JPH09501829A

JPH09501829A - 肝炎ｂ型ウイルスのヌクレオチド配列及びｄｎａの増幅及び検出のための方法

Info

Publication number: JPH09501829A
Application number: JP7504627A
Authority: JP
Inventors: シユピーズ，ウーベ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-07-13
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1997-02-25
Also published as: CA2167056A1; EP0785996A1; AU7326494A; WO1995002690A1; EP0785996A4

Abstract

(57)【要約】検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスの存在及び種類を決定するために有用な肝炎Ｂ型ウイルスの短いヌクレオチド配列。提供する配列は、修飾ポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応を含む種々のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によって増幅できる。提供する配列はまた、標準的ドット−又はレプリカ−ドット操作によってハイブリダイズできる。検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスの検出及び検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスの種類の決定に使用される方法及びキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】肝炎Ｂ型ウイルスのヌクレオチド配列及びＤＮＡの増幅及び検出のための方法技術分野本発明は一般的には、肝炎Ｂ型ウイルス、並びに肝炎Ｂ型ウイルスを検出するための方法及び検査キットに関する。本発明はより特定的には、肝炎Ｂ型ウイルスゲノムのセグメントと相補的なヌクレオチド配列であって、増幅することができ、及び／又は検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定するために使用できるヌクレオチド配列に関する。発明の背景肝炎Ｂ型ウイルス（以後ＨＢＶと称する）のウイルス増殖の検出は、ウイルス複製及び患者感染度の有用な指標であることが判明した。ＨＢＶは、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅと称する新種ウイルスの原型物質である。これらのウイルスは、一本鎖の部分を含む小さい環状ＤＮＡ分子と、ＤＮＡを修復して完全に二本鎖にする内在性ＤＮＡポリメラーゼとを有する。肝細胞に対する強い向性及び持続的感染の発生も、この種のウイルスの特徴である。Ｂ型肝炎の完全ビリオンは、全体の直径が４２ｎｍの複雑な二層構造からなる。２７ｎｍの高電子密度コアは、分子量１．６×１０⁶の環状二本鎖ＤＮＡを含んでいる。コアを包囲する厚さ７ｎｍの外層は、ＨＢｓＡｇと称する生化学的に不均一な複合体からなる。ＨＢｓＡｇは感染した肝細胞が多く産生し、大きさ１７〜２５ｎｍの範囲の球形粒子、及び直径は類似しているが長さは様々である管状フィラメントとして血液中に放出される。コア及び表面抗原に対する抗体は、それぞれ抗ＨＢｃ及び抗ＨＢｓと称する。Ｂ型肝炎感染では第三の抗原−抗体系も観察され、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅと称されている。現在のデータは、ＨＢｅＡｇがＢ型肝炎ビリオンのキャプシドの構成部分であることを示唆している。ＨＢｅＡｇはＨＢＶのヌクレオチドキャプシドと密に相関しているため、ビリオン濃度の、従って血清感染度の信頼できる指標である。現在の慢性Ｂ型肝炎療法はいずれも、ウイルス複製の持続的抑制を目指している。従って、ウイルスＤＮＡの信頼できる直接的測定方法があれば、療法に応答する患者と応答しない患者とを早期に判別する上で極めて有用である。血清ＨＢＶ−ＤＮＡ及びＨＢｅＡｇは、ＨＢＶ複製を監視するための信頼できる指標であると考えられる。ＨＢｓＡｇの主な抗原決定基又はサブタイプは４種類存在し、ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ及びａｙｒと称されている。ａｄｗ及びａｙｒサブタイプは、東南アジア及び極東を除き殆ど世界中で優位を占めているが、東南アジア及び極東ではａｄｒも一般的である。ａｙｒサブタイプはめったに観察されない。基反応性決定基（ｇｒｏｕｐ−ｒｅａｃｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）ａは前記４種類の間で交差反応し、この決定基に対する抗体が生ずると、第二のサブタイプによる再感染が防護される。血清及び他の体液中のＨＢＶを検出するために、種々の検査が使用されてきた。免疫学的検査は、ヒト又は動物の体内で産生された抗体に依存して、前述の特定ウイルスタンパク質を検出する。しかしながら、免疫学的検査は間接的であり、非特異的抗原−抗体反応があると偽陽性という結果をもたらし得る。また、ある状況下では、抗原−抗体検査が血清陰性の人からでも、輸血した血液の受容体がＨＢＶ感染を引き起こす。サザンブロット又はドットブロット操作のようなハイブリダイゼーション技術も使用されてきた。この種の技術は通常、細胞スクレープ又は生検材料からＤＮＡを抽出し、これを固相上に完全ＤＮＡとして直接固定するか、又は分解した後でゲル電気泳動によって制限フラグメントとして固定する操作を含む。固定したＤＮＡは、放射性標識を有する核酸プローブによって検出するのが最も一般的である。しかしながら、標準的ハイブリダイゼーション方法の感度はごく僅かのウイルス複製を認識するほど十分ではないため、感染患者と非感染患者とを判別することができない。この感度の問題を解決するために、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ウイルスＤＮＡ配列を増幅することができる。このようにして得た生成物は、ウイルスの種類を同定するための一般的ハイブリダイゼーション技術、例えばサザンブロットを用いて同定できる。Ｃ．Ｏｓｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：１６３（１９８８）及びＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，２０２号参照。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に記載されており、標準的ハイブリダイゼーション方法の感度の改善に使用されてきた。米国特許第４，５６２，１５９号には、検査試料中のＨＢＶＤＮＡを特異的に検出するためにＰＣＲを使用する方法及びキットが開示されている。実際の操作では、感度レベルは、試料当たり約５０〜１００コピーである。前述のようなスクリーニング方法があるにも拘わらず、輸血後肝炎症例のかなりの割合が、依然として、検出を免れたＨＢＶで汚染された血液の輸血によって発生している。従って、臨床試料中のＨＢＶを同定するための、より正確で、信頼性が高く、半自動化が可能な別の方法が必要とされている。別の標的増幅メカニズムとして、欧州特許出願公開第３２０３０８号又は欧州特許出願公開第４３９１８２号に記載のようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ（商標））も知られている。ＬＣＲ（商標）は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ標的の検出に使用できる。この操作では、標的核酸配列の隣接領域に対して相補的な二つのプローブ（例えばＡ及びＢ）をハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼによって連結する。次いで、連結したプローブを変性して標的から切り離し、その後、最初のプローブＡ及びＢと反対のセンスの二つの別のプローブ（Ａ’及びＢ’）とハイブリダイズする。次いで、前記第二のプローブを連結する。その後の変性／ハイブリダイゼーション／連結サイクルによって、センス（＋）及びアンチセンス（−）両方の２倍の長さのプローブが形成される。ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを繰り返すと、標的核酸の増幅が達成される。ＬＣＲはこれまで、ＨＢＶの検出及び／又は定量に使用されたことはない。従って、増幅が可能であり、検査試料中にＨＢＶがあればこれをＬＣＲの使用によって検出するためのＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖を提供することは有益なことと思われる。オリゴヌクレオチド鎖を組合わせて使用することは、検査試料中のＨＢＶの存在及び特定種類の特異的且つ高感度なｉｎｖｉｔｒｏ診断を可能にするために有利であろう。また、慢性活性肝炎患者の薬物療法の成果を監視するために、検査試料中のＨＢＶの定量法を提供することも有益であろう。発明の概要ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する約１０〜約６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブが、本発明により提供されよう。標的ＨＢＶ配列（配列番号２１、２２、２３、２４及び２５）及びオリゴヌクレオチドプローブは、下記のうちの一つ以上から選択し得る：ｘは特に指示のない限りヒドロキシルである。下線の塩基は、本明細書中に記載のような意図的な不適合である。一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは下記の中から選択する：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９又はこれらの相補配列。非標的ＤＮＡを含む検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを検出するための構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）も提供される。該構成物は、第一上流オリゴヌクレオチドプローブと、第一下流オリゴヌクレオチドプローブとを含み、各プローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、上流プローブの３’末端が下流プローブの５’末端の近傍にハイブリダイズし、標的核酸配列は前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である。本発明の構成物は更に、上流プローブの３’末端及び下流プローブの５’末端が無修正の場合には連結不能であるという特徴も有する。ある実施態様では、末端が連結可能となるように、上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することによって、連結不能末端を修正する。この種の構成物は、下記の対セット又はこれらの相補配列の中から選択し得る：本発明の別の実施態様では、末端が連結可能となるように、標的依存エキソヌクレオリチック物質（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｇｅｎｔ）により下流プローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いで対応する上流プローブを標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、連結不能末端を修正する。この種の構成物は下記の対セット又はこれらの相補配列の中から選択し得る：本発明の第三の実施態様では、下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５’突出部を形成し、プローブの末端を連結可能にすべく前記突出部を除去する修正をなし、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように操作することからなる。検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスのＤＮＡを検出するための構成物であって、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズすることができる約１０〜約６０ヌクレオチドの第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブからなる構成物も提供される。