JPH09500023A

JPH09500023A - レセプターでトランスフェクションされた細胞の選択増幅によるリガンドの同定

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Publication number: JPH09500023A
Application number: JP7504713A
Authority: JP
Inventors: ロバートブラン，マーク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-07-13
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1997-01-07
Anticipated expiration: 2015-10-23
Also published as: EP0708922A1; EP0708922B1; DE69417037D1; US5955281A; CA2167048C; NZ269442A; KR100272459B1; AU7333094A; JP3102571B2; IL110298A; DE69417037T2; AU679253B2; US5707798A; CA2167048A1; ES2129658T3; DK0708922T3; ATE177535T1; WO1995002823A1; IL110298A0; US5912132A

Abstract

(57)【要約】リガンドとして働くことのできる物質を検出する方法であって、（ａ）細胞増幅が可能となる条件下で、リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできるレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた細胞を、このレセプターの潜在的な作動因子又は拮抗因子である試験物質と共にインキュベートする、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、そして（ｂ）細胞増幅が可能となるのに十分な期間を経た後、このマーカーを含まない細胞に比してのこのマーカーを含む細胞の増幅の有無を決定する、ことを含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】レセプターでトランスフェクションされた細胞の選択増幅によるリガンドの同定発明の分野本発明はクローニングしたレセプターに関するリガンドとして働く物質を同定するための方法及びその方法に利用するための試験キットに関する。発明の背景薬剤の発見のための標的の多くはレセプタータンパク質のリガンドであり、その多くが現在までクローニングされており、且つ薬理学的に特性決定されている。莫大な数のレセプターがクローニングされた現在、薬理産業の主たる目標は莫大な数の物質のライブラリーをスクリーニングすることによってこのようなレセプターのリガンドを同定することにある。残念ながら、現状の方法及び技術において、薬剤の発見の過程における主たる制約はこのような多くの標的に対するこのようなライブラリーをスクリーニングするために必要な時間及び費用にある。クローニングしたレセプターとのリガンド相互作用を特性決定するうえでの第一段階はレセプターをリガンド感受性形態で発現させることにある。若干のレセプターが容易に操作できるモデル系、例えば酵母及びＥ．コリ（E.coli）において発現されているが、ほとんどのレセプターとのリガンドの相互作用は哺乳動物細胞にのみ存在している後翻訳修飾により左右され、そしてこれらのレセプターのほとんどがその生物学的効果を正確に変換するために哺乳動物系タンパク質を必要とする。従って、幅広い応用のためには、アッセイ系は哺乳細胞におけるクローニングしたレセプターの発現を基礎としなければならない。リガンドのレセプターと相互作用する能力はレセプター上の結合部位に対してラベル化リガンド（例えば放射性核種）と競合させることによって評価できうる。かかるアッセイは一般的であり、なぜならそれらは比較的少ない数の工程を包括するからである。また、結合は往々にしてその他の細胞性タンパク質との相互作用を必要としないため、これらのアッセイはレセプターの発現レベル及び細胞環境の如くの要因に対してあまり敏感でない。近年、近位アッセイ（Proximity Assay）（Amercham Co.）の如くの技術が、自動化及び大量スクリーニングを可能にし、そしてこのようなアッセイを更に簡単なものとした。（ｉ）数多くの技術的理由のため、結合アッセイはほぼ常に非生理学的バッファーの中で実証されている。これらのバッファーは往々にしてレセプターの薬効を著しく左右する。（ii）作動因子及び拮抗因子は結合アッセイにおいては信頼できるほどに判別されていない。（iii）そのラベル化リガンドを入手することのできる結合部位しか研究できない。（iv）哺乳細胞においては低レベルのレセプター（結合部位）発現しか達成されていないため、これらのアッセイにおいてレセプターの増幅は費用がかさむ。（ｖ）ラベル化リガンドの大多数はラジオアイソトープであり、その購入、取り扱い及びその廃棄には莫大な費用がかかる。作動性リガンドと拮抗性リガンドとを確実に判別するためには、レセプターの応答を測定せねばならない。レセプターの作動的活性化に対する応答は一般に、様々な内因性細胞タンパク質の改変された活性として測定される。その例には二次メッセンジャー、例えばcAMP（アデニルサイクラーゼ）、ホスホイノシトール代謝（ホスホリパーゼＣ）、チロシンのリン酸化及びイオンチャンネルの測定が含まれる。これらのアッセイの全てが、高度の生物学的保全性を有する細胞及び／又は細胞調製品の利用を必要とし、そしてこれらのアッセイは数多くの複雑且つ費用のかかる工程を含む（Schlessinger and Ullrich, Neuron 9, 383 (1992) ; Molecular Biology ofG-Protein-coupled receptors, M Brann、編 Birkhauser (1992)の章）。内因性タンパク質の測定にかかる時間及び費用を回避するのに用いられる手法は、レセプターの活性により制御されることのできる慣用的にアッセイされるマーカータンパク質の発現にある。例えば、転写因子のレベルをコントロールするレセプターは、その発現がこのような因子の転写コントロール下にあるマーカーを用いてアッセイされうる。この手法は転写のコントローラーとして機能すること知られるレセプター（例えばステロイド／甲状腺ホルモンレセプター、Evans (WO 91/07488) ; Spanjaard らMol. Endocrinology ７ : 12〜16 (1993))の慣用のアッセイへと導かれるが、これらのアッセイは細胞表層レセプターに応用したときには限られた有用性しか有さないことが実証されており、その理由はおそらくはこれらのレセプターが発揮する転写コントロール能の低さにあるであろう。転写コントロール能に基づくアッセイ以外で、慣用的に測定されうる組換マーカーを介してレセプターをアッセイする手法は述べられていない。他の手法はレセプターを、そのレセプターのリガンド活性化の慣用のアッセイを可能にする内因性応答メカニズムを有する特製の細胞において発現させることにある。２つの例にはRBL 細胞及びメラニン保有細胞が挙げられる。RBL 細胞において、ホスホリパーゼＣを剌激するムスカリン様レセプターは、慣用的に測定される応答である酵素ヘキソースアミニダーゼの放出量（Jones ら、FEBS Lett. 289, 47 (19 91))を高める。メラニン保有細胞においては（培養色素細胞）、cAMPレベルを変えるクローン化レセプターは細胞の色を変える。その応答も同様に簡単に測定できる（Potenza ら、Anal.Biochem. 206, 315 (1992)）。これらのアッセイの制約は、一定の機能的なタイプのレセプターしか測定できないことにある。また、これらのアッセイは比較的簡単ではあるが、その内因性応答及び使用する細胞において固有の制約がある。リガンドに曝露したとき、多種多様なレセプターは細胞培地のために利用する培地のpHを変えてしまうことがある。このようなpH変化の程度は小さく、測定のためには高額な設備を必要とする（cytosensor, Molecular Dynamics Co.）。この装置は大量スクリーニングにおいて利用される他の装置（例えば、９６穴プレート方式の利用）には適合せず、そしてサンプルは装置の中で数分間インキュベートしなくてはならないため、サンプルの仕込み量に制約がある。上記のアッセイの全てにおける固有の理論的な制約は、所定のリガンドを一度に多くのレセプターに対してアッセイできないことにある。例えば、ラジオリガンド結合アッセイは、異なる、且つ判別できるラジオアイソトープが入手できたときにのみ多重化できうる（例えば3H、対、¹²⁵Ｉ）。その限られた測定域、非適合性条件、及び多くのレセプターがその機能的応答に基づいて別のものと区別できないため、二次メッセンジャー応答及びレセプターのほとんどのその他の生化学的効果は全く多重アッセイとすることができない。同様に、RBLアッセイ、メラニン保有細胞アッセイ及びサイトセンサーpHアッセイは一度に一種のレセプターのアッセイしかできない。数多くのレセプターにより共有されている別の細胞応答は細胞増殖能を変える能力である。NIH 3T3 細胞は細胞増殖をコントロールする多種多様な遺伝子生成物の活性を評価するのにかなり利用されており、そして数多くのレセプターが個々のリガンドにより剌激されたときにこれらの細胞の活性をコントロールすることができる。その例には、細胞がtrk Ａレセプター（NGF レセプター）によりトランスフェクションされたときにのみ増殖を剌激する神経成長因子（NGF）（Cordon-Cardoら、Cell 66 : 173-183 (1992) ; Chao, Neuron 9 : 583 -593 (1992)）、一定のムスカリン様レセプターによりトランスフェクションされた細胞を剌激するカルバコール（ムスカリン様作動因子）（Gutkind ら、Proc . Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991)）；及び一定のアルファーアドレナリン作動性レセプターによりトランスフェクションされた細胞を剌激するノルエピネフィリン（Allen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11354 (1991)）が含まれる。作動性リガンドによる長期剌激を経て、細胞は細胞増殖、接触阻害の消失及びフォーカスと称する巨視的なコロニーの形成を含む数多くの特徴を変える。NIH 3T3 細胞のフォーカスを誘導する能力は癌関連遺伝子（オンコジーン）の一般的な特徴である。 NIH 3T3 細胞の増殖を剌激する及びフォーカスを誘導するレセプター及びその他の遺伝子生成物の能力は個々の二次メッセンジャー系の剌激に相関する。trk Ａレセプターはチロシンのホスホリル化を剌激し（チロシンキナーゼレセプター）、そしてチロシンのホスホリル化を剌激する数多くのその他の遺伝子はNIH 3T 3 細胞の増殖及びフォーカス形成を剌激する（Schlessinger and Ullrich, Neu ron 9, 383 (1992)）。ホスホリパーゼＣを剌激する一定のムスカリン様レセプター（Gutkind ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991)）、アドレナリン作動性レセプター（Allen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11354 (1991)）及びセロトニン様レセプター（Juliu sら、Science 244, 1057 (1989)もNIH 3T3 細胞の増殖及びフォーカス形成を剌激する。ムスカリン様レセプターの場合、フォーカス及びホスホリパーゼＣを剌激する能力は全く同じ投与量／応答特性を有し、これらの応答がリガンド相互作用のアッセイに利用できうることを示唆している。残念ながら、これらのアッセイは上記の手法に少ない利点しか供さない。フォーカスアッセイは少なくとも２週間の細胞培養を必要とする応答を包括し、そして増殖パターンの定性的変化により困惑される。細胞増殖の直接的な測定もリガンドの効果を測定するために利用されている。最も一般的に利用されているアッセイは ³Ｈ−チミジンの取込みである（Stephensら、Oncogene 8, 1993, pp 19-26）。これらのアッセイは実施するのに簡単でもなければ安価でもない。発明の概要本発明の目的はクローニングしたレセプターについてのリガンドを同定するための改良された方法の提供にある。本発明の別の目的は、化合物の、多重クローニングしたレセプターにおいての活性の同時スクリーニングにより、リガンドを同定するための方法の提供にある。本発明の更なる目的は、リガンド濃度を、クローニングレセプターにおいての活性により測定するための方法の提供にある。本発明の更なる目的は、更にクローニングしたレセプターについてのリガンドのアッセイを促進するために組換シグナル生成分子を採用するための方法の提供にある。本発明の更なる目的はリガンドについてのレセプターをコードするDNA を同定するための方法の提供にある。本発明の更なる目的は改変されたリガンド依存性を有する突然変異形態のレセプターを同定する方法の提供にある。