RS61447B1 - Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv) - Google Patents

Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv)

Info

Publication number
RS61447B1
RS61447B1 RS20210190A RSP20210190A RS61447B1 RS 61447 B1 RS61447 B1 RS 61447B1 RS 20210190 A RS20210190 A RS 20210190A RS P20210190 A RSP20210190 A RS P20210190A RS 61447 B1 RS61447 B1 RS 61447B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
hbv
liver
antisense
isis
compound
Prior art date
Application number
RS20210190A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric E Swayze
Susan M Freier
Michael L Mccaleb
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47041953&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61447(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of RS61447B1 publication Critical patent/RS61447B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovde su otkriveni postupci, jedinjenja i kompozicije za inhibiciju ekspresije iRNK virusa i proteina hepatitisa B (HBV) kod životinje. Takvi postupci, jedinjenja i kompozicije su korisni za lečenje, prevenciju ili poboljšanje stanja bolesti i poremećaja povezanih sa HBV-om.
Osnova pronalaska
[0002] Hepatitis B je virusna bolest koja se prenosi parenteralno preko kontaminiranog materijala kao što su krv i krvni produkti, kontaminirane igle, seksualno ili vertikalno od inficiranih ili majki koje su nosioci na njihovo potomstvo. Svetska zdravtsvena organizacija procenjuje da je više od 2 milijardi ljudi širom sveta inficirano, sa oko 4 miliona akutnih slučajeva godišnje, 1 milion smrtnih slučajeva godišnje i 350-400 miliona hroničnih nosilaca (World Health Organization: Geographic Prevalence of Hepatitis B Prevalence, 2004. http://www.who.int/vaccines-surveillance/graphics/htmls/hepbprev.htm).
[0003] Virus, HBV je dvolančani hepatotropni virus koji inficira samo ljude i nehumane primate. Virusna replikacija se pretežno odigrava u jetri i, u manjem stepenu, u bubrezima, pankreasu, koštanoj srži i slezini (Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev. 64: 2000; 51-68.). Virusni i imuni markeri su detektabilni u krvi i karakteristični obrasci antigena-antitela se razvijaju tokom vremena. Prvi detektabilni virusni marker je HBsAg, praćen hepatitis B e antigenom (HBeAg) i HBV DNK. Titri mogu biti visoki u toku inkubacionog perioda, ali nivoi HBV DNK i HBeAg počinju da opadaju na početku bolesti i mogu biti nedetektabilni u vreme pika kliničke bolesti (Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences. N Engl J Med. 350: 2004; 1118-1129). HBeAg je virusni marker detektabilan u krvi i u korelaciji je sa aktivnom virusnom replikacijom, i prema tome visokom virusnom koncentracijom i infektivnošću (Hepatitis B e antigen-the dangerous end game of hepatitis B. N Engl J Med.347: 2002; 208-210). Prisustvo anti-HBsAb i anti-HBcAb (IgG) označava oporavak i imunitet kod prethodno inficirane individue.
[0004] Trenutno preporučene terapije za hroničnu infekciju HBV od strane Američke asocijacije za ispitivanje bolesti jetre (AASLD) i Evrospke asocijacije za ispitivanje jetre (EASL) obuhvataju interferon alfa (INFα), pegilovani interferon alfa-2a (Peg-IFN2a), entekavir i tenofovir. Nukleozidne i nukleotidne terapije, entekcavir i tenofovir, su uspešne u redukciji virusne koncentracije, ali stope serokonverzije HBeAg i gubitka HBsAg su čak niže od onih dobijenih upotrebom IFNα terapije. Takođe se koriste ostale slične terapije, uključujući lamivudin (3TC), telbivudin (LdT) i adefovir, ali za nukleozidne/nukleotidne terapije generalno, pojava rezistencije ograničava terapeutsku efikasnost.
[0005] Na taj način, postoji potreba u stanju tehnike za otkrivanjem i razvojem novih antivirusnih terapija. Pored toga, postoji potreba za novim anti-HBV terapijama sposobnim za povećanje stopa serokonverzije HBeAg i HBsAg. Novije kliničko istraživanje je našlo korelaciju između serokonverzije i redukcija u HBeAg (Fried et al (2008) Hepatology 47:428) i redukcija u HBsAg (Moucari et al (2009) Hepatology 49:1151). Redukcije u nivoima antigena moguće da su omogućile imunološku kontrolu HBV infekcije zbog toga što se veruje da visoki nivoi antigena indukuju imunološku toleranciju. Trenutne nukleozidne terapije za HBV su sposobne za dramatične redukcije u nivoima HBV u serumu, ali imaju mali uticaj na nivoe HBeAg i HBsAg.
[0006] Antisens tehnologija se javlja kao efikasno sredstvo za redukciju ekspresije specifičnih genskih proizvoda i može prema tome da obezbedi da bude jedinstveno korisna u određenom broju terapeutskih, dijagnostičkih i istraživačkih primena za modulaciju ekspresije HBV (Videti U.S. patentne objave br. 2008/0039418 i 2007/0299027). Antisens terapija se razlikuje od nukleozidne terapije po tome što ona može direktno da bude usmerena na transkripte za HBV antigene i na taj način redukuje nivoe HBeAg i HBsAg u serumu. Zbog višestrukih, preklapajućih transkripata proizvedenih posle infekcije HBV-om, takođe postoji mogućnost da jedan antisens oligomer redukuje HBV DNK pored oba HBeAg i HBsAg. Prema tome, antisens tehnologija se javlja kao efikasno sredstvo za redukciju ekspresije određenih genskih proizvoda i može prema tome da se dokaže kao jedinstveno kroisna u određenom broju terapeutskih, dijagnostičkih i istraživačkih primena za modifikaciju HBV.
[0007] WO 95/191433 opisuje anti-hepatitis B poli- i oligonukleotide. US 5,718,528 B1 opisuje antivirusne poli- i oligonukleotide. Deng et al. (Chinese Journal of Hepatology, 2009:17(12):900-4) opisuju inhibiciju replikacije virusa hepatitisa B (HBV) upotrebom antisens LNA ciljnog delovanja na oba S i C gene u HBV.
[0008] Yu et al. (Biochemical Pharmacology, 2009:77(5):910-9) opisuju interspecijsko poređenje in vivo PK/PD veza za antisens oligonukleotide druge generacije koji su usmereni na apolipoprotein B-100. Henry et al. (Current Opinions in Investigational Drugs, 2001:2(10):1444-9) opisuju osobine leka antisens oligonukleotida druge generacije: kako se meri sa svojim prethodnicima? Swayze et al. (Antisense drug technology: strategies and applications, 2007, pages 143-82) opisuju medicinsku hemiju oligonukleotida. Stanley et al. (Antisense drug technology: strategies and applications, 2007, pages 327-57) opisuju toksikološke osobine 2’-O-metoksietil himernih antisens inhibitora kod životinje i čoveka.
Kratak opis pronalaska
[0009] Pronalazak daje jedinjenje koje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja povezanog sa HBV-om kod subjekta, pri čemu, bolest, poremećaj ili stanje je žutica, inflamacija jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, insuficijencija jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija jetre povezana sa bolešću, pri čemu se jednolančani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu prema SEQ ID NO: 226 i sadrži: gap segment koji se sastoji od deset vezanih deoksinukleozida; 5’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; i 3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; pri čemu je gap segment postavljen između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, pri čemu svaki nukleozid svakog krilnog segmenta sadrži 2’-O-metoksietil šećer, pri čemu, svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza, i pri čemu, svaki citozin je 5-metilcitozin
[0010] Pronalazak takođe daje kompoziciju za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa HBV-om kod subjekta, pri čemu, bolest, poremećaj ili stanje je žutica, inflamacija jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, insuficijencija jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija jetre povezana sa bolešću, pri čemu kompozicija sadrži jedinjenje ili njegovu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, pri čemu jedinjenje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, pri čemu se jednolančani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu prema SEQ ID NO: 226 i sadrži: gap segment koji se sastoji od deset vezanih deoksinukleozida; 5’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; i 3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; pri čemu je gap segment postavljen između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, pri čemu svaki nukleozid svakog krilnog segmenta sadrži 2’-O-metoksietil šećer, pri čemu, svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza, i pri čemu, svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0011] Ovde su otkriveni postupci, jedinjenja i kompozicije za modulaciju ekspresije HBV iRNK i proteina. U određenim slučajevima, jedinjenja korisna za modulaciju ekspresije HBV iRNK i proteina su antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su antisens oligonukleotidi.
[0012] U određenim slučajevima, modulacija može da se javi u ćeliji ili tkivu. U određenim slučajevima, ćelija ili tkivo je životinja. U određenim slučajevima, životinja je čovek. U određenim slučajevima, nivoi HBV iRNK su smanjeni. U određenim slučajevima, nivoi HBV DNK su redukovani. U određenim slučajevima, nivoi HBV proteina su redukovani. U određenim slučajevima, nivoi HBV antigena su redukovani. U određenim slučajevima, nivoi HBV santigena (HBsAg) su redukovani. U određenim slučajevima, nivoi HBV e-antigena (HBeAg) su redukovani. Takva redukcija može da se javi na način zavisan od vremena ili na način zavisan od doze.
[0013] Takođe su otkriveni postupci, jedinjenja i kompozicije korisni za prevenciju, lečenje i poboljšanje bolesti, poremećaja i stanja. U određenim slučajevima, takve bolesti, poremećaji ili stanja povezana sa HBV-om su bolesti jetre. U određenim slučajevima, takve bolesti, poremećaji ili stanja obuhvataju žuticu, kancer jetre, inflamaciju jetre, fibrozu jetre, inflamaciju, cirozu jetre, insuficijenciju jetre, difuznu hepatocelularnu inflamatornu bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremiju i transplantaciju jetre povezanu sa bolešću. U određenim slučajevima, takve bolesti, poremećaji i stanja povezani sa HBV-om su hiperproliferativne bolesti, poremećaji i stanja. U određenim slučajevima takve hiperproliferativne bolesti, poremećaji i stanja obuhvataju kancer kao i povezane malignitete i metastaze. U određenim slučajevima, takvi kanceri obuhvataju kancer jetre i hepatocelularni kancer (HCC).
[0014] Takve bolesti, poremećaji i stanja mogu imati jedan ili više zajedničkih faktora rizika, uzroka ili ishoda. Određeni faktori rizika i uzroci za razvoj bolesti jetre ili hiperproliferativne bolesti obuhvataju starenje; upotrebu duvana; izlaganje sunčevoj svetlosti i jonizujućem zračenju; kontakt sa određenim hemikalijama; infekciju određenim virusima i bakterijama; određene hormonske terapije; porodičnu istoriju kancera; upotrebu alkohola; i određene izbore životnog stila uključujući lošu ishranu, nedostatak fizičke aktivnosti i/ili prekomernu telesnu težinu. Određeni simtomi i ishodi povezani sa razvojem bolesti jetre ili hiperproliferativne bolesti obuhvataju, ali bez ograničenja na: bolest sličnu gripu, slabost, bolove, glavobolju, groznicu, gubitak appetita, dijareju, žuticu, mučninu i povraćanje, bol u predelu jetre, stolica boje gline ili sive boje, svrab po celom telu i tamnu boju urina.
Detaljan opis
[0015] Potrebno je razumeti da su gorenavedeni opšti opis i sledeći detaljan opsi opis samo ilustrativni i objašnjavajući i da nisu ograničavajući za pronalazak, kako je navedeno u patentnim zahtevima. Ovde, upotreba jednine uključuje množinu, osim ukoliko nije specifično navedeno drugačije. Kao što je ovde korišćena, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko je navedeno drugačije. Pored toga, upotreba termina "uključujući" kao i drugih oblika, kao što je "obuhvata" i "uključen", nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su "element" ili "komponenta" obuhvataju elemente i komponente koji sadrže jednu jedinicu i elemente i komponente koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ukoliko nije specifično navedeno drugačije.
[0016] Podnaslovi koji su ovde korišćeni su dati samo za organizacione svrhe i ne bi ih trebalo tumačiti kao ograničavajuće za opisani predmet zaštite.
Definicije
[0017] Osim ukoliko su ovde date specifične definicije, nomenklatura korišćena u vezi sa, i postupci i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisani ovde su oni koji su dobro poznati i uobičajeno se koriste u stanju tehnike. Standardne tehnike mogu biti korišćene za hemijsku sintezu i hemijsku analizu.
[0018] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini imaju sledeća značenja:
"2’-O-metoksietil" (takođe 2’-MOE i 2’-O(CH2)2-OCH3) označava O-metoksi-etil modifikaciju na 2’ položaju furanoznog prstena. 2’-O-metoksietil modifikovani šećer je modifikovani šećer. "2’-MOE nukleozid" (takođe 2’-O-metoksietil nukleozid) označava nukleozid koji sadrži 2’-MOE modifikovanu šećernu grupu.
"2’-supstituisani nukleozid" označava nukleozid koji sadrži susptituent na 2’-položaju furanozil prstena osim H ili OH.2’ supstituisani nukleozidi obuhvataju nukleozide sa bicikličnim šećernim modifikacijama.
"3’ ciljno mesto" označava nukleotid ciljne nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 3’-krajnjim nukleotidom određenog antisens jedinjenja.
"5’ ciljno mesto" označava nukleotid ciljne nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 5’-krajnjim nukleotidom određenog antisens jedinjenja.
"5-metilcitozin" označava citozin modifikovan metil grupom vezanom za 5 položaj. 5-metilcitozin je modifikovana nukleobaza.
"Oko" označava unutar ±7% vrednosti. Na primer, ako je navedeno, "jedinjenja su postigla najmanje oko 70% inhibicije HBV", podrazumeva se da su nivoi HBV inhibirani unutar opsega od 63% i 77%.
"Prihvatljivi profil bezbednosti" označava obrazac sporednih efekata koji je unutar klinički prihvatljivih granica.
"Aktivno farmaceutsko sredstvo" označava supstancu ili supstance u farmaceutskoj kompoziciji koje obezbeđuju terapeutsku korist kada su primenjene na individuu. Na primer, antisens oligonukleotid usmeren ka HBV je aktivno farmaceutsko sredstvo.
"Aktivni ciljni region" označava ciljni region prema kome su usmereni jedno ili više aktivnih antisens jedinjenja. "Aktivna antisens jedinjenja" označavaju antisens jedinjenja koja redukuju nivoe ciljne nukleinske kiseline i nivoe proteina.
"Akutna infekcija hepatitisa B" rezultuje kada osoba izložena virusu hepatitisa B počne da razvija znakove i simptome virusnog hepatitisa. Ovaj vremenski period, označen kao period inkubacije, je u proseku 90 dana, ali bi mogao biti kratak kao 45 dana ili dug kao 6 meseci. Za većinu ljudi ova infekcija će izazvati blagu do umerenu nelagodnost, ali će nestati sama po sebi zbog toga što imuni odgovor tela uspeva u borbi protiv virusa. Međutim, neki ljudi, naročito oni sa kompromitovanim imunim sistemom, kao što su osobe koje pate od SIDA-e, koje se podvrgavaju hemoterapiji, koje uzimaju imunosupresivne lekove ili koje uzimaju steroide, imaju veoma ozbiljne probleme kao rezultat akutne infekcije HBV-om, i idu ka težim stanjima kao što je fulminantna insuficijencija jetre.
"Primenjivan istovremeno" označava ko-primenu dva sredstva na bilo koji način u kome se farmakološki efekti oba manifestuju kod pacijenta u isto vreme. Istovremena primena ne zahteva da se oba sredstva primenjuju u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, u istom obliku doze ili preko istog puta primene. Efekti oba sredstva ne moraju sami po sebi da se manifestuju u isto vreme. Samo je potrebno da se efekti preklapaju tokom vremenskog perioda i ne moraju da budu istovremeni.
