンエルマー
社）を用いてベクター側のプライマーによりシークエン
ス反応を行い、ＤＮＡシークエンサー(373A,アプライド
バイオシステムズ社）により塩基配列を決定した。その
結果、ＰＣＲによって増幅された遺伝子断片は以下の配
列を有していた。CACACAACGGAAGGGGAGTTCGA CATCGAACTGTACGACGAGCGGGCCCCCCGCACCGTCGAGAACTTCC H T T E G E F D I E L Y D E R A P R T V E N F LTCGCCCTCGC A L

【００１９】なお、下線部はプライマーの増幅部分であ
り、本来の配列とは完全には一致しない可能性が高い。
実施例１の結果と比較すると5'側プライマーの３番目の
アミノ酸はＳがＴをコードする配列になっており、3'側
プライマーのＡとして設計した未同定のアミノ酸部分は
Ａをコードする配列であった。また内部の未同定のアミ
ノ酸はＲとなっていた。それ以外の配列はすべて実施例
１の結果と一致し、本ＰＰＩアーゼ遺伝子の一部である
と判断した。

【００２０】〔実施例４〕 DSM669 株ゲノムＤＮＡライ
ブラリーの作製 実施例２に従って作製したゲノムＤＮＡ４μg に1.5 ユ
ニットの制限酵素Sau3AIを添加して１時間37℃で反応
し、切断を行った。切断反応後の溶液をフェノール、エ
タノール沈殿処理をして、ＤＮＡを得た。一方、BamHI
切断および脱リン酸化処理したpUC18 をファルマシア社
より購入し、その切断位置にゲノムＤＮＡ断片をTakara
ligation kit Ver.1 により連結し、E.coli JM109を用
いて形質転換してSau3AIゲノムＤＮＡライブラリーとし
た。

【００２１】また、ゲノムＤＮＡ４μg に18ユニットの
制限酵素BamHI を添加して18時間37℃で反応し、切断を
行った。切断反応後の溶液をフェノール、エタノール沈
澱処理をして、ＤＮＡを得た。そしてBamHI 切断および
脱リン酸化処理したpUC18 に上記と同じ方法で連結し、
BamHI ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。

【００２２】〔実施例５〕 ＰＰＩアーゼ遺伝子を含む
組み換えクローンの選択 ＰＰＩアーゼ遺伝子全長を取得するためのプローブとし
て、まずpCR-ScriptSK(+) ベクター側の配列60bpを含む
140bp のＤＮＡ断片をDIG DNA labelling anddetection
kit （ベーリンガーマンハイム社）を用いてランダム
プライマーによりラベルしたもの、および実施例３によ
って作製した80bpのＤＮＡ断片の5'側及び3'側の配列に
基づいたプライマーを設計して、DIG DNA labelling an
d detection kit （ベーリンガーマンハイム社）を用い
てランダムプライマーによりラベルしたものをプローブ
とした。しかし、両者ともラベルの効率が低く、特に前
者はベタクーの配列を含んでいるため良好なプローブは
調製できなかった。そこで、PCR DIG probe synthesis
kit(ベーリンガーマンハイム社）を用い、ＰＣＲにより
DIG ラベルしたプローブを調製した。

【００２３】一方、実施例４に従いSau3AIで作製した形
質転換株をＬＢプレート（アンピシリン、X-gal を含
む）にまいて一晩培養後、ナイロンメンブレン ハイボ
ンドＮ（アマシャム社）上に固定し、コロニーハイブリ
ダイゼーションを行った。方法は主にDIG DNA labellin
g and detection kit(ベーリンガーマンハイム社）添付
のプロトコールに従った。プレハイブリダイゼーショ
ン、ハイブリダイゼーションおよびフィルター洗浄の条
件設定に関して種々の検討を行い、温度が68℃では洗浄
用緩衝液組成が0.5 ×ＳＳＣ（0.1%ＳＤＳ含有）または
0.1 ×ＳＳＣ（0.1%ＳＤＳ含有）では陽性クローンは見
出されなかった。次に、プレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーションは62℃、洗浄は60℃で0.1 ×Ｓ
ＳＣ（0.1%ＳＤＳ含有）を使用して行ったところ、約8,
000 個のクローンより２個の陽性クローンを得た。しか
しながら、両者ともＰＰＩアーゼをコードする配列全長
を含んでおらず、遺伝子内部に存在するSau3AI部位で切
断されていた。

【００２４】次に実施例４に従いBamHI で作製したライ
ブラリーを用いてスクリーニングを行い、約5000個のク
ローンより、プローブと結合する３個のコロニーを得
た。これらのコロニーのプラスミドに挿入されているＤ
ＮＡ断片を調べた結果、２クローンがＰＰＩアーゼ遺伝
子全長を含んでいることを明らかにした。そしてDye Te
rminator cycle sequencing kit を用いてシークエンス
反応を行い、373AＤＮＡシークエンサーにより塩基配列
を決定した。なお、この際、ＧＣ含量が69% と高くＧあ
るいはＣの連続した配列も多く存在しており、プライマ
ーにはＧＣに偏らない、また２次構造をとらない配列を
選択した。Forward 側のプライマーは以下の３種を用い
た。なお、プライマーの名称、配列の位置（開始コドン
のＡを１番としたときの番号）、塩基配列の順に記載し
た。

【００２５】 Hppi-3F: 47〜65 : TCGAACTGTACGACGAGCG Hppi-4F: 326〜344 : CCGGCGTGCTCTCGATGGC Hppi-5F:-321〜-303 : CCGAGTACGGCATGGACTT（5'上流
側） Reverce 側のプライマーは以下の３種を用いた。 Hppi-3R: 100〜82 : CGAGGTTCAGGAAGTTCTC Hppi-4R: 497〜479 : CGTCGATGTTGTGCTGGAG Hppi-5R: 712〜684 : GCGTCGTTGGCGTCGGTCT（3'下流
側） これらのプライマーを用いて全配列を決定した。得られ
た遺伝子およびそれより推定されるアミノ酸配列を図１
に示す。なお、翻訳開始コドンであるメチオニン残基の
位置は実施例１によって決定したアミノ酸配列から推定
したものである。

【００２６】

【発明の効果】本発明は、動物由来のものと同様に、免
疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合性のある、新規なサ
イクロフィリンタイプＰＰＩアーゼ遺伝子を提供する。
本発明の遺伝子から作られる蛋白質は、変性蛋白質の再
生、蛋白質試薬の安定化、組み換え蛋白質の生産、さら
には新規免疫抑制剤、生理活性物質の探索に極めて有用
である。

【００２７】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：５４３ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名 ：Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｒｕ
ｂｒｕｍ

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＰＩアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列と、そ
れをコードするアミノ酸配列を表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩淵 徳郎 岩手県釜石市平田第３地割75番１ 株式会 社海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究 所内 (72)発明者 丸山 正 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列、
   又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同
   一なＤＮＡ塩基配列を有するＰＰＩアーゼ遺伝子。