従って、本発明はリガンドとして働くことのできる物質を検出する方法に関し、この方法は、（ａ）細胞増幅が可能となる条件下で、リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできるレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた細胞を、このレセプターの潜在的な作動因子又は拮抗因子である試験物質と共にインキュベートする、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、そして（ｂ）細胞増幅が可能となるのに十分な期間を経た後、このマーカーを含まない細胞に比してのこのマーカーを含む細胞の増幅の有無を決定する、ことを含んで成る。本発明の方法において、トランスフェクションされた及びトランスフェクションされていない細胞の混合物が一般に工程（ａ）において存在しているであろう。試験物質をこの混合物に加えたとき、注目のレセプターに対するリガンドとして働くその能力は、このレセプターを発現しない細胞に比しての、この混合物中のレセプターを発現する細胞に競合的アドバンテージを付与するその能力により決定される。例えば、原則として、インビボであろうとインビトロであろうと、レセプターを発現する細胞集団は、細胞機能の総合的な高揚により、リガンドに対して陽性的に応答するであろう。その一の観点は増殖速度の上昇又は接触阻害の消失でありうる。本法の実施にこの所見を適用すると、インビトロにおいて、培養物中の細胞は全て互いと本質的に競合し合う。注目レセプターを発現する細胞（トランスフェクションされた細胞）をリガンドにより剌激すると、刺激された細胞の高められた機能は、それらが、剌激されていない（トランスフェクションされていない）細胞を犠牲にして繁茂することを可能とするであろう。即ち、もし試験するリガンドがレセプターの作動性因子であるなら、その混合物中のトランスフェクション細胞は、非トランスフェクション細胞に比べ、その作動因子に応答して優先的に増幅するであろう。換言すれば、このトランスフェクション細胞集団は非トランスフェクション細胞より速い速度で増殖するであろう。本法において、トランスフェクション細胞は、このトランスフェクション細胞におけるマーカーの存在により、その混合集団中の非トランスフェクション細胞から区別される。トランスフェクション細胞を試験リガンドにより剌激したときのみ、増幅シグナル（マーカー）は蓄積するであろう。リガンドが拮抗因子であるとき、その作用は同様ではあるが逆として決定されうる。即ち、マーカーを含む細胞は非トランスフェクション細胞に比してディスアドバンテージをもって競合し、その集団はトランスフェクション細胞より速い速度で増殖するであろう。しかしながら、拮抗因子についてのアッセイは作動因子の存在下で実施するのが好ましく、そして観察される効果は剌激性リガンドのみの存在によりもたらされる増幅応答の低下である。別の観点において、本発明はリガンドとして働くことのできる物質を検出するための試験キットに関連し、ここでこのキットは、（ａ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできるレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされている凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｂ）細胞の増殖のための培地、（ｃ）マーカーの存在及び量を検出するための試薬、を含んで成る。この試験キットは、本法であって、試験物質（又は潜在的な大量の試験物質）のリガンド活性を単独レセプターにより決定する方法の態様にとって有用である（本発明の方法のこの態様は以降において単独レセプター方式と称する）。更なる観点において、本発明はリガンドとして働くことのできる物質を検出するための試験キットに関し、ここでこのキットは、（ａ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできる第一レセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｂ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできる第二レセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｃ）細胞の増殖のための培地、（ｄ）このマーカーの存在及び量を検出するための試薬、を含んで成る。この試験キットは、本法であって、試験物質（又は潜在的に大量の試験物質）の特異的なレセプターに対するリガンドとしての能力を、この試験物質と、少なくとも２種類のレセプター及び潜在的に大量のレセプターとの同時インキュベーションにより決定する方法の態様にとって有用である（本発明のこの方法の態様は以降、多重レセプター方式と称する）。本法は従事技術のスクリーニングアッセイに勝る有意義な改善を提供する。一般に、公知の「増殖」アッセイはレセプター発現の増大の直接的な観察を必要とし、そして一般的に定量的である。例えば、その結果は細胞増殖のインジケーターとして経時的な放射性ラベル化試薬の取込みにより定量的に決定される。数多くの場合、例えばフォーカスアッセイの場合、アッセイにおいて要求される細胞増殖のインジケーター、即ち、フォーカス形成は展開させるのに数週間かかりうる。更に、判別できる試験細胞系とコントロール細胞系とはリガンドのスクリーニングを始める前に樹立しておかなければならない。別々に培養した細胞系で作業するときには一貫した結果を得るのが難しい。従ってかかるアッセイは時間がかかるのみならず、かなり費用もかかる。反対に、本発明は本質的に定量的である。レセプターを発現する細胞のリガンド誘導により高揚させた細胞機能は、同一の培養物由来の非トランスフェクション細胞集団に対するトランスフェクション細胞集団の増幅の観察により決定される。増幅は、トランスフェクション細胞におけるマーカー遺伝子の高められた発現能（例えば、基質と反応したときに目に見える検出可能な生成物を生成する酵素）の観察により容易に確認できる。独立のコントロール細胞系は必要でなく、そしてその結果は数日以内に観察できる。定義本説明及び請求の範囲において、以下の用語は以下に示す通りに定義されるであろう。「試験物質」とは、潜在的な生物活性を有する任意の薬剤、化合物又は分子を含むことを意図する。「リガンド」とは、レセプターの活性を阻害するか又は剌激する任意の物質を含むことを意図とする。「作動因子」はレセプターの機能活性（即ち、レセプターを介するシグナル変換）を増大させるリカンドと定義される。「拮抗因子」は、作動因子の作用を阻害することにより、又はそれ自体の活性によりレセプターの機能活性を低下させるリガンドと定義される。「レセプター」とは、細胞の内側又は表層に存在する任意の分子であって、リガンドにより阻害又は刺激されたときに細胞生理に影響を及ぼしうる分子を含むことを意図する。一般に、本目的のために利用されうるレセプターは、リガンド結合特性を有する細胞外ドメイン、このレセプターを細胞膜に定着させるトランスメンブランドメイン、及びリガンド結合に対する細胞性シグナル（「シグナル変換」）を発生せしめる細胞質ドメインを含んで成る。あるケースにおいては、例えばアドレナリン作動性レセプターの場合、このトランスメンブランドメインは複数のヘリックスの形態をとり、優先的に疎水性な構造が細胞膜に広がり、そしてトランスメンブランドメインの一部がリガンド結合特性を有している。「チロシンキナーゼレセプター」とは固有チロシンキナーゼ酵素活性を有する任意のレセプターを含むことを意図する。「チロシンホスファターゼレセプター」とは固有チロシンホスファターゼ酵素活性を有する任意のレセプターを含むことを意図する。「キメラレセプター」とは２種以上のレセプターの任意の組合せであって、一方のレセプターの機能的な「シグナル変換」成分が別のレセプターのリガンド結合性成分に融合しているものを含むことを意図している。「キメラＧ−タンパク質」とは、２種類のＧ−タンパク質の任意の組合せであって、一方のＧ−タンパク質のエフェクター結合性成分が他方のＧ−タンパク質のレセプター結合性成分に融合しているものを含むことを意図する。「Gq−i5」は、Ｃ末端の５個のアミノ酸がGiのＣ末端の５個のアミノ酸に置き代っているＧ−タンパク質Gqより成るキメラＧ−タンパク質と定義する。「Gi」とは、活性化されたときに酵素アデニリルサイクラーゼを阻害する任意のＧ−タンパク質を含むことを意図する。「Gq」とは、活性化されたときに酵素ホスホリパーゼＣを剌激する任意のＧ−タンパク質を含むことを意図する。「Gs」は、活性化されたときに酵素アデニルサイクラーゼを剌激する任意のＧ −タンパク質を含むことを意図する。「Ｇ−タンパク質−複合型レセプター」とは、グアニンヌクレオチド結合性タンパク質との複合によりシグナル変換を媒介する任意のレセプターを含むことを意図する。「Ｇ−タンパク質」は、ヘテロ三量体のシグナル変換性グアニンヌクレオチド結合性タンパク質のファミリーの任意の構成員と定義する。「シグナル変換」は、レセプターへのリガンドの結合からの情報が生理学的変化へと変換される過程と定義する。「オンコジーン」は、任意のリガンドの非存在下でNIH 3T3 細胞のフォーカス形成を剌激することのできる任意の遺伝子と定義する。「転写因子」は、一定の遺伝子の転写を変えることのできる任意の物質と定義する。これらの因子は往々にして、プロモーターの活性を改変するような、DNA 領域に結合するタンパク質である。「トランスフェクション」は、外来遺伝子を培養細胞に挿入する任意の方法と定義する。「マーカー」は、容易に測定でき、且つ他の細胞成分から区別できる任意の物質と定義する。このマーカーはトランスフェクションされたレセプターDNA 、転写されたレセプターmRNA、酵素、結合性タンパク質又は抗原でありうる。本目的にとって有用な「細胞」は、細胞増幅により、一定のレセプターを介してシグナル変換に応答する能力を有するものとする。「アリコート」は、固相支持体、例えばマイクロタイタープレート、試験管又はマイクロビーズの上に付与されたトランスフェクション細胞の一部と定義する。「増幅」とは、レセプター・トランスフェクション細胞の増殖能、特に非−レセプター・トランスフェクション細胞の増殖能に比しての増殖能を意味することを意図する。「改変された増殖特性」とは、トランスフェクション細胞と共に培養した非− レセプター・トランスフェクション細胞（バックグランド）に対するレセプター・トランスフェクション細胞の高められた又は低められた増殖能を意味することを意図する。作動因子とインキュベートした細胞は一般に高められた増殖能により応答するか、又はあるケースにおいては、培養プレート上でのフォーカスの形成により応答するであろう。拮抗因子とインキュベートした細胞は一般に低められた増殖能により応答するであろう。用途本発明のリガンド依存状況で細胞増殖を調節する一定のレセプターの能力に基づく。本法は２通りの方式において採用されうる。単独のレセプターの詳細な薬効に極めて適応できる単独レセプター方式においては、レセプター・トランスフェクション細胞の増殖を選択的に誘導するリガンドの能力は、慣用のマーカーの誘導に直結している。大量のレセプターに対する潜在的なリガンドの同時アッセイに適応する多重レセプター方式は、複数種のレセプターでトランスフェクションされた細胞の混合物である培養物中の個々のレセプターの固有のマーカーを選択的に誘導するリガンドの能力を利用する。単独レセプター方式は、作動性及び拮抗性リガンドと個々のレセプターとの相互作用の簡便なアッセイを可能にする。多重レセプター方式は、作動性及び拮抗性リガンドと複数種のレセプターとの相互作用の簡便な同時アッセイを可能にする。単独レセプター方式は非常に少ない工程；高価な試薬がない；部分的作動因子、完全作動因子及び拮抗因子を定量的に判別する能力；を包括する。このアッセイは組換レセプター及びマーカーDNA のトランスフェクションを頼りとするため、このアッセイは多種多様なレセプター、マーカー及び細胞タイプにより実施できる。これらの特性に加えて、多重レセプター方式は、本願発明者が知る大量のレセプターに対するリガンド活性についての同時スクリーニングに応用できる唯一の方法である。即ち、この多重レセプター方式は、大量の試験物質の中から「当たり」（即ち、リガンド活性を有する物質）を迅速に同定できうる薬剤スクリーニングプログラムにおいて利用するのに極めて適切である。レセプターベースアッセイは既知のリガンドの濃度を評価するのに利用できうる。測定すべきリガンドを本法に従ってトランスフェクション細胞とインキュベートすることができる。化学又は免疫ベースアッセイとレセプターベースアッセイとの主たる違いは、レセプターベースアッセイがリガンドの機能作用を測定することにある。この特徴の一の応用は化合物の薬理動力学的分析である。これらのアッセイのうち、レセプターベースアッセイは活性代謝を検出するであろうこれは化学又は免疫ベース技術によっては果たせないことがある。レセプターベースアッセイは不活性な代謝を無視するであろう。かかるデーターは試験化合物の治療的効果における一定のレセプターの占める役割を評価するうえで非常に有用であろう。この手法の別の用途は薬歴がわかっていない体液の薬理特定を同定することにある。一のかかる用途は禁制薬剤検査であろう。この場合、血液を、アヘンレセプターを活性化する能力について検査し、個体が数多くのオピオイドのいづれかを消費したかどうかを決定する。本法の別の用途は、cDNAライブラリーから一定のリガンドに対するレセプターを新たにクローニングすることでありうる。cDNAライブラリーからのプールを一定のリガンドによる活性化についてスクリーニングにかけることができうる。一定のプールにおけるどのcDNAが応答性レセプターをコードするかは、応答性レセプターが同定されるまでライブラリー中の各cDNAをトランスフェクションすることにより同定されるであろう。