"Primena" označava obezbeđivanje farmaceutskog sredstva na individuu, i obuhvata, ali bez ograničenja na primenu medicinske profesionalne i auto-primene.
"Sredstvo" označava aktivnu supstancu koja može da obezbedi terapeutsku korist kada je primenjena na životinju. "Prvo sredstvo" označava terapeutsko jedinjenje opisano ovde. Na primer, prvo sredstvo može biti antisens oligonukleotid koji je usmeren ka HBV. "Drugo sredstvo" označava drugo terapeutsko jedinjenje koje je ovde opisano (npr. drugi antisens oligonukleotid koji je usmeren ka HBV) i/ili ne-HBV terapeutsko jedinjenje.
"Poboljšanje" označava smanjenje najmanje jednog indikatora težine stanja ili bolesti. Težina indikatora može biti određena subjektivnim ili objektivnim merama koje su poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike.
"Životinja" označava čoveka ili nehumanu životinju, uključujući, ali bez ograničenja na, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i nehumane primate, uključujući, ali bez ograničenja na, majmune i šimpanze.
"Antitelo" označava molekul okarakterisan specifičnim reagovanjem sa antigenom na neki način, gde su antitelo i antigen definisani prema onom drugom. Antitelo može da označava kompletan molekul antitela ili bilo koji njegov fragment ili region, kao što je težak lanac, laki lanac, Fab region i Fc region.
"Antisens aktivnost" označava bilo koju detektabilnu ili merljivu aktivnost koja se može pripisati hibridizaciji antisens jedinjenja za njegovu ciljnu nukleinsku kiselinu. U određenim slučajevima, antisens aktivnost je smanjenje u količini ili ekspresiji ciljne nukleinske kiseline ili proteina kodiranih takvom ciljnom nukleinskom kiselinom.
"Antisens jedinjenje" označava oligomerno jedinjenje koje je sposobno da se podvrgava hibridizaciji za ciljnu nukleinsku kiselinu preko vodonične veze. Primeri antisens jedinjenja obuhvataju jednolančana i dvolančana jedinjenja, kao što su, antisens oligonukleotidi, siRNK, shRNK, snoRNK, miRNK, i satelitski ponovci.
"Antisens inhibicija" označava redukciju nivoa ciljne nukleinske kiseline u prisustvu antisens jedinjenja komplementarne sa ciljnom nukleinskom kiselinom u poređenju sa nivoima ciljne nukleinske kiseline u odsustvu antisens jedinjenja.
"Antisens mehanizmi" su svi oni mehanizmi uključujući hibridizaciju jedinenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom, pri čemu je ishod ili efekat hibridizacije ciljno razlaganje ili ciljna zauzetost sa istovremenim zaustavljanjem ćelijske mašinerije uključujući, na primer, transkripciju ili splajsing.
"Antisens oligonukleotid" označava jednolančani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja dozvoljava hibridizaciju za odgovarajući region ili segment ciljne nukleinske kiseline.
"Komplementarnost baza" označava kapacitet za precizno bazno sparivanje nukleobaza antisens oligonukleotida sa odgovarajućim nukleobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini (tj., hibridizaciju), i posredovana je preko Watson-Crick, Hoogsteen ili reverznog Hoogsteen vodoničnog vezivanja između odgovarajućih nukleobaza.
"Biciklični šećer" označava furanozni prsten modifikovan premošćavanjem dva ne-geminalna atoma ugljenika. Biciklični šećer je modifikovani šećer.
"Telesna težina" označava težinu celog tela životinje, uključujući sva tkiva uključujući adipozno tkivo.
"Struktura kape" ili "terminalna grupa kape" označava hemijske modifikacije, koje su ugrađene na bilo kom terminusu antisens jedinjenja.
"cEt" ili "ograničeni etil" označava bicikličnu šećernu grupu koja sadrži most koji povezuje 4’-ugljenik i 2’-ugljenik, pri čemu most ima formulu: 4’-CH(CH3)-O-2’.
"Ograničeni etil nukleozid" (takođe cEt nukleozid) označava nukleozid koji sadrži bicikličnu šećernu grupu koja sadrži 4’-CH(CH3)-O-2’ most.
"Hemijski različit region" označava region antisens jedinjenja koji je na neki način hemijski različit od drugog regiona istog antisens jedinjenja. Na primer, region koji ima 2’-O-metoksietil nukleotide je hemijski različit od regiona koji ima nukleotide bez 2’-O-metoksietil modifikacija. "Himerna antisens jedinjenja" označavaju antisens jedinjenja koja imaju najmanje 2 hemijski različita regiona, pri čemu svaki položaj ima više podjedinica.
"Hronična infekcija hepatitisa B" javlja se kada osoba početno pati od akutne infekcije, ali je zatim nesposobna da se bori protiv infekcije. Da li bolest postaje hronična ili potpuno nestaje zavisi većinom od starosti inficirane osobe. Oko 90% beba inficiranih na rođenju napredovaće do hronične bolesti. Međutim, kako osoba stari, rizik od hronične infekcije se smanjuje tako da će između 20%-50% dece i manje od 10% starije dece ili odraslih napredovati od akutne do hronične infekcije. Hronične HBV infekcije su primarni cilj lečenja za primere izvođenja prema predmetnom pronalasku, iako su ASO kompozicije prema predmetnom pronalasku takođe sposobne za lečenje stanja povezanih sa HBV, kao što su inflamacija, fibroza, ciroza, kancer jetre, serum hepatitis i tako dalje.
"Ko-primena" označava primenu dva ili više farmaceutskih sredstava na individuu. Dva ili više farmaceutskih sredstava mogu biti u jednoj farmaceutskoj kompoziciji ili mogu biti u posebnim farmaceutskim kompozicijama. Svako od dva ili više farmaceutskih sredstava mogu biti primenjivani preko istog ili različitih puteva primene. Ko-primena obuhvata primenu koja je paralelna ili uzastopna.
"Komplementarnost" označava kapacitet sparivanja između nukleobaza prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.
"Komplajans/pristanak" označava pridržavanje preporučene terapije od strane individue.
"Sadrže," "sadrži" i "koji sadrži" biće shvaćeni tako da podrazumevaju uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, ali ne isključenje bilo kog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata.
"Kontinuirane nukleobaze" označavaju nukleobaze koje su međusobno susedne.
"Lečenje" označava postupak ili kuru koja ponovo uspostavlja zdravlje ili prepisani tretman za bolest.
"Deoksiribonukleotid" označava nukleotid koji ima vodonik na 2’ položaju šećernog dela nukleotida. Deoksiribonukleotidi mogu biti modifikovani sa bilo kojim od različitih supstituenata.
"Dizajniranje" ili "dizajniran za" označava postupak dizajniranja oligomernog jedinjenja koje se specifično hibridizuje sa izabranim molekulom nukleinske kiseline.
"Razblaživač" označava sastojak u kompoziciji koji nema farmakološku aktivnost, ali je farmaceutski neophodan ili poželjan. Na primer, u lekovima koji su injektirani, razblaživač može biti tečan, npr. fiziološki rastvor.
"Jedinica doze" označava oblik u kome je obezbeđeno farmaceutsko sredstvo, npr. pilula, tableta, ili druga jedinica doze poznata u stanju tehnike.
"Doza" označava naznačenu količinu farmaceutskog sredstva obezbeđenu u jednoj primeni, ili u naznačenom vremenskom periodu. U određenim slučajevima, doza može biti primenjena u dva ili više bolusa, tableta ili injekcije. Na primer, u određenim slučajevima, gde je poželjna subkutana primena, željena doza zahteva zapreminu koja se ne može lako smestiti u jednu injekciju. U takvim slučajevima, sve ili više injekcija mogu biti korišćene za željenu dozu. U određenim slučajevima, doza može biti primenjena u dve ili više injekcija za minimizaciju reakcije na mestu injekcije kod individue. U drugim slučajevima, farmaceutsko sredstvo je primenjeno infuzijom tokom dužeg vremenskog perioda ili kontinuirano. Doze mogu biti navedene kao količina farmaceutskog sredstva na čas, dan, nedelju ili mesec.
"Režim doziranja" je kombinacija doza dizajniran za postizanje jednog ili više željenih efekata. "Trajanje" označava vremenski period tokom koga se aktivnost ili događaj nastavlja. U određenim slučajevima, trajanje tretmana je vremenski period u toku koga se primenjuju doze farmaceutskog sredstva.
"Efikasna količina" u kontekstu modulacije aktivnosti ili lečenja ili prevencije stanja označava primenu te količine aktivnog sastojka na subjekta kod koga postoji potreba za takvom modulacijom, lečenjem ili profilaksom, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, koja je efikasna za modulaciju tog efekta, ili za lečenje ili profilaksu ili poboljšanje tog stanja. Efikasna količina će varirati u zavisnosti od zdravstvenog i fizičkog stanja subjekta koji se leči, taksonomske grupe subjekata koji se leče, formulacije kompozicije, procene medicinske situacije i drugih relevantnih faktora.
"Efikasnost" označava sposobnost za proizvodnju željenog efekta.
"Ekspresija" obuhvata sve funkcije pomoću kojih su genom kodirana informacija prevedena u prisutne strukture i funkcionisanje u ćeliji. Takve strukture obuhvataju, ali bez ograničenja na proizvode transkripcije i translacije.
"Potpuno komplementarno" ili "100% komplementarno" znači da svaka naukleobaza prve nukleinske kiseline ima komplementarnu nukleobazu u drugoj nukleinskoj kiselini. U određenim slučajevima, prva nukleinska kiselina je antisens jedinjenje i target nukleinska kiselina je druga nukleinska kiselina.
1
"Potpuno modifikovani motiv" odnosi se na antisens jedinjenje koje ima neprekidnu sekvencu nukleozida gde je suštinski svaki nukleozid nukleozid sa modifikovanim šećerom koji ima uniformnu modifikaciju.
"Gapmer" označava himerno antisens jedinjenje u kojem interni region koji ima više nukleozida koji pomažu u cepanju sa RNkazom H se nalazi između spoljašnjih regiona koji imaju jedan ili više nukelozida, pri čemu nukleozidi koji sadrže interni region su hemijski različiti od nukleozida ili nukleozida koji sadrže spoljašne regione. Interni region se može označiti kao "gap" i eksterni regioni se mogu označiti kao "krila".
"Gap-proširen" označava antisens jedinjenje koje ima gap segment od 12 ili više neprekidnih 2’-deoksiribonukleotida koji se nalaze između 5’ i 3’ krilnih segmenata koji imaju od jednog do šest nukleotida koji imaju modifikovane šećerne delove.
"HBV" označava sisarski hepatitis B virus, uključujući humani hepatitis B virus. Termin obuhvata geografske genotipove hepatitis B virusa, naročito humanog hepatitis B virusa, kao i varijante sojeva geografskih genotipova hepatitis B virusa.
"HBV antigen" označava bilo koji hepatitis B virus antigen ili protein, uključujući proteine jezgra kao što su "hepatitis B jezgarni antigen" ili "HBcAG" i "hepatitis B E antigen" ili "HBeAG" i proteine omotača kao što je "HBV površinski antigen", ili "HBsAg" ili "HBsAG". "Hepatitis B E antigen" ili "HBeAg" ili "HBeAG" je izlučeni, ne-partikularni oblik HBV jezgarnog proteina. HBV antigeni HBeAg i HBcAg dele primarne aminokiselinske sekvence, tako da pokazuju unakrsnu reaktivnost na T ćelijskom nivou. HBeAg nije neophodan za sastavljanje ili replikaciju virusa, iako studije sugerišu da može biti neophodan za uspostavljanje hronične infekcije. Neonatalna infekscija sa HBeAg-negativnim mutantom često rezultujue u snažnoj akutnoj pre nego hroničnoj HBV infekciji (Terezawa et al (1991) Pediatr. Res. 29:5), dok infekcija mladih mrmota sa WHeAg-negativnim mutantom rezultuje u mnogo nižoj stopi hronične WHV infekcije (Cote et al (2000) Hepatology 31:190). HBeAg verovatno može funkcionisati kao toleragen preko inaktivacije jezgranih specifičnih T ćelija preko delecije ili klonske anergije (Milich et al (1998) J. Immunol. 160:8102). Postoji pozitivna korelacija između smanjenja HBV virusnog opterećenja i antigena, i smanjenja ekspresije, sa T ćelijama, inhibitornog receptora programirane smrti-1 (PD-1; takođe poznatog kao PDCD1), negativnog regulatora aktiviranih T ćelija, nakon antivirusne terapije i HBeAg serokonverzije (Evans et al (2008) Hepatology 48:759).
"HBV iRNK" označava bilo koju informacionu RNA eksprimiranu od strane hepatitis B virusa. "HBV nukleinska kiselina" ili ’HBV DNK" označava bilo koju nukleinsku kiselinu koja kodira HBV. Na primer, u određenim slučajevima, HBV nukleinska kiselina uključuje, bez ograničenja, bilo koju virusnu DNK sekvencu koja kodira HBV genom ili njegov deo, bilo koju RNK sekvencu prepisanu sa virusne DNK uključujući bilo koju iRNK sekvencu koja kodira HBV protein.
"HBV protein" označava bilo koji protein izlučen od strane hepatitis B virusa. Termin obuhvata različite HBV antigene, uključujući jezgarne proteine kao što su "Hepatitis E antigen", "HBeAg" ili "HBeAG" i proteine omotača kao što je "HBV površinski antigen", ili "HBsAg".
"HBV površinski antigen", ili "HBsAg", ili "HBsAG" je protein omotača infektivnih HBV virusnih čestica ali se takođe izlučuje kao neinfektivna čestica sa nivoima u serumu koji su 1000-puta viši od HBV virusnih čestica. Nivoi HBsAg u serumu kod inficirane osobe ili životinje mogu biti do 1000 µg/mL (Kann and Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 9th ed. 745). Kod akutnih HBV infekcija, polu-život HBsAg u serumu, ili serum t1⁄2, je 8.3 dana (Chulanov et al (2003) J. Med. Virol. 69: 313). Internalizacija HBsAg od strane mijeloidnih dendritskih ćelija inhibira ushodnu regulaciju kostimulirajućih molekula (tj. B7) i inhibira T ćelijski stimulatorni kapacitet (den Brouw et al (2008) Immunology 126:280), i dendritske ćelije od hronično inficiranih pacijenata takođe pokazuju deficit u ekspresiji kostimulatornih molekula, sekreciju IL-12, i stimulaciju T ćelija u prisustvu HbsAg (Zheng et al (2004) J. Viral Hepatitis 11:217). HBsAg specifične CD8 ćelije od CHB pacijenata pokazuju izmenjeno vezivanje tetramera. Ove CD8 ćelije nisu anergične ali mogu imati TCR topologiju koja daje delimičnu toleranciju ili ignorisanje (Reignat et al (2002) J. Exp. Med. 195:1089). Dodatno, smanjenje u serumu HBsAg > 1 log u 24 nedelji ima visoku prediktivnu vrednost (92%) za produženi virološki odgovor (SVR – definisan kao nedetektabilna HBV DNK sa PCR 1 godinu nakon tretmana) tokom Peg-IFNα2a terapije (Moucari et al (2009) Hepatology 49:1151).
