JPH09500962A - 試験装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サンプル、特に唾液サンプル中の被検体（病原体に対する抗体等）の検出装置は、偽陰性の結果を検出し、サンプルの生存能を決定する手段を有する。本装置は、粒子に連結しかつ試験される種の特徴的な分子（他の抗体等）に結合することにより二成分系複合体を形成することができる第一の抗体または特異的な結合分子；被検体を検出する手段；及び特徴的な分子に結合できる第二の固定された特異的な結合分子からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 試験装置 本発明は、体液のサンプル、特に血清サンプル以外のサンプルにおける被検体 の存在を検出する装置に関するものである。このような被検体は具体的には免疫 グロブリン分子であるが、他のタンパク質であってもよい。 免疫グロブリン分子、またはその断片は、唾液や尿等の血清以外の体液中に存 在することが知られている。特に、ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭクラスの免疫グロ ブリン分子は唾液中に多く存在する。唾液や尿は分泌された体液であり、サンプ ルの収集は容易かつ簡単に行われる。 医学的な診断の分野において、特定の体液サンプルにおける被検体を検出する 試験や装置は数多く知られている。これらの試験としては、特殊なタンパク質ま たは免疫グロブリンの量および／または存在の生化学的なアッセイ；いわゆる免 疫グロブリンに対する「サンドイッチアッセイ(sandwich assay)」および個々の 免疫グロブリンのクラスを特定する電気泳動の使用が挙げられる。 唾液中の免疫グロブリン等の被検体を検出するのに用いられる装置としては、 一端に吸収剤を含むスティックまたは吸着剤パッド材料(adsorbent pad of mate rial)から構成される様々なプローブが挙げられる。このようなプローブは、Ｅ Ｐ−Ａ−０４１８７３９号、ＥＰ−Ａ−０４４２２３１号及びＵＳ−Ａ−５１０ ３８３８号に開示されている。従来のプローブとしては、さらに、唾液中の抗体 を同定できる検出システムが挙げられる。 このようなタイプの診断プローブに関して従来使用されている検出シ ステムは、検出可能な結果を目視できる酵素結合検定または粒子凝集検定(parti cle-agglutinalion assay)を用いるものであった。 しかしながら、診断試験装置には重大な欠点があった。抗体−抗原結合による すべての免疫診断試験は、特殊なサンプルでは偽陰性の結果を生じる。標準的な 酵素結合イムノソルベント検定では、目的とする抗体と特異的に結合する抗原は 固体基材に結合される。目的とする抗体を含むサンプルを添加すると、抗体が結 合している抗原と特異的な複合体を形成する。さらに、結合しない抗体は、洗浄 除去され、標識された抗体を添加することによって試験装置表面に形成された複 合体を検出する。しかしながら、この検定法は、非常に多量の被検体がサンプル 中に存在しないと信頼性に欠ける。臨床医が検定したいと考えている尿や唾液の サンプルは、通常、血清または血漿サンプル中に見られる量より２ないし３倍の オーダー低い量の抗体を含むものである。尿や唾液サンプル中の抗体濃度は様々 な因子の影響を受け、本来ばらつきのあるものである。抗体濃度は、サンプリン グ前に多量の液体を摂取することにより尿の排出量が増加すると、または唾液の 生成がクエン酸または他の酸による刺激によって人工的に増加する際には、減少 する。 サンプル中の抗体濃度が酵素結合検定あるいは同様の試験過程において陽性の 反応が生じるのには不十分である際には、ばらつきによって偽陰性の結果が出て しまう。偽陰性の結果によって、臨床医による医学的な症状の診断が不正確にな ってしまう。試験が特定の病原性の細菌若しくはウィルスに対する抗体、または 自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患に関連した抗体の存在に対するものであ る際には、不適切なサンプルの使用による偽陰性の結果により患者に関する結論 がめちゃくちゃになり、患者に不必要な苦痛を与える。この問題はヒト免疫不全 ウィルス（ＨＩＶ）感染症の場合に特にいえることである。近年、アメリカ合衆 国の食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)（ＦＤＡ）が 免疫診断分野におけるすべての試験装置はサンプルの生存能を示さなければなら ないことを決定したことが報告された。 