標的核酸配列は前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はその相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択され、前記プローブは、肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的核酸配列の互いに反対側の末端で互いに反対側の鎖にハイブリダイズされる。対は下記の対セット又はその相補配列の中から選択し得る：検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスのＤＮＡを検出するための構成物であって、（ａ）第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが、ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、第一上流プローブの３’末端が第一下流プローブの５’末端の近傍にハイブリダイズされ、標的核酸配列が前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である第一オリゴヌクレオチドセット、並びに（ｂ）第二上流プローブ及び第二下流プローブを含み、どちらのプローブもステップ（ａ）の第一オリゴヌクレオチドセットにハイブリダイズでき、第二上流プローブの５’末端が第二下流プローブの３’ 末端の近傍にハイブリダイズされる第二オリゴヌクレオチドセットであると定義される構成物も提供される。該構成物は、第一上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結可能になるように修正される連結不能末端を有する。ある実施態様では、４個のオリゴヌクレオチドプローブを下記の中から選択する：（ａ）セット４０３Ｇ：配列番号１及び３がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号２及び４がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｂ）セット１８４Ｇ：配列番号５及び７がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号６及び８がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｃ）セット２３１Ｇ：配列番号９及び１１がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１０及び１２がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｄ）セット１８７５Ｇ：配列番号１３及び１５がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１４及び１６がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｅ）セット６６４Ｇ：配列番号１７及び１９がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１８及び２０がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである。これらのセットは下記のように例示される：別の実施態様では、本発明の構成物は、標的依存エキソヌクレオリチック剤によって非ホスホリル化又は不適合塩基を第一下流プローブの５’末端から除去し、次いで標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで上流プローブを延長することにより、末端が連結可能になるように修正される連結不能末端を有する。該構成物は、下記の中から選択した４個のオリゴヌクレオチドプローブを有する：（ａ）セット４０３Ｅ：配列番号１及び２８がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号２７及び４がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｂ）セット２３１Ｅ：配列番号９及び３２がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号３１及び３３がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｃ）セット６６４Ｅ：配列番号１７及び３６がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号３５及び３７がそれぞれ第二上流プローブ及び第二下流プローブである。これらのセットは下記のように例示される：別の実施態様では、本発明の構成物は、標的にハイブリダイズした時に５’末端突出部を有する下流プローブを含み、プローブの末端を連結可能にすべく前記突出部を除去する修正をなし、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように操作することからなる。検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定するための方法も提供する。該方法は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、検査試料中のＤＮＡを本発明の一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプローブは非ハイブリダイズプローブと区別ができるようになっており、ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することからなる。別の実施態様では、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定する方法で連結可能対セットを使用する。この場合は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）検査試料中のＤＮＡを、本発明の一つ以上の上流オリゴヌクレオチドプローブ及び一つ以上の下流オリゴヌクレオチドプローブで、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖とハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションの結果として、無修正のままでは連結不能な末端を発生させ、（ｂ）プローブを連結可能にするために、上流プローブの３’末端を標的依存的に修正し、（ｃ）ハイブリダイズした上流プローブの３’末端をハイブリダイズした下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に連結して、ハイブリダイズしたプローブを非ハイブリダイズプローブと区別できるようにし、（ｄ）ハイブリダイズしたプローブの存在を検出する。更に別の実施態様として、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在をＰＣＲによって決定する方法を提供する。この方法は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）第一オリゴヌクレオチドプローブ及び第二オリゴヌクレオチドプローブを、肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的核酸配列の互いに反対側の末端で互いに反対側の鎖にハイブリダイズし、（ｂ）ハイブリダイズした第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブを延長して、標的配列に対し連続的に相補的にして、ハイブリダイズしたプローブを非ハイブリダイズプローブと区別できるようにし、（ｄ）ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することからなる。ＬＣＲ対は、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスの存否又は量を決定するための方法でも使用される。この場合は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）一本鎖標的核酸配列を含んでいる疑いのある試料を、第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが前記ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの前記標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズすることができ、下流プローブの５’末端及び／又は上流プローブの３’末端がこれらのプローブを標的にハイブリダイズできるように修正されない限り連結不能であるような第一オリゴヌクレオチドセットに暴露し、（ｂ）第一上流プローブの３’末端及び第一下流プローブの５’末端を、これらのプローブが標的配列にハイブリダイズした時にのみ修正し、それによって前記末端を連結可能にし、（ｃ）二つの第一プローブを連結して第一連結生成物を形成し、該第一連結生成物を標的から分離し、（ｄ）該混合物を、ハイブリダイゼーション条件下で、第二上流プローブ及び第二下流プローブからなる第二オリゴヌクレオチドセットに暴露し、二つの第二プローブを連結して第二連結生成物を形成し、該第二連結生成物を第一連結生成物から分離し、ここで連結したプローブは非連結プローブから区別することができるものであり、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返し、（ｅ）標的ＤＮＡの存否又は量と相関している連結オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出するステップからなる。配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列に指向される本発明の一つ以上のオリゴヌクレオチドであって、検出可能なように標識されたオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドを検出するための手段と、試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを増幅する試薬とを含む、肝炎Ｂ型ウイルス検出キットも提供する。図面の簡単な説明第１図は、先行技術で公知のリガーゼ連鎖反応のプロセスを示す説明図である。第２図は、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）１０³ＨＢＶゲノムコピー／ｍｌ患者血清で、ＨＢＶＤＮＡ標的分子の数をＩＭｘ（登録商標）速度（計数／秒／秒）に対してプロットした標準曲線である。ＨＢＶＤＮＡ陽性試料を、ＨＢＶ指標が陰性のヒト血清中に希釈した。血清希釈物は陰性対照としても使用した。血清１ｍｌ当たりのＨＢＶＤＮＡ分子数としてグラフに示す陽性対照希釈物を反復して検査し、平均値をＩＭｘ（登録商標）速度として示した。約２０００〜３０００ゲノムコピー／ｍｌ又は１０〜１５コピー／アッセイにそれぞれ等しい５〜１０ｆｇＨＢＶ−ＤＮＡ／ｍｌ試料の検出限界が得られた。ＬＣＲの結果は後述の実施例１で得た。第３図ａ〜第３図ｃは、ＨＢＶに感染した３人の患者（Ａ、Ｂ、Ｃ）から得られた結果を示すグラフである。ＬＣＲで得られたデータ（実施例７）は、半定量的にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルと明らかに併行していた（第３図ａ）。ＨＢＶ−ＤＮＡレベルは、インターフェロンで治療した患者の逐次的採血試料中でも測定できた（３ｂ〜３ｃ）。これらの患者の血清では、ＨＢＶ−ＤＮＡは、インターフェロン治療開始前は一般的なドットブロットハイブリダイゼーション検査によって明らかに検出可能であったが、治療後は陰性となった。ＬＣＲ検出システムでは、治療に成功した後でも、一般的なハイブリダイゼーションアッセイより数週間長い期間にわたって血清ＨＢＶ−ＤＮＡを検出することができた。発明の詳細な説明定義本発明で使用する用語は下記のように定義される。「アッセイ条件」とは、温度、イオン強度、プローブ濃度等に関するＬＣＲ条件を意味する。これらは当業者に公知である。ＬＣＲは本質的に二つの状態又は条件、即ちアニーリング又ハイブリダイゼーション条件、及び変性条件を使用する。