"Hepatitis B-povezano stanje" ili "HBV-povezano stanje" označava bilo koju bolest, biološko stanje, medicinsko stanje, ili događaj koji je pogoršan, izazvan, koji se odnosi na, povezan sa, ili se može pratiti do hepatitis B infekcije, izlaganja, ili bolesti. Termin hepatitis B-povezano stanje uključuje hroničnu HBV infekciju, inflamaciju, fibrozu, cirozu, kancer jetre, serumski hepatitis, žuticu, kancer jetre, inflamaciju jetre, fibrozu jetre, cirozu jetre, otkazivanje jetre, difuznu hepatocelularnu inflamatornu bolest, hemofagocitni sindrom, serumski hepatitis, HBV viremiju, bolest jetre povezanu sa transpalntacijom, i stanja koja imaju simptome koji mogu uključivati bilo koje ili sve od sledećeg: bolest slična gripu, slabost, bolovi, glavobolja, groznica, gubitak apetita, dijareja, mučnina i povraćanje, bol u predelu jetre, glinasta- ili sivo objena stolica, svrab po celom telu, i urin tamne boje, koja su povezana sa pozitivnim testom za hepatitis B virus, hepatitis B virusni antigen, ili pozitivni test za prisustvo antitela specifičnog za hepatitis B virusni antigen.
"Hibridizacija" označava aniling komplementarnih moleula nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, komplemntarni molekuli nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens jedinjenje i targhet nukleinsku kiselinu. U određenim slučajevima, komeplementaerni molekuli nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens oligonukleotide i target nukelinsku kiselinu.
"Identifikacija životinje koja ima HBV infekciju" označava identifikaciju životinje koja je dijagnostifikovana sa HBV; ili, identifikovanje životinje koja ima bilo koji simptom HBV infekcije uključujući, ali se ne ograničavajući na hroničnu HBV infekciju, inflamaciju, fibrozu, cirozu, kancer jetre, serumski hepatitis, žuticu, kancer jetre, inflamaciju jetre, kancer jetre, inflamaciju jetre, fibrozu jetre, cirozu jetre, otkazivanje jetre, difuznu hepatocelularnu inflamatornu bolest, hemofagocitni sindrom, serumski hepatitis, HBV viremiju, bolest jetre povezanu sa transpalntacijom, i stanja koja imaju simptome koji mogu uključivati bilo koje ili sve od sledećeg: bolest slična gripu, slabost, bolovi, glavobolja, groznica, gubitak apetita, dijareja, mučnina i povraćanje, bol u predelu jetre, glinasta- ili sivo objena stolica, svrab po celom telu, i urin tamne boje, koja su povezana sa pozitivnim testom za hepatitis B virus, hepatitis B virusni antigen, ili pozitivni test za prisustvo antitela specifičnog za hepatitis B virusni antigen.
"Neposredno susedan" označava da ne postoje međuelementi između neposredno susednih elemenata.
"Individua" označava humanu ili ne-humanu životinju za tretman ili terapiju.
"Individualna komplijansa " označava pridržavanje preporučene ili prepisane terapije od strane bilo koje individue.
"Indukovati", "inhibirati", "potencirati", "podići", "povećati", "smanjiti" ili slično, generalno označavaju kvantitativne razlike između dva stanja. Takvi termini se mogu odnosti na statistički značajnu razliku između dva stanja. Na primer, "količina efikasna da inhibira aktivnost ili ekspresiju HBV" označava da nivo aktivnosti ili ekspresije HBV u tretiranom uzorku će se kvantitativno razlikovati, i može biti statistički značajan, od nivoa HBV aktivnosti ili ekspresije kod netretiranih ćelija. Takvi termini se primenjuju na, na primer, nivoe ekspresije, i nivoe aktivnosti.
"Inhibirane HBV" označava smanjenje nivoa ili ekspresije HBV iRNK, DNK i/ili proteina. U određenim slučajevima, HBV je inhibiran u prisustvu antisens jedinjenja koje targetira HBV, uključujući antisens oligonukleotid targeting HBV, u poređenju sa nivoom ekspresije HBV iRNK, DNK i/ili proteina u odsustvu HBV antisens jedinjenja, kao što je antisens oligonukleotid. "Inhibiranje ekspresije ili aktivnosti" odnosi se na smanjenje, blokadu ekspresije ili aktivnosti i ne mora da označava potpuno eliminisanje ekspresije ili aktivnosti.
1
"Reakcija na mestu injekcije" označava inflamaciju ili abnormalno crvenilo kože na mestu injekcije kod individue.
"Internukleozidna veza" se odnosi na hemijsku vezu između nukleozida.
"Intraperitonealna primena" označava primenu preko infuzije ili injekcije u peritoneum.
"Intravenska primena" označava primenu u venu.
"Produženi" antisens oligonukleotidi su oni koji imaju jedan ili više dodatnih nukelozida u odnosu na antisens oligonukleotid opisan ovde.
"Povezani deoksinukleozid" označava bazu nukleinske kiseline (A, G, C, T, U) supstituisanu sa deoksiribozom povezanom sa fosfatnim estrom za formiranje nukleotida.
"Vezani nukleozidi" označava susedne nukleozide međusobno povezane sa internukleozidnom vezom.
"Zaključana nukelinska kiselina" ili "LNA" ili "LNA nukleozidi" označavaju monomere nukleinske kiseline koji imaju most koji vezuje dva atoma ugljenika između 4’ i 2’ položaja jedinice šećera nukleozida, čime se dormira biciklični šećer. Primeri takvog bicikličnog šećera uključuju, ali nisu ograničeni na A) α-L-Metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA , (B) β-D-Metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA, (C) Etilenoksi (4’-(CH2)2-O-2’) LNA , (D) Aminooksi (4’-CH2-O-N(R)-2’) LNA and (E) Oksiamino LNA, as depicted below.
Kao što je ovde korišćeno, LNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, jedinjenja koja imaju najmanje jedan most između 4’ i 2’ položaja šećera gde svaki od mostova nezavisno sadrži 1 ili od 2 do 4 vezane grupe nezavisno izabrane od -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- i -N(R1)-; gde: x je 0, 1, ili 2; n je 1, 2, 3, ili 4; svaki R1i R2je, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterocciklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.
Primeri 4’- 2’ premošćujućih grupa obuhvaćeni definicijom LNA uključuju, ali nisu ograničeni na jednu od formula: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- ili -C(R1R2)-O-N(R1)-. Dodatno, druge premošćujuće grupe obuhvaćene sa definicijom LNA su 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ i 4’-CH2-N(R1)-O-2’-mostovi, gde je svaki R1i R2, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
Takođe uključeno unutar definicije LNA prema opisu su LNAs u kojima je 2’-hidroksil grupa ribozil šećera vezana sa 4’ ugljenikovim atomom prstena šećera, čime se formira metilenoksi (4’-CH2-O-2’) most da bi se formirao biciklični šećerni deo. Most može takođe biti metilen (-CH2-) grupa koja povezuje 2’ atom kiseonika i 4’ ugljenikov atom, za koje se koristi termin metilenoksi LNA. Dodatno; u slučaju bicikličnog šećernog dela koji ima etilen premošćujuću grupu na ovom položaju, korišćen je termin etilenoksi (4’-CH2CH2-O-2’) LNA. α-L- metilenoksi (4’-CH2-O-2’), izomer metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA je takođe obuhvaćen definicijom LNA, kao što je ovde korišćeno.
"Nepodudaranje" ili "ne-komplementarna nukleobaza" odnosi se na slučaj kada nukleobaza prve nukleinske kiseline nije sposobna da se upari sa odgovarajućom nukleobazom druge ili target nukleinske kiseline.
"Modifikovana internuklozidna veza" odnosi se na supstituciju ili bilo koju promenu u odnosu na prirodnu internukleozidnu vezu (tj. fosfodiestarsku vezu).
"Modifikovana nukleobaza" označava bilo koju nukleobazu osim adenina, citozina, guanina, timidina, ili uracila. "Nemodifikovana nukleobaza" označava purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U).
"Modifikovani nukleozid" označva nukleozid koji ima, nezavisno, modifikovani šećerni deo i/ili modifikovanu nukleobazu.
"Modifikovani nukleotid" označava nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovani šećerni deo, modifikovanu internukleozidnu vezu, ili modifikovanu nukleobazu.
"Modifikovani oligonukleotid" označva oligonukleotid koji sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, modifikovani šećer, i/ili modifikovanu nukleobazu.
"Modifikovani šećer" označava supstituciju i/ili bilo koju promenu u odnosu na prirodni šećerni deo.
"Monomer" se odnosi na jednu jedinicu oligomera. Monomeri uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleozide i nukleotide, bilo da su prirodni ili modifikovani.
"Motiv" označava obrazac nemodifikovanih i modifikovanih nukleozida u antisens jedinjenju.
"Prirodni šećerni deo" označava šećerni deo koji se nalazi u DNK (2’-H) ili RNK (2’-OH).
1
"Prirodna internukleozidna veza" označava 3’ do 5’ fosfodiestaersku vezu.
"Ne-komeplementarna nukleobaza" odnosi se na par nukleobaza koji međusobno ne formira vodonične veze ili na drugi način podržava hibridizaciju.
"Nukleinska kiselina" odnosi se na molekule sastavljene od monomernih nukleotida. Nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, ribonukleinske kiseline (RNK), deoksiribonukleinske kiseline (DNK), jednolančane nukleinske kiseline, dvolančane nukleinske kiseline, male interferirajuće ribonukleinske kiseline (siRNK), i mikroRNK (miRNK).
"Nukleobaza" označava heterociklični deo sposoban da se upari sa bazom druge nukleinske kiseline.
"Komplementarnost nukleobaze" odnosi se na nukleobazu koja je sposobna za bazno sparivanje sa drugom nukleobazom. Na primer, u DNK, adenin (A) je komplementaran sa timinom (T). Na primer, u RNK, adenin (A) je komplementaran sa uracilom (U). U određenim slučajevima, komplementarna nukleobaza se odnosi na nukleobazu antisens jedinjenja koje je sposobno za bazno sparivanje sa nukleobazom njegove target nukleinske kiseline. Na primer, ukoliko je nukleobaza na određenom položaju antisens jedinjenja sposobna da stvara vodonične veze sa nukleobazom na određenom položaju target nukleinske kiseline, onda se položaj vodoničnog vezivanja između oligonukleotida i target nukleinske kiseline smatra komplementarnim na tom nukleobaznom paru.
"Sekvenca nukleobaze" označava redosled neprekidnih nukleobaza nezavisno od bilo kog šećera, veze, i/ili modifikacije nukleobaze.
"Nukleozid" označava nukleobazu vezanu za šećer.
"Nukleozidni mimetik" uključuje one strukture korišćene za zamenu šećera ili šećera i baze i ne obavezno veze na jednom ili više položaja oligomernog jedinjena kao što su na primer nukleozidni mimetici koji imaju morfolino, cikloheksenil, cikloheksil, tetrahidropiranil, biciklo ili triciklo šećerne mimetike, npr., ne furanozne šećerne jedinice. Nukleotidni mimetici uključuju one strukture koje se koriste za zamenu nukleozida i veze na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja kao što su na primer peptidne nukleinske kiseline ili morfolino (morfolino vezan sa -N(H)-C(=O)-O- ili drugom ne-fosfodiestarskom vezom). Surogat šećera se preklapa sa nešto širim terminom nukleozidni mimetik ali je namera da označava zamenu samo šećerne jedinice (furanozni prsten). Tetrahidropiranil prstenovi obezbeđeni ovde su ilustartivni za primer surogata šećera gde je furanozna šećerna grupa zamenjena sa tetrahidropiranil sistemom prstena. "Mimetik" se odnosi na grupe koje su suptituisane sa šećerom, nukleobazom, i/ili internukleozidnom vezom. Generalno, mimetik se koristi umesto šećera ili kombinacije šećer internukleozidna veza, i nukleobaza je održavana za hibridizaciju sa izabranim targetom.
1
"Nukleotid" označava nukleozid koji ima fosfatnu grupu kovalentno vezanu sa šećernim delom nukleozida.
"Off-target efekat" se odnosui na neželjeni ili štetni biološki efekat povezan sa modulacijom ekspresije gena RNK ili proteina različitog od nameravane target nukleinske kiseline.
"Oligomerno jedinjenje" označava polimer vezanih monomernih subjedinica koji je sposoban da hibridizuje sa najmanje regionom molekula nukleinske kiseline.
"Oligonukleozid" označava oligonukleotid u kojem internukleozidne veze ne sadrže atom fosfora.
"Oligonukleotid" označava polimer vezanih nukleozida od kojih svaki može biti modifikovan ili nemodifikovan, međusobno nezavisno.
"Parenteralna primena" označva primenu preko injekcije (npr., bolus injekcija) ili infuzija. Parenteralna primena uključuje potkožnu primenu, intravensku primenu, intramuskularnu primenu, intraarterijalnu primenu, intraperitonealnu primenu, ili intrakraniajlnu primenu, npr., intratekalnu ili intracerebroventrikularnu primenu.
"Peptid" označava molekul formiran vezivanjem najmanje dve aminoksieline amidnim vezama. Bez ograničenja, kao što je ovde korišćeno, "peptid" se odnosi na polipeptide i proteine.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" označava medijum ili razblaživač koji se ne utiče na strukturu oligonukleotid. Određeni takvi nosači omogućuju da farmaceutske kompozicije budu formulisane kao, na primer, tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije, suspenzije i lozenge za oralno uzimanje od strane subjekta.
"Farmaceutski prihvatljiv derivat" obuhvata farmaceutski prihvatljive soli, konjugate, prolekove ili izomere jedinjenja opisanih ovde.
"Farmaceutski prihvatljive soli" označavaju fiziološki i faramceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost roditeljskog oligonukleotida i ne izazivaju neželjene toksikološke efekte.
"Farmaceutsko sredstvo" označava supstancu koja obezbeđuje terapeutski benefit kada se primenjuje na individuu. Na primer, u određenim slučajevima, antisens oligonukleotid koji targetira HBV je farmaceutsko sredstvo.
"farmaceutska kompozicija" označava smešu supstanci pogodnih za primenu na subjekta. Na primer, farmaceutska kompozicija može sadržati antisens oligonukleotid i sterilni vodeni rastvor. U određenim slučajevima, farmaceutska kompozicija pokazuje aktivnost u atestu slobodnog preuzimanja kod određenih ćelijskih linija.
"Fosforotioatna veza" označava vezu između nukleozida gde je fosfodiestarska veza modifikovana zamenom jednog od ne-premošćujućih atoma kiseonika sa atomom sumpora. Fosforotioatna veza je modifikovana internukleozidna veza.
1
"Deo" označava definisani broj neprekidnih (tj., vezanih) nukleobaza nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, deo je definisan broj neprekidnih nukleobaza target nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, deo je definisani broj neprekidnih nukleobaza antisens jedinjenja. "Prevencija" ili "sprečavanje" odnosi se na odlaganje ili predupređivanje nastanka ili razvoja stanja ili bolesti u vremenskom periodu od časova do dana, poželjno nedelja do meseci.
"Prolek" označava terapeutsko sredstvo koje je pripremljeno u enaktivnom obliku koji je konvertovan u aktivni oblik (tj., lek) unutar tela ili njegovih aktivnošću endogenih enzima ili drugih hemikalija i/ili uslova.
"Profilaktički efikasna količina" se odnosi na količinu farmaceutskog sredstva koja obezbeđuje profilaktičku ili preventivnu korist životinji.
"Preporučena terapija" označava terapeutski režim preporučen od strane profesionalne medicinske osobe za tretman, ublažavanje, ili prevenciju bolesti.
"Region" je definisan kao deo target nukleinske kiseline koji ima najmanje jednu strukturu, funkciju ili karakteristiku koja se može identifikovati.