この手法は添付の図11に示しているものに似ているが、ただしトランスフェクションのために未知のcDNAを使用している。本法の更なる用途において、一定のレセプターのライブラリーは、複数の個体、腫瘍、組織又はランダムに突然変異させたプール由来の特定の遺伝子を増幅させることにより調製されうる。cDNAのこのようなライブラリーを次にDNA のプールを細胞にトランスフェクションし、そして細胞をリガンドの存在下又は非存在下で増殖させることができる。この手法は構成的に活性なバージョンのレセプター（例えば一定のオンコジーン）の同定に応用したときに極めて有効のようである。発明の詳細な説明単独レセプター方式本法の一の態様において、細胞を単独レセプターをコードするDNA でトランスフェクションさせる。トランスフェクションは公知の方法に従って実施できうる。一般に、レセプターをコードするDNA 配列を、組換DNA 手順に簡単にかけることのできうる適当なクローニングベクターの中に挿入することができうる。このベクターは自己複製式ベクター、即ち、体外染色質として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。他方、このベクターは宿主細胞に導入したときに、宿主細胞のゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるものでありうる。ベクターにおいて、このレセプターをコードするDNA 配列は適当なプロモーター配列に作動連結されているべきである。このプロモーターは選択した宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA 配列であってよく、そしてその宿主細胞にとって同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。哺乳動物細胞の中でレセプターをコードするDNA の転写を導く適当なプロモーターの例はSV40プロモーター（Subramani ら、Mol. Cell. Biol.」(1981), 854-864）、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiterら、Science 222 (1983), 8 09-814）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。レセプターをコードするDNA 配列は適当なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiterら、前掲）に作動連結されていてもよい。このベクターは更にポリアデニル化シグナル（例えばSV40又はアデノウィルス5Elb領域由来）、転写エンハンサー配列（例えばSV40エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウィルスVA RNAをコードするもの）の如くの要素を更に含んで成りうる。このベクターは更に注目の宿主細胞の中でベクターを複製させることのできる DNA 配列を含んで成りうる。かかる配列の例（宿主細胞が哺乳細胞であるとき）はSV40複製起点である。このレセプター、プロモーター及びターミネーターのそれぞれをコードするDN A 配列をライゲーションするのに、並びにそれらを複製にとって必要な情報を含む適当なベクターに挿入するのに利用する手順は当業界に公知である（例えば、 Sambrookら、Molecular Cl oning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring H arbor, New York, 1989を参照のこと）。本法において利用することのできる細胞は、細胞増殖によって一定のレセプターを介してシグナル変換に応答できる細胞である。かかる細胞の一般に哺乳動物細胞（又はその他の真核系細胞）とし、なぜなら寿命の短い細胞は一般的に本目的にとって適切なシグナル変換経路を欠くからである。適当な細胞の例は、Gq及びチロシンキナーゼレセプター並びにオンコジーン（例えばras (Barbacid, Ann . Rev. Biochem. 56 , 1987, pp 779-827を参照のこと）又はｐ53）、突然変異Ｇタンパク質（Kalinec ら、Mol. Cell. Biol. 12, 1992 p 4687を参照のこと）に対して増殖により応答するマウス繊維芽細胞系NIH 3T3 の細胞 (ATCC CRL 1658) ; Gi及びGsレセプターにより媒介されたサイクリックAMP の変化に応答するRAT １細胞 (Paceら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, pp. 7031-7035) ; 並びにこれもGi及びGsレセプターにより媒介されたサイクリックAMPの変化に応答する下垂体細胞（Vallarら、Nature 330, 1987, pp.556-558）である。哺乳動物細胞をトランスフェクションする及び細胞に導入されたDNA 配列を発現させる方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-6 21 ; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet.１ (1982), 327-341 ; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426 ; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725 ; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (198 1), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456 ; Neumannら、EMB O J. １ (1982), 841-845 ; and Wigler ら、Cell11, 1977, pp. 223-232に記載されている。このレセプターをコードするDNA 配列は、チロシンキナーゼレセプター、例えばコロニー剌激因子１（CSF-１）、血小板由来成長因子（PDGF）、表皮細胞成長因子（EGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、インスリン、インスリン様成長因子１（IGF-１）レセプター等；Ｇ −タンパク質複合型レセプター、例えばGi−複合型、Gq−複合型もしくはGs−複合型レセプター、例えばムスカリン様レセプター（例えばサブタイプm1，m2，m3 ，m4，m5）、ドーパミンレセプター（例えばサブタイプD1，D2，D3，D4，D5）、アヘンレセプター（例えばサブタイプμ又は８）、アドレナリン作動性レセプター (例えばサブタイプα1A，α1B，α1C，α2C10，α2C2，α2C4)、セロトニン様レセプター、タキキニンレセプター、黄体形成ホルモンレセプターもしくは甲状腺剌激性ホルモンレセプター（Ｇ−タンパク質複合型レセプターについての更なる情報はM. Brann（編）Molecular Biology of G-Protein Coupled Receptors , Birhauser, Boston, 1992を参照のこと）をコードしうる。Ｇ−タンパク質Gsに複合するレセプターはGsとGqとのキメラ（例えばGq−S5）と共に発現されたとき、β−gal を誘導できうる。他方、Gs活性又はcAMPの変化に応答する細胞をNIH 3T3 細胞の代わりに利用できうる。同様に、候補は、cAMP が細胞増殖に有意義な影響を及ぼすことで知られるRAT １細胞（Paceら、Proc. Natl. Acad.Sci. 88 : 7031-7035 (1991)）、及び増殖がGs経路の変化に敏感である一定の下垂体細胞系（Vallarら、Nature 330 : 556-558 (1987)）である。第三の可能性は、一定のGs−複合型レセプターのリガンド結合性ドメインがGq− 複合型レセプターのＧ−タンパク質複合性ドメインに融合されているようなキメラレセプターを調製することである（Wongら、J. Biol. Chem. 265 : 6219-6224 (1990)）。固有チロシンキナーゼ活性を有さないが、NIH 3T3 細胞を含む様々な細胞にとって内因性であるチロシンキナーゼの活性を剌激することのできるいくつかのレセプターが同定されている。一の例はリガンドにより活性化されたときにNIH 3T3 細胞のフォーカスを誘導するGM-CSFレセプターである（Arecesら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 3963-3967 (1993)）。チロシンキナーゼレセプターと同様に、これらのレセプターは本法によってアッセイできうる。近年、固有チロシンキナーゼ活性を有するいくつかのレセプターが同定されている。本法において利用するために、チロシンホスファターゼレセプターをチロシンキナーゼレセプターと共に発現させてよい。これらのレセプターはチロシンキナーゼレセプターによりチロシンのホスホリル化を反転させることができ、それ故これらのレセプターにより媒介されるシグナルを阻害できる。転写因子は、転写因子のDNA 結合標的が、細胞増殖を剌激する遺伝子の発現をコントロールするように操作されているベクターを構築することによってアッセイできうる。即ち、もしリガンドが転写因子の機能を抑制（又はDNA 結合部位と競合）するものであるなら、増殖をコントロールする遺伝子に至る発現は抑制されるであろう（Spanjaard ら、Mol. Endocrinology. 71 : 12-16 (1993)）。レチン酸／ステロイド超科レセプターのレセプターは、これらのレセプターのリガンド結合性部分と、転写因子として作用することにより細胞増殖を剌激するタンパク質とのキメラを調製することによりアッセイできうる。グルココルチコイドレセプターとオンコジーンＣ−fosとのキメラは、NIH 3T3 細胞のフォーカスをグルココルチコイドが剌激するようにさせる（Superti-Furga ら、Proc. Na tl. Acad. Sci. USA 88 : 5114-5118 (1991)）。リガンド非依存性増殖を誘導できる数多くの遺伝子生成物も本法により簡単にアッセイできうる。リガンドー非依存性増殖を誘導する数多くのタンパク質はレセプターの突然変異形態である。その例には、trk Ａレセプターの形態、EGF レセプターの突然変異形態、neu オンコジーン（Wongら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 : 2965-2969 (1992) ; Schlessinger ら、Neu ron ９ : 383-391 (1992)）が含まれる。更に、このようなタンパク質の多くはＧ−タンパク質の如くのシグナル変換タンパク質の突然変異形態である（Barbac id Ann. Rev. Biochem. 56 : 779-827 (1987)）。原理的には、この用途における本法の利点は、増殖能に及ぼす化合物の一般作用がオンコジーンの活性に基づく特異的な作用から区別できることにある。これは総合的な細胞増殖と培養の生存率とをトランスフェクション細胞の中に存在している特異的なマーカーと平行して測定することにより成し遂げることができうる。細胞の大半はトランスフェクションされていないため、細胞増殖能に及ぼす一般作用は非特異的にちがいない。レセプターがリガンドー又はボルテージー依存性イオンチャンネルでありうることが更に着想される。リガンド依存性チャンネルには、ニコチン・アセチルコリンレセプター、GABAレセプター、グルタミン酸レセプター（NMDA又はそのサブタイプ）のサブタイプ、セロトニンレセプターのサブタイプ３又は嚢胞性線維症を引き起こすcAMP調節型チャンネルが含まれる。ホルテージ依存性イオンチャンネルにはカリウム、ナトリウム、クロリド又はカルシウムチャンネルのサブタイプが含まれる（Lester, Science 241, 1988, ｐ1057 ; Nicoll, Science 241, 1 988, ｐ545を参照のこと）。これらのチャンネルをアッセイするため、細胞をイオン性条件であってチャンネルの活性化（又は失活）がイオン流の正味の変化をもたらすであろう条件のもとでインキュベートしてよい。これらの細胞は、細胞増幅に及ぼす細胞内イオンチャンネル濃度の変化の効果が高まるように遺伝的に改変されることができる。例えば、カルシウムチャンネルの所望のチャンネルと、カルシウムレベルに対して敏感であるオンコジーンとの同時トランスフェクションによりアッセイできうる。本法に従うと、この試験物質の任意の作動因子は、このレセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、このレセプタートランスフェクション細胞の増殖に及ぼすこのレセプターの高められた効果により決定されうる。高められた効果は増殖の増大又は低下のいづれかとして測定されうるが、作動因子の存在下でのレセプターの高められた効果は最も通常にはレセプタートランスフェクション細胞の高められた増幅として検出する。本法に従うと、この試験物質の任意の拮抗活性は、レセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、トランスフェクション細胞の増殖に及ぼすレセプターの作用の阻害により決定されうる。この作用の阻害は増殖能の増大又は低下のいづれかとして測定でき、レセプターの作用の阻害は一般にレセプター・トランスフェクション細胞の増幅の阻害として検出される。