「ハイブリダイゼーション条件」は一般的に、アニーリング及びハイブリダイゼーションを促進する条件であると定義される。しかしながら当業者によく知られているように、このようなアニーリング及びハイブリダイゼーションは幾つかの要素、例えば温度、イオン強度、プローブの長さ及びプローブのＧ：Ｃ含量に依存するものである。例えば、反応温度の低下はアニーリングを促進する。任意の所与のプローブセットについて、融点又はＴｍは幾つかの公知の方法のいずれかによって測定できる。典型的には、アッセイ条件は、融点よりやや低い温度を含む。イオン強度又は「塩」濃度も融点に作用する。なぜなら、小型のカチオンはホスホジエステル主鎖上の負電荷を無くすことにより二重構造（ｄｕｐｌｅｘ）の形成を安定化する傾向を示すからである。典型的な塩濃度はカチオンの種類及び原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。また、高いＧ：Ｃ含量及び長いプローブ長も、二重構造の形成を安定化することが知られている。なぜなら、Ａ：Ｔ対には水素結合が２個しかないのに対し、Ｇ：Ｃ対合は３個の水素結合を有し、またプローブが長いと塩基を互いに保持する水素結合がより多くなるからである。従って、高いＧ：Ｃ含量及び長いプローブ長は、融点を低下させ「アッセイ条件」に作用する。プローブを選択すればＧ：Ｃ含量及び長さが分かり、これを基にして、どのような「アッセイ条件」とするかを正確に決定することができる。イオン強度は典型的には酵素活性に関して最適化されるため、変化させる余地がある唯一のパラメーターは温度であり、特定プローブセット及びシステムの適当な「アッセイ条件」は当業者が決定できる。「変性条件」は、一般的には、二本鎖オリゴヌクレオチドから一本鎖形態への解離を促進する条件であると定義される。この条件には、高温及び／又は低イオン強度が含まれる。これは、当業者には明らかなように、前述のパラメーターと本質的に反対のものである。塩基に関する「相補（的）」という用語は、ＤＮＡの場合には塩基対Ａ及びＴ、Ｃ及びＧを意味し、ＲＮＡの場合には塩基対Ａ及びＵ、Ｃ及びＧを意味する。即ち、ＧはＣに対して相補的であり、ＣもＧに対して相補的である。相補塩基は「適合」であり、非相補塩基は「不適合」である。核酸配列に関しては、プローブ又は標的に対して「相補的」な核酸配列又はプローブとは、その配列がアッセイ条件下で相補プローブ又は標的にハイブリダイズできることを意味する。従って、アッセイ条件下でハイブリダイズさせることができさえすれば、ハイブリダイゼーション可能領域に不適合塩基対を有し得る配列が含まれる。後述のように、プローブＡはプローブＡ’と相補的であり、プローブＢはプローブＢ’と相補的である。「修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」は、上流プローブを対応する下流プローブに標的依存的に連結できるようにする操作を意味する。従って、標的、標的相補配列又はこれらから生成されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプローブのみが「修正」される。好ましくは、ハイブリダイズしたプローブを、標的内に含まれている配列情報に依存する方法で酵素的に修正して、これらのプローブが互いに連結できるようにする。好ましい酵素は、５’から３’への標的依存エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。５’から３’への標的依存エキソヌクレアーゼ活性は、５’から３’への標的依存ポリメラーゼ活性を有する試薬と組合わせて使用することもできる。「修正」は、使用する修飾末端の種類に応じて、幾つかの方法で実施し得る。例えば、本発明のプローブの一部は、１９９１年１０月１日出願の米国特許出願第０７／７６９，７４３号に記載のようなギャップ充填、又は１９９２年８月３日出願の米国特許出願第０７／９２５，４０２号に記載のようなエキソヌクレアーゼ開裂によって「修正」されるように設計した。前記先行特許はどちらも本明細書に参考として包含される。「エキソフォーマット（ｅｘｏｆｏｒｍａｔ）」は、標的依存性エキソヌクレオリチック剤により下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いですぐ近傍の上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結可能にするように連結不能末端を修正する操作を意味する。「エキソヌクレオリチック」という用語は、好ましくは酵素が示す、ＤＮＡ又はＲＮＡ基質の５’末端からの除去活性を意味する。エキソヌクレオリチック活性は、通常はある種のＤＮＡポリメラーゼと協働するエキソヌクレアーゼ又は５ ’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性と協働し得る。後で詳述するように、エキソヌクレオリチック活性は通常鋳型依存性である。「ギャップフォーマット」は、標的にハイブリダイズした上流オリゴヌクレオチドプローブの３’末端を、標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結できるように、連結不能末端を修正する方法を意味する。「連結」は一般的な用語であり、二つのプローブを共有的に結合させる任意の方法を意味する。酵素連結及び光連結（ｐｈｏｔｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）は二つの一般的に使用されている連結方法である。好ましい酵素連結ステップを可能にする条件及び試薬は当業者に公知であり、前出の参考文献に開示されている。本発明で有用な連結試薬としては、Ｔ４リガーゼ、並びに原核生物リガーゼ、例えば大腸菌リガーゼ、及び欧州特許第３２０３０８号に教示されているようなＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）が挙げられる。最後に挙げたリガーゼは、ＬＣＲ（商標）の熱サイクルの間活性を維持することができるため、現在好んで使用されている。熱的に安定なリガーゼがなければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを再添加しなければならない。真核生物リガーゼ、例えばＲａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６）に記載のようなショウジョウバエのＤＮＡリガーゼも有用である。酵素連結に代え得るものの一つは、欧州特許出願明細書第３２４６１６号に記載のような光連結である。「修正がないと連結不能」という用語は、標的依存的に修正していない場合には別のプローブに連結できない上流プローブの３’末端又は下流プローブの５’ 末端を説明する用語である。修正は、この末端を連結可能にするために除去、置換又は別の修飾にかける操作であり得る。連結不能末端の具体例としては、上流プローブの３’に連結することはできないが、連結可能になるように標的依存的に修正することはできる、下流プローブの非ホスホリル化５’末端が挙げられる。別の具体例は、標的の末端に対するプローブの末端又は内部不適合である。プローブがそれぞれの標的にハイブリダイズしたら、これらの不適合を標的依存的に修正してプローブの連結を可能にする。別の具体例は、前出の米国特許出願第０７／９２５，４０２号に記載されている。「近傍（ｐｒｏｘｉｏｍａｔｅ）」は、３’末端及び５’末端が約１〜２０ヌクレオチド、より好ましくは約１〜１０ヌクレオチドの距離内で位置するように、近傍で同一標的鎖にハイブリダイズした後述のような上流及び下流プローブの位置を意味する。近傍は、ギャップ及び突出延長を含み得る。これに対し、「隣接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」プローブは、それぞれの３’及び５’末端が０ヌクレオチドの距離で位置するような位置でハイブリダイズしたものであると定義される。近傍プローブは修正によって隣接する。「上流」及び「下流」プローブは、同一標的核酸鎖の異なる領域にハイブリダイズした二つの異なる非重複オリゴヌクレオチドを意味する。一方のオリゴヌクレオチドの３’末端は他方のオリゴヌクレオチドの５’末端の方向にある。前者は「上流」プローブと称し、後者は「下流」プローブと称する。「プライム（’）」符号は、相補的な塩基又は配列を示すのに使用されている。従ってプローブＡは、Ａ’に対して補末端（ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）ではない末端を有し得るとしても、前述の定義に従い、Ａ’に対して相補的であり得る。Ｂ及びＢ’についても同様である。「適した及び／又は適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）」は、近傍プローブのギャップを充填するために必要なヌクレオチドを意味する。必要とされるヌクレオチドの種類及び量は標的ＤＮＡに依存する。ギャップ充填については後で詳述する。典型的ヌクレオチドは、ＤＮＡの場合にはグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を含み、ＲＮＡの場合にはチミンの代わりに塩基ウラシル（Ｕ）を含む。この用語には、３７ＣＦＲ１．８２２（ｐ）（１）に記載のような前述の塩基の類似体及び誘導体も含まれる。本発明では縮重塩基イノシン（Ｉ）を使用し得るが、本発明のプローブの修飾部分内でＩを使用するのは好ましくない。標的核酸配列本発明のオリゴヌクレオチド配列は、肝炎Ｂ型ウイルス抗原をコードする遺伝子上の特定位置を同定する。既知のゲノム配列を有する種々のＨＢＶ株を野生型ＨＢＶ株（株ａｄｗ）と比較して保存領域を検出し、この保存領域を共通配列として検査した。ＨＢＶゲノムの相同性領域をカバーするオリゴヌクレオチドプローブを最初に検査し、次いで標的依存的に増幅し得る。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、ＨＢＶの表面抗原（Ｓ）をコードする遺伝子上の特定座を同定する。ヌクレオチド配列、及びＨＢＶの表面抗原をコードする遺伝子上の対応する位置の非限定的具体例を下記に示す。一般的なヌクレオチドホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学、及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手できる装置を使用して、所望のプローブを常法により合成する。適当なプローブの５’末端のホスホリル化はリガーゼによる連結に必要であり、キナーゼによって、又は当業者に公知の、もしくは本明細書にいう修正メカニズムとして加えられるような、市販の合成試薬によって実施し得る。一般的には、本発明の方法は、（ａ）選択した一次プローブを標的ＨＢＶＤＮＡに（そして、標的相補配列が存在するような二本鎖の場合には標的相補配列に）ハイブリダイズするステップと、（ｂ）選択したプローブを標的依存的に修正して一次プローブを連結可能にするステップと、（ｃ）修正したプローブを相手に連結して融合即ち連結生成物を形成するステップと、（ｄ）融合生成物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、修正及び連結ステップを繰り返して所望の標的配列を増幅するステップとを反復することからなる。プローブのハイブリダイゼーション概論標的への（及び場合によっては標的相補配列への）プローブのハイブリダイゼーションは、先行技術、例えば欧州特許出願第３２０３０８号、米国特許第５１８５２４３号及び米国特許第４８８３７５０号に記述されている。プローブの長さ、プローブ濃度及び条件の厳密性は総て、ハイブリダイゼーションが生起する度合い及び速度に作用する。プローブは、所望の特異性を与える、即ち試料中の非標的配列にハイブリダイズするのを回避するのに十分な長さを有するのが好ましい。現時点で好ましいのは、約１５〜約４０塩基の長さを有するプローブである。一本鎖プローブ及び連結可能な対セット本明細書で定義されているような一本鎖プローブ及び対セットのハイブリダイゼーションは、効果的なハイブリダイゼーション選択性、好ましくは結合プローブの特定長さに対する最大のハイブリダイゼーション選択性が得られるように選択した温度で実施する。有利なことに、本発明のプローブ及びプローブ対には通常中庸な温度を使用する。温度は一般的には約２０℃〜約９０℃、より一般的には約３０℃〜７０℃、好ましくは３７℃〜６０℃にする。改変ＰＣＲ本明細書で「短いＰＣＲ」又は「ｓＰＣＲ」と称する改変形態ＰＣＲのプライマーのためのハイブリダイゼーションは、当業者に公知のものである。