"Ribonukleotid" označava nukleotid koji ima hidroksi na 2’ položaju šećernog dela nukleotida. Ribonukleotidi smogu biti modifikovani sa bilo kojim od različitih supstituenata.
"Soli" označavaju fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost roditeljskog oligonukleotida i ne daju neželjene toksikološke efekte.
"Segmenti" su definisani kao manji ili sub-delovi regiona unutar target nukleinske kiseline.
"Serokonverzija" je definisana kao odsutnost HBeAg u serumu plus prisustvo HBeAb u serumu, ukoliko se prati HBeAg kao determinanta za serokonverziju, ili definisano kao odsustvo HBsAg u serumu, ukoliko se prati HBsAg kao determinanta za serokonverziju, kao što je određenop trenutno dostupnim granicama detekcije komercijalnih ELISA sistema.
"Skraćene" ili "isečene" verzije antisens oligonukleotida date vode, dva ili više deletiranih nukleozida.
"Sporedni efekti" označavaju fiziološke odgovore koji se mogu pripisati tretmanu pored željenih efekata. U određenim slučajevima, sporedni efekti uključuju, bez ograničenja, reakcije na mestu injekcije, abnormalnosti testa funkcije jetre, abnormalnosti renalne funkcije, toksičnost po jetru, renalna toksičnost, abnormalnosti centralnog nervnog sistema, i miopatije. Na primer, povećani nivoi aminotransferaze u serumu mogu ukazati na toksičnost po jetru ili abnormalnost u funkcionisanju jetre. Na primer, povećani bilirubin može ukazati na toksičnost po jetru ili abnormalnost u funkcionisanju jetre.
1
"Značajan," kao što je ovde korišćeno označava merljiv ili uočljiv, npr, značajan rezultat, kao što je, značajno poboljšanje ili značajno smanjenje generalno se odnosi na merljiv ili uočljiv rezultat, kao što je merljivo ili uočljivo poboljšanje ili smanjenje.
"Mesta," kao što je ovde korišćeno, su definisana kao jedinstveni položaji nukleobaza unutar target nukleinske kiseline.
"Sporo napredovanje" označava smanjenje u razvoju pomenute bolesti.
"Specifično hibridizovanje" odnosi se na antisens jedinjenje koje ima dovoljan stepen komplementarnosti između antisens oligonukleotida i target nukleinske kiseline da bi se indukovao željeni efekat, uz pokazivanje minimalnih ili nikakvih efekata na ne-target nukleinske kiseline pod uslovima u kojima je poželjno specifično vezivanje, npr., pod fiziološkim uslovima u slučaju in vivo analiza i terapeutskih tretmana.
"Stringentni hibridizacioni uslovi" ili "stringentni uslovi" odnose se na uslove pod kojima će oligomerno jedinjenje hibridizovati sa svojom target sekvencom, ali sa minimalnim brojem drugih sekvenci.
"Statistički značajno," kao što je ovde korišćeno označava merljivi ili uočljivi parametar koji je malo verovatan.
"Potkožna primena" označava primenu neposredno sipod kože.
"Subjekt" označava humanu ili ne-humanu životinju izabranu za tretman ili terapiju.
"Target" se odnosi na protein, čije je modulacija poželjna.
"Target gen" se odnosi na gen koji kodira target.
"Targeting" označava proces dizajniranja i selekcije antisens jedinjenja koje će specifično hibridizovati sa target nukleinskom kiselinom i indukovati željeni efekat.
"Target nukleinska kiselina," "target RNK," "target RNK transkript" i "nukleinska kiselina target" svi označavaju nukleinsku kiselinu koja je sposobna da se targetira sa antisens jedinjenjima.
"Target region" označava deo target nukleinske kiseline na koji je jedno ili više antisens jedinjenja targetirano.
"Target segment" označava sekvencu nukleotida target nukleinske kiseline na koju je antisens jedinjenje targetirano. "5’ target mesto" odnosi se na najviše 5’ nukleotid target segmenta. "3’ target mesto" odnosi se na najviše 3’ nukleotid target segmenta.
"Terapeutski efiaksna količina" označava količinu farmaceutsko sredstvo koje obezbeđuje terapeutsku korist individui.
"Tretman" se odnosi na primenu kompozicije za izvođenje izmene ili poboljšanje bolesti ili stanja.
1
"Nemodifikovane" nukleobaze označavaju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U).
"Nemodifikovani nukleotid" označava nukleotid koji je sastavljen od prirodnih nukleobaza, šećernih delova, i internukleozidnih veza. U određenim slučajevima, nemodifikovani nukleotid je RNK nukleotid (tj. β-D-ribonukleozidi) ili DNK nukleotid (tj. β-D-deoksiribonukleozid). "Validirani target segment" je definisan kao najmanje deo od 8-nukleobaza (tj. 8 uzastopnih nukleobaza) target regiona na koji je aktivno oligomerno jedinjenje targetirano.
"Krilni segment" označava više nukleozida modifikovanih da daju oligonukleotidu osobine kao što je poboljšana inhibitorna aktivnost, povećana afinitet vezivanja za target nukleinsku kiselinu, ili otpornost na degradaciju sa in vivo nukleazama.
Određeni primeri izvođenja
[0019] Pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, za upotrebu u tretiranju HBV-povezane bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta, gde bolest, poremećaj ili stanje je žutica, zapaljenje jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, otkazivanje jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serumski hepatitis, HBV viremija, ili transplantacija povezana sa bolešću jetre, gde se jednolačani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju sekvencu nukleobaza iz SEQ ID NO: 226 i sadrži: gap segment koji se sastoji od deset veaznih deoksinukleozida; 5’ krilni segment koji se sastoji od 5 veaznih nukleozida; i 3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; gde gap segment se nalazi između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, gde svaki nukleozid svakog krilnog segmenta sadrži 2’- O-metoksietil šećer, gde svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza.
[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u tretiranju HBV-povezane bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta, gde nolest, poremećaj ili stanje je žutica, zapaljenje jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, otkazivanje jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serumski hepatitis, HBV viremija, ili transplantacija povezana sa bolešću jetre, gde kompozicija sadrži jedinjenje, ili njegovu so, i farmaceutski prihvatljivi noasč ili razblaživač, gde jedinjenje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, gde se jednolančani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu iz SEQ ID NO: 226 i sadrži: gap segment koji se sastoji od deset vezanih deoksinukleozida; 5’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; i 3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; gde se gap segment nalazi između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, gde svaki nukleozid svakog krilnog segmenta
2
sadrži 2’-O-metoksietil šećer, gde svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza, i gde svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0021] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije sadrže so modifikovanog oligonukleotida.
[0022] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije dodatno sadrže farmaceutski prihvatljivi nosač ili razblaživač.
[0023] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja, i kompozicijne inhibiraju HBV iRNK eskpresiju i/ili nivoe DNK i/ili nivoe proteina i/ili nivoe antigena.
[0024] Ovde je opiasn postupak za tretiranje HBV-povezanih bolesti, poremećaja, i stanja kod sisara, pri čenu postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine bilo koje farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno, tako da se tretiraju HBV-povezane bolesti, poremećaji, i stanje. U povezanim slučajevima, sisar je čovek i HBV-povezana bolest, poremećaj, i stanje je infekcija virusom hepatitisa B od humanog hepatitis B virusa. Specifičnije, humani hepatitis B virus može bitibilo koji od humanih geografskih genotipova: A (Severozapadna Evropa, Severna Amerika, Centralna Amerika); B (Indonezija, Kina, Vijetnam); C (Istočna Azija, Koreja, Kina, Japan, Polinezija, Vijetnam); D (Mediteranska oblast, Bliski Istok, Indija); E (Afrika); F (Indijanci, Polinezija); G (Sjedinjene Države, Francusaka); ili H (Centralna Amerika).
[0025] U određenim primerima izvođenja, ISIS 505358 izaziva najmanje 50% inhibicije HBV iRNA.
[0026] U određenim primerima izvođenja, ISIS 505358 izaziva najmanje 60% inhibicije HBV iRNA.
[0027] U određenim primerima izvođenja, ISIS 505358 e izaziva najmanje 70% inhibicije HBV iRNA.
[0028] U određenim primerima izvođenja, ISIS 505358 izaziva najmanje 80% inhibicije HBV iRNA.
[0029] Primeri HBV-povezanih bolesti, poremećaja ili stanja uključuju, ali nisu ograničeni na hroničnu HBV infekciju, žuticu, kancer jetre, inflamaciju jetre, fibrozu jetre, cirozu jetre, otkazivanje jetre, difuznu hepatocelularnu inflamatornu bolest, hemofagocitni sindrom, serumski hepatitis, HBV viremiju, i stanja koja imaju simptome koji mogu uključivati bilo koje ili sve od sledećeg: bolest slična gripu, slabost, bolovi, glavobolja, groznica, gubitak apetita, dijareja, mučnina i povraćanje, bol u predelu jetre, glinasta- ili sivo objena stolica, svrab, i urin tamne boje, koja su povezana sa pozitivnim testom za hepatitis B virus, hepatitis B virusni antigen, ili pozitivni test za prisustvo antitela specifičnog za hepatitis B virusni antigen.
[0030] Ovde je opiasn postupak za smanjenje ekspresije HBV iRNK u životinji koji sadrži primenu na životinju jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. U određenim slučajevima, jedinjenje ili kompozicija sadrži modifikovani oligonukleotid dužine 10 do 30 vezanih nukleozida koji targetira HBV. U određenim slučajevima, smanjenje ekspresije HBV iRNK u životinji sprečava, ublažava ili tretira HBV-povezanu bolest, poremećaj ili stanje. U određenim slučajevima, smanjenje ekspresije HBV iRNK u životinj i sprečava, ublažava ili tretira bolest jetre. U određenim slučajevima, ekspresija HBV iRNK je smanjena najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0031] Ovde je opisan postupak za smanjenje nivoa HBV proteina u životinji koji sadrži primenu na živortinj jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. U određenim slučajevima, jedinjenje ili kompoziicja sadrž imodifikovani oligonukleotid dužine 10 do 30 vezanih nukleozida koi targetiraju HBV. U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV proteina u životinji sprečava, ublažava ili tretira HBV-povezanu bolest, poremećaj ili stanje. U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV proteina u životinji sprečava, ublažava ili tretira bolest jetre. U određenim slučajevima, nivo HBV proteina je smanjne najmanje za 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0032] Ovde je opisan postupak za smanjenje nivoa HBV DNK u životinji koji sadrži primenu na životinju jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. U određenim slučajevima, jedinjenje ili kompozicija sadrži modifikovani oligonukleotid dužine 10 do 30 vezanih nukleozida targetiranih na HBV. U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV DNK u životinji sprečava, ublažava ili tretira HBV-povezanu bolest, poremećaj ili stanje. U određenim slučajevima, sisar može biti čovek, i hepatitis B virus može biti humani hepatitis B virus. Specifičnije, humani hepatitis B virus može biti bilo koji od geografskih genotipova: A (Severozapadna Evropa, Severna Amerika, Centralna Amerika); B (Indonezija, Kina, Vijetnam); C (Istočna Azija, Koreja, Kina, Japan, Polinezija, Vijetnam); D (Mediteranska oblast, Bliski Istok, Indija); E (Afrika); F (Indijanci, Polinezija); G (Sjedinjene Države, Francusaka); ili H (Centralna Amerika). U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV DNK u životinji sprečava, ublažava ili tretira bolest jetre. U određenim slučajevima, Nivo HBV DNK je smanjen najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0033] Ovde je opisan postupak za smanjenje nivoa HBV antigena u životinji koji sadrži primenu na životinju jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. U određenim slučajevima, jedinjenje ili kompozicija sadrži modifikovani oligonukleotid dužine 10 do 30 vezanih nukleozida targetiran na HBV. U određenim slučajevima, antigen je HBsAG ili HBeAG. U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV antigena u životinji sprečava, spublažava ili tretira HBV-vezanu bolest, poremećaj ili stanje. U određenim slučajevima, smanjenje nivoa HBV antigena u životinji sprečava, ublažava ili tretira bolest jetre. U određenim slučajevima, nivoi HBV antigena su smanjeni najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0034] Ovde je opisan postupak za smanjenje HBV DNK i HBV antigena kod životinje inficirane sa hepatitis B virusom, koji sadrži primenu na životinju jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. U određenim slučajevima, jedinjenje ili kompozicija sadrži modifikovani oligonukleotid dužine 10 do 30 vezanih nukleozida targetiranih na HBV. U određenim slučajevima, antigen je HBsAG ili HBeAG. U određenim slučajevima, količina HBV antigena može biti dovoljno smanjena da rezultuje u serokonverziji, definisanoj kao odsustvo HBeAg u serumu plus prisustvo HBeAb u serumu ukoliko je praćen HBeAg kao determinanta za serokonverziju, ili definisanoj kao odsustvo HBsAg u serumu ukoliko se prati HBsAg kao determinanta za serokonverziju, kao što je određeno trenutno dostupnim detecionim granicama komercijalnih ELISA sistema.
[0035] Ovde je opisan postupak za tretiranje životinje sa HBV povezanom bolešću, poremećajem ili stanjem koji sadrži: a) identifikovanje pomenute životinje sa HBV povezanom bolešću, premećajem ili stanjem, i b) primenu na pomenutu životinju terapeutski efikasne količine jedinjenja ili kompozicije koaj sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 14 do 20 vezanih nukleozida i koji ima nukleobaznu sekvencu najmanje 90% komplementarnu sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362, i 1363, kao što je mereno celom dužinom pomenutog modifikovanog oligonukleotida. U određenim slučajevima, terapeutski efiaksna količina jedinjenja ili kompozicije primenjene na životinju tretira ili smanjuje HBV povezanu bolest, poremećaj ili stanje, ili njen simptom, kod životinje. U određenim slučajevima, HBV povezana bolest, poremećaj ili stanje je bolest jetre. U određenim slučajevima, povezana bolest, poremećaj ili stanje je hronična HBV infekcija, žutica, kancer jetre, inflamacija jetre, fibroza jetre, ciroza jetre, insuficijencija jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija povezana sa bolešću jetre.
[0036] Ovde je opisan postupak za tretiranje životinje sa HBV povezanom bolešću, poremećajem ili stanjem koji sadrži: a) identifikovanje pomenute životinje sa HBV povezanom bolešću, premećajem ili stanjem, i b) primenu na pomenutu životinju terapeutski efikasne količine jedinjenja ili kompozicije koaj sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 14 do 20 vezanih nukleozida i koji ima nukleobaznu sekvencu najmanje 90% komplementarnu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, kao što je mereno celom dužinom pomenutog modifikovanog oligonukleotida. U određenim slučajevima, terapeutski efiaksna količina jedinjenja ili
2
kompozicije primenjene na životinju tretira ili smanjuje HBV povezanu bolest, poremećaj ili stanje, ili njen simptom, kod životinje. U određenim slučajevima, HBV povezana bolest, poremećaj ili stanje je bolest jetre. U određenim slučajevima, povezana bolest, poremećaj ili stanje je hronična HBV infekcija, žutica, kancer jetre, inflamacija jetre, fibroza jetre, ciroza jetre, insuficijencija jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija povezana sa bolešću jetre.
[0037] U određenim slučajevima, životinja je čovek.
[0038] U određenim slučajevima, jedinjenja ili kompozicije su označene kao prvo sredstvo. U određenim slučajevima, postupci sadrže primenu prvog sredstva i jednog ili više drugih sredstava. U određenim slučajevima, postupci sadrže primenu prvog sredstva i jednog ili više drugih sredstava. U određenim slučajevima, prvo sredstvo i jedno ili više drugih sredstava su koprimenjeni. U određenim slučajevima prvo sredstvo i jedno ili više drugih sredstava su koprimenjeni sekvencijalno ili istovremeno.