特定の態様において、試験物質をトランスフェクション細胞と、細胞増幅のレセプター刺激の作動因子の存在下でインキュベートする。作動因子による細胞増幅の阻害は拮抗因子の存在を示す。トランスフェクション細胞において、マーカーはトランスフェクションされたレセプターDNA 又は転写されたレセプターmRNAであってよい。レセプターDNA 又はRNA の存在はDNA 増幅及び／又はハイブリダイゼーション技術により決定できうる。ハイブリダイゼーションの目的のため、DNA を細胞から単離し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼで消化する。消化後、得られるDNA フラグメントをアガロースゲルでの電気泳動にかけることができる。ゲルからのDNA を次にニトロセルロースフィルターにブロットし、そして放射性ラベル化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。このプローブは好都合にはレセプター遺伝子のDNA フラグメントを含みうる（実質的にはE. M. Sout hern, J. Mol. Biol. 98, 1975, pp 503の方法に従う）。増幅の目的のため、細胞から単離した全mRNAを逆転写させてcDNAライブラリーを調製することができる。次にレセプターをコードするcDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、注目のレセプターをコードする遺伝子のセグメントに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅し、次いでアガロースゲルによりサイズによって検出することができる。増幅したレセプターcDNAは、レセプターをコードする遺伝子の少なくとも一部に対応するDNA 配列を含んで成る放射性ラベル化オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションによっても検出されうる。この方法は例えばSambrookら、前掲に記載されている。このマーカーは酵素、結合性タンパク質又は抗原であってもよい。この場合、細胞を注目のマーカーをコードするDNA 配列でトランスフェクションする。マーカーとして有用な酵素の例はホスファターゼ（例えば酸性又はアルカリ性ホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、β −グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）である。本法において酵素活性を目に見えるようにするため、最終生成物が検出可能なものである反応を触媒する基質を加えねばならない。本発明に係る方法において採用できうる基質の例には、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クロロナフトール、ｏ−フェニレンジアミン、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ニトロフェニルガラクトース、４−メチルウンベリフェリル−Ｄ −ガラクトピラノシド、H₂O₂／テトラメチルベンジジン又はルシフェリンが含まれうる。本発明において利用できうる結合性タンパク質の例は、ラベル化ビオチンにより検出されうるアビジン又はストレプトアビジンである。ビオチンをラベルするのに適当な物質は蛍光タグ（例えばフルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン）又はマーカー酵素（例えば上記の酵素のいづれか）であってよい。その他の可能な結合性タンパク質はレクチン、特に植物性レクチン、例えばレンチルレクチン又はムギレクチンである。レクチンは、そのレクチンに結合できる炭水化物を介して目に見えるようにすることができうる。かかる炭水化物はビオチンについて述べたものと同じ物質でラベルしてよい。本法において使用できうる抗原の例はHLA 又はc-myc である。抗原はそれと反応性であるラベル化抗体を介して目に見えるようにすることができうる。この抗体はビオチンについて述べたものと同じ物質でラベルしてよい。マーカーは好ましくは酵素、特にＥ．コリ lac Ｚ遺伝子によりコードされる β−ガラクトシダーゼ又はホタルルシフェラーゼとする。マーカー酵素をコードするDNA はレセプターDNA を有するベクター上にあるか、又はその後にレセプターDNA 有するベクターと一緒にトランスフェクションせしめる独立のベクター上にあってよい。単独レセプター方式の特に好ましい態様において、本法は、（ａ）細胞を、レセプターをコードするDNA 及びマーカー酵素をコードするDNA でトランスフェクションする、（ｂ）トランスフェクション細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターとが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定する、ことを含んで成る。工程（ｄ）における細胞増殖に対する非特異的な効果をコントロールするため、剌激された細胞により発現されるマーカー酵素の量を、試験物質の添加の前に培養物の中に混合せしめた非トランスフェクション細胞により発現される第二の、且つ容易に判別できるマーカー酵素の量と比較しておいてよい。本発明に従ってマーカーとして２種類の酵素を利用する利点は、剌激された細胞及び非剌激細胞の区別に必要な時間が比較的短いことにある。培養プレート上にフォーカスが形成されるまで数日も待つ必要はなく、そして実際には、判別はプレート中の培地の交換が必要となる前になされうる。更に、もし酵素反応が発色性又は発光性であるなら、検出の前での基質の分離は必要とされない。図２は単独レセプターとのリガンド相互作用の簡便なアッセイとして細胞増殖を利用する手法の模式図である。リン酸カルシウム沈殿を利用してNIH 3T3 細胞をトランスフェクションするのに高濃度のレセプターDNA及び慣用のマーカーDNA (例えば、β−ガラクトジダーゼをコードするDNA)を用いている。他方、このレセプター及びマーカーは同一のプラスミドに組込んでよい。これらの条件を利用して、少数の細胞が事実上トランスフェクションされ、そしてトランスフェクションされた細胞の大多数の両方のDNA を発現するであろう。リガンド抜きで増殖させた培養物においては、細胞の全てが類似の増殖特性を有し、そして理論的には、一定の培養時間を経て培養物の中で見い出せるマーカーの量はマーカーにより最初にトランスフェクションされた細胞のパーセンテージに比例するであろう。細胞を、レセプターを剌激するリガンド（作動因子）の存在下でインキュベートすると、レセプター・トランスフェクション細胞は培養物中のその他の細胞に比してポジティブを増殖アドバンテージを有するであろう。レセプター・トランスフェクション細胞の大多数はマーカーも発現するため、マーカーの量は最終培養物の中で増大するであろう。多重レセプター方式本法の別の態様において、細胞を２種以上の異なるレセプターをコードするDN A によりトランスフェクションする。各トランスフェクション細胞は個々のレセプターを発現する。これは、統計学的に、各細胞が１個の個別のレセプターのみによってトランスフェクションされていることを意味するものと解すべきである。これは、任意のいづれかの特定のレセプターをコードするDNA がトランスフェクションのために用いる全DNA のほんのわずかな％しか占めないほど、トランスフェクションのためにほんのわずかなレセプターDNA しか使用しないことにより得られ、例えば担体DNA を使用することにより、又は細胞を多数の異なるレセプターDNA で同時にトランスフェクションすることにより得られる。後者の場合、１より多くのレセプターDNA によってはほんのわずかな細胞しかトランスフェクションされないが、一部の細胞の中に他のレセプターDNA が少量で存在しうることも否定できない。しかしながら、細胞に加えられた特定のリガンドにより剌激されたレセプターを含む細胞のみ本法に従って増幅される（それ故、このアッセイにおいて見えるようになる）。この手順の他に、個別の細胞培養物を各々のレセプターでトランスフェクションしておき、次いで混合してから試験物質を加えてよい。他に、トランスフェクション手順は単独レセプター方式について記載の通りである。同様に、トランスフェクションのために用いるレセプターのタイプは上記と同じである。応答の強さはシグナル変換のタイプに関連するため、最良の結果は同じクラスのレセプターを一緒に試験することにより得られるであろう。例えば、Gq−複合型レセプター、例えばα1A，Ｂ及びＣアドレナリン作動性レセプター、m1，m3及びm5ムスカリンレセプター、S2及び1Cセロトニンレセプター；trk Ａ，Ｂ及びＣレセプター、EGF 及びPDGFレセプター；アデノシンレセプター、α ２アドレナリン作動性レセプターサブタイプ、ソマトスタチンレセプター、アヘンμ及びδレセプター；オンコジーン、例えばras，p53，neu オンコジーン、又はtrk，EGF，PDGF等のレセプターのオンコジーン形態である。適当なマーカーは上記した。しかしながら、本発明の方法に別々のマーカーを含ませておき、一定のレセプターを発現する細胞が、別のレセプターによりトランスフェクションされている細胞により発現されるマーカーから区別できるマーカーをも発現できるようにする（異なるレセプター間の区別を簡単にするため）ことが極めて好都合でありうる。区別可能にするため、酵素マーカー同志は基質特異性において重複し合うべきでない（例えば、アルカリホスファターゼとβ− ガラクトシダーゼ）。基質及び検出メカニズムは従って区別できうるようにアッセイのための選ぶべきである（例えば黒色の反応生成物を供するアルカリホスファターゼと、黄色の反応生成物を供するβ−ガラクトシダーゼ）。他方、発色性及び発光性検出を組合せてよい（例えばβ−ガラクトシダーゼ及びホタルルシフェラーゼ）。この場合、その反応は容易に区別でき、なぜならβ−ガラクトシダーゼはｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと反応したときに発色生成物を生み出し、一方、ルシフェラーゼはルシフェリンと反応したときに発光生成物を生み出すからである。発光反応は不安定な生成物（光）を生み出す更なる利点を有する。即ち、数種の発光酵素反応を同一の反応混合物の中で順次行うことができうる。多重レセプター方式の一の特に好適な態様において、本法は、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、マーカー酵素をコードするDNA とで細胞をトランスフェクションする、ここで各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現する、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）単独レセプター方式の工程（ａ）−（ｄ）において上記した方法に各レセプターを委ねることによりこのリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る。多重レセプター方式の別の特に好適な態様において、本法は、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、マーカー酵素をコードするDNA とで細胞をトランスフェクションする、ここで各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現する、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）DNA 増幅及び／又はハイブリダイゼーション技術によりレセプターDNA 及び／又はmRNAをアッセイすることにより、このリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る。多重レセプター方式の更なる特に好適な態様において、本法は、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、２種以上のマーカー酵素をコードする複数のDNA とで細胞をトランスフェクションする、これにより各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現し、一定のレセプターを発現する細胞は、別のレセプターによりトランスフェクションされた細胞により発現されるマーカーから区別できるマーカーを発現するようになる、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞は数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激された及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時聞インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）各個別のマーカー酵素にとっての基質を加え、次いでアッセイすることにより、このリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る。本発明のこれらの態様は、単独のレセプターの一連の突然変異バージョンの代わりに、多重レセプタータイプを一緒にトランスフェクションさせ、そしてリガンドの存在下で増殖させると、大量のレセプターが、そして更に可能としては潜在的なリガンドが同時に試験されることができ、それ故薬剤のスクリーニングプログラムの時間が節約される。リガンドが活性化させることのできる一又は複数種のレセプターはそのレセプターを発現する細胞の増殖をもたらし、それ故一定のリガンドにより活性化されるレセプターは培養物において、例えばDNA 増幅技術により同定されうる。