典型的条件は、下記の実施例１１及び１２に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、一本鎖核酸標的へのプローブの結合を可能にするものでなければならない。公知のように、プローブは、二重配列に沿ったこれらプローブの相対位置が、一つのプローブから合成した延長生成物が、該延長生成物を鋳型（相補配列）から分離した時に他方のプローブを延長するための鋳型として機能して所定長さの複製鎖を形成するような位置となるように選択する。リガーゼ連鎖反応標的への、そして場合によっては標的相補配列へのＬＣＲ（商標）プローブセットのハイブリダイゼーションは、先行技術、例えば欧州特許出願第３２０，３０８号及び欧州特許第４３９，１８２号に記述されている。プローブは化学量論的に反応すると予測されるため、ほぼ等モルの濃度で加える。各プローブは約５ナノモル（ｎＭ）〜約９０ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約３５ｎＭの濃度で存在させる。これは、標準的反応量５０μｌの場合には、約３×１０¹¹〜約１×１０¹²分子の各プローブの添加に等しい。約５×１０¹¹分子／５０μｌから始めるのがよい。各反応に使用する最適プローブ量は、実施しなければならないサイクルの数及びもちろん反応量によっても変化する。プローブ濃度は、所与のサイクル数で最適シグナルが得られるように、当業者が容易に決定できる。条件の厳密性は、温度、溶媒及び他の要素に依存することが当業者に公知である。これらの要素のうちで最も簡単に制御できるものはおそらく温度であるため、通常ＬＣＲ性能は温度を変えて調節する。本発明の実施に必要な厳密性条件は一般的なＬＣＲの条件と変わらないため、これ以上の詳細説明は無用と思われる。実際日常的に実施する人は下記の実施例に従えばよい。典型的には、任意にアセチル化ＢＳＡを加えたＬＣＲ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、２０ｍＭＫＣ１、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ及び任意的な０．５ｍＭＮＡＤ⁺）中で反応を実施した。温度サイクルは、例えばＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ（ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）のサーマルサイクラー又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＣｙｃｌｅｒＲｅａｃｔｏｒ（商標）（Ｅｒｉｃｏｍｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから市販）を用いて実現した。プローブの修正本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、「ギャップ充填」フォーマット又は「エキソ」フォーマットで修正し得る。これら２種類の修正を以下に説明する。ギャップ充填フォーマットによる修正ギャップ充填法で修正したプローブは、プローブのうちの一つ以上から短い塩基配列を除去した結果、二つのプローブを標的（もしくは標的相補配列又はこれらから生成したポリヌクレオチド）にハイブリダイズした時に、一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間に凹部ないしギャップが残されるために生じる修飾末端を有する。ＬＣＲによって標的を増幅するためには、プローブ間のギャップを充填しなければならない（即ち、修飾「修正」しなければならない）。ギャップフォーマットではこの操作を、ポリメラーゼ又は逆転写酵素と、ギャップと反対側の標的鎖に対して相補的な過剰なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとを用いて実施できる。この実施態様では、本発明は、（ａ）プローブを標的ＨＢＶに（そして、標的相補配列が存在するような二本鎖の場合には標的相補配列に）ハイブリダイズさせるステップと、（ｂ）少なくとも一つのギャップを埋めるために少なくとも一つのプローブを延長するステップと、（ｃ）延長したプローブを隣接プローブに連結して融合即ち連結生成物を形成するステップと、（ｄ）融合生成物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、延長及び連結ステップを繰り返して所望の標的配列を増幅するステップとを反復することからなる。シングルギャップ（ＳＧ）形態及びダブルギャップ（ＤＧ）形態の両方を含むこの実施態様では、「修飾末端」を形成する「ギャップ」を、ポリメラーゼ又は逆転写酵素を用いて修飾プローブの一方又は両方を延長することにより修正する。ＨＢＶＤＮＡ標的にハイブリダイズしたプローブの延長は通常、当業者に公知のように、ＤＮＡポリメラーゼ又はクレノウフラグメントによって行う。ＲＮＡ標的の場合は、延長を逆転写酵素によって行う。逆転写酵素の具体例としては、当業者が一般的に入手できる鳥類骨髄母細胞ウイルス（ＡＭＶ）及びＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）由来のものが挙げられる。ある種のＤＮＡポリメラーゼも、特定条件下でＲＮＡを鋳型として認識する。勿論、熱的に安定であり、ＬＣＲに必要な高温サイクルに耐えることができる延長試薬を使用することが好ましい。熱的に安定でない延長試薬は、原則として各ＬＣＲサイクル毎に再添加しなければならない。この種の熱安定性ポリメラーゼの具体例としては現在のところ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）（Ｃｅｔｕｓ−ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能）、Ｔｈｅｒｍｕｓポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，“ＭＢＲ”から入手可能）、及びＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又は熱安定性であることが知られている他の種に由来する組換え又は精製野生型ポリメラーゼが挙げられる。このような延長による修正では、ギャップ領域内の標的の塩基と相補的なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を反応混合物中に存在させる必要がある。より特定的には、第１図に基づいて説明すると、配列Ｘ_nを有するギャップの場合は、供給すべきｄＮＴＰはｄＸ’ＴＰと称する。Ｘ’はギャップＸ_n内の各塩基の相補塩基を意味する。ｄＮＴＰは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む多くの業者から市販されている。延長は、延長したプローブが隣接プローブに当接してこれに連結できるように、正確に連結点で終結しなければならない。そのためには「ストップベース（ｓｔｏｐｂａｓｅ）」を使用する。Ｑ’と称するストップベース（第１図参照）は対応する相補塩基Ｑに関して定義され、Ｑと相補的なｄＮＴＰを反応混合物から省略する、即ちｄＱ’ＴＰを反応混合物から省略することにより得られる。このようにして、４個のｄＮＴＰのうち相補的な３個を反応混合物に加えるために、４個の塩基のうち３個のみからなるセットＮから如何にしてギャップ配列用塩基を選択すべきかが理解される。第四のｄＮＴＰであるｄＱ’ＴＰが反応混合物中に存在しなければ、延長は所望の連結点で終結する。従って、Ｑ’が下流プローブの第一塩基であり、ストップベースをコードする標的上の塩基がギャップに隣接する第一塩基ということになる。ポリメラーゼ又は転写酵素による延長は５’から３’への方向で生起する。従って、両方の上流プローブ（第１図、プローブＡ及びＢ’）の３’末端は、延長を妨害するものがなければポリメラーゼにより延長することができる。延長は、鋳型によって必要とされる次の塩基が反応混合物中に存在しない時に終結する。即ち、プローブＡは、標的鎖上でストップベース相補塩基（Ｑ）と遭遇するまでギャップＸ_nを通して延長される。同様にして、プローブＢ’は、（標的相補配列上又は再構成されたＡ：ＢのＡ側の半分で）ストップベース相補塩基（Ｑ）に遭遇するまで、ギャップＹ_mを通して延長される。プローブＡ’もＢも、Ａ又はＢ’の延長鋳型として機能することはない。従ってプローブＡ及びＢ’は、標的に（又は先行サイクルで得られた再構成ポリヌクレオチド生成物に）ハイブリダイズした時にのみ延長される。前述のように、Ａ及びＢ’の延長は、延長したプローブが下流プローブＢ及びＡ’の５’末端に連結できるように、それぞれのギャップの末端（即ち連結点）で終結することが重要である。従って、反応混合物から、ギャップＸ_n及びＹ_mの５’末端のすぐ隣の塩基（Ｑ）と相補的なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを抜く。勿論、同一塩基で両方向の延長を停止する必要はない。ギャップのいずれかを充填する必要がなければ、異なる塩基を使用できる。この実施態様では、実際の連結点が常に下流プローブ（Ａ’及びＢ）の５’末端にあることは明らかであろう。これらの連結点がストップベースＱ’の位置でもあることは単なる偶然ではない。従って、ギャップＸ_n及びＹ_mは任意の塩基数の長さを有し得る。即ち、ｎは１以上の任意の整数であり得、ｍは０より大きい任意の整数であり得る。しかしながら、どのギャップをＸ_nにし、どのギャップをＹ_mにするかはひとまず任意に選択する。但し、ｎ及びｍの両方が０であってはならない。ギャップは同じ長さを有する必要はない。即ち、ｍはｎに等しくなくてもよい。ｍがゼロに等しい場合は、ダブルギャップ形態でなくなり、特定のシングルギャップ形態に変化する。これは、本明細書で開示する実施態様では使用されない。塩基Ｘに関する唯一の制約は、４種の塩基のうち任意の１〜３種からなるセットＮから選択しなければならないという点にある。同様にして、塩基ＹはセットＭから選択する。少なくとも一つのストップベースＱ’を確保しなければならないため、それぞれＸ及びＹに関して可能な塩基を表すセットＮ及びＭの組合わせは、４種の塩基のうちの３種以下しか含むことができない。従ってＹは、少なくとも１種の塩基がセット「非Ｎ非Ｍ」中に残る限り、４種の塩基のうちの任意の３種〜０であってよい。セットＮが４種の塩基のうちの３種より少ない塩基からなる場合には、Ｙは、対応する相補塩基がプローブ延長終結用ストップベースＱ’として機能し得る少なくとも１種の塩基が残存する限り、Ｎ内に存在しない塩基であってよい。単一のストップベースを使用して、ギャップＸ_n 及びＹ_m両方の延長を終結することができる。配列Ｙ_mの第二の制限はｍがｎに等しい場合に生じる。ギャップの長さが互いに同じである時は、配列Ｙ_mは配列Ｘ_nと相補的であってはならず、又はプローブＡの３’末端及びＢ’が「付着末端」を構成する。付着末端は、連結及び増幅が生起するようにプローブＡがプローブＢ’にハイブリダイズする標的非依存性二本鎖複合体の形成を可能にする。ｍがｎに等しい場合は、Ｙ_mがＸ_nと相補的ではないことが好ましい。即ち、プローブＡ及びＢ ’の末端は少なくとも、同じ長さを有し得るが相補的ではない「平滑末端（Ｓｌｉｐｐｅｒｙｅｎｄ）」でなければならない。本発明の好ましい実施態様の一つでは、第四プローブＢ’が、標的内のＸ_n配列ギャップと同じ長さを有するＸ_nの３’末端配列を含む。しかしながら、この構造は本発明にとって必須ではない。なぜなら、ギャップはプローブ間に形成されさえすればよいからである。従って、第四プローブＢ’の３’末端は、第二プローブＢに対する３’凹末端（ｒｅｃｅｓｓｅｄｅｎｄ）が存在しない限り、配列Ｘ_nの３’末端の手前で停止し得る。延長は５’から３’に向かって生起し、且つｄＸ’ＴＰは（Ｘ_nを通して延長するために）とにかく存在していなければならないため、プローブＢ’は、第一プローブＡがＸ_nギャップを通して延長されるのと同様に、ギャップ（Ｙ_m及びＸ_n残部の両方）を通して延長される。エキソフォーマットによる修正この実施態様では、連結不能末端が下流プローブの非ホスホリル化５’末端であり得る。この末端は、上流プローブの３’末端に連結することはできないが、標的依存的に修正して連結可能にすることはできる。連結不能末端の別の具体例としては、標的の末端に対するプローブの末端不適合又は内部不適合が挙げられる。この種のプローブがそれぞれの標的にハイブリダイズしたら、短い塩基配列を除去し、その結果二つのプローブを標的（もしくは標的相補配列又はこれらから産生したポリヌクレオチド）にハイブリダイズした時に一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間に凹部又はギャップが残されるようにして、一つ以上のプローブの５’末端を修飾することにより、前記不適合を標的依存的に修正する。