[0039] U određenim slučajevima, jedno ili više drugih sredstava su takođe jedinjenje ili kompozicija opisani ovde. U određenim slučajevima, jedno ili više drugih sredstava su različiti od jedinjenja ili kompozicije opisane ovde. Primeri jednog ili više drugih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-inflamatorno sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo ili anti-infektivno sredstvo.
[0040] U drugim povezanim slučajevima, dodatno terapeutsko sredstvo može biti HBV sredstvo, HCV sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, antibiotik, analgetik, ne-steroidno anti-inflamatorno (NSAID) sredstvo, antifungalno sredstvo, antiparasitsko sredstvo, sredstvo protiv mučnine, antisredstvo protiv dijareje, ili imunosupresivno sredstvo.
[0041] U određenim slučajevima, jedno il više drugih sredstava su HBV sredstvo. U određenim slučajevima HBV sredsrtvo može uključivati, ali nije ograničeno na, interferon alfa-2b, interferon alfa-2a, i interferon alfakon-1 (pegilovani i nepegilovani), ribavirin; HBV RNK inhibitor replikacije; drugi antisens oligomer; HBV terapeutska vakcina; HBV profilaktička vakcina; lamivudin (3TC); entekavir (ETV); tenofovir diizoproksil fumarat (TDF); telbivudin (LdT); adefovir; ili terapija HBV antitelom (monoklonsko ili poliklonsko).
[0042] U određenim slučajevima, jedan ili više drugih sredstava je HCV sredstvo. U određenim slučajevima HBV sredstvo može uključivati, ali nije ograničeno na interferon alfa-2b, interferon alfa-2a, i interferon alfakon-1 (pegilovani i nepegilovani); ribavirin; HCV RNK inhibitor replikacije (npr., ViroPharma VP50406 serija); HCV antisens sredstvo; HCV terapeutska vakcina; HCV inhibitor proteaze; HCV inhibitor helikaze; ili terapija HCV monoklonskim ili poliklonskima antitelom.
[0043] U određenim slučajevima, jedno ili više drugih sredstava su anti-inflamatorna sredstva (tj., terapija za smanjenje inflamacije). U određenim slučajevima terapija za smanjenje inflamacije moež uključivati, ali nije ograničena na, terapeutsku promenu načina života, steroid, NSAID ili DMARD. Steroid može biti kortikosteroid. NSAID može biti aspirin, acetaminofen, ibuprofen, naproksen, COX inhibitori, indometacin i slično. DMARD može biti TNF inhibitor, inhibitor sinteze purina, inhibitor kalcineurina, inhibitor sinteze pirimidina, sulfasalazin, methotreksat i slično.
[0044] U određenim slučajevima, jedno ili više drugih sredstava su hemoterapeutska sredstva (tj., sredstvo za tretiranje kancera). Hemoterapeutska sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, daunorubicin, daunomcin, daktinomicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, esorubicin, bleomicin, mafosfamid, ifosfamid, citozin arabinozid, bis-hloroetilnitrozurea, busulfan, mitomicin C, actinomicin D, mitramicin, prednizon, hidroksiprogesteron, testosteron, tamoksifen, dakarbazin, prokarbazin, heksametilmelamin, pentametilmelamin, mitoksantron, amsakrin, hlorambucil, metilcikloheksilnitrozurea, azotni iperit, melfalan, ciklofosfamid, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin (CA), 5-azacitidin, hidroksiure, deoksikoformicin, 4-hidroksiperoksiciklofosforamid, 5-fluorouracil (5-FU), 5-fluorodeoksiuridin (5-FUdR), metotreksat (MTX), kolhicin, taksol, vinkristine, vinblastin, etoposid, trimetreksat, teniposid, cisplatin, gemcitabin i dietilstilbestrol (DES).
[0045] U određenim slučajevima, jedno ili više drugih sredstava su anti-infektivna sredstva. Primeri anti-infektivnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, antibiotike, antifungalne lekove i antivirusne lekove.
[0046] U određenim slučajevima, primena sadrži parenteralnu primenu.
[0047] Ovde je opisan postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije kao što je opisano prethodno na sisara kome je to potrebno da bi se smanjila hepatitis B virus infekcija i hepatitis B antigen, u poređenju sa količinom HBV iRNK, proteina i količine HBV antigena kod sisara pre tretmana. U nekim slučajevima, sisar može biti čovek, i hepatitis B virus može biti humani hepatitis B virus. Specifičnije, humani hepatitis B virus može biti bilo koji od humanih geografskih genotipova: A (Severozapadna Evropa, Severna Amerika, Centralna Amerika); B (Indonezija, Kina, Vijetnam); C (Istočna Azija, Koreja, Kina, Japan, Polinezija, Vijetnam); D (Mediteranska oblast, Bliski Istok, Indija); E (Afrika); F (Indijanci, Polinezija); G (Sjedinjene Države, Francusaka); ili H (Centralna Amerika).
[0048] U određenim slučajevima, opisan je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranih sa hepatitis B virusom, pri čemu
2
postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije ka ošto je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno tako da bi se smanjila infekcija hepatitis B virusom i hepatitis B antigen, u poređenjeu sa količinom HBV iRNK, proteina i količinom HBV antigena u sisaru pre tretmana, gde je količina iRNK smanjena najmanje 70% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U određenim slučajevima, opisna je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno da bi se smanjila infekcija hepatitis B virusom i hepatitis B antigen, u poređenju as količinom HBV iRNK, proteinom i količinom HBV antigena kod sisara pre tretmana, pri čemu je količina iRNK smanjena najmanje 75% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U određenim slučajevima, opisan je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisar akome je to potrebno tako da se smanji infekcija hepatitis B virusom i hepatitis B antigen, u poređenju sa količinom HBV iRNK, proteina i količinom HBV antigena kod sisara pre tretmana, pri čemu je kolilčina iRNK smanjena najmanje 80% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U određenim slučajevima, opisan je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži terapeutski efiaksnu količinu farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno tako da se smanji infekcija hepatitis B virusom i hepatitis B antigen, u poređenju sa količinom HBV iRNK, proteina i količinom HBV antigena kod sisara pre tretmana, pri čemu je količina iRNK smanjena najmanje 85% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U određenim slučajevima, opisan je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži terapeutski efiaksnu količinu farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno tako da se smanji infekcija hepatitis B virusom i hepatitis B antigen, u poređenju sa količinom HBV iRNK, proteina i količinom HBV antigena kod sisara pre tretmana, pri čemu je količina iRNK smanjena najmanje 90% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U određenim slučajevima, opisan je postupak za smanjenje količine HBV iRNK, DNK, proteina i/ili količine HBV antigena kod sisara inficiranog sa hepatitis B virusom, pri čemu postupak sadrži terapeutski efiaksnu količinu farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara kome je to potrebno tako da se smanji infekcija hepatitis B virusom i
2
hepatitis B antigen, u poređenju sa količinom HBV iRNK, proteina i količinom HBV antigena kod sisara pre tretmana, pri čemu je količina iRNK smanjena najmanje 95% u poređenju sa količinom pre primene modifikovanog antisens oligonukleotida. U povezanim postupcima, HBV antigen može biti HBsAg ili može biti HBeAg, i specifičnije, količina HBV antigena može biti dovoljno smanjena da erzultuje u serokonverziji, definisanoj kao odsustvo HBeAg u serumu plus prisustvo HBeAb u serumu ukoliko se prati HBeAg kao determinanta za serokonverziju, ili definisano kao odsustvo HBsAg u serumu ukoliko se prati HBsAg kao determinanta za serokonverziju, kao što je određeno trenutno dostupnim granicama detekcije komercijalnih ELISA sistema.
[0049] Ovde je opisan postupak za promovisanje serokonverzije hepatitis B virusa kod sisara inficiranog sa HBV, pri čemu postupak sadrži primenu terapeutski efektivne količine farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano na sisara inficiranog sa hepatitisom B; praćenjem prisustva HBeAg plus HBeAb u uzorku seruma sisara, ili praćenjem prisustva HBsAg u uzorku seruma sisara, tako da odsustvo HBeAg plus prisustvo HBeAb u uzorku seruma ukoliko se prati HBeAg kao determinanta za serokonverziju, ili odsustvo HBsAg u uzorku seruma ukoliko se prati HBsAg kao determinanta za serokonverziju, kao što je određeno trenutno dostupnim granicama detekcije komercijalnih ELISA sistema, je indikacija serokonverzije kod sisara.
[0050] Ovde je opisana upotreba jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano za prevenciju, ublažavanje ili tretiranje bolesti jetre, ili njenog simptoma, kod životinje.
[0051] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su efikasne zahvaljujući tome što imaju najmanje jedan od in vitro IC50manji od 250 nM, manji od 200 nM, manji od 150 nM, manji od 100 nM, manji od 90 nM, manji od 80 nM, manji od 70 nM, manji od 65 nM, manji od 60 nM, manji od 55 nM, manji od 50 nM, manji od 49 nM, manji od 47 nM, manji od 46 nM, kada su isporučeni HepG2.2.1 ćelijama. U određenim slučajevima inhibicija je merena sa setom test prajmera RTS3370, kao što je ovde opisano.
[0052] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su efikasne zahvaljujući tome što imaju najmanje jedan od in vitro IC50 manji od 250 nM, manji od 200 nM, manji od 100 nM, manji od 90 nM, manji od 80 nM, manji od 70 nM, manji od 60 nM, manji od 50 nM, manji od 40 nM, manji od 35 nM, manji od 34 nM, manji od 33 nM, manji od 32 nM, manji od 31 nM, kada su isporučeni u HepG2.2.1 ćelije. U određenim slučajevima inhibicija je merena sa setom test prajmera RTS3371, kao što je ovde opisano.
[0053] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su efikasne zahvaljujući tome što imaju najmanje jedan od in vitro IC50 manji od 20 mM, manji od 10 mM, manji od 9.5 mM, manji od 9.0 mM, manji od 8.5 mM, manji od 8.0 mM, manji od 7.5
2
mM, manji od 7.0 mM, manji od 6.5 mM, manji od 6.0 mM, manji od 5.5 mM, manji od 5.0 mM, manji od 4.5 mM, manji od 4.0 mM, manji od 3.5 mM, manji od 3.0 mM, manji od 2.5 mM, kada su isporučeni u HepG2.2.1 ćelije.
[0054] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su visoko tolerabilne što je pokazano time što imaju najmanje jedan od povećanja vrednosti ALT ili AST od ne više od 4 puta, 3 puta, ili 2 puta u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom ili povećanju težine jetre, slezine, ili bubrega ne veće od 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5%, ili 2%. U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su visoko toleravbilne kao što je pokazano time što nemaju povećanje ALT ili AST u odnosu na životinje tretirane sa fiziološkim rastvorom. U određenim primerima izvođenja, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su visoko tolerabilne kao što je pokazano time što nemaju povećanje težine jetre, slezine, ili bubrega u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom.
[0055] Ovde je opisan komplet za tretiranje, prevenciju, ili ublažavanje HBV-povezane bolesti, poremečaja ili stanja, ili njenog simptoma, kao što je ovde opisano pri čemu komplet sadrži: a) jedinjenje ili kompozicije opisane ovde; i izborno b) dodatno sredstvo ili terapiju kao što je ovde opisano. Komplet može dodatno uključivati uputstva ili oznaku za upotrebu kompleta za tretiranje, prevenciju, ili ublažavanje HBV-povezane bolesti, poremećaja ili stanja.
Antisens jedinjenja
[0056] Oligomerna jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, oligonukleotide, oligonukleozide, oligonukleotidne analoge, oligonukleotidne mimetike, antisens jedinjenja, antisens oligonukleotide, i siRNK. Oligomerno jedinjenje može biti "antisens" za targeting nukleinske kiseline, što znači da je sposobno da podlegne hibridizaciji sa target nukleinskom kiselinom preko vodoničnih veza.
[0057] Antisens jedinjenje ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u 5’ do 3’ smeru, sadrži reverzni komplement target segmenta target nukleinske kiseline za koju je targetirana. Antisens oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u 5’ do 3’ smeru, sadrži reverzni komplement target segmenta target nukleinske kiseline za koju je targetiran.
Motivi antisens jedinjenja
[0058] Antisens jedinjenje za upotrebu prem apronalasku targetira HBV nukleinsku kiselinu i ima hemijski modifikovane subjedinice aranžirane u obrascima, ili motivima, da bi dali antisens
2
jedinjenju osobine kao što su pojačana inhibitorna aktivnost, povećani afinitet vezivanja za target nukleinsku kiselinu, ili rezistenciju na degradaciju sa in vivo nukleazama.
[0059] Himerna antisens jedinjenja tipično sadrže najmanje jedan region modifikovan tako da daje povećanu rezistenciju na degradaciju nukleazom, povećano ćelijsko preuzimanje, povećani afinitet vezivanja za target nukleinsku kiselinu, i/ili povećanu inhibitornu aktivnost. Drugi region himernog antisens jedinjenja može izborno služiti kao supstrat za ćelijsku endonukleazu RNkazu H, koja seče RNK lanac RNK:DNK dupleksa.
[0060] Antisens jedinjenja koja imaju gapmer motiv smatraju se himernim antisens jedinjenjima. U gapmer interni region koji ima više nukleotida koji podržavaju Rnkaza H sečenje je postavljen između ekternih regiona koji imaju više nukleotida koji su hemijski različiti od nukleozida internog regiona. U slučaju antisens oligonukleotida koji ima gapmer motiv, gap segment generalno služi kao supstrat za sečenje sa endonukleazom, dok krilni segmenti sadrže modifikovane nukleozide. U određenim slučajevima, regioni gapmera su diferencirani sa tipovima šećernih delova koji sadrže svaki različiti region. Tipovi šećernih delova koji su korišćeni za razlikovanje regiona gapmera mogu u nekim slučajevima uključivati β-D-ribonukleozide, β-D-deoksiribonukleozide, 2’-modifikovane nukleozide (takvi 2’-modifikovani nukleozidi mogu uključivati 2’-MOE i 2’-O-CH3, između ostalog), i nukelozide modifikovane sa bicikličnim šećerom (takvi nukleozidi modifikovani bicikličnim šećerom mogu uključivati one koji imaju ograničeni etil). U određenim slučajevima, nukleozidi u krilima mogu uključivati nekoliko modifikovanih šećernih delova, uključujući, na primer 2’- MOE i delove sa bicikličnim šećerom kao što su ograničeni etil ili LNA. U određenim slučajevima, krila mogu uključivati nekoliko modifikovanih i nemodifikovanih šećernih delova. U određenim slučajevima, krila mogu uključivati različite kombinacije 2’-MOE nukleozida, delova bicikličnog šećera kao što su nukleozidi sa ograničenim etilom ili LNA nukleozidi, i 2’-deoksinukleozidi.
[0061] Svaki različiti region može sadržati uniformne šećerne delove, varijantu, ili alternirajuće šećerne delove. Krilni gap-krilni motiv se često opisuje kao "X-Y-Z", gde "X" predstavlja dužinu 5’-krila, "Y" predtavlja dužinu gapa, i "Z" predstavlja dužinu 3’-krila. "X" i "Z" mogu sadržati uniformne, varijantu, ili alternirajuće šećerne delove. U određenim slučajevima, "X" i "Y" mogu uključivati jedan ili više 2’-deoksinukleozida."Y" može sadržati 2’- deoksinukleozide. Kao što je ovde korišćeno, gapmer opisan kao "X-Y-Z" ima konfiguraciju tako da je gap postavljen neposredno susedno svakom od 5’-krila i 3’ krila. Stoga, ne postoje nukleotidi između 5’-krila i gapa, ili gapa i 3’-krila. Bilo koje od antisens jedinjenja opisanih ovde može imati gapmer motiv.