多重レセプター方式のいくつかの形態が技術的に可能である。図10は多重レセプター方式の一般的な概念を紹介している。ここでは、２種類のレセプターを、低濃度レセプターDNA を利用して、NIH 3T3 細胞にトランスフェクションしている。これらの条件下で、わずかな細胞がトランスフェクションされ、そしてトランスフェクションされたものは通常単独のレセプターのみを発現するであろう。稀に、両方のレセプターが一定の細胞において発現されるであろう。もし培養物をR1に対する作動活性を有するリガンドの存在下で増殖させると、R1でトランスフェクションされた細胞は培養中で増幅するであろう。R2もR1と一緒に発現する細胞については、一部のR2も増幅するであろう。レセプター増幅の程度はプラスミドレセプターのそれぞれにおいて発現されて判別可能マーカーを有することにより、又はDNA 増幅技術を介して直接DNAのレセプターmRNAを検出することにより決定できうる。多重レセプター方式の一の形態を図11に示す。ここで、多重レセプターは単独のマーカーと一緒に発現される。一又は複数種のマーカーの活性化はマーカーの誘導をもたらし、そして活性を有する試験リガンドを同定せしめる。どのレセプターが活性化されたかは単離物中の各レセプターに対するスクリーニングにより決定できうる。この手法は、多重のレセプター標的に対するリガンド活性について、化合物を大量スクリーニングすることにおいて用途を有するであろう。どのレセプターが活性化されたかを同定する別の手法は図14に示しているようにDNA 増幅技術によりレセプターmRNA及び／又はDNA 測定することであろう。この後者の手法は、固有の活性を有するレセプター（例えばオンコジーン）の拮抗因子又は阻害剤としてのリガンドの分析においてかなりの用途を有するようである。図面の簡単な説明図1aはフォーカス数、対、m5 DNAの濃度のプロットである。図1bはフォーカス数、対、カルバコールの濃度のプロットである。カルバコール処理の２週間後に細胞を染色し、そしてフォーカスを数えた。実験は10cmのプレートで行い、そしてカルバコール(100μＭ)をトランスフェクションの２日後に適用し、そして３〜４日毎に変換した。図２は単独レセプター方式の模式図であり、ここではレセプターの作動因子誘導をβ−ガラクトシダーゼ活性として検出している。レセプターDN A 及びβ−ガラクトシダーゼDNA を高濃度の両DNA を利用して同時トランスフェクションせしめ、その条件は、有効にトランスフェクションされる細胞の大多数が両DNA によりトランスフェクションされるであろうものとした。以下に説明するリン酸カルシウム沈殿手順を利用すると、培養物中のほんのわずかな細胞しかトランスフェクションされないであろう。実施例において、細胞は１日１回分裂し、そして作動性リガンドの存在はレセプターでトランスフェクションされた細胞の分裂速度(^* )を二倍にした。図3aは、ヒトtrk Ａレセプターによりトランスフェクションした細胞における β−ガラクトシダーゼ活性の経時的ヒト神経成長因子(NGF)剌激を示する。図示しているのは420での吸収、対、10nMのNGF の存在下又は非存在下でのインキュベーション日数の棒グラフである。図3bは処理３日後のNGF とNT3 の投与量−応答の関係を示す。図４はm5及びm2ムスカリン様レセプターによりトランスフェクションした細胞中のβ−ガラクトシダーゼのカルバコール剌激の経時変化を示す。図５は単独レセプター方式においてレセプターをアッセイするのに用いることのできるプロトコールの例を示す模式図である。図6aはm1，m3及びm5ムスカリン様レセプターの投与量−応答の関係を示す。図 6bはm2及びm4ムスカリン様レセプターの投与量−応答の関係を示す。図７はm5ムスカリン様アセチルコリンレセプターのランダム−飽和突然変異誘発のための手法を示す。図8aは８種の機能的なムスカリン様レセプターの突然変異領域内の配列を示し、それらは少なくとも２種類のフォーカスからそれぞれ単離され、且つ配列決定されたものである。野生型m5レセプターの配列を一番上に示し（一文字及び三文字コード）、それに突然変異配列が続く。コードアミノ酸を変えない塩基変化を（★）で示し、そして保存型置換を伴う推定アミノ酸変化を平記号で、そして非保存型置換を伴う推アミノ酸変化を太記号で示す。20 の追加の固有配列が個々のフォーカスから単離された。28の突然変異レセプター配列に関し、平均2.4のアミノ酸変化がレセプター当り観察された。図8bは５種の野生型ムスカリン様レセプターサブタイブの配列の比較を示す。シェーディングはm5レセプターの配列に対する同一性又は保存型置換を示す。５種のレセプターサブタイプ全てについて同一性又は保存型置換のみが寛容されている位置を（ °）で示す。レセプターの機能的分類（m2／m4、対、m1／m3／m5）に関係しない非保存型置換の位置を（×）で示す。少なくともPI−結合型ムスカリン様レセプター（m1／m3／m5）が保存されている位置を（Ｏ）で示す。置換が機能的分類の前兆を示す位置を（★）により示す（m1／m3／m5保存型、非保存型、対、m2／m4 、及びm2／m4保存型）。枠で囲った残基は、突然変異レセプターにおいて非保存型置換が同定されなかった位置（パートＣに示している位置の下に表示）との関係で保存されている。図8cは少なくとも２つの独立のフォーカスにおいて同定されたアミノ酸置換の全ての編集を示す。アミノ酸置換をＢに示す対応のアミノ酸置換の下に示している。アミノ酸置換は独立のレセプターそれぞれについて一度示している。少なくとも２つのフォーカスにおいて観察されたアミノ酸変化の位置を野生型アミノ酸の対応の位置の下に示す。これらのアミノ酸の変化は、675 の組換ライブラリーから単離した28の独立の突然変異レセプターから編集した。非保存型置換のない位置を枠で囲った。m5との関係でその他のムスカリン様レセプターが保存型となっているアミノ酸もこれらの枠の中に含ませた。図8dはＥ．コリにおいて発現された突然変異レセプターライブラリー（NIH 3T3 細胞の形質転換によるトランスフェクション及び選別の前）からランダムで選別した17のクローンにおいて観察されたアミノ酸置換の編集を示す。平均4.2のアミノ酸置換が突然変異レセプター当り観察された。停止コドンの存在を表示した(sto)。保存型置換は以下の群のメンバーとして定義する： S (Ser)，T (Thr)，P (Pro)，A (Ala)，and G (Gly)；N (Asn)，D (Asp)，E (Gl u)，and Q (Gln)；H (His)，K (Lys) 及びR (Arg)；M (Met)，I (Ile)，L (Leu) and V (Val)；F (Phe)，Y (Tyr) and W (Trp)；又はC (Cys) 。図９はm5ムスカリン様レセプターの突然変異ドメインのヘリックス図を示す模式図である。このドメインは細胞内空間から見ている。Ｃ−i3はi3ループのＣ− 末端領域を示す。アミノ酸置換（図８より）を小文字で示す。保存型置換のみの位置を独立させ、そして円で囲った。大要してある影付きの楕円は保存型置換のみが観察されたアミノ酸の位置を包括する。これはヘリックスの機能的臨界面であると推定される。大きな影付き楕円は、非保存型置換が全ての位置で観察されたアミノ酸の位置を包括する。これはヘリックスの機能性の非臨界面であると推定される。大きな外円はTM5 から出発するアミノ酸の番号付けを示す。その他のムスカリン様レセプターとの相同性に関するアミノ酸の分類を、図８に定義する記号を用いてこの円上に表示した。チェックは、部位特異的突然変異誘発による判定に従ってラジカル置換を寛容するm1ムスカリン様レセプターにおける位置を表示する。図10は多重レセプター方式の例の模式図である。本例においては、トランスフェクションのために低濃度の２種類のレセプターDNA( R1及びR2)を利用した。これらの条件下では、非常にわずかな細胞しかR1及びR2 により同時にトランスフェクションされなかった。従って、R1リガンドはR1発現性細胞を選択的に増幅するであろう。図11は多重レセプター方式の態様の模式図を示し、ここでは複数種のレセプターをβ−gal アッセイのみを利用して同時にアッセイしている。図12はオンコジーンＶ−ras に対する細胞の応答を示す。６枚のウェルプレートのNIH 3T3 細胞を１μｇのＶ＝ras 又はｎ−ras 及び１μｇのβ−gal cDNAでトランスフェクションした。アッセイを図５に示している通りに標準単独レセプター方式を利用して実施した。コントロールは活性化性リガンドなしでm5レセプタートランスフェクション細胞を用いて実施した。図13は突然変異m5レセプターの作動性及び拮抗性表現型を示す。 10cmプレートのNIH 3T3 細胞を1.5μｇの野生型m5（●）又はm5−160突然変異レセプター（○）、及び３μｇのβ−gal cDNAでトランスフェクションした。アッセイは表示のリガンドと４日間インキュベーションした後、図５に示すように実施した。図14は複数のレセプターをβ−ガラクトシダーゼ及びDNA 増幅アッセイの組合せを利用して同時にアッセイする多重レセプター方式の態様の模式図である。図15はFPプロスタノイド（Ｂ）及びER_Bエンドセリン（Ａ）レセプターのリガンド及びレセプターcDNAの投与量／応答関係を示す。10cmプレートのNIH 3T3 細胞を表示濃度のレセプターcDNAでトランスフェクションした。細胞を96穴プレートのウェルの中で表示の濃度のリガンドと共に４日間インキュベーションした。トランスフェクション体は全て2.5μｇのD2レセプター及び2.5μｇのβ−gal cD NAをも含んだ。図16は図11に記載のそれと類似の多重レセプター方式を利用する同時トランスフェクションを利用してアッセイした、表示のレセブターに対する最大のリガンドー誘導応答を示す。10cmプレートのNIH 3T3 細胞を0.5μｇづつの５つの試験D NA，2.5μｇのD2レセプターcDNA及び2.5μｇのβ−gal cDNAでトランスフェクションした。各レセプターに対して特異的な作動性リガンドの７通りの投与量を試験した（m1／カルバコール：アルファ−1B／フェニレフリン。NK１／物質Ｐ：ET B ／エンドセリン−３：FP／フルプロステノール）。細胞を各リガンドと共に96 穴プレートのウェルの中で４日間インキュベーションした。最大応答を、データーをシングル−マス−作用部位(single mass-action sitc)のモデルにフィットさせることにより計算した。個々の実験は、これらのリガンドそれぞれが、表示の標的レセプター抜きでは応答を誘導できないことを示した。図17は作動因子UK 14,304に対する野生型及びキメラアルファー２アドレナリン作動性レセプターの投与量−応答を示す。表示の投与量の作動因子を単独レセプター方式を利用してアッセイした。５μｇのレセプターDNA 及び５μｇのベーターgal DNA 10cmプレートのために用いた。レセプターを作動因子と共に５日間インキュベーションした。データーは三回の測定の平均である。それらの線は、非線形回析による活性のシングル・マス−作用部位に対してデーターをフィットさせたものである。α2C10のキメラ構築体をPCR 及び標準のクローニング技術を利用して調製した。詳しくは、アルファー2C10のi3ループ全体を対応のアルファー1Ai3ループの大半に置き換えた。ベーターガラクトシダーゼはONPGの中での24 時間のインキュベーション後に光度計で420において吸収を測定することによりアッセイした。本発明を以下の実施例に更に説明し、これらは本発明を限定するものではない。実施例単独レセプター方式の一般プロトコール NIH 3T3 細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、ATCC C RL 1658 として入手可能）の培養物を50〜60％の集密度となるように調製した。１日目に細胞をトリプシン処理し、遠心し、そして10mlのDulbecco改良Eagle培地（DMEM）、10％の仔牛血清の中で１×10⁶細胞／10cmのプレートでブレート培養した（１本の175cm²のフラスコから３〜４枚の10cmプレートが得られる）。２日目に細胞をWiglerら、Cell 11 : 223-232(1977)のリン酸カルシウム沈殿手順を利用してトランスフェクションさせた。各プレートにつき、５μｇのレセプターDNA ５μｇのβ−galDNA(β−gal，pSV−β−ガラクトシダーゼ、Promega)、2 0μｇのサイ精子DNA ，65.5μｌの2.0ＭのCaCl₂をH₂Oで0.5mlにした。このDNA 溶液を0.5mlの2XのHEPES 緩衝食塩水（280mMのNaCl，10mMのKCl，1.5mMのNa₂HPO₄ ・２H₂O，12mMのデキストロース、50mMのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）(HEPES)，pH7.05）に、気泡で緩やかに混合しながら加えた。３日目、プレートをHANKのバランス食塩水溶液（HBSS）で洗い、そして10mlのDMEM＋10％の仔牛血清を加えた。４日目、細胞をトリプシン処理し、遠心し、そして10mlに再懸濁した（DMEM＋10％の仔牛血清）。100μｌの懸濁物を96穴プレートの各ウェルに加えた。100μｌのDMEM（10％の仔牛血清）中の2Xの濃度の試験化合物を各ウェルに加えた。細胞を試験物質と共に３〜５日、培地を変換することなくインキュベーションした。Lim and Chac Biotechni ques７ : 576-579（1989）の改良方法をβ−gal をアッセイするのに用いた。