この修飾は、エキソヌクレオリチック活性、好ましくはＤＮＡポリメラーゼに基づく５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって修正する（Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．編，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。これらのＤＮＡポリメラーゼは、適当なデオキシヌクレオチドの存在下で、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブの３’ヒドロキシル末端から合成を開始し、ＤＮＡ標的鋳型に沿って進み、このプロセスでハイブリダイズしたＤＮＡ配列を加水分解し、置換する。ＤＮＡ配列のエキソヌクレオリチック分解の結果、モノ、ジ及びより大きいヌクレオチドフラグメントが放出される。典型的には、このエキソヌクレアーゼ活性は合成依存性である。従って、合成の終結は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性の終結をもたらす。合成を調節的に終結させる方法の一つは、ＤＮＡ合成に必要な４個のｄＮＴＰのうちの１個又は数個を除去して、ｄＮＴＰプールを制限することからなる。ＤＮＡポリメラーゼによる合成は、ｄＮＴＰプールから除去されたデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートと相補的な標的上の鋳型塩基（ストップベース）に遭遇するまで続く。分解及び合成はその時点で終了する。ＬＣＲでは、修正しなければ連結不能である５’末端を含む下流プローブを使用する。修飾は、プローブの標的非依存性連結を阻止する。また、隣接ＬＣＲプローブは標的核酸配列の存在下でハイブリダイズはするが、連結可能にはならない。標的ＤＮＡに含まれている配列情報を、連結不能末端を修正するための鋳型として使用する。合成依存性鎖置換５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して上流プローブを延長し、標的核酸を鋳型として下流プローブを加水分解する。上流プローブの延長及び下流プローブの加水分解は、ＤＮＡ合成に必要な４種のｄＮＴＰのサブセットを使用することにより、相補ｄＮＴＰが存在しない標的内の鋳型塩基に遭遇した時点で合成及び加水分解が停止するように制御し得る。その結果得られる下流プローブは、延長した上流プローブの３’ヒドロキシル末端に隣接することになる５’ホスフェートで終結する。この方向の隣接ＤＮＡ配列は、ＤＮＡリガーゼによる連結のための適当な基質である。結果としてプローブ間に生じたギャップは充填の必要がある（即ち、修飾を修正しなければならない）。この修正は、ギャップ充填フォーマットについて説明したように行う。連結一般的には、修正に次ぐステップは、一方のプローブを隣接プローブに連結することからなる。即ち、修正した各第一上流（又は一次）プローブを対応する第一下流プローブに連結し、修正した各第二下流（又は二次）プローブを対応する第二上流プローブに連結する。「隣接」プローブは連続方向で標的にハイブリダイズできる二つのプローブのうちのいずれか一つである。前記二つのプローブのうちの一方は、ホスホリル化５’末端が相手のプローブの３’ヒドロキシル末端に当接した状態で存在する。「隣接」プローブは、修飾末端を前述のように標的依存的に修正した時に形成される。二つの隣接プローブを共有的に結合するための好ましい方法は酵素連結である。但し、「連結」は一般的な用語であり、二つのプローブを共有結合する任意の方法を含むと理解されたい。好ましい酵素連結ステップを可能にする条件及び試薬は当業者に公知であり、前出の参考文献に開示されている。本発明で有用な連結試薬としては、Ｔ４リガーゼ並びに原核生物リガーゼ、例えば大腸菌リガーゼ及び欧州特許出願第３２０３０８号に教示されているようなＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）が挙げられる。最後に挙げたリガーゼはＬＣＲの熱サイクルの間活性を維持することができるため、現在好んで使用されている。熱的に安定なリガーゼが存在しないと、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを再添加しなければならない。真核生物リガーゼ、例えばＲａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６）に記載のようなショウジョウバエのＤＮＡリガーゼも有用である。連結後は、一般的ＬＣＲの場合のように融合再構成プローブを標的から解離し（例えば熔融し）、この操作を数サイクル繰り返す。反復サイクル数は１〜約１００とし得るが、現時点で好ましいのは約１５〜約７０である。プローブは、相補的（二次）プローブにハイブリダイズした時に、所期の連結点と反対側の末端が別の望ましくない連結反応に関与できないように設計することが望ましい。即ち、連結可能な付着末端又は平滑末端は回避しなければならない。この種の末端を使用する必要がある時は、５’末端ホスフェートを回避、除去又はブロックする。この操作は、オリゴヌクレオチドプローブ（通常は５’末端ホスフェート基を有していない）の合成を介して、又は（例えばＤＮＡの制限消化によって産生したオリゴヌクレオチドから）末端ホスフェートを除去するためのホスファターゼ酵素の使用を介して実施することができる。あるいは、少なくとも一方のプローブの末端を後述のように「フック」又はマーカー部分でブロックすることにより、プローブの「間違った」外側末端の連結を防止することもできる。前記技術のいずれも使えなければ、プローブの外側末端を、これらのプローブが結合した時に指数増幅用鋳型として機能しないようにずらすことができる。特に好ましい形態では、ハプテン又は「フック」を、少なくとも２個のプローブの使用可能な外側末端（融合生成物の互いに反対側の末端）、好ましくは４個のプローブ全部の外側末端に取り付ける。「フック」は、特異的リガンド−受容体親和性を有する任意の部分からなる。例えば、ハプテン又はポリヌクレオチドのセグメントであってよい。一つのプローブにフックを結合し、同一方向の別のプローブに標識を結合してもよい。連結によって標識が親和性部分に結合し、分離後に、分離した標識を固相上で測定できる。検出増幅した標的の存在は、任意の方法で検出できる。一つの方法は、特定の大きさの反応生成物を分子量によって弁別することからなる。分子量弁別方法の具体例としては、アフィニティ標識、組成、ゲル濾過、沈降速度、浸透圧又はゲル電気泳動が挙げられる。特に好ましい方法は、使用するヌクレオチドが³²Ｐのような放射性標識で標識されている場合に特に有用なゲル電気泳動である。検出は、典型的には、分離後に分離フラクション中の標識量を測定することによって実施する。勿論、分離フラクション中の標識は、系に添加した標識の総量を知り、非分離フラクション中に存在する量を測定することによって、引き算で測定することもできる。分離は、電気泳動、クロマトグラフィー又は下記の好ましい方法によって実施し得る。別の方法としては、検出可能なシグナルを発生することができる物理的標識でヌクレオチドを標識する方法が挙げられる。使用し得る種々の「シグナル発生化合物」（標識）にとしては、色原体、酵素のような触媒、フルオレセン及びローダミンのような発光化合物、化学発光化合物、放射性元素及び直接視覚標識がある。酵素の具体例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。特定標識の選択は決定的に重要ではないが、単独で、又は１種類以上の別の物質と協働して、シグナルを発生できるものを選択する。ハプテンは様々なものが知られており、本発明では実質的に任意のハプテンを使用し得る。本発明が必要とするのは、特異的結合相手が既知であるか又は製造できるものであること（ハプテンの定義に基づく特性）と、ハプテンがハイブリダイゼーションを妨害しないようにプローブに結合できることだけである。プローブにハプテンを付加する方法は当業者に多数知られている。ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ）はどちらもプローブ標識技術を開示し商品化している。例えば、３’−アミン−ＯＮＣＰＧ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて３’オリゴ末端に一級アミンを付加することができる。また、ＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒII（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて５’オリゴ末端に一級アミンを付加することもできる。アミンは、一般的な活性化及び結合化学手法を用いて、種々のハプテンと反応させることができる。また、１９９０年１２月１１日及び１９９０年１２月２０日それぞれ出願された米国特許同時係属出願第６２５，５６６号及び第６３０，９０８号は、プローブをそれぞれ５’末端及び３’末端で標識する方法を教示している。前記二つの同時係属出願は参考として本明細書に包含される。ハプテンの非限定的具体例としては、多くの薬剤（例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、サリチル酸塩等）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；並びに修飾ヌクレオチド、例えばブロモウラシル、及びＮ−アセチル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の導入によって修飾した塩基等が挙げられる。本明細書に記載の特定ハプテンは、いずれも１９９１年１２月１７日に出願された同時係属共有米国特許出願第０７／８０８，５０８号（アダマンタン酢酸）及び米国特許出願第８０８，８３９号（カルバゾール及びジベンゾフラン）、どちらも１９９２年３月２７日に出願された米国特許出願第０７／８５８，９２９号及び米国特許出願第０７／８５８，８２０号に開示されている（本明細書では、これらをまとめて「ハプテン出願」と称する）。前記ハプテン出願の各々の開示全体は本明細書に参考として包含される。二つ以上の標的、例えばＨＢＶ及びＨＣＶを検出するための手順は、１９９２年３月３１日出願の米国特許出願第８６０，７０２号に詳述されているように、２種類の標識、即ち共通標識及び固有標識を含み得る。どちらの標識も検出標識として使用し得る。説明を簡単にするために、ハプテンを共通標識及び固有標識の両方として使用しながら実施態様を説明する。勿論、ハプテンのうちの少なくとも一つ、特に共通ハプテンに代えて、別の標識も容易に使用できる。好ましい標準的ＬＣＲ手順では、第一ハプテンを用いて、再構成された分子を捕捉し分離する。第二ハプテンは、再構成された複合体をシグナル発生体と結合するのに使用する。この操作は、欧州特許出願公開第４３９−１８２号に詳述されている。例えば、第一の一次プローブの５’末端及び第一の二次プローブの３ ’末端にフルオレセンを結合する。更に、異なるハプテン、例えばビオチンを、第二の一次プローブの３’末端及び第二の二次プローブの５’末端に結合する。このようにして、再構成分子が二重構造になると、二重構造の一方の末端に二つのビオチンが存在し、他方の末端に二つのフルオレセンが存在する。抗フルオレセンのコーティングを有する固相を用いて、ビオチンを有する非連結プローブから再構成分子を分離する。（フルオレセンを有する非連結プローブも捕捉される。）酵素のような検出可能なシグナル発生体で標識したアビジン又は抗アビジンを用いて、分離複合体を検出する。検査試料は、ＨＢＶを含んでいる疑いのある任意の生物学的物質であってよい。例えば、検査試料は、ヒト体組織、又はＨＢＶを含んでいる疑いのある細胞を含む検査試料であり得る。この用語は、実質的に任意の液体試料を意味し得る。検査試料は、任意の所望の供給源、例えば体液、例えば血液、唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、羊水等に由来し得る。液体検査試料は使用前に、血液からの血漿の調製、粘稠液の希釈等の予備処理にかけ得る。予備処理の方法としては、分離、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化及び試薬の添加も挙げられる。体液以外に、水、食品等のような液体試料も使用できる。また、固体検査試料を、液体媒質を形成するように改質した後で使用することもできる。