本発明は、不適切なサンプル(invalid sample)を用いることから生じる偽陰性 の結果を検出する組立て手段(inbuilt means)を備えた装置を提供することによ って上記問題を解決しようとするものである。 本発明の第一の概念によると、基材および基材上のそれぞれ別の位置に以下の 部材からなる、動物種の体液中に存在する被検体の検出装置を提供する： （ａ）試験される種の特徴的な分子(characteristic molecule)に結合すること により二成分系複合体(binary complex)を形成することができる可動性の(mobil e)標識された第一の特異的な結合分子； （ｂ）被検体を検出する手段；及び （ｃ）二成分系複合体(binary complex)またはこの成分に結合できる固定された 第二の特異的な結合分子。 この装置の特長は、特徴的な分子を第二の固定された特異的な結合分子に結合 させる最終段階にある。この段階は、十分な量の特徴的な分子が存在することに より有意な結果を得、これにより特定の試験を容易に確認することができるもの である。試験サンプル中の特徴的な分子の全濃度は容易に定量化３４され、十分 高い量である際には偽陰性の結果が出る危険性が非常に減少する。 ＧＢ−Ａ−２２０４３９８号は、可動性の標識された第一の特異的な結合分子 、被検体を検出する手段及び固定された第二の特異的な結合分子を含む検定装置 に関するものである。しかしながら、第一の特異的な結合分子は本発明において いう試験される種の特徴的な分子にではなく被検体に特異的であるため、上記装 置は本発明の装置とは全く異なるも のである。このことは、ＧＢ−Ａ−２２０４３９８号の装置を用いてはサンプル が生存しているかどうかを決定する、即ち、偽陰性を排除することができないこ とを意味する。 本明細書において、「二成分系複合体(binary complex)」という言葉は、基材 上の粒子に結合する特異的な結合分子および被検体分子等の特徴的な分子によっ て形成される複合体を定義するために用いられる。被検体は抗体であってもよい 。 第一の特異的な結合分子に関して用いられる際の「可動性(mobile)」という言 葉は、第一の特異的な結合分子が基材上に固定されていないことを示すものであ る。 「特徴的な分子(characteristic molecule)」という言葉は、試験されるべき タイプのサンプル中に典型的に認められる、従って、サンプルが生存しているな らば検出可能な濃度で存在する分子を意味するものである。例えば、唾液サンプ ルでは、一般的に検出可能な量のＩｇＧを見付けることができるため、ＩｇＧは 唾液サンプルに関しては好ましい特徴的な分子となる。この場合では、第一の特 異的な結合分子はＩｇＧイソタイプのすべての抗体に特異的に結合する。 本発明の装置は、体液中の被検体を検出するのに適しているが、被検体の濃度 が変化しやすい唾液や尿サンプル中の被検体を検出する際の問題を解決するのに 特に有用である。また、本発明の装置は血液等の他の体液にも使用できる。 本発明の装置で試験される被検体は、細菌(bacterial)、ウィルス、菌類(fung al)若しくは原生動物の病原体、例えば、ヘリコバクター ピロリ(Hericobacter pylori)、ヒト免疫不全ウィルス(Human Immunodeficiency virus）（ＨＩＶ １及び２）、サルモネラ亜種(Salmonella spp.）、ストレプトコッカス種(Strep tococcus species)、ポリオウィル ス(polio virus)、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎表面抗原若しくはＢ型肝炎核抗原、カン ジダ亜種(Candida spp.)、アスペルギルス亜種(Aspergillus spp.)、アメーバ属 (Entamoeba spp.)またはジアルジア亜種(Giardia spp.)に対する抗体が挙げられ る。また、被検体は、自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患に関連した組織ま たは種に特異的な抗体に対する抗体であってもよい。 または、被検体は、抗原、例えば、病原体タンパク質またはホルモン、血液型 を特定するタンパク質または検出する必要のある他のタンパク質若しくは糖タン パク質であってもよい。核酸もまた本発明の装置を用いて検出できる。 さらに、被検体は、特徴的な分子の一部を形成するものでなければならない、 または二成分系複合体を形成する第一の特異的な結合分子に結合する、特徴的な 分子のサブセット(subset)でなければならない。 