β −gal のアッセイの日に、培地をアスピレート吸引し、そしてウェルを100μｌのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすいだ。3.5mMのｏ−ニトロフェニル −β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び0.5％のNonidet Ｐ−40(Sigma)を有する200 μｌのPBS を各ウェルに加え、そして室温で４日インキュベーションした。β− gal 答を数時間直線上であった。各ウェルの吸収を〜405nm に設定したプレートリーダー(Bio Tec)により決定した。実施例１trk Ａレセプターでトランスフェクションされた細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性神経成長因子(NGF)はtrk Ａレセプターの作動因子である。NGF 剌激したtrk Ａレセプターはチロシンのホスホリル化を活性化し、そしてNIH 3T3 細胞のフォーカスを誘導する。図3aはtrk Ａレセプタートランスフェクション細胞を上述の一般手順に従いNGF の存在下又は非存在下で増殖させたときの実験由来のデーターを示す。10cmプレートのNIH 3T3 細胞を５μｇのtrk ＡレセプターDNA （Kapl an ら、Science 252, 1991, ｐ554及びMartin-Zarcaら、Mol. Cell. Biol. 9, 1 989, ｐ24に実質的に記載の通りにクローニング）及び５μｇのβ−gal DNA でトランスフェクションした。24hr後に細胞を洗い、そして48hr後に細胞を96穴マイクロタイタープレートに移し、そして表示の日数にわたりNGF の存在下又は非存在下で増殖させた。β−gal 活性をNGF により誘導し、３日以内に著しい誘導が観察された。図3aに示すデーターは三回の測定（それぞれ別々のウェル由来）の平均値±SDである。図3bは３日聞のNGF 処理後のβ−gal の誘導についてのNG F 投与量−応答関係を示す。この応答のNGF ED₅₀はPC12細胞における内因性NGF レセプター誘導型軸索生長で観察されたものに類似していた(Cordon-Cardoら、C ell 66 : 173-183 (1991) ; Chao ら、Neuron 9 : 583-593(1992))。更に、関連の好中球性因子NT3 の投与量−応答関係を示す。示されていないのは、NGF が、trk Ｃレセプターサブタイプによりトランスフェクションされた細胞における増幅応答を誘導できないことであり、ニュートロトロフィンレセプターの既知の選択性として一致する（表２も参照のこと）。実施例２ムスカリン様レセプタマサブタイプm1，m2，m3，m4及びm5によりトランスフェクションされた細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性ホスホリパーゼＣを剌激するムスカリン様アセチルコリンレセプター（m1，m3 ，m5）は、細胞増殖を剌激し、そしてNIH 3T3 細胞のフォーカスを誘導することを、トランスフェクションされたレセプターが作動活性を有するリガンドによって活性化されたときにのみできる。これらのレセプターでトランスフェクションしたNIH 3T3 細胞から単離したモノクローナル細胞系において、ホスホリパーゼＣの剌激、有系分裂誘発の剌激及びフォーカス形成についての作動因子投与量− 応答関係は同一であり、そしてこれらの応答はムスカリン様レセプターの拮抗因子アトロピンによりブロックされる。m2及びm4ムスカリン様レセプターはNIH 3T 3 細胞においてホスホリパーゼＣを強く剌激せず、フォーカスを誘導させもしない。これらのデーターは、細胞増殖におけるリガンド誘導型変化が一部のムスカリン様レセプターサブタイプの薬効のアッセイに利用できうることを示唆する（ Gutkindら、PNAS 88, 4703 (1991) ; Stephens ら、Oncogene 8, 19-26 (1993) ）。 NIH 3T3 細胞においてフォーカスを誘導することについてのm5 DNAの投与量− 応答関係を図1aに示す。これらのデーターは、フォーカス応答が低濃度のDNA を必要とし（〜１ng）、そして幅広いDNA 濃度にわたって直線上であることを示唆する（１ngから少なくとも 1000ngまで）。100ngのm5 DNAに閏して、フォーカスを誘導するカルバコールの投与量−応答関係を図1bに示す。一般のプロトコールのもとでの上述のリン酸カルシウム沈殿条件を利用し、各培養物中のほんのわずかな細胞がDNA によりトランスフェクションされた。これらのデーターは、培養物中のほんのわずかの細胞のトランスフェクションに低濃度のDNAを利用する条件下では、強力なリガンド −依存性応答が観察されることを示唆する。ムスカリン様レセプターサブタイプは、数多くのその他のレセプターと同様に、機能的に異なるＧ−タンパク質に選択的に相互作用することができる。例えば、m1，m3及びm5レセプターはＧ−タンパク質Gqに複合することによって選択的にホスホリパーゼＣを剌激し、そしてm2及びm4はＧ−タンパク質Giと複合することによりアデニルサイクラーゼを選択的に阻害する。m2及びm4はＧ−タンパク質Go とも選択的に複合する（Jonesら、Molecular Biology of G-protein-coupled re ceptors ，M Brann 編、Birhauser Boston, pp 170〜197(1992)）。レセプターの機能的表現型を改変するための一の手法は突然変異Ｇ−タンパク質を伴ってレセプターを発現することである。例えば、もしGqのレセプター複合選択性がGiのそれに変えられるなら、m2及びm4レセプターはかかる突然変異Gqを活性化できるであろう。最近、Ｇ−タンパク質のカルボキシ末端は種々レセプターに対する選択性を誘導することが示されている。我々の研究において、我々はGqと、Giのカルボキシ末端の５個のアミノ酸（Gq−i5）又はGoのそれとのキメラを試験した（Gq −i5及びGq−o5構築体はConklin らNature 363, 1993, p. 274に記載されている）。 β−ガラクトシダーゼ活性のカルバコール誘導の経時変化をm5及びm2ムスカリン様レセプターでトランスフェクションしたNIH 3T3 細胞（図４）で調べた。５ μｌのヒトm5ムスカリン様レセプターDN A 及び５μｇのコントロールプラスミドDNA 、又は５μｇのヒトm2ムスカリン様レセプターDNA 及び５μｇのGq−i5 DNA（m2／Gq−i5）のいづれかを５μｇのβ −ガラクトシダーゼDNA と組合せて10cmプレートをトランスフェクションした。 48hr後、細胞を96穴プレートのウェルに、カルバコールによる即時処理のために移した。カルバコール処理を表示の日数にわたり続け、そして培地及びカルバコールを３日毎に変換した。 m2レセプターの場合、Ｇ−i5キメラをレセプターと共に同時発現させた（５μ ｇのレセプター及び５μｇのＧ−タンパク質）。発現化Ｇ−タンパク質の非存在下では、m2レセプターはβ−ガラクトシダーゼレベルに対して効果をもたなかった。m2／ｑ−i5及びm5トランスフェクション培養物の両方について、カルバコールはβ−ガラクトシダーゼレベルを有意義に誘導でき、そしてこの効果は約５日問の薬剤処理でプラトーに達した。β−ガラクトシダーゼ応答を媒介するGq−i5 及びGq−o5の能力を、カルバコールによるm4レセプターの剌激能と比較した。m4 ／ｑ−i5についてのカルバコールのED₅₀は0.037±0.046であり、そしてm4／ｑ− o5については0.032±0.047であり、そして両者の組合せは類似の最大応答をもたらした。これらのデーターは、m4レセプターがｑ−i5及びｑ−o5と似たような効率で複合することを示唆する。最大のβ−ガラクトシダーゼシグナルを生成するように細胞密度を最適化した上記の経時変化及び実験に基づき、上記の単独レセプター方式についての一般プロトコールを応用した。m1−m5ムスカリン様レセプターをBonnerら、Science 23 7 , 1987, p. 527及びBonnerら、Neuron 1, 1988, p. 403に実質的に記載の通りにしてクローニングした。m1，m3及びm5ムスカリン様レセプターのそれぞれについて、NIH 3T3 細胞を５μｇのレセプターDNA 及び５μｇのβ−ガラクトシダーゼDNA によりトランスフェクションした。m2及びm4ムスカリン様レセプターのそれぞれについて、NIH 3T3 細胞を５μｇのレセプターDNA 、５μｇのGq−i５ DNA及び５μｇのβ−ガラクトシダーゼDNA によりトランスフェクションした。m1，m3及びm5ムスカリン様レセプターのデーターをカルバコール処理の５日後に集め、そしてm2及びm4ムスカリン様レセプターのデーターをカルバコール処理の４日後に集めた。培地変換は行わなかった。データーは３〜４の独立のウェルからの平均値であり、物質及び界面活性剤の添加の４時間後にオリジナルのウェルから直接読み取った。直線は活性のシングル・マス−作用部位の平衡式に対するデーターのコンピューター作製フィットである。 m1，m3及びm5トランスフェクション細胞のカルバコール投与量−応答関係を調べた（図6a）。同様の実験をGq−i5で同時トランスフェクションしたm2及びm4レセプターで実施した（図6b）。示している通り、この一般プロトコールはこれらの５つのレセプターについてのカルバコールのED₅₀の正確な決定を可能にした。これらの値は、フォーカス誘導（Gutkindら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4703 (1991)）、細胞分裂誘発（StephensらOncogene 8 : 19-26 (1993)）、二次メッセンジャー及び生理学的応答（Jonesら、Mol. Pharm. 40 : 242-247 (1991) ）を利用する初期の測定値と良く一致した。更に、作用のシングル・マス−作用部位の平衡式に対するデーターのフィットを示す。示している通り、全てのレセプターがこのレセプター・マス−作用関係に従っていた。表１はこのアッセイを用いて評価したm1〜m5レセプターの複数のムスカリン様作動因子及び拮抗因子の薬効を示す。拮抗データーの全てが結合アッセイを用いて予め評価したパラメーターと良好に一致したが、ただしほとんどの拮抗因子は結合アッセイにおけるものより低い能力をこれらの機能アッセイにおいて有していた（Jonesら、Molecular Biology of G-Protein Coupled Receptors 前掲を参照のこと）。また、完全及び部分作動因子の応答を区別するためのアッセイの能力を示す。部分作動因子は往々にして機能アッセイにおいては完全作動因子と区別しにくい。その困難性は頭打ち効果（ceiling ef fect）とレセプターの乏しさ(spareness)に原因する。事実、弱い部分作動因子に対する高感度と、完全及び部分作動因子を区別する能力この組合さったアッセイはほとんどない。表１．ムスカリン様アセチルコリンレセプターの薬効５種のクローニング・ヒト・ムスカリン様レセプターサブタイプのムスカリン様作動因子及び拮抗因子の投与量−応答関係。NIH 3T3 細胞をムスカリン様レセプター及びβ−ガラクトシダーゼcDNAで同時トランスフェクションした。m2及び m4をGq−i5 cDNAによってもトランスフェクションした。増幅アッセイは単独レセプター方式を利用して行った。データーは２〜４回の実験の平均値（±SE）を示す。Ａ．作動因子の薬効。個々のEC₅₀及び最大応答は８〜10通りの濃度の表示のリガンドからのデーターの非線形回析に由来し、濃度当り３〜４のレプリケートとした。最大応答はカルバコール応答の％として表示する。カルバコールについての最大応答は200μＭ（m1），10μＭ(m2，m4)，100μＭ（m3）及び５μＭ（ m5）を用いて規定した。Ｂ．拮抗因子の薬効。個々のEC₅₀値は８〜10通りの濃度の表示のリガンドからのデーターの非線形回析に由来し、濃度当り３〜４のレプリケートとした。IC₅₀値はCheng-Prusoff 平衡式を用い、Ｋ値に変換した。拮抗因子は50μＭ（m1），５μＭ（m2，m4），10μＭ（m3）及び１μＭ（m5）でカルバコールを用いて評価した。実施例３m5及びm2（Gq−i5）ムスカリン様レセプターでトランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ活性上記の一般プロトコールに従い、m5ムスカリン様レセプター及びm2ムスカリン様レセプター（Gq−i5により同時トランスフェクション）の増幅を、マーカーとしてβ−ガラクトシダーゼの代わりにホタルルシフェラーゼ（Iuc，pGL２−コントロールベクター、Promega)を用いて決定した。レセプター、マーカー及びＧ− タンパク質DNA 濃度は実施例２におけるβ−ガラクトシダーゼ実験について記載のものと同じとした。ホタルルシフェラーゼの誘導活性についてのカルバコールのED₅₀はm5については0.22±0.01μＭであり、そしてm2／ｑ−i5については0.14 ±0.11μＭであった。ホタルルシフェラーゼを製造者(Promega)の推奨によりアッセイした。得られるデーターは、β−ガラクトシダーゼと同様に、ホタルルシフェラーゼがリガンドによるムスカリン様レセプターの活性化の高感度マーカーを担うことができることを示唆する。実施例４種々のレセプターの剌激いくつかの機能的カテゴリーに属するレセプターを上記の単独レセプター方式についての一般プロトコールを利用して有効にアッセイすることができた。その結果を以下の表２に示す。これらのデーターは、広域のレセプター及び近縁分子が我々の増幅アッセイによりアッセイできることを示唆する。