キット本発明の方法で使用する試薬は、診断キットに組込むことができる。診断キットは標識オリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドが非標識の場合は、特異的標識試薬もキットに組込み得る。キットは更に、特定のプローブ設計及びギャップ充填もしくはセキソ充填の必要に応じて、ヌクレオシドトリホスフェート、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰの組合わせ、即ちｄＮＴＰのうちの３種以下の組合わせを適当に包装したものも含み得る。キットは更にポリヌクレオチドポリメラーゼを含み得、上流及び下流配列を共有的に結合する手段、例えばリガーゼも含み得る。これらの試薬は、典型的には、別個の容器に入れてキットに組込むが、反応性及び保存性が許せば、同一容器内に包装することもできる。キット内の種々の薬剤の相対量は、本発明で生起する必要がある反応を最適化する試薬濃度を得るために、且つアッセイ感度を最適化するために、広い範囲で変化させ得る。キットは更に、分析対象を変性させるための変性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、陰性及び陽性対照並びにアッセイを実施するための説明書も含み得る。ここで実施例を挙げて本発明を説明する。以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、前述の一般的説明及び詳細説明と協働して、本発明の理解を更に深め、本発明の好ましい実施態様の特徴を明らかにするためのものである。実施例材料及び方法実施例で使用する下記の用語は、下記の定義に従う商標、商品名又は化学的略号である：ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＥＤＴＡ：金属キレート化剤であるエチレンジアミンテトラ酢酸ＥＰＰＳ：緩衝液として使用される［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン −Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）］酸の化学的略号ＦＩＴＣ：蛍光ハプテン誘導体であるフルオレセンイソチオシアネートの化学的略号ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィーＭＥＳ：緩衝液である［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］の化学的略号ＩＭｘ（登録商標）：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）を実施するための本出願人の自動化装置の商標Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる緩衝液下記の表は、以下の実施例で使用するプローブ及び／又はプライマーを示すものである。各配列は、特定実施例でそれぞれの配列番号によって示されている。任意の種類の細胞、スワブ、スミア、血液又は組織を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のそれぞれの細胞懸濁液の遠心分離により、試料として調製し得る。通常は、ペレットを１００μｌの１０ｍＭＮａＯＨに再懸濁し、１００℃で５〜１０分間加熱する。沸騰後、試料を再度遠心分離し、細胞残渣を除去する。上清の一部を、５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び５×１０¹¹分子の本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物に加える。捕捉リガンドオリゴヌクレオチドＡ及びＡ’は、カルバゾール及び／又はＦＩＴＣで誘導体化し得る。プローブＢ及びＢ’は、アダマンタン又はビオチンをシグナル部分として誘導体化し得る。ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、選択したプローブの５’末端をホスホリル化する。試料及び反応混合物を入れた管の上部を鉱油で覆い、約３分間沸騰させる。その後、管を１分間８５℃に維持し、更に１分間５０℃に維持する。反応混合物にＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（Ａｂｂｏｔｔ）及びＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）を加える。次いで管を、サーマルサイクラーで、又は二つの水浴の間で、交互に８５℃及び５０℃ にする。アッセイのために標的ＨＢＶＤＮＡを増幅するには、通常３０回のＬＣＲサイクルで十分である。反応生成物を検出するために、混合物を鉱油層から分離し、同量の蒸留水で希釈する。反応混合物の一部をＩＭｘ（登録商標）分析器の使い捨て反応セル内に充填する。検査のそれぞれの試薬、例えば試料希釈緩衝液、メチルウンベリフェロンホスフェート、抗ビオチンアルカリホスファターゼ結合体、抗フルオレセンコーティングした粒子等をＩＭｘ（登録商標）分析器に充填する。３０分以内でＭＥＩＡが完了した後、アルカリホスファターゼ結合速度を、計数／秒／秒で表される反応速度から算出する。ポリメラーゼの量は下記のように定義される単位で表す：１単位の酵素は製造業者（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）によって定義されている通りである。リガーゼ酵素の単位は本明細書で下記のように定義される：１ｍｇの純度９５％ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼをもって約１×１０⁸単位の比活性を有するものとする。これは正確には標準化されておらず、２０％も変化し得、最適化は当業者によって実施され得る。ＬＣＲ（商標）条件総ての反応は、特に指摘のない限り、ＬＣＲ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、２０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ）中で実施した。温度サイクルは、例えばＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ（ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）のサーマルサイクラー、又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＣｙｃｌｅｒＲｅａｃｔｏｒ（商標）（Ｅｒｉｃｏｍｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから市販されている）で実施した。反応は、アリコートを停止緩衝液（８０％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ：ｖ）キシレンシアノール及び０．０５％ブロモフェノールブルー）中に移すことによって停止させた。連結生成物及び非連結生成物を、８０ｍＭＴｒｉｓ中８．３Ｍ尿素、８０ｍＭホウ酸ｐＨ８．０、１．０ｍＭＥＤＴＡを含む１６×２０×０．０４ｃｍの１５％ポリアクリルアミドゲル上で分割した。ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、オートラジオグラフを鋳型として用いて連結プローブ及び非連結プローブを切除し、各バンドの放射能の量を液体シンチレーション計数で測定した。連結プローブの放射能の割合を、各レーンの総計数の関数として計算した。実施例１配列番号１、２、３及び４（表Ａ参照）からなるプローブセット４０３Ｇを用いて、ＬＣＲ緩衝液を入れた０．５ｍｌポリプロピレン管内でＬＣＲ（商標）を実施した。ＨＢＶＤＮＡを含んでいる検査試料（２．８×１０⁷分子ＨＢＶＤＮＡ／ｍｌ）を、ＨＢＶ指標が陰性のヒト血清中に希釈した。この血清希釈物は陰性対照としても使用した。各プローブは５×１０¹¹分子／反応で存在させ、ＤＮＡリガーゼ最終濃度は５０００単位、ＤＮＡポリメラーゼ最終濃度は１．０単位とした。試料を鉱油で覆い、８５℃で３０秒のインキュベーション、次いで５０℃で２０秒のインキュベーションからなる温度サイクルにかけた。グラフでは血清１ｍｌ当たりのＨＢＶＤＮＡ分子として示した陽性対照の希釈物を２個ずつ検査し、平均値を下記の表１にＩＭｘ（登録商標）速度として示した。直線範囲の計算値は第２図に直線グラフとして示す。軸値は、反応当たりの分子数（表１）に反応のｍｌ数（×２００）を掛けることにより算出する。実施例２前記実施例１に記載の条件下で、ＨＢＶＤＮＡ用プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３、４）を用いてＬＣＲを実施した。結果は下記の表２に示す。実施例３前記実施例１に記載の条件下で、プローブセット２３１Ｅ（配列番号９、３１、３２及び３３）及び２３１Ｇ（配列番号９、１０、１１及び１２）を用いてＬＣＲを実施した。プローブセット３２１Ｅの場合はサイクルを４５回実施した。結果は下記の表３に示す通りである。プローブセット２３１Ｇの場合は、温度８５℃及び６０℃でそれぞれ３０秒及び２０秒のサイクルを４０回実施した。結果は表４に示す。実施例４前記実施例１に記載の条件下で、プローブセット６６４Ｇ（配列番号１７、１８、１９及び２０）及び６６４Ｅ（配列番号１７、３５、３６及び３７）を用いてＬＣＲを実施した。６６４Ｇの結果は表５、６６４Ｅの結果は表６に示す。実施例５実施例１に記載の条件下で、但し１３５０単位のリガーゼを使用して、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施した。ＨＢＶ−ＤＮＡに対するこれらのプローブの特異性を、健常者、非Ｂ型肝炎患者及び自己免疫性肝炎患者に由来する３１個の血清試料を用いて明らかにした（下記の表６参照）。検査結果が陰性の各患者は、肝機能検査で明らかなように、ＬＣＲ方法を用いると偽陽性がないことを示している。各検査試料は血清試料当たり２５０分子のＨＢＶＤＮＡを有していた。健常者は肝疾患がなく、非Ｂ型肝炎患者は肝疾患陽性兆候を示し、自己免疫性肝炎患者は肝炎様症状と肝臓欠陥の臨床的兆候とを示した。実施例６Ｂ型肝炎に感染した（ＨＢｓＡｇ＋）種々の患者群に由来する２０個のヒト血清試料を使用し、実施例１に記載の条件下で、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）及び１８４Ｇ（配列番号５、６、７及び８）を用いてＬＣＲを実施した。結果は下記の表７に示す。試料は二回反復して検査し、平均値を信号雑音（Ｓ／Ｎ）比で示した。検査試料の評価基準（−、＋／−、＋又は＋＋）は、ＩＭｘ（登録商標）バックグラウンド（ｂｇ）速度に基づいて定義される。０〜１．５×ｂｇ速度は陰性（−）と定義され、＞１．５〜３．０×ｂｇ速度は中間（＋／−）と定義され、３．０−２０×ｂｇ速度は弱陽性（＋）と定義され、＞２０×ｂｇ速度は陽性（＋＋）と定義される。ＬＣＲ以外に、ＡｂｂｏｔｔＨＢＶＤＮＡ検査（ＤＮＡ溶液ハイブリダイゼーションアッセイ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて試料を評価した。試料は総てＨＢｓＡｇ陽性であり、ＨＢｅＡｇ又は抗ＨＢｅの結果が含まれる。検査したＨＢＶキャリヤーは種々の臨床的背景を有していた。高ウイルス血症はＨＢＶＤＮＡ及びＨＢｅＡｇの存在を特徴とし、低ウイルス血症は抗ＨＢｅ及びＨＢＶＤＮＡの存在を特徴とし、無症候ＨＢＶキャリヤーは抗ＨＢｅの存在を特徴としていた。実施例７実施例１に記載の条件下でプローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施し、慢性肝炎患者（Ａ、Ｂ、Ｃ）の追跡検査試料中のＨＢＶＤＮＡ濃度のモニターに使用した。信号雑音（Ｓ／Ｎ）比として示されるＩＭｘ（登録商標）装置から得たＬＣＲデータは、グラフで、肝臓由来酵素アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中濃度（ｍ／ｌ）と比較できる。検査試料の評価基準は前記実施例６に記載の通りである。検査は下記のように実施した。患者Ａには１９９０年６月１３日及び１９９０年１０月１５日にインターフェロン療法（下記の表に＊で示す）を施した（下記のＡ２及びＡ３）。１９９２年３月１７日まで設定された間隔でＨＢＶＤＮＡ濃度を監視した。患者Ｃには、１９９１年１１月１４日、１９９１年１２月１０日、１９９２年１月７日、１９９２年１月２８日及び１９９２年３月３日にインターフェロン療法を施した（下記のＣ４〜Ｃ８）。１９９２年５月２６まで設定された間隔でＨＢＶＤＮＡ濃度を監視した。