Target nukleinske kiseline, target regioni i nukleotidne sekvence
2
[0062] Nukleotidne sekvence koje kodiraju HBV uključuju, bez ograničenja, sledeće: GENBANK Accession U95551.1 (ovde uključena kao SEQ ID NO: 1).
[0063] Podrazumeva se da je data sekvenca u svakoj SEQ ID NO u Primerima kojui se nalaze ovde je nezavisna od bilo kakve modifikacije šećernog dela, internukleozidne veze, ili nukleobaze. Kao takva, antisens jedinjenja definisana sa SEQ ID NO mogu sadržati, nezavisno, jednu ili više modifikacija šećernog dela, internukleozidne veze, ili nukleobaze. Antisens jedinjenja opisana sa Isis brojem (Isis No) označavaju kombinaciju nukleobazne sekvence i motiva.
[0064] U određenim slučajevima, target region je strukturno definisani region target nukleinske kiseline. Na primer, target region može obuhvatati 3’ UTR, 5’ UTR, egzon, intron, egzon/intron spoj, kodriajući region, region za inicijaciju translacije, region za terminaciju translacije, ili drugi definisani region nukleinske kiseline. Strukturno definsiani regioni za HBV mogu se dobiti prema pristupnom broju iz baze sekvenci kao što je NCBI. U određenim slučajevima, target region može obuhvatati sekvencu od 5’ target mesta jednog target segmenta unutar target regiona do 3’ target emsta drugog target segmenta unutar istog target regiona.
[0065] Targeting uključuje određivanje najmanje jednog target segmenta sa kojim antisens jedinjenje hibridizuje, tako da se dešava željeni efekat. U određenim slučajevima, željeni efekat je smanjenje nivoa iRNK target nuikleinske kiseline. U određenim slučajevima, željeni efekat je smnjenje nivoa proteina kodrianih sa target nukleinskom kiselinom ili fenotipska promena povezana sa target nukleinskom kiselinom.
[0066] Određivanje pogodnih target segmenata može uključivati poređenje Sekvence target nukleinske kiseline sa drugim sekvencama u genomu. Na primer, može se koristiti BLAST algoritam za identifikaciju regionsa sličnosti između različitih nukleinskih kiselina. Ovo poređenje može sprečiti selekciju sekvenci antisens jedinjenja koje mogu hibridizovati na nespecifični način sa sekvencama koje su različite od izabranih target nukleinskih kiselina (tj., netarget ili off-target sekvence).
[0067] Može postati varijacija u aktivnosti (npr., kao što je definisano procentom smanjenja nivoa target nukleinske kiseline) antisens jedinjenja unutar aktivnog target regiona. U određenim primerima izvođenja, erdukcije HBV iRNK nivoa su indikativni za inhbiiciju HBV ekspresije. Smanjenje nivoa HBV proteina je takođe indikativno za inhibiciju target iRNK ekspresije. Dodatno, fenotipske promene su indikativne za inhibiciju HBV ekspresije. U određenim primerima izvođenja, smanjeni zamor, smanjeni simptomi slični gripu, povećanje apetita, smanjena mučnina, smanjeni bol u zglobovima, smanjena žutica, smanjeni bol u abdomenu, smanjena slabost, smanjen gubitak težine, smanjenje povećanja dojki kod muškaraca, smanjeni osip na dlanovima, smanjena težina zgrušavanja krvi, smanjena ciroza, smanjeni krvni sudovi nalik pauku na koži, povećana apsorpcija vitamina A i D, smanjeni rast tumora, smanjena zapremina tumora, smanjena glavobolja, smanjena groznica, smanjena dijareja, smanjeni bol u predelu jetre, smanjena glinasta ili sivo-obojena stolica, smanjeni svrab, smanjeni tamno obojeni urin, i smanjan mučnina i povraćanje mogu biti indikacija inhibicije ekspresije HBV, u određenim primerima izvođenja, ublažavanje simptoma povezanih sa HBV-povezanim stanjima, bolešću, i poremećajima može biti indikativan za inhibiciju HBV ekspresije. U određenim primerima izvođenja, smanjenje ciroze je indikativno za inhibiciju HBV ekspresije. U određenim primerima izvođenja, smanjenje markera akncera jetre može bit iindikativno za inhibiciju HBV ekspresije.
Hibridizacija
[0068] U nekim slučajevima, hibridizacija se događa između antisens jedinjenja razmatranog ovde i HBV nukleinske kiseline. Najčešći mehanizam hibridizacije uključuje vodonične veze (npr., Watson-Crick, Hoogsteen ili reverzne Hoogsteen vodonične veze) između komplementarnih nukleobaza molekula nukleinske kiseline.
[0069] Hibridizacija se može dogoditi pod različtiim uslovima. Stringentni uslovi su zavisni od sekvence i određeni su prirodom i sastavom molekula nukleinske kiseline koja hibridizuje.
[0070] Postupci za određivanje da li sekvenca može specifično hibridizovati sa target nukleinskom kiselinom su dobro poznati u tehnici. Antisens jedinjenje opisano ovde specifično hibridizuje sa HBV nukleinskom kiselinom.
Komplementarnost
[0071] Antisens jedinjenje i target nukleinska kiselina su međusobno komplementarni kada se dovoljan broj nukleobaza antisens jedinjenja može vezati vodoničnom vezom sa odgovarajućim nukleobazama target nukleinske kiseline, tako da se dešava željeni efekat (npr., antisens inhibicija target nukleinske kiseline, kao što je HBV nukleinska kiselina).
[0072] Ne-komplementarne nukleobaze između antisens jedinjenja i HBV nukleinske kiseline se mogu tolerisati uz uslov da antisens jedinjenje ostaje sposobno da specifično hibridizuje sa target nukleinskom kiselinom. Dodatno, antisens jedinjenje može hibridizovati sa jednim ili više segmenata HBV nukleinske kiseline tako da segmenti koji su između ili su susedni nisu uključeni u hibridizacioni digađaj (npr., struktura petlje, nepoklapanje ili struktura ukosnice). Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa target nukleinskom kiselinom može se odrediti korišćenjem rutinskih postupaka.
1
[0073] Na primer, antisens jedinjenje u kojem je 18 od 20 nukleobaza antisens jedinjenja komplementarno sa target regionom, i stoga bi specifično hibridizovalo, predstavljalo bi 90 posto komplementarnosti. U ovom primeru, preostale nekomplementarne nukleobaze mogu biti u klasteru ili raštrkane između komplementarnih nukleobaza i ne moraju biti međusobno neprekidne ili sa komeplementarnim nukleobazama. Kao takvo, antisens jedinjenje koje je dužine 18 nukleobaza koje ima četiri nekomplementarne nukleobaze koje su flankirane sa dva regiona kompletne komeplementarnosti sa target nukleinskom kiselinom imalo bi 77.8% ukupne komplementarnosti sa target nukleinskom kiselinom. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa regionom target nukleinske kiseline može se rutinski odrediti korišćenjem BLAST programa (basic local alignment search tools) i PowerBLAST programa poznatih u tehnici (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Procenat homologije, identičnosti sekvence ili komplementarnosti, može se odrediti, na primer, Gap programom (Wisconsin Sekvenca Analysis Package, Version 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), korišćenjem podrazumevanih porešavanja, koji koristi algoritam Smith i Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0074] Antisens jedinjenje, ili njegovi određeni delovi, je potpuno komplementarno (tj. 100% komplementarno) target nukleinskoj kiselini, ili njenom određenom delu. Na primer, antisens jedinjenje može biti potpuno komplementarno sa HBV nukleinskom kiselinom, ili target regionu, ili target segmentu ili njenoj target sekvenci. Kao što je ovde korišćeno, "potpuno komplementarno" označava da je svaka nukleobaza antisens jedinjenja sposobna za tačno bazno sparivanje sa odgovarajućim nukleobazama target nukleinske kiseline. Na primer, antisens jedinjenje od 20 nukleobaza je potpuno komplementarno sa target sekvencom koja je dužine 400 nukleobaza, dok god postoji deo sa odgovarajućih 20 nukleobaza target nukleinske kiseline koji je potpuno komplementarno antisens jedinjenju. Potpuno komplementarno se takođe može koristiti u odnosu na određeni deo prve i/ili druge nukleinske kiseline. Na primer, deo od 20 nukleobaza antisens jedinjenja od 30 nukleobaza može biti "potpuno komplementaran" target sekvenci koja je dužine 400 nukleobaza. Deo od 20 nukleobaza oligonukleotida od 30 nukleobaza je potpuno komplementaran target sekvenci ukoliko target sekvenca ima deo sa odgovarajućih 20 nukleobaza pri čemu je svaka nuklobaza komplementarna delu od 20 nukleobaza antisens jedinjenja. U isto vreme, celo antisens jedinjenje od 30 nukleobaza može ili ne mora biti potpuno komplementarno target sekvenci, u zavisnosti od toga da li je preostalih 10 nuklobaza antisens jedinjenja takođe komplementarno target sekvenci.
[0075] Položaj ne-komplementarne nukleobaze može biti na 5’ kraju ili 3’ kraju antisens jedinjenja. Alternativno, ne-komplementarna nuklobaza ili nukleobaza može biti na internom
2
položaju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više ne-komplementarnih nukleobaza, one mogu biti neprekidne (tj. vezane) ili nesusedne.
[0076] Opisana antisens jedinjenja takođe uključuju ona koja su komplementarna delu target nukleinske kiseline. Kao što je ovde korišćeno, "deo" se odnosi na definisani broj neprekidnih (tj. vezanih) nukleobaza unutar regiona ili segmenta target nukleinske kiseline. "Deo" se može takođe odnositi na definisani brij neprekidnih nukleobaza antisens jedinjenja.
Identičnost
[0077] Antisens jedinjenja opisana ovde mogu takođe imati definisan procenat identičnosti sa određenom nukleotidnom sekvencom, SEQ ID NO, ili jedinjenjem predstavljenim specifičnim Isis brojem, ili njegovim delom. Kao što je ovde korišćeno, antisens jedinjenje je identično sekvenci opisanoj ovde ukoliko ima istu sposobnost sparivanja nukleobaza. Na primer, RNK koja sadrži uracil umesto timidina u opisanoj DNK sekvenci smatrala bi se identičnom DNK sekvenci jer se i uracil i timidin uparuju sa adeninom. Skraćene i produžene verzije antisens jedinjenja opisane ovde kao i jedinjenja koja imaju ne-identične baze u odnosu na antisens jedinjenja opisana ovde su takođe predviđena. Ne-identične baze mogu biti međusobno susedne ili dispergovane kroz antisens jedinjenje. Procenat identičnosti antisens jedinjenja je izračunata u odnosu na broj baza koje imaju uparivanje identičnih baza u odnosu na sekvencu sa kojom se upoređuju.
Modifikacije
[0078] Nukleozid je kombinacija baze i šećera. Nukleobazni (takođe poznat kao baza) deo nukleozida je normalno deo heterociklične baze. Nukleotidi su nukleozidi koji dodatno uključuju fosfatnu grupu kovalanento vezanu za šećerni deo nukleozida. Za one nukleozide koji uključuju pentofuranozil šeećr, fosfatna grupa može biti vezana za 2’, 3’ ili 5’ hidroksil deo šećera. Oligonukleotidi se formiraju preko međusobne kovalentne veze susednih nukleozida, da bi formirali linearni polimerni oligonukleotid. Unutar oligonukleotidne strukture, fosfatne grupe se uobičajeno označavaju kao da formiraju internukleozidne veze oligonukleotida.
[0079] Modifikacije antisens jedinjenja obuhvataju supstitucije ili promene internukleozidnih veza, šećernih delova, ili nukleobaza. Modifikovana antisens jedinjenja su četo poželjna u odnosu na prirodne oblike zbog poželjnih osobina kao što su, na primer, poboljšalni ćelijski unos, poboljšani afinitet za target nukleinsku kiselinu, povećana stabilnost u prisustvu nukleaza, ili povećana inhibitorna aktivnost.
[0080] Hemijski modifikovani nukleozidi se takođe mogu upotrebiti da se poveća vezujući afinitet skraćenog ili isečenog antisens oligonukleotida za njegovu target nukleinsku kiselinu. Kao posledica toga, uporedivi rezultati se često mogu dobiti sa kraćim antisens jedinjenjima koja imaju takve hemijski modifikvoane nukleozide.
Modifikovane internukleozidne veze
[0081] Prirodna internukleozidna veza RNK i DNK je 3’ sa 5’ fosfodiestarska veza. Antisens jedinjenja koja imaju jednu ili više modifikovanih, tj. onih koje se ne javljaju u prirodi, internukleozidnih veza su često izabrane u odnosu na antisens jedinjenja koja imaju prirodne internukleozidne veze usled željenih osobina kao što su, na primer, poboljšalni ćelijski unos, poboljšani afinitet za target nukleinsku kiselinu i povećana stabilnost u prisustvu nukleaza,
[0082] Oligonukleotidi koji imaju modifikovane internukleozidne veze uključuju internukleozidne veze koje zuadržavaju atom fosfora kao i internukleozidne veze koje nemaju atom fosfora. Reprezentativne internukleozidne veze koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničene na, fosfodiestre, fosfotriestre, metilfosfonate, fosforoamidate, i fosforotioate. Postupci pripreme veza koje sadrže fosfor i veza koje ne sadrže fosfor su dobro poznate.
Modifikovani šećerni delovi
[0083] Antisens jedinjenja opisana ovde mogu izborno sadržati jedan ili više nukleozida gde je šećerna grupa modifikovana. Takvi nukleozidi sa modifikovanim šećerom mogu dati poboljšanu stabilnost na nukleaze, povećani afinitet vezivanja, ili neku drugu korisnu biološku osobinu antisens jedinjenjima. U određenim slučajevima, nukleozidi sadrže hemijski modifikovani deo ribofuranoznog prstena. Primeri hemijski modifikovanih ribofuranoznih prstenova uključuju, bez ograničenja, dodavanje supstituentskih grupa (uključujući 5’ i 2’ supstituentske grupe); premošćavanje ne-geminalnih atoma prstena da bi se formirale biciklične nukleinske kiseline (BNA); zamenu atoma kiseonika ribozil prstena sa S, N(R), ili C(R1)(R)2(R = H, C1-C12alkil ili zaštitnom grupom); i njihove kombinacije. Primeri hemijski modifikovanih šećera uključuju, 2’-F-5’-metil supstituisani nukleozid (videti, PCT međunarodna prijava WO 2008/101157, objavljena 8/21/08 za druge opisane 5’, 2’-bis supstituisane nukleozide), zamenu atoma kiseonika ribozil prstena s S sa ddoatnom supstitucijom na 2’-položaju (videti, objavljena SAD patentna prijava. Patentna prijava US2005/0130923, objavljena 16. juna 2005), ili, alternativno, 5’-supstitucija BNA (videti, PCT emđunarodna prijava WO 2007/134181, objavljena 11/22/07, gde je LNA supstituisana, na primer, sa 5’-metil ili 5’-vinil grupom).