例証しているのはモノアミン、アミノ酸、ペプチド及び大型ホルモンを含む多様な伝達物質にとってのレセプターの例である（ムスカリン様レセプター、Bonnerら、Science 237: 527, 1987 ; Bonnerら、Neuron 1 : 403, 1988 ; ドーパミンD2レセプター、St ormannら、mol．pharm. 37 : 1, 1990 ; タキキニンレセプター、Takedaら、BBR C 179 : 1232, 1991 ; Huang ら、BBRC 184 : 966, 1992 ; Gerard ら、JBC 265 : 20455, 1990 ; アルファ−１アドレナリン作動性レセプター、Cottecchiaら、PNAS 85 : 7159, 1988 ; Lomasneyら、JBC 266 : 6365, 1991 ; アルファー２アドレナリン作動性レセプター、Reganら、PNAS 85 : 6301, 1988 ; Lomasneyら、PNAS 87 : 5094, 1990 ; エンドセリンレセプター、Araiら、Nature 348 : 73 0, 1990 ; Sakuraiら、Nature 348 : 732, 1990 ; P53, Baker ら、Science 249 : 912, 1990 ; タンパク質突然変異休、Voyno-Yasenetskayaら、JBC 269 : 472 1）。多様なシグナル変換クラスも例証する。Ｇ−タンパク質複合型レセプター、チロシンキナーゼ結合型レセプター、Ｇ−タンパク質及びオンコジーン。これらのケースのうちのわずかにおいて、例証のレセプターとのリガンド相互作用をアッセイするためにフォーカスアッセイを利用した。多数のケースにおいて、フォーカスアッセイは測定可能な応答をもたらさないことが示されている（例えば、Gq−i5とのm2及びm4ムスカリン様レセプター）。アルファーアドレナリン作動性レセプターの薬効の詳細な分析も表３に示す。表２．NIH 3T3 細胞の増幅応答を誘導するレセプター及びその他のタンパク質。全てのクローンを単独レセプター方式を利用して試験した。リガンドを７〜９通りの投与量で三重測定で試験した。Ｒ_MAxは他のクローンに比しての、任意単位における、各クローンについて観察された最大応答を示す（＋＋＋＋最高、＋最低）。レセプターの公知のシグナル変換クラスを表示する（TK＝チロシンキナーゼ）。いくつかのレセプター(^* )は応答を媒介するのにＧ−タンパク質Gq−i5の同時発現を必要とした。突然変異活性化クローンの場合（一部のケースにおいてはオンコジーン）、表示のアミノ酸置換はタンパク質が添加リガンドの非存在下で有意義な増幅応答を誘導するようにさせた。表示の野生型Ｇ−タンパク質について、Ｇ−タンパク質はレセプター（Ｒ）と同時発現させたときにアッセイできた。Ｇ−タンパク質はConk linら（Nature 363 : 274-276, 1993）の命名法により命名されている。m5−164 は図13に記載の構成的に活性なm5レセプターを意味する。表３．クローニングしたアルファー２アドレナリン作動性レセプターの作動薬効。３種のクローニングしたヒトアルファー２アドレナリン作動性レセプターサブタイプでのアドレナリン作動性因子の投与量−応答関係。NIH 3T3 細胞をアドレナリン作動性レセプター及びβ−ガラクトシダーゼcDNAにより同時にトランスフェクションした。増幅アッセイを単独レセプター方式を利用して実施した。データーは２〜３回の実験の平均値を示す。個々のEC₅₀及び最大応答は８〜10通りの濃度の表示のリガンドからのデーターの非線形回析に由来し、濃度当り３〜４レプリケートとした。最大応答を一定のレセプターで他のリガンドと対比させて表示する（＋＋＋＋最高、＋最低）。全体的に、C2及び C10はC4よりも強い応答を媒介した。（ND）決定せず。（±）非常に低い応答が観察されたが、信頼性のある値は計算できず。実施例５m5ムスカリン様レセプターのランダム突然変異誘発多重レセプター方式の有用性を例証するため、m5レセプターを、第五トランスメンブランドメイン（TM５）に隣接する第三細胞内ループ（Ｎ−i3）のＮ末端の 20個のアミノ酸、即ち、Ｇ−タンパク質に対する複合に関与するレセプター領域にわたって、ランダム突然変異誘発にかけた。２種類のPCR生成物を調製し、第一生成物についてのリバースプライマー（P2）はTM5 ドメイン全体を含んで成るように、そして第二生成物についてのフォワードプライマー（P3）はＮ−i3 ドメイン全体を含んで成るようにした。突然変異を組込むため、４種の塩基の等モル混合物を、P3プライマーの合成の際に、野生型ヌクレオチドの15％の率において置換せしめた。外部プライマー（P1及びP4）は事後クローニングのためのApa １及びEcoR１制限部位を含む。２種類のPCR生成物をT4 DNAポリメラーゼにより処理して平滑末端を作り上げ、コンカテマーとなるようにライゲーションし、そしてApa Ｉ及びEcoRＩで制限処理してランダムに突然変異させ(^* )、Ni3^*Apa Ｉ／EcoRＩインサートを遊離させた。インサートをpcＤ−m5のApa Ｉ／EcoRＩフラグメントにライゲーションし、突然変異m5レセプターcDNAの集団（pcＤ−m5−Ni 3^*）を得た。クローニング手法全体を図７に示す。それぞれ異なるランダム突然変異のセットを有するレセプターのcDNAライブラリーをNIH 3T3 細胞のトランスフェクションのために用いた。トランスフェクションは10cmのプレート当り450ngのライブラリーcDNA（675組換体）により実施した。NIH 3T3 細胞をフォーカスが形成されるまで100μＭのカルバコールの存在下で増殖させた。２〜３週間後、巨視的な目に見えるフォーカスをプレートから取り出し、全RNA を抽出し、そしてランダム六量体をプライマーとして用いて合成した。これらのcDNA鋳型はPCR プライマーとしてP4及びP5を用い、1.6kbのフラグメントを増幅するのに用いた。P5は、転写されたプラスミドDNA 配列と相補性であるが、m5レセプターcDNAの上流にある。従って、内因性ゲノム配列は増幅されない。PCR 生成物を、プライマーとしてP1を用い、サイクル−配列決定プロトコールで、Taq ポリメラーゼを用いて直接配列決定した。図８及び９に示している通り、多種多様な突然変異レセプターがフォーカスにおいて同定された。これらのデーターは、Ｇ−タンパク質複合に関与するムスカリン様レセプターの領域のだいたいの構造に関する推定を可能にする。技術的レベルで、これらのデーターは、低い濃度のレセプターDNA を使用したときに、単一のプラスミドDNA がNIH 3T3 細胞をトランスフェクションすることができ、そしてリガンドカルバコールが細胞の増殖を剌激してフォーカスが得られることを可能とすること、及びフォーカスを誘導する突然変異レセプターはDNA 増幅手順により同定できることを示唆する。実施例６ベーターガラクトシダーゼの増幅によりアッセイしたm5ムスカリン様レセプターのランダム突然変異誘発図７に記載のものと類似のランダム突然変異誘発を利用することにより、我々はリガンド結合及びＧ−タンパク質複合に閏与すると考えるm5レセプターの領域に突然変異を導入した。これらの突然変異をアッセイするため、小スケールプラスミド調製品を各クローンについて作った。これはミニQiagenアニオン交換カラムを用いて行った。これらのDNA 調製品をトランスフェクション及び単独レセプター方式の改良アッセイに用いた。改良は10cmプレートに用いたものからのNIH 3T3 細胞数及びDNA 量の、６穴又は24穴プレートの個々のウェルにとって適当な量への比例的なスケールダウンを含む。24穴プレートで行うトランスフェクションの場合、ベーターgal アッセイは中間移し工程（例えば標準の単独レセプター方式の10cmプレートから96 穴プレートへの移し；図５）抜きでのトランスフェクションのために用いたウェルの中で直接行った。これらの手順を利用して、我々は様々な機能的表現型について数百のクローンをスクリーニングした。作動因子に対する応答能力を保持する突然変異レセプターを同定するため、我々は高濃度の作動因子をスクリーニングした。リガンドの非存在下で高められた活性を有する突然変異体をスクリーニングするため、我々は作動因子の非存在下及び／又は拮抗因子の存在下で突然変異体をスクリーニングした。この手順により単離した一のクローンを図13に示す。野生型に比して、このクローンはリガンドの非存在下で有意に高い応答を有し、そしてこの基底応答は拮抗因子によりブロックされた。このデーターは、突然変異表現型を有するレセプターの同定のための増幅アッセイの有用性を示唆する。実施例７多重レセプター方式多重レセプター方式の一の形態を図11に示す。本実施例において、いくつかのレセプターのcDNAをNIH 3T3 細胞の培養の中にベーターgal cDNAと共に同時トランスフェクションした。リガンドの添加後、有効なリガンド／レセプター相互作用を陽性ベーターgal 応答により同定した。この手法の実用性を裏付けするデーターを図15に示す。これらの実施例において、エンドセリン及びプロステノイドレセプターDN A の濃度をかなり低めてもシグナルは失われなかった。多重レセプターを利用する実験データーを図16に示す。本実施例において、ムスカリン様、アドレナリン作動性、ニューロキニン、エンドセリン及びプロステノイドレセプター活性化に対するリガンド応答を同時トランスフェクション培養物においてアッセイした。本実験において、過剰の不活性レセプターDNA 10重の多重アッセイをシュミレートするのに用いた（10レセプターを同時にアッセイ）。実施例８疾病遺伝子のアッセイ及び同定数多くの疾病はレセプター及び／又は一体化シグナル変換タンパク質における突然変異に原因する。最も良く特性決定されている例はオンコジーンであるが、しかしその他の例には色素性網膜炎、色盲及びインスリン依存性又は非依存性糖尿病が含まれる。最も良く特性決定されたオンコジーンは小Ｇ−タンパク質ras の突然変異形態である。図12に示している通り、突然変異ras（v-ras）は、野生型ras（v-ras）と異なり、増幅アッセイにおいて有意義な応答を媒介できる。表２にまとめている通り、その他のオンコジーン、例えばｐ53及びＧ−タンパク質 G12 の突然変異形態は増幅応答を媒介できる。実施例６においても示している通り、作動因子の非存在下で活性であるm5レセプターの突然変異形態が増幅アッセイにより同定された。これらのデーターと共に、増幅アッセイは疾病遺伝子のアッセイ及び同定の両者への有力な手法であることが示唆される。疾病遺伝子の同定のための手順は以下の通りである。１）一定の疾病において推定されるレセプターのコード領域をPCR により増幅させる。増幅は疾病を有する個体又は個体集団を用いて実施できる。２）レセプターをリガンドの非存在下での活性及び／又は不適切なリガンド感度について増幅アッセイにより試験する。「不適切なリガンド感度」とは、突然変異形態が、野生型形態よりも低い濃度でリガンドに応答すると予測されうることを意味する。更に、突然変異形態の高められた活性は、例えば図13に示している通り、拮抗因子によってもブロックされるであろう。アッセイは実施例６に示す通り一度に行うか、又は数人の患者のDNA を実施例７に記載の多重型アッセイを利用して同時に検査できる。実施例９キメラレセプターのアッセイ増幅アッセイにおいて強力な応答を媒介しない数多くのレセプターを、シグナル変換経路についてのそれらの選択性を変えることによって応答を媒介するように操作できる。図17に示している通り、機能的応答を媒介するアルファー２アドレナリン作動性レセプターの能力はアルファー１レセプターの第三のループを挿入することにより大幅に増幅できる。アルファー１レセプターはGqに効果的に複合し、一方アルファー２レセプターはGiにより効果的に複合する。このデーター及びその他により示唆される通り、この第三のループは複合選択性の主要決定基と考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．リガンドとして働くことのできる物質を検出する方法であって、（ａ）細胞増幅が可能となる条件下で、リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできるレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた細胞を、このレセプターの潜在的な作動因子又は拮抗因子である試験物質と共にインキュベートする、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、そして（ｂ）細胞増幅が可能となるのに十分な期間を経た後、このマーカーを含まない細胞に比してのこのマーカーを含む細胞の増幅の有無を決定する、ことを含んで成る方法。２．前記細胞を単独のレセプターをコードするDNA でトランスフェクションする、請求項１記載の方法。３．前記DNA が、チロシンキナーゼレセプター、Ｇ−タンパク質複合型レセプター、チロシンキナーゼ活性化性レセプター、チロシンホスファターゼレセプター、転写因子、ステロイドレセプター、オンコジーン又はリガンドもしくはボルテージ依存性イオンチャンネル、又は一のレセプターのリガンド結合性領域と別のレセプターのシグナル変換領域とより成るキメラレセプターをコードする、請求項２記載の方法。４．一又は複数種の試験物質の任意の作動活性を、前記レセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、トランスフェクションされた細胞の増幅に及ぼす前記レセプターの高揚効果により決定する、請求項１記載の方法。５．