したがって、被検体が特定のイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥま たはＩｇＡの抗体である場合には、特徴的な分子はそのイソタイプの抗体であり 、第一の特異的な結合分子はそのイソタイプの抗体すべてに結合するように選択 される。同様にして、被検体が糖タンパク質である場合には、第一の特異的な結 合分子はサンプル中に存在するすべての糖タンパク質に結合しこれらを標識する レクチンであり、被検体が核酸である場合には、第一の特異的な結合分子は標識 された特異性の低い核酸プローブであることが好ましい。 被検体は特徴的な分子のサブセットであるため、標識された二成分系複合体の 一部は被検体を含むが、このことは、１つ超の検出可能な標識を必要としないの で、本発明の特に好ましい特徴である。 好ましい実施態様としては、本発明による装置は、ヒトがかかる医学的な症状 (condition)を診断するのに使用できるように設計される。 上記したように、第一の特異的な結合分子は、ＩｇＧまたはＩｇＭのイソタイ プであることが好ましい抗体であることが多い。他のイソタイプの抗体も、必要 であれば、同様にして使用される。第一の特異的な結合分子はポリクローナルま たはモノクローナル源(origin)であってもよく、また、そのままの分子であって もまたは酵素による若しくは化学的な切断によって得られる特異的な部位を含む 断片であってもよく、あるいは、組換ＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を適用す ることによって得られるものであってもよい。 第一の特異的な結合分子は、既知の標識で標識されている。標識によって、特 に、特異的な結合分子が、固定化された際に、目視できる、さもなければ検出す ることができる。粒子が本目的に好ましい標識を構成する。試験装置上で第一の 特異的な結合分子に連結される粒子は、ラテックス、コロイド金属(colloidal m etal)、リポソームまたはポリスチレン等の既知の材料で作製される。発色団、 発蛍光団、および／または他の標識を代わりにまたはさらに用いてもよい。 試験装置において被検体を検出する手段は、被検体に特異的な固定された結合 分子を含む１つ以上の分離した領域からなることが好ましい。被検体は特徴的な 結合分子の一部を形成するまたは特徴的な結合分子のサブセットであるため、被 検体は検出可能なように標識された第一の特異的な結合分子にすでに結合してお り、このため、検出領域で一旦固定されると検出可能になる。 被検体を定量できるので、装置に複数個の被検体検出領域を設けることが特に 有用である。したがって、被検体が少量しか存在しない場合には、第一の検出領 域において固定された結合分子とは相互作用するが、他の検出領域を通過するこ とができる過剰の被検体は存在しない。より多くの被検体が存在する場合には、 被検体の存在量が検出される検出領 域の数によって分かるように、過剰な被検体はさらなる次の検出領域に移動して いく。 または、同一サンプル中の２つ以上の異なる被検体の存在を同時に検出できる ように、それぞれの被検体に特異的な２つ以上の固定された結合分子を試験装置 の離れた領域に配置してもよい。 被検体が上記した抗体の一つである際には、検出領域中の固定された結合分子 は、通常、固定された病原体タンパク質、炭水化物若しくは他の断片、またはヒ ト組織由来のタンパク質、炭水化物若しくは他の断片、またはヒト以外の種由来 のタンパク質、炭水化物若しくは他の断片である。固定された結合分子は抗イデ ィオタイプ抗体であってもよい。 被検体がタンパク質である際には、固定された結合分子は、タンパク質に特異 的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体または検出されるべき特 定のタンパク質に特異的な他の結合分子である。核酸に関しては、固定された結 合分子は特異性の高い核酸プローブであることが好ましい。 被検体以外の特徴的な分子を含む二成分系複合体は固定されずまたはそうでな ければ位置（ｂ）で除去され、被検体は位置（ｂ）で検出され確認場所(verific ation station)として機能する位置（ｃ）に移る。第二の特異的な結合分子は複 合体を固定した後、この複合体は標識によって検出可能になる。第二の特異的な 結合分子は複合体のどの部分にも特異的に結合する。第二の特異的な結合分子が 特徴的な分子に結合することが好ましい；このため、例えば、特徴的な分子がヒ ト抗体のイソタイプである際には、第二の特異的な結合分子は再度抗ヒトＩｇＧ 等の抗ヒト抗体である。他の好ましい結合分子は、第一の特異的な結合分子に関 して上記したのと同様であり、被検体及び特徴的な分子によって選ばれる。 