4
[0084] Primeri nukleozida koji imaju modifikovane šećerne delove uključuju, bez ograničenja, nukleozide koji sadrže 5’-vinil, 5’-metil (R ili S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3, i 2’-O(CH2)2OCH3supstituentske grupe. Supstituent na 2’ položaju se takođe može izabrati od alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-ON( Rm)(Rn), i O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), gde su svaki Rmi Rn, nezavisno, H ili susptituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil.
[0085] Kao što je ovde korišćeno, "2’-modifikovani" označava furanozil šećer modifikovan na 2’ položaju. U određenim slučajevima, takve modifikacije uključuju supstitucije izabrane od: halida, uključujući, ali se ne ograničavati na supstituisani i nesupstituisani alkoksi, supstituisani i nesupstituisani tioalkil, supstituisani i nesupstituisani amino alkil, supstituisani i nesupstituisani alkil, supstituisani i nesupstituisani alil, i supstituisani i nesupstituisani alkinil. U određenim slučajevima, 2’ modifikacije su izabrane od supstituenata uključujući, ali se ne ograničavajući na: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, gde n i m su od 1 do oko 10. Druge 2’-supstituentske grupe se takođe mogu izabrati od: C1-C12alkil; supstituisani alkil; alkenil; alkinil; alkaril; aralkil; O-alkaril ili O-aralkil; SH; SCH3; OCN; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocikloalkil; heterocikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino; supstituisani silil; RNK isecajuća grupa; reporter grupa; interkalator; grupa za poboljšanje farmakokinetičkih osobina; i grupa za poboljšanje farmakodinamskih osobina antisens jedinjenja, i drugi supstituenti koji imaju slične osobine. U pronalasku za koji se traži zaštita, modifikovani nukleozidi sadrže 2’-MOE bočni lanac (videti, npr., Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Takva 2’-MOE supstitucija je opisana da ima poboljšan afiniet vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim nukleozidima i drugim modifikovanim nukleozidima, kao što su 2’- O-metil, O-propil, i O-aminopropil. Takođe je pokazano da su oligonukleotidi koji imaju 2’-MOE supstituent antisens inhibitori genske ekspresije sa obećavajućim osobinama za in vivo upotrebu (videti, npr., Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; i Altmann et al., Nukleozids Nukleotids, 1997, 16, 917-926).
[0086] Kao što je ovde korišćeno, "2’-modifikovani nukleozid" ili "2’-supstituisani nukleozid" odnosi se na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži supstituent na 2’ položaju furanoznog prstena različit od H ili OH. 2’-modifikovani nukleozidi, uključuju, ali nisu ograničeni na, biciklične nukleozide gde most koji spaja dva atoma ugljenika prstena šećera spaja 2’ ugljenik i drugi ugljenik prstena šećera i nukleozide sa ne-premošćujućim 2’supstituentima, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ili OCH2- C(=O)-N(Rm)(Rn), gde svaki Rmi Rnje, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil. 2’- modifikovani nukleozidi mogu dodatno sadržati druge modifikacije, na primer, na drugim položajima šećera i/ili na nukleobazi.
[0087] Kao što je ovde korišćeno, "2’-F" se odnosi na šećer koji sadrži fluoro grupu na 2’ položaju.
[0088] Kao što je ovde korišćeno, "2’-OMe" ili "2’-OCH3" ili "2’-O-metil" svaki se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH3grupu na 2’ položaju prstenu šećera.
[0089] Kao što je ovde korišćeno, "oligonukleotid" se odnosi na jedinjenje koje sadrži više vezanih nukleozida.
[0090] Postupci za pripreme modifikovanih šećera su dobro poznati stručnjacima.
[0091] Kod nukleotida koji imaju modifikovane šećerne delove, nukleobazni delovi (prirodni, modifikovani, ili njihova kombinacija) su održani za hibridizaciju sa odgovoarajućom target nukleinskom kiselinom.
Kompozicije i postupci za formulisanje farmaceutskih kompozicija
[0092] Antisens oligonukleotidi se mogu pomešati sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremu farmaceutskih kompozicija ili formulacija. Kompozicije i postupci za formulaciju farmaceutskih kompozicija su zavisni od brojnih kriterijuma, uključujući, ali se ne ograničavajući na, put primene, stepen bolesti, ili dozu koja se primenjuje.
[0093] Antisens jedinjenje targetirano na HBV nukleinsku kiselinu može se koristiti u farmaceutskim kompozicijama kombinovanjem antisens jedinjenja sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač uključuje fosfatno-puferovani fiziološki rastvor (PBS). PBS je razblaživač pogodan za upotrebu u kompozicijama koje se isporučuju parenteralno. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, upotrebljeno u postupcima opisanim ovde je farmaceutska kompozicija za upotrebu prema pronalasku koja sadrži antisens jedinjenje za upotrebu prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv razblaživač. U određenim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljiv razblaživač je PBS.
[0094] Farmaceutske kompozicije koje sadrže antisens jedinjenja obuhvataju bilo koje farmaceutski prihavtljive soli, estre, ili soli takvih estara ili bilo koji drugi oligonukleotid koji, nakon primene na životinju, uključujući čoveka, je sposoban da obezbedi (direktno ili indirektno) biološki aktivni metabolit ili njegov ostatak. Shodno tome, na primer, opis se takođe odnosi na farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, prolekove, farmaceutski prihvatljvie soli takvih prolekova, i druge bioekvivalente. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli natrijuma i kalijuma.
[0095] Prolek može uključivati inkorporaciju dodatnih nukleozida na jednom ili oba kraja antisens jedinjenja koja su isečena endogenim nukleazama unutar tela, da bi se formiralo aktivno active antisens jedinjenje.
Konjugovana antisens jedinjenja
[0096] Antisens jedinjenja mogu biti kovalentno vezana za jedan ili više delova ili konjugata koji poboljšavaju aktivnost, ćelijsku distruibuciju ili ćelijsko preuzimanje rezultujućih antisens oligonukleotida. Tipične konjugatne grupe uključuju holesterol delove i lipidne delove. Dodatne konjugatne grupe uključuju ugljene hidrate, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrahinon, akridin, fluorescein, rodamine, kumarine, i boje.
[0097] Antisens jedinjenja se takođe mogu modifikovati da imaju jednu ili više stabilizujućih grupa koje su generalno vezane za jedan ili oba terminusa antisens jedinjenja da poboljšaju osobine kao, na primer, stabilnost u odnosu na nukleaze. U stabilizujuće grupe su uključene strukture kape. Ove terminalne modifikacije štite antisens jedinjenje koje ima terminalnu nukleinsku kiselinu od degradacije egzonukleazama, i mogu pomoći u isporuci i/ili lokalizaciji unutar ćelije. Kapa može biti prisutna na 5’-terminusu (5’-kapa), ili na 3’-terminusu (3’-kapa), ili može biti prisutna na oba terminusa. Strukture kape su dobro poznate u tehnici i uključuju, na primer, invertovane deoksi abazne kape. Dodatne 3’ i 5’-stabilizujuće grupe koje se mogu koristiti kao kapa za jedan ili oba kraja antisens jedinjenja da bi dale stabilnost u odnosu na nuklezu uključuju one opisane u WO 03/004602 objavljene 16. januara 2003.
Kultura ćelija i tretman antisens jedinjenjem
[0098] Efekti antisens jedinjenja na nivo, aktivnost ili eskpresiju HBV nukleinskih kiselina mogu se testirati in vitro u različitim tipovima ćelija. Zipovi ćelija korišćeni za takve analize su dostupni od komercijalnih dobavljača (npr. American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) i kultivisane su u skladu sa uputstvima dobavljača korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (npr. Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Ilustrativni tipovi ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, HuVEC ćelije, b.END ćelije, HepG2 ćelije, Hep3B ćelije, i primerni hepatociti.
In vitro testiranje antisense oligonukleotida
[0099] Ovde su opisani postupci za tretman ćelija sa antisens oligonukleotidima, koji se mogu odgovarajuće modifikovati za tretman sa drugim antisens jedinjenjima.
[0100] Ćelije se mogu tretirati sa antisense oligonukleotidima kada ćelije dostignu približno 60-80% konfluence u kulturu.
[0101] Jedan reagens uobičajeno korišćen za introdukciju antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje katjonski lipid tranmsfekcioni reagens LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotidi se mogu pomešati sa LIPOFECTIN u OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena finalna koncentracija antisens oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTIN koja može biti u opsegu 2 do 12 ug/mL na 100 nM antisens oligonukleotida.
[0102] Drugi reagens korišćen za introdukciju antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotid je pomešan sa LIPOFECTAMINE u OPTI-MEM 1 redukovanom serumskom medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena koncentracija antisens oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTAMINE koja može biti u opsegu od 2 do 12 ug/mL na 100 nM antisens oligonukleotida.
[0103] Sledeća tehnika korišćena za introdukciju antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje elktroporaciju.
[0104] Ćelije su tretirane antisense oligonukleotidima rutinskim postupcima. Ćelije se mogu sakupiti 16-24 časova nakon tretmana antisens oligonukleotidom, u koje vreme su nivoi RNK ili proteina of target nukleinskih kiselina mereni postupcima pozantim u tehnici i opisani ovde. Generalno, kada su tretmani izvedeni u više replika, podaci su predstavljeni kao prosečna vrednost replika tretmana.
[0105] Koncentracija korišćenog antisens oligonukleotida varira od jedne do druge ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalne koncentracije antisens oligonukleotida za određenu ćelijsku liniju su dobro poznati u tehnici. Antisens oligonukleotidi su tipično korišćeni na koncentracijama u opsegu od 1 nM do 300 nM kada su transficirani sa LIPOFECTAMINE. Antisens oligonukleotidi su korišćeni na višim koncentracijama u opsegu od 625 do 20,000 nM kada su transfektovani korišćenjem elektroporacije.
Izolacija RNK
[0106] RNK analiza se može izvesti na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci za izolaciju RNK su dobro poznati u tehnici. RNK je pripremljena korišćenjem postupaka dobero poznatih u tehnici, na primer, korišćenjem TRIZOL reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema protokolima preporučenim od strane proizvođača.
Naliza inhibicije nivoa ili ekspresije targeta
[0107] Inhibicija nivoa ili ekspresije HBV nukleinske kiseline može se anlizirati na različite načine poznate u tehnici. Na primer, nivoi target nukleinske kiseline se mogu kvantifikovati sa, np., Northern blot analizom, kompetitivnom lačanom reakcijom polimeraze (PCR), ili kvantitativnom real-time PCR. RNK analiza se može izvesti na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci za izolaciju RNK su dobro poznati u tehnici. Northern blot analiza je takođe rutinska u tehnici. Kvantitativna realtime PCR se može pogodno izvesti korišćenjem komercijalno dostupnog ABI PRISM 7600, 7700, ili 7900 Sequence Detection System, dostupnog od PE-Applied Biosystems, Foster City, CA i korišćenog u skladu sa uputstvima proizvođača.
Kvantitativna Real-Time PCR analiza nivoa RNK targeta
[0108] Kvantifikacija nivoa RNK targeta može se postići pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu korišćenjem ABI PRISM 7600, 7700, ili 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) u skaldu as uputsvima proizvođača. Postupci za kvantitativnu real-time PCR su dobro poznati u tehnici.
[0109] Pre real-time PCR, izolovana RNK je podvrgnuta reakciji reverzne transkriptaze (RT), koja proizvodi komplementarnu DNK (cDNK) koja je zatim korišćena kao supstrat za real-time PCR amplifikaciju. RT i realtime PCR reakcije su izvedene sekvencijalno u istom bunarčiću sa uzorkom. RT i real-time PCR reagensi se mogu dobiti od Invitrogen (Carlsbad, CA). RT realtime-PCR reakcije su izvedene postupcima koji su dobro poznati stručnjacima.
[0110] Količine gena (ili RNK) targeta dobijene real time PCR su normalizovane korišćenjem ili ekspresionog nivoa gena čija je ekspresija konstantna, kao što je ciklofilin A, ili kvantifikacijom ukupne RNK korišćenjem RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Ciklofilin A eskpresija je kvantifikovana real time PCR, tako što je izvedena istovremeno sa targetom, multiplesingom, ili zasebno. Ukupna RNK je kvantifikovana korišćenjem RIBOGREEN RNA kvantifikacionog reagensa (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Postupci RNk kvantifikacije sa RIBOGREEN su dati u Jones, L.J., et al, (Analytical BioHemija, 1998, 265, 368-374). A CYTOFLUOR 4000 instrument (PE Applied Biosystems) je korišćenza merenje RIBOGREEN fluorescencije.
[0111] Probe i prajmeri su dizajnirani da hibridizuju sa HBV nukleinskom kiselinom. Postupci za dizajniranje real-time PCR proba i prajmera su dobro pozanti u tehnici, i mogu uključivati softver kao što je PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Kvantitativna Real-Time PCR analiza nivoa DNK targeta
[0112] Kvantifikacija nivoa DNK targeta može se postići pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu korišćenjem ABI PRISM 7600, 7700, ili 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) prema uputstvima proizvođača. Postupci kvantitativne real-time PCR su dobro pozanti u tehnici.
[0113] Količine gena (ili DNK) targeta dobijene real time PCR su normalizovane korišćenjem ili ekspresionog nivoa gena čija je ekspresija konstantna, kao što je ciklofilin A, ili kvantifikacijom ukupne RNK korišćenjem RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Ciklofilin A eskpresija je kvantifikovana real time PCR, tako što je izvedena istovremeno sa targetom, multiplesingom, ili zasebno. Ukupna DNK je kvantifikovana korišćenjem RIBOGREEN RNA kvantifikacionog reagensa (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Postupci DNK kvantifikacije sa RIBOGREEN su dati u Jones, L.J., et al, (Analytical BioHemija, 1998, 265, 368-374). A CYTOFLUOR 4000 instrument (PE Applied Biosystems) je korišćen za merenje RIBOGREEN fluorescencije.
[0114] Probe i prajmeri su dizajnirani da hibridizuju sa HBV nukleinskom kiselinom. Postupci za dizajniranje real-time PCR proba i prajmera su dobro pozanti u tehnici, i mogu uključivati upotrebu softvera kao što je PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Analiza nivoa proteina
[0115] Antisens inhibicija HBV nukleinskih kiselina može biti procenjivana merenjem nivoa HBV proteina. Nivoi proteina HBV mogu biti procenjivani ili kvantitativno određivani na različite načine koji su dobro poznati u stanju tehnike, kao što su imunoprecipitacija, Western blot analiza (imunobloting), enzimska imuno analiza (ELISA), kvantitativne proteinske analize, analize aktivnosti proteina (na primer, analize aktivnosti kaspaze), immunohistohemija, imunocitohemija ili fluorescencijom-aktivirano sortiranje ćelija (FACS). Antitela usmerena na target mogu se identifikovati i dobiti iz različitih izvora, kao što je MSRS katalog antitela (Aerie Corporation, Birmingham, MI), ili se mogu pripremiti postupcima stvaranja konvencionalnih monoklonskih ili poliklonskih antitela koji su dobro poznati u tehnici.
4
In vivo testiranje antisens jedinjenja
[0116] Antisens jedinjenja, na primer, antisens oligonukleotidi, su testirani kod životinja radi procene njihove sposobnosti da inhibiraju ekspresiju HBV i proizvode fenotipske promene. Testiranje se može izvesti kod normalnih životinja ili u eksperimentalnim modelima bolesti. Za primenu na životinje, antisens oligonukleotidi su formulisani u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, kao što je fosfatno puferisani fiziološki rastvor. Primena obuhvata parenterane puteve primene, kao što su intraperitonealna, intravenska, subkutana, intratekalna i intracerebroventrikularna. Izračunavanje doze antisens oligonukleotida i učestalost doziranja je unutar sposobnosti stručnjaka iz date oblasti tehnike i zavisi od faktora kao što su put primene i telesna težina životinje. Posle perioda tretmana antisens oligonukleotidima, RNK je izolovana iz tkiva jetre i merene su promene u ekspresiji HBV nukleinske kiseline. Takođe su merene promene u nivoima HBV DNK. Takođe su merene promene u nivoima HBV proteina. Takođe su merene promene u nivoima HBV HBeAg. Takođe su merene promene u nivoima HBV HBsAg.