これらの患者の血清中では、インターフェロン治療の開始前には一般的なドットブロットハイブリダイゼーションによってＨＢＶ−ＤＮＡが明白に検出されたが、治療後は陰性になった。ＬＣＲ検出システムでは、治療に成功した後でも、一般的ハイブリダイゼーションアッセイの場合より数週間長い期間にわたって血清ＨＢＶ−ＤＮＡを検出することができた。ＬＣＲ検出によるＨＢＶＤＮＡ及びＡＬＴの半定量的モニターの適性は、第３図ａ〜第３図ｃのグラフから明らかである。実施例８実施例１に記載の条件下で、但し０．５単位のＤＮＡポリメラーゼ及び３４００単位のＤＮＡリガーゼを使用して、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施した。反応は、ＨＢＶＤＮＡ陰性血清（陰性対照）又はａｄｗ型又はａｙ型ＨＢＶを含む血清で生起させた。増幅後に反応混合物をＩＭｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅生成物を、ＡｂｂｏｔＩＭｘ（登録商標）自動化免疫アッセイシステムを用いて実施したサンドイッチ免疫アッセイによって検出した。以下の実施例中の数値は、このプロセスの速度読取り値を計数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）で表したものである。連結プローブの量は、読取った速度に直接関連していた（欧州特許出願公開第３５７−０１１号参照）。試料は３回の反復検査にかけた。３回の反復検査の平均値と変動係数（ＣＶ％）とを下記の表９に示す。これらの結果は、プローブセット４０３Ｇが、ＨＢＶ各サブタイプに共通した検出と、抗ウイルス療法に対して効果を示している又は該療法を受けている患者の追跡検査に有用であることを示している。実施例９「短いＰＣＲ」又は「ｓＰＣＲ」と称するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の修飾を用いてＨＢＶＤＮＡを検出するために、プローブ配列番号１及び４を使用した。ｓＰＣＲは本質的に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから市販されているＧｅｎｅ−ＡＭＰ（商標）キットの包装中の説明書に従って実施した。対照は、ＡｂｂｏｔｔＧｅｎｏｓｔｉｃｓ（商標）ＤＮＡキットのものを使用した。ＰＣＲ操作は、プライマーセット配列番号１及び４を１×１０¹²分子／反応で使用し、反応緩衝液を９４℃で３０秒、５０℃で２０秒のサイクル３０回にわたって使用し、且つＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）を１．２５単位／反応で使用して行った。１９９０年３月７日公開のＬａｆｆｌｅｒらの欧州特許第３５７，０１１号に記載のように、ＩＭｘ（登録商標）装置で二重構造生成物を分離し、検出した。前記欧州特許は全体が本明細書に参考として包含される。反復操作の結果の平均値を下記の表に示す。実施例１０プローブ配列番号５及び８をプライマーとして用いて、前記実施例９に記載のようにＰＣＲでＨＢＶＤＮＡを検出した。反復操作の結果の平均値を下記の表に示す。実施例１１プライマー配列番号１及び３を用いて、１９９３年２月９日交付米国特許第５１８５２４３号に記載のように、標的特異的ポリマー化及び連結反応を実施した。前記米国特許は全体が本明細書に参考として包含される。プローブを前述のようにＦＩＴＣ及び／又はフルオレセンで誘導体化し、選択した標的ＨＢＶＤＮＡ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏから入手可能な修飾ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液及び水と混合する。該混合物を５分間８０℃に加熱し、ゆっくりと２３℃まで放冷する。短時間の遠心にかけた後、該反応混合物に、³²Ｐ標識ｄＣＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを加える。得られた溶液を２３℃で１２時間インキュベートする。前記反応混合物の一部を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、長さ４８塩基の³²Ｐ標識生成物が示される。この生成物は、標的にハイブリダイズした後の配列番号１及び３の充填及び連結生成物に対応する。実施例１２前記実施例１１に記載の条件下で、但しｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを加えて、プローブ配列番号１及び２８を標的ＨＢＶＤＮＡにハイブリダイズする。反応混合物の一部は、長さ４８塩基の³²Ｐ標識生成物を示す。この生成物は、標的にハイブリダイズした後の配列番号１及び２８の充填及び連結生成物に対応する。

Claims

【特許請求の範囲】１．非標的ＤＮＡを含む検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを検出するための構成物であって、第一上流オリゴヌクレオチドプローブと、第一下流オリゴヌクレオチドプローブとを含み、各プローブが、ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、上流プローブの３’末端が下流プローブの５’末端の近傍にハイブリダイズし、標的配列が配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である前記構成物。２．上流プローブの３’末端又は下流プローブの５’末端が、これらの末端に修正が無いかぎり連結不能である請求項１に記載の構成物。３．末端が連結可能となるように、上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、連結不能末端を修正した請求項２に記載の構成物。４．上流及び下流オリゴヌクレオチドプローブが、下記の対：（ａ）配列番号１及び３、（ｂ）配列番号５及び７、（ｃ）配列番号９及び１１、（ｄ）配列番号１３及び１５、並びに（ｅ）配列番号１７及び１９の中から選択した対である請求項１に記載の構成物。５．末端が連結可能となるように、標的依存性エキソヌクレオリチック剤により下流プローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いで上流プローブを標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、連結不能末端を修正した請求項２に記載の構成物。６．上流及び下流オリゴヌクレオチドプローブが、下記の対：（ａ）配列番号１及び２８、（ｂ）配列番号９及び３２、並びに（ｃ）配列番号１７及び３６又はこれらの相補配列の中から選択した対である請求項５に記載の構成物。７．下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５’突出部を形成し、プローブの末端を連結可能にすべく、下流プローブの５’末端が上流プローブの３’ 末端に当接するように前記突出部を除去することからなる請求項２に記載の構成物。８．検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存否又は量を決定するための方法であって、（ａ）検査試料中のＤＮＡを、請求項１に記載の一つ以上の上流オリゴヌクレオチドプローブ及び一つ以上の下流オリゴヌクレオチドプローブで、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖とハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションの結果、無修正の場合には連結不能な末端が生じ、（ｂ）プローブを連結可能にするために、上流プローブの３’末端を標的依存的に修正し、（ｃ）ハイブリダイズした上流プローブの３’末端を、ハイブリダイズした下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に連結し、連結生成物は非連結プローブから弁別できるようにし、（ｄ）検査試料中のＨＢＶＤＮＡの存在又は量の尺度として、連結生成物の形成の度合いを検出することからなる前記方法。９．前記プローブを分子量によって弁別する請求項８に記載の方法。１０．更に、（ａ）検出可能シグナルを直接又は間接的に発生することができるリポーター基をオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも一つに結合し、（ｂ）ハイブリダイゼーションに関連して前記リポーター基からシグナルを発生させ、（ｃ）発生したシグナルを検出することによって肝炎Ｂ型ウイルスの存在を決定するステップも含む請求項８に記載の方法。１１．前記ハイブリダイゼーションステップの前に又は同時に増幅ステップも含む請求項８に記載の方法。１２．増幅がＬＣＲ又はＰＣＲである請求項１１に記載の方法。１３．修正が、上流プローブの３’及び下流プローブの５’を連結可能にするために、標的配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドにより一つのプローブの少なくとも一端を延長するこからなる請求項８に記載の方法。１４．修正により末端を連結可能にするために、標的依存性エキソヌクレオリチック活性によって下流プローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いで標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで上流プローブを延長するこからなる請求項８に記載の方法。１５．検出が、下流プローブからのフラグメントの除去をモニターすることからなる請求項１４に記載の方法。１６．下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５ ’突出部を形成し、プローブの末端を連結可能にすべく、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように前記突出部を除去する修正をなしたことからなる請求項８に記載の方法。１７．肝炎Ｂ型ウイルスを検出するためのキットであって、請求項１に記載の上流及び下流プローブからなる構成物を含み、前記プローブのうちの少なくとも一つが検出可能なように標識されており、該プローブを検出するための手段も含まれている前記キット。１８．更にリガーゼも含む請求項１７に記載のキット。１９．更にポリメラーゼと少なくとも１種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの供給とを含む請求項１７に記載のキット。２０．検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを検出するための構成物であって、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなる第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブを含み、標的核酸配列が配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択され、プローブが肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的配列の反対の末端で反対の鎖にハイブリダイズできる前記構成物。２１．第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブが、下記の対：（ａ）配列番号１及び４、（ｂ）配列番号５及び８、（ｃ）配列番号９及び１２、（ｄ）配列番号１３及び１６の中から選択した対である請求項２０に記載の構成物。２２．請求項２０に記載の構成物を用いて検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定する方法であって、（ａ）第一オリゴヌクレオチドプローブ及び第二オリゴヌクレオチドプローブを肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的核酸配列の反対の末端で反対の鎖にハイブリダイズし、（ｂ）延長生成物をその形成に使用した鋳型から分離した時に反対側のプローブのハイブリダイゼーション及び延長のための鋳型として使用できるように、ハイブリダイズした第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブを延長して延長生成物を形成し、（ｃ）延長生成物をその形成に使用した鋳型から分離し、（ｄ）ステップ（ａ）の第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブをステップ（ｂ）の延長生成物にハイブリダイズし、それによって延長生成物を形成し、（ｅ）ステップ（ａ）及びステップ（ｄ）を少なくとも一回反復し、（ｆ）検査試料中に存在する肝炎ＤＮＡの尺度として延長プローブの存在を検出することからなる前記方法。