装置は、基材と共にあるいは基材とは別に連続した吸着材料からなるサンプル 収納部位をさらに有していてもよい。このように構造に柔軟性を付与することに よって、サンプルの使用形態による操作の利用可能性を最大限にすることができ る。 試験装置の基材材料は紙または膜から構成される。基材材料は、必要であれば 、炭水化物であってもよく、好ましくはニトロセルルロース材料である。 装置は、体液（またはその成分）が、例えば、毛細管作用により、順次位置（ ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に流れるように構成されることが好ましい。各位置 に体液を運ぶ他の手段も本発明の概念に含まれる。 上述したように、本発明の好ましい概念によると、サンプルを毛細管作用によ り膜または紙基材に沿って吸い上げる。さらなる溶剤は必要としないが、特定の サンプル希釈液によって結果を得る速度を上昇させる、または陽性の試験結果と 共に得られるシグナルを高めてもよい。 本発明の第二の概念によると、以下よりなる、動物の体液中に存在する被検体 の検出方法を提供する： （ｉ）吸着基材上にサンプルを吸着させる段階； （ｉｉ）サンプル中に存在する試験種の特徴的な分子が特異的な結合分子に結合 して二成分系複合体を形成するように、サンプルを可動性の標識された特異的な 結合分子と接触させる段階； （ｉｉｉ）被検体を含む二成分系複合体が被検体に特異的な結合分子に結合して 検出可能な反応生成物を生じるように、被検体を含む二成分系複合体を固定され た被検体に特異的な結合分子と接触させる段階；および （ｉｖ）被検体を含まない二成分系複合体を二成分系複合体と反応することによ って目視で検出可能な生成物を形成する固定された特異的な結 合分子と接触させる段階。 段階（ｉｉ）で使用された標識が粒子である際の検出可能な生成物と同様、段 階（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）における検出可能な生成物は目視で検出できることが 好ましい。 本発明の第二の概念の好ましい態様は、必要な変更を加えて(mutatis mutandi s)、第一の概念と同様である。 本発明を以下の図面を参照しながら実施例によってさらに説明する： 図１は、本発明による装置の斜視図を示すものである。 図１に示されるように、サンプリング装置１０は、吸着材料、好ましくはニト ロセルロース紙、から形成される基材１２、およびこの基材に接着される形態で 、サンプル収納部位１４からなる。基材上には、粒子に連結した抗ヒトＩｇＧ抗 体が含まれる第一の領域１６が配置される。この粒子は、例えば、ラテックス、 コロイド金属、リポソームまたはポリスチレン等の既知の材料で作製される。サ ンプル検出領域１８，２０は、ニトロセルロース基材１２上に固定された被検体 に特異的な抗体を含む。本装置を用いて検出するのが特に好ましい被検体は、ヘ リコバクター ピロリ(H．pylori)に対する抗体であり、したがって、この場合 においては、検出領域１８，２０はヘリコバクター ピロリ(H．pylori)抗体に 特異的な固定された抗原を含む。 本装置の最後の領域は、固定された抗ヒトＩｇＧを含む確認領域２２である。 これは、粒子に結合した抗ヒトＩｇＧと同様であるが、必ずしも同様である必要 はない。 使用する際には、サンプルをサンプル収納部位１４に置くと、基材１２の吸着 性により、サンプルは第一の領域１６に達するまで基材に沿って吸い上げられる 。この時点で、サンプル中に存在するヒトＩｇＧ抗体は粒子に連結した抗ＩｇＧ に結合し、二成分系複合体を形成する。この 二成分系複合体は第一のサンプル検出領域１８に到達するまで基材１２に沿って 吸い上げられ続ける。この領域において、被検体を含む二成分系複合体は固定さ れた抗体に結合し、サンプル検出領域１８上で分離した(discrete)目視できるク ラスター(clustering)を形成する。結合しなかった二成分系複合体は、第二のサ ンプル検出領域２０に達するまで基材に沿って移動し続け、ここで残りの被検体 含有二成分系複合体は固定されて第二の分離した目視できるクラスターを形成す る。最終的には、残りの二成分系複合体は、確認領域２２に到達するまで基材に 沿って移動し、ここでこの領域にある抗ＩｇＧに結合し、さらに分離した目視可 能なクラスターを形成する。この確認領域における目視可能なシグナルによって 、初期サンプルがサンプルが目視でき、それにより陽性の結果を得るのに十分な 量のヒトＩｇＧを含んでいたことが示される。 したがって、明らかに、本発明の装置は簡単に使用でき、これによりサンプル が目視できるものであることを確認する迅速かつ容易な方法が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．