試験物質の任意の拮抗活性を、前記レセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、トランスフェクションされた細胞の増幅に及ぼす前記レセプターの阻害効果により決定する、請求項１記載の方法。６．前記試験物質を、細胞増幅のレセプター剌激の作動因子の存在下で、前記トランスフェクションされた細胞とインキュベートする、請求項５記載の方法。７．前記マーカーが、トランスフェクションされたレセプターDNA 、転写されたレセプターmRNA、酵素、結合性タンパク質又は抗原である、請求項１記載の方法。８．前記マーカーがレセプターDNA 又はmRNAであり、そしてその存在をDNA 増幅及び／又はハイブリダイゼーション技術により決定する、請求項７記載の方法。９．前記マーカーが、ホスファターゼ（例えば酸性又はアルカリ性ホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペリオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）より成る群から選ばれる酵素である、請求項７記載の方法。 10．前記方法であって、（ａ）細胞を、レセプターをコードするDNA 及びマーカー酵素をコードするDNA でトランスフェクションする、（ｂ）トランスフェクションした細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターとが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、そして（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定する、ことを含んで成る、請求項１〜９のいづれか１項記載の方法。 11．前記細胞を２種以上のレセプターをコードするDNA でトランスフェクションし、ここでこのトランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現する、請求項１記載の方法。 12．前記DNA が、チロシンキナーゼレセプター、Ｇ−タンパク質複合型レセプター、チロシンキナーゼ活性化性レセプター、チロシンホスファターゼレセプター、転写因子、ステロイドレセプター、オンコジーン又はリガンドもしくはボルテージ依存性イオンチャンネル、又は一のレセプターのリガンド結合性領域と別のレセプターのシグナル変換領域とより成るキメラレセプターをコードする、請求項11記載の方法。 13．一又は複数種の試験物質の任意の作動活性を、前記レセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、トランスフェクションされた細胞の増幅に及ぼす一又は複数種の前記レセプターの高揚効果により決定する、請求項11記載の方法。 14．一又は複数種の試験物質の任意の拮抗活性を、前記レセプターによりトランスフェクションされていない細胞のバックグランドに対する、トランスフェクションされた細胞の増幅に及ぼす一又は複数種の前記レセプターの阻害効果により決定する、請求項11記載の方法。 15．前記一又は複数種の試験物質を、細胞増幅のレセプター剌激の作動因子の存在下で、前記トランスフェクションされた細胞とインキュベートする、請求項14記載の方法。 16．前記マーカーが、トランスフェクションされたレセプターDNA 、転写されたレセプターmRNA、酵素、結合性タンパク質又は抗原である、請求項11記載の方法。 17．前記マーカーがレセプターDNA 又はmRNAであり、そしてその存在をDNA 増幅及び／又はハイブリダイゼーション技術により決定する、請求項16記載の方法。 18．前記マーカーがβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホタルルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼより成る群から選ばれる、請求項16記載の方法。 19．一定のレセプターを発現する細胞が、別のレセプターによりトランスフェクションされた細胞により発現されたマーカーから区別できるマーカーを発現する、請求項11記載の方法。 20．前記方法であって、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、マーカー酵素をコードするDNA とで細胞をトランスフェクションする、ここで各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現する、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）請求項10記載の工程（ａ）−（ｄ）において上記した方法に各レセプターを委ねることによりこのリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る、請求項11〜19のいづれか１項記載の方法。 21．前記方法であって、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、マーカー酵素をコードするDNA とで細胞をトランスフェクションする、ここで各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現する、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞を数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）DNA 増幅及び／又はハイブリダイゼーション技術によりレセブターDNA 及び／又はmRNAをアッセイすることにより、このリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る、請求項11〜19のいづれか１項記載の方法。 22．前記方法であって、（ａ）２種以上の異なるレセプターをコードするDNA と、２種以上のマーカー酵素をコードする複数のDNA とで細胞をトランスフェクションする、これにより各トランスフェクションされた細胞は個々のレセプターを発現し、一定のレセプターを発現する細胞は、別のレセプターによりトランスフェクションされた細胞により発現されるマーカーから区別できるマーカーを発現するようになる、（ｂ）このトランスフェクションされた細胞は数等分のアリコートに分ける、（ｃ）各アリコートを１又は複数の試験物質と、剌激されたレセプター及び非剌激レセプターが区別できるようになるのに十分な時間インキュベートする、（ｄ）各アリコートにおけるマーカー酵素活性を測定することにより細胞増殖の任意の変化を決定し、細胞増殖特性を改変するその能力により活性リガンドを同定する、そして（ｅ）各個別のマーカー酵素にとっての基質を加え、次いでアッセイすることにより、このリガンドによりどのレセプターが活性化されるかを同定する、ことを含んで成る、請求項11〜19のいづれか１項記載の方法。 23．リガンドとして働くことのできる物質を検出するための試験キットであって、（ａ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできるレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされている凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｂ）細胞の増殖のための培地、（ｃ）マーカーの存在及び量を検出するための試薬、を含んで成る試験キット。 24．前記DNA が、チロシンキナーゼレセプター、Ｇ−タンパク質複合型レセプター、チロシンキナーゼ活性化性レセプター、チロシンホスファターゼレセプター、転写因子、ステロイドレセプター、オンコジーン又はリガンドもしくはボルテージ依存性イオンチャンネル、又は一のレセプターのリガンド結合性領域と別のレセプターのシグナル変換領域とより成るキメラレセプターをコードする、請求項23記載の試験キット。 25．細胞増幅のレセプター剌激の作動因子を更に含んで成る、請求項23記載の試験キット。 26．前記マーカーが、トランスフェクションされたレセプターDNA 、転写されたレセプターmRNA、酵素、結合性タンパク質又は抗原である、請求項23記載の試験キット。 27．前記マーカーが、ホスファターゼ（例えば酸性又はアルカリ性ホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペリオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）より成る群から選ばれる酵素である、請求項26記載の試験キット。 28．前記マーカーの存在及び量を検出するための試薬が、ｏ−ニトロフェニル −β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄ−ガラクトピラノシド、クロロナフトール、ｏ−フェニレンジアミン、３− （ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ニトロフェニルガラクトース、４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、H₂O₂／テトラメチルベンジジン又はルシフェリンより成る群から選ばれる、請求項27記載の試験キット。 29．リガンドとして働くことのできる物質を検出するための試験キットであって、（ａ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできる第一レセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｂ）リガンドに応答して細胞増幅に影響を及ぼすことのできる第二レセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた凍結細胞、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、（ｃ）細胞の増殖のための培地、（ｄ）このマーカーの存在及び量を検出するための試薬、を含んで成る試験キット。 30．更なる個別のレセプターをコードするDNA でトランスフェクションされた凍結細胞を更に含んで成り、各後続レセプターは各先行レセプターとは異なる、請求項29記載の試験キット。 31．前記細胞が２種以上のマーカーをコードするDNA でトランスフェクションされており、これにより一定のレセプターを発現する細胞は別のレセプターによりトランスフェクションされた細胞により発現されるマーカーから区別できるマーカーを発現し、ここでこのキットは更に各マーカーを検出するための試薬を更に含んで成る、請求項29記載の試験キット。 32．前記DNA が、チロシンキナーゼレセプター、Ｇ−タンパク質複合型レセプター、チロシンキナーゼ活性化性レセプター、チロシンホスファターゼレセプター、転写因子、ステロイドレセプター、オンコジーン又はリガンドもしくはボルテージ依存性イオンチャンネル、又は一のレセプターのリガンド結合性領域と別のレセプターのシグナル変換領域とより成るキメラレセプターをコードする、請求項29記載の試験キット。 33．細胞増幅のレセプター剌激の作動因子を更に含んで成る、請求項29記載の試験キット。 34．前記マーカーが、トランスフェクションされたレセプターDNA 、転写されたレセプターmRNA、酵素、結合性タンパク質又は抗原である、請求項29記載の試験キット。 35．前記マーカーが、ホスファターゼ（例えば酸性又はアルカリ性ホスファターゼ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−グルコシダーゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、ルシフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はペリオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）より成る群から選ばれる酵素である、請求項29記載の試験キット。 36．前記マーカーの存在及び量を検出するための試薬が、ｏ−ニトロフェニル −β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−-クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クロロナフトール、ｏ−フェニレンジアミン、３ −（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、ルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ニトロフェニルガラクトース、４− メチルウンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、H₂O₂／テトラメチルベンジジン又はルシフェリンより成る群から選ばれる、請求項35記載の試験キット。 37．リガンドの非存在下では細胞増幅を媒介することのできない野生型遺伝子の突然変異形態を検出する方法であって、（ａ）細胞増幅の可能な条件下で、この遺伝子の突然変異形態のコード領域を含むと予測されるDNA でトランスフェクションされた細胞を、リガンドの非存在下で、又は不適切な量のリガンドの存在下でインキュベートする、ここでこの細胞は細胞増幅のマーカーを含んで成る、そして（ｂ）細胞増幅が可能な十分な時間の後、前記マーカーを含まない細胞に対するこのマーカーを含む細胞の増幅の有無を決定する、ことを含んで成る方法。 38．前記突然変異形態が疾病症状に係っている、請求項37記載の方法。 39．前記突然変異形態がオンコジーンである、請求項38記載の方法。