２３．ステップ（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１０回反復する請求項２２に記載の方法。２４．更に、（ａ）検出可能シグナルを直接又は間接的に発生することができるリポーター基をオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも一つに結合し、（ｂ）ハイブリダイゼーションに関連して前記リポーター基からシグナルを発生させ、（ｃ）標的ＤＮＡの存在と相関している延長オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出するステップも含む請求項２２に記載の方法。２５．肝炎Ｂ型ウイルスを検出するためのキットであって、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ対からなる構成物を含み、プローブのうちの少なくとも一つが検出可能なように標識されており、該プローブを検出するための手段も含まれている前記キット。２６．更にポリメラーゼと４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート全部の供給とを含む請求項２５に記載のキット。２７．検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを検出するための構成物であって、（ａ）第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが、ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、標的配列が配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である第一オリゴヌクレオチドセットと、（ｂ）第二下流プローブ及び第二上流プローブを含み、両方のプローブがステップ（ａ）の第一オリゴヌクレオチドセットにハイブリダイズできる第二オリゴヌクレオチドセットとを含む前記構成物。２８．少なくとも一つの第一下流プローブの５’末端及び／又は少なくとも一つの上流プローブの３’末端が、修正が無いかぎり連結不能である請求項２７に記載の構成物。２９．末端が連結可能になるように、第一上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することによって、連結不能末端が修正されている請求項２８に記載の構成物。３０．４個のオリゴヌクレオチドプローブが、（ａ）配列番号１及び３がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号２及び４がそれぞれ第二上流及び第二下流プローブであるセット４０３Ｇ、（ｂ）配列番号５及び７がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号６及び８がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット１８４Ｇ、（ｃ）配列番号９及び１１がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号１０及び１２がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット２３１Ｇ、（ｄ）配列番号１３及び１５がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号１４及び１６がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット１８７５Ｇ、及び（ｅ）配列番号１７及び１９がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号１８及び２０がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット６６４Ｇの中から選択したものである請求項２９に記載の構成物。３１．末端が連結可能になるように、非ホスホリル化又は不適合塩基を標的依存性エキソヌクレオリチック剤によって第一下流プローブの５’末端から除去し、次いで上流プローブを標的配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、連結不能末端を修正した請求項２７に記載の構成物。３２．４個のオリゴヌクレオチドプローブが、（ａ）配列番号１及び２８がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号２７及び４がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット４０３Ｅ、（ｂ）配列番号９及び３２がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号３１及び３３がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット２３１Ｅ（配列番号９、３１、３２及び３３）、及び（ｃ）配列番号１７及び３６がそれぞれ第一上流及び第一下流プローブであり、配列番号３５及び３７がそれぞれ第二下流及び第二上流プローブであるセット６６４Ｅの中から選択したものである請求項３１に記載の構成物。３３．下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５’突出部を形成し、修正が、プローブの末端を連結可能にすべく、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように前記突出部を除去することからなる請求項２７に記載の構成物。３４．検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存否又は量を請求項２７に記載の構成物を用いてリガーゼ連鎖反応により検出する方法であって、（ａ）一本鎖標的核酸配列を含んでいる疑いのある試料を、第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが前記ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの前記標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズでき、下流プローブの５’末端及び／又は上流プローブの３’末端が前記プローブを標的にハイブリダイズできるように修正されないかぎり連結不能である第一オリゴヌクレオチドセットに暴露し、（ｂ）前記プローブが標的配列にハイブリダイズした時にのみ第一上流プローブの３’末端及び／又は第一下流プローブの５’末端を修正して末端を連結可能にし、（ｃ）二つの第一プローブを連結して第一連結生成物を形成し、該第一連結生成物を標的から分離し、（ｄ）前記混合物を、ハイブリダイゼーション条件下で、第二上流プローブ及び第二下流プローブを含む第二オリゴヌクレオチドセットに暴露し、二つの第二プローブを連結して第二連結生成物を形成し、該第二連結生成物を第一連結生成物から分離し、連結プローブは非連結プローブから弁別することができ、ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を少なくとも一回反復し、（ｅ）標的ＤＮＡの存否又は量に相関している連結オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出することからなる前記方法。３５．連結プローブを分子量によって検出する請求項３４に記載の方法。３６．連結プローブを、アフィニティ標識、組成、ゲル濾過、沈降速度、浸透圧、又はゲル電気泳動によって検出する請求項３４に記載の方法。３７．更に、（ａ）検出可能シグナルを直接又は間接的に発生することができるリポーター基をオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも一つに結合し、（ｂ）ハイブリダイゼーションに関連して前記リポーター基からシグナルを発生させ、（ｃ）標識ＤＮＡの存在に相関している延長オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出するステップも含む請求項３４に記載の方法。３８．修正ステップが、末端を連結可能にすべく、第一上流プローブの３’末端及び／又は第一下流プローブの５’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することからなる請求項３４に記載の方法。３９．修正ステップが、末端を連結可能にすべく、非ホスホリル化又は不適正塩基を標的依存性エキソヌクレオリチック剤により第一下流プローブの５’末端から除去し、次いで上流プローブを標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することからなる請求項３４に記載の方法。４０．下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５’突出部を形成し、修正が、プローブの末端を連結可能にすべく、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように前記突出部を除去することからなる請求項３４に記載の方法。４１．検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を検出するためのキットであって、請求項２７に記載の構成物を含み、プローブのうちの少なくとも一つが検出を可能にするために標識されており、該プローブを検出するための手段も含まれている前記キット。４２．更にリガーゼも含む請求項４１に記載のキット。４３．更にポリメラーゼと少なくとも１種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの供給とを含む請求項４２に記載のキット。４４．ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する約１０〜約６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブであって、標的配列が配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択される前記オリゴヌクレオチドプローブ。４５．配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９又はこれらの相補配列の中から選択される請求項４４に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。４６．検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定するための方法であって、検査試料中のＤＮＡを請求項４４に記載の一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズして、ハイブリダイズしたプローブを非ハイブリダイズプローブから弁別できるようにし、ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することからなる前記方法。４７．更に、（ａ）検出可能シグナルを直接又は間接的に発生することができるリポーター基をオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも一つに結合し、（ｂ）ハイブリダイゼーションに関連して前記リポーター基からシグナルを発生させ、（ｃ）発生したシグナルを検出することによって肝炎Ｂ型ウイルスの存在を決定するステップも含む請求項４６に記載の方法。４８．更に、前記ハイブリダイゼーションステップの前に又は同時に増幅ステップも含む請求項４６に記載の方法。４９．増幅がＬＣＲ又はＰＣＲである請求項４８に記載の方法。５０．肝炎Ｂ型ウイルスを検出するためのキットであって、請求項４４に記載の一つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが検出可能なように標識されており、該オリゴヌクレオチドを検出するための手段も含まれている前記キット。５１．試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを増幅するための試薬も含む請求項５０に記載のキット。