基材および基材上のそれぞれ別々の位置に以下の部材からなる、動物種の体 液中に存在する被検体の検出装置： （ａ）試験される種の特徴的な分子に結合することにより二成分系複合体を形成 することができる可動性の標識された第一の特異的な結合分子； （ｂ）被検体を検出する手段；及び （ｃ）二成分系複合体またはこの成分に結合できる固定された第二の特異的な結 合分子。 ２．該体液が唾液、尿または血液である、請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．該被検体が細菌、ウィルス、菌類若しくは原生動物の病原体、例えば、ヘリ コバクター ピロリ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ １及び２）、サルモネラ 亜種、ストレプトコッカス種、ポリオウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎表面抗原若 しくはＢ型肝炎核抗原、カンジダ亜種、アスペルギルス亜種、アメーバ属または ジアルジア亜種に対する抗体、自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患に関連し た組織または種に特異的な抗体に対する抗体、抗原、例えば、病原体タンパク質 またはホルモン、血液型を特定するタンパク質または検出する必要のある他のタ ンパク質若しくは糖タンパク質、または核酸である、請求の範囲第１項または第 ２項に記載の装置。 ４．該特徴的な分子が抗体、タンパク質または核酸である、請求の範囲第１項か ら第３項のいずれかに記載の装置。 ５．該抗体がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＡのイソタイプである、請求の 範囲第４項に記載の装置。 ６．該第一および／または第二の特異的な結合分子が抗体、レクチンま たは核酸プローブである、請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の装置 。 ７．該種がヒトである、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の装置。 ８．該第一の特異的な結合分子が粒子状標識、例えば、ラテックス、コロイド金 属、リポソームまたはポリスチレン粒子で標識されたものである、請求の範囲第 １項から第７項のいずれかに記載の装置。 ９．被検体を検出する手段が被検体に特異的な固定された結合分子を含む１つ以 上の分離した領域からなる、請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の装 置。 １０．検出領域における固定された結合分子が固定された病原体タンパク質、炭 水化物若しくは他の断片、またはヒト組織由来のタンパク質、炭水化物若しくは 他の断片、またはヒト以外の種由来のタンパク質、炭水化物若しくは他の断片、 モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、または特異性の高い核酸プローブ である、請求の範囲第９項に記載の装置。 １１．基材と共にあるいは基材とは別に連続した吸着材料からなるサンプル収納 部位をさらに有する、請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載の装置。 １２．該基材が紙または膜材料から構成される、請求の範囲第１項から第１１項 のいずれかに記載の装置。 １３．該紙または膜基材が炭水化物材料である、請求の範囲第１２項に記載の装 置。 １４．該基材がニトロセルロースである、請求の範囲第１２項に記載の装置。 １５．以下よりなる、動物の体液中に存在する被検体の検出方法： （ｉ）吸着基材上にサンプルを吸着させる段階； （ｉｉ）サンプル中に存在する試験される種の特徴的な分子が特異的な結合分子 に結合して二成分系複合体を形成するように、サンプルを標識された特異的な結 合分子と接触させる段階； （ｉｉｉ）被検体を含む二成分系複合体が被検体に特異的な結合分子に結合して 検出可能な反応生成物を生じるように、被検体を含む二成分系複合体を固定され た被検体に特異的な結合分子と接触させる段階；および （ｉｖ）被検体を含まない二成分系複合体を二成分系複合体と反応することによ って目視で検出可能な生成物を形成する固定された特異的な結合分子と接触させ る段階。 １６．段階（ｉｖ）において固定された特異的な結合分子が二成分系複合体の特 徴的な分子と反応する、請求の範囲第１５項に記載の方法。