Određene indikacije
[0117] U određenim slučajevima, ovde su otkriveni postupci, jedinjenja i kompozicije za lečenje individue koji sadrže primenu jedne ili više farmaceutskih kompozicija opisanih ovde. U određenim slučajevima, individua ima stanje povezano sa HBV-om. U određenim slučajevima, hronična HBV infekcija, inflamacija, fibroza, ciroza, kancer jetre, serum hepatitis, žutica, kancer jetre, inflamacija jetre, fibroza jetre, ciroza jetre, insuficijencija jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis i HBV viremija. U određenim slučajevima, stanje povezano sa HBV-om može da obuhvata bilo koji ili sve od sledećih: bolest slična gripu, slabost, bolovi, glavobolja, groznica, gubitak apetita, dijareja, žutica, mučnina i povraćanja, bol u predelu jetre, stolica boje gline ili sive boje, svrab po celom telu i tamno obojeni urin, zajedno sa pozitivnim testom za prisustvo virusa hepatitisa B, antigena virusa hepatitisa B ili pozitivnim testom za prirustvo antitela specifičnog za antigen virusa hepatitisa B. U određenim slučajevima, individua je u riziku od stanja povezanog sa HBV-om. Ovo obuhvata individue koje imaju jedan ili više faktora rizika za razvoj stanja povezanog sa HBV-om, uključujući seksualno izlaganje individui inficiranoj virusom hepatitisa B, život u istom domaćinstvu kao individua sa doživotnom infekcijom virusom hepatitisa B, izlaganje ljudskoj krvi inficiranoj virusom hepatitisa B, injektiranje ilegalinih droga, osoba sa hemofilijom i poseta oblasti gde je hepatitis B čest. U određenim slučajevima, individua je identifikovana tako da kod nje postoji potreba za tretmanom stanja povezanog sa HBV-om. Ovde su otkriveni postupci za profilaktičko redukovanje ekspresije HBV kod individue. Određeni slučajevi obuhvataju lečenje individue kod koje postoji potreba za tim primene na individuu terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini.
[0118] Kao posledica preklapajućih puteva prenošenja, ,nogi ljudi su izloženi virusu hepatitisa B (HBV) i virusu hepatitisa C (HCV), i manja proporcija je hronično inficirana sa oba virusa, naročito u regionima kao što su Azija gde je HBV endemičan. Procene sugerišu da do 10% ljudi sa HCV takođe mogu imati HBV, dok možda 20% ljudi sa HBV je koinficirano sa HCV. Međutim, tretman hepatitisa B ili hepatitisa B kod individua koinficiranim HBV-HCV nije dobro ispitan. Tretman je komplikovan činjenicom da izgleda da HCV i HBV međusobno inhibiraju replikaciju onog drugog (iako nisu sve studije zabeležeile ovu interakciju). Prema tome, tretman koji potpuno suprimirani HBV mogao bi potencijalno omogućiti ponovnu pojavu HCV ili obrnuto. Prema tome, jedinjenja i kompozicije opisani ovde mogu povoljno biti korišćeni za lečenje pacijenata inficiranih sa oba HBV i HCV. Primeri opcija tretmana za hepatitis C (HCV) obuhvataju interferone, npr., interferon alfa-2b, interferon alfa-2a i interferon alfakon-1. Ređe doziranje interferona može biti postignuto upotrebom pegilovanog interferona (interferon vezan za polietilen glikol grupu koja poboljšava njegov farmakokinetički profil). Kombinovana terapija interferonom alfa-2b (pegilovanim ili nepegilovanim) i ribavirinom takođe je pokazana kao efikasna za neke populacije pacijenata. Ostala sredstva koja se trenutno razvijaju obuhvataju inhibitore HCV RNK replikacije (npr., ViroPharma’s VP50406 serija), HCV antisens sredstva, HCV terapeutske vakcine, inhibitori HCV proteaze, inhibitori HCV helikaze i terapija HCV antitelom (monoklonskim ili poliklonskim).
[0119] U određenim slučajevima, tretman postupcima, jedinjenjima i kompozicijama opisanim ovde je koristan za prevenciju stanja povezanog sa HBV-om povezanog sa prisustvom virusa hepatitisa B. U određenim slučajevima, tretman postupcima, jedinjenjima i kompozicijama opisanim ovde je koristan za prevenciju stanja povezanog sa HBV-om.
[0120] U jednom slučaju, primena terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini je praćena praćenjem nivoa HBV iRNK u serumu individue za određivanje odgovora individue na primenu antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, primena terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja sumerenog ka HBV nukleinskoj kiselini je praćena praćenjem nivoa HBV DNK u serumu individue za određivanje odgovara individue na primenu antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, primena terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini je praćena praćenjem nivoa HBV proteina u serumu individue za određivanje odgovora individue na primenu antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, primena terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini je praćena praćenjem nivoa HBV S antigena (HBsAg) u serumu individue za određivanje odgovora individue na primenu antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, primena terpeutski efikasne količine antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini je praćena praćenjem nivoa HBV E antigena (HBeAg) u serumu individue za određivanje odgovora individue na primenu antisens jedinjenja. Odgovor individue na primenu antisens jedinjenje je korišćen od strane lekara za određivanje količine i trajanja terapeutske intervencije.
[0121] U određenim slučajevima, primena antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini rezultuje u redukciji ekspresije HBV za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99%, ili opseg definisan sa bilo koje dve od ovih vrednosti. U određenim slučajevima, primena antisens jedinjenja usmerenog ka HBV nukleinskoj kiselini rezultuje u redukovanom simptomima povezanim sa stanjem povezanim sa HBV-om i redukovanim markerima povezanim sa HBV-om u krvi. U određenim slučajevima, primena HBV antisens jedinjenja smanjuje nivoe HBV RNK, nivoe HBV DNK, nivoe HBV proteina, nivoe HBsAg ili nivoe HBeAg za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99%, ili opseg definisan sa bilo koje dve od ovih vrednosti.
[0122] U određenim slučajevima, farmaceutske kompozicije koje sadrže antisens jedinjenje usmereno ka HBV su korišćene za pripremu leka za lečenje pacijent akoji pati od ili je podložan stanju povezanom sa HBV-om.
Određene kombinovane terapije
[0123] U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku su ko-primenjivane sa jednim ili više drugih farmaceutskih sredstava. U određenim primerima izvođenja, takvo jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su dizajnirani za lečenje iste bolesti, poremećaja ili stanja kao jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku. U određenim primerima izvođenja, takvo jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su dizajnirani za lečenje različite bolesti, poremećeja ili stanja kao jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku. U određenim primerima izvođenja, takvo jedno ili više farmaceutskih sredstava su dizajnirana za lečenje neželjenog sporednog efekta jedne ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku su koprimenjivane sa drugim farmaceutskim sredstvom za lečenje neželjenog efekta tog drugog farmaceutskog sredstva. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku su ko-primenjene sa drugim
4
farmaceutskim sredstvom za proizvodnju kombinovanog efekta. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija za upotrebu prema pronalasku ovde su koprimenjivane sa drugim farmaceutskim sredstvom za proizvodnju sinergističkog efekta.
[0124] U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku i jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su primenjivani u isto vreme. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su primenjivani u različita vremena. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su pripremljeni zajedno u jednoj formulaciji. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više farmaceutskih kompozicija obezbeđenih za upotrebu prema pronalasku jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava su pripremljeni posebno. U određenim primerima izvođenja otkriveni antisens oligonukleotidi su primenjivani u kombinaciji sa HCV sredstvom. U dodatnim primerima izvođenja, HCV jedinjenje je primenjivano istovremeno kao antisens jedinjenje; u drugim primerima izvođenja, HCV jedinjenje je primenjivano posebno; tako da se doza svakog HCV sredstva i antisens jedinjenja preklapaju, u vremenu, unutar pacijentovog tela. U srodnim primerima izvođenja, HCV sredstvo može biti izabrano od interferona alfa-2b, interferona alfa-2a i interferona alfakon-1 (pegilovanog i nepregilovanog); ribavirina; inhibitora HCV RNK replikacije (npr., ViroPharma’s VP50406 serija); HCV antisens sredstva; HCV terapeutske vakcine; inhibitora HCV proteaze; inhibitora HCV helikaze; i terapije HCV antitelom (monoklonskim ili poliklonskim).
[0125] U drugim primerima izvođenja, HBV antisens jedinjenje za upotrebu prema predmetnom pronalasku može biti primenjivano na pacijenta inficiranog sa HBV, u kombinaciji sa jednim ili više HBV terapeutskih sredstava, pri čemu jedno ili više HBV terapeutskih sredstava mogu biti primenjivani u istoj formulaciji leka kao HBV ASO jedinjenje, ili se mogu primenjivati u posebnoj formulaciji. Jedno ili više HBV terapeutskih sredstava mogu biti primenjivani istovremeno sa ASO HBV jedinjenjem, ili mogu biti primenjivani posebno, tako da se doza svakog HBV ASO jedinjenja i HBV terapeutskog sredstva preklapaju, u vremenu, unutar pacijentovog tela. U srodnim primerima izvođenja, jedno ili više HBV terapeutskih sredstava mogu biti izabrani od interferona alfa-2b, interferona alfa-2a i interferona alfakona-1 (pegilovanog i nepregilovanog), ribavirina; inhibitora HBV RNK replikacije; drugog HBV antisens jedinjenja; HBV terapeutske vakcine; HBV profilaktičke vakcine; lamivudina (3TC); entecavira; tenofovira; telbivudina (LdT); adefovira; i terapije HBV antitelom (monoklonskim ili poliklonskim).
PRIMERI
Neograničavajuće otkriće
[0126] Dok su određena jedinjenja, kompozicije i postupci opisani ovde opisani sa specifičnošću u skladu sa određenim primerima izvođenja, sledeći primeri služe samo za ilustraciju jedinjenja opisanih ovde i nije bila namera da isti ograniče.
[0127] Aspekti ovih primera koji se ne odnose na pronalazak za koji se traži zaštita su samo za poređenje i ilustraciju.
Primer 1: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0128] Antisens oligonukleotidi su dizajnirani tako da su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Kultivisane HepG2.2.15 ćelije u gustini od 25,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom elektroporacije sa 15,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 („forward“ sekvenca CTTGGTCATGGGCCATCAG, označena ovde kao SEQ ID NO: 2; reverzna sekvenca CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, označena ovde kao SEQ ID NO: 3; sekvenca probe TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, označena ovde kao SEQ ID NO: 4) je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0129] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 1 su dijaznirani kao 5-10-5 MOE gapmeri ili 3-10-4 MOE gapmeri.5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. 3-10-4 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže tri i 4 nukleozide respektivno. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima MOE šećernu modifikaciju. Svaki nukleozid u centralnom gap segmentu ima deoksi šećernu modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.
4
[0130] “Virusno ciljno početno mesto” označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je gapmer usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. “Virusno ciljno mesto zaustavljanja” označava 3’-krajni nukleotid prema kome je gapmer usmeren u ciljnoj virusnoj genskoj sekvenci. Kolona pod nazivom “Motiv” označava strukturu proreda i krila svakog gapmera. Svaki gapmer naveden u Tabeli 1 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, koja je označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1).
Tabela 1
4
4
4
Primer 2: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0131] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji ciljno deluju na HBV virusnu nukleinsku kiselinu i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Kultivisane HepG2.2.15 ćelije u gustini od 25,000 ćelija po komorici su transficirane upotrebom elektroporacije sa 15,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoćui kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. RTS3370 detektuje iRNK cele dužine i drugi delovi pre-S1, pre-S2 i pre-C iRNK transkripata. Gapmeri su takođe ispitivani sa dodatnim setovima prajmer probe. Set virusne prajmer probe RTS3371 („forward“ sekvenca CCAAACCTTCGGACGGAAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 311; reverzna sekvenca TGAGGCCCACTCCCATAGG, označena ovde kao SEQ ID NO: 312; sekvenca probe CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, označena ovde kao SEQ ID NO: 313) je korišćen takođe za merenje nivoa iRNK. RTS3371 setektuje iRNK cele dužine i druge delove pre-S1, pre-S2 i pre-C iRNK transkripata, slično RTS3370, ali na različitim regionima. Set virusne prajmer probe RTS3372 („forward“ sekvenca ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT, označena ovde kao SEQ ID NO: 314; recerzna sekvenca CGACGCGGCGATTGAG, označena ovde kao SEQ ID NO: 315; sekvenca probe AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG, označena ovde kao SEQ ID NO: 316) je korišćen za merenje nivoa iRNK. RTS3372 detektuje genomsku sekvencu pune dužine. Set virusne prajmer
4
probe RTS3373MGB („forward“ sekvenca CCGACCTTGAGGCATACTTCA, označena ovde kao SEQ ID NO: 317; reverzna sekvenca AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA, označena ovde kao SEQ ID NO: 318; sekvenca probe TTAAAGACTGGGAGGAGTTG, označena ovde kao SEQ ID NO: 319) je korišćen za merenje nivoa iRNK. RTS3373MGB detekcuje iRNK pune dužine i druge delove pre-S1, pre-S2, pre-C i pre-X iRNK transkripata.
[0132] Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0133] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 2 su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri, 3-10-3 MOE gapmera ili 2-10-2 MOE gapmeri. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleotida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. 3-10-3 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleotida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po tri nukleozida. 2-10-2 MOE gapmeri su dužine 14 nukleozida, gde centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleotida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po dva nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima MOE šećernu modifikaciju. Svaki nukleozid u centralnom gap segmentu ima deoksi šećernu modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5’-metilcitozini.
[0134] "Početno mesto" označava 5’-krajni nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. "Mesto zaustavljanja" označava 3’-krajni nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. ’Motiv’ kolona označava gap i strukturu krila svakog gapmera. Svaki gapmer naveden u Tabeli 2 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, koja je označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. U95551.1).
2 a abel T
Primer 3: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepAD38 (Tet-HBV) ćelijama preko MOE gapmera
[0135] Određeni antisens oligonukleotidi izabrani iz studije opisane u Primeru 2 su testirani za njihove efekte na HBV iRNK u drugoj ćelijskoj liniji, ćečlijama humanog hepatoma HepAD38, u kojima je proizvodnja HBV pod kontrolom tetraciklinom-regulisanog promotora. Kultivisane HepAD38 (Tet-HBV) ćelije u gustini od 45,000 ćelija po komorici su transficirane upotrebom elektroporacije sa 15,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prjamer probe RTS3372 i RTS3373MGB su korišćeni pojedinačno za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno preko RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani u Tabeli 3 kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Tabela 3
4
Primer 4: Antisens inhibicija HBV virusne i RNK u HepAD38 (Tet-HBV) ćelijama preko MOE gapmera
[0136] Određeni antisens oligonukleotidi iz studije opisane u Primerima 1 i 2 su testirani za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Kultivisane HepAD38 (Tet-HBV) ćelije u gustini od 45,000 ćelija po komorici su transficirane upotrebom elektroporacije sa 15,000 nM antisens oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3372 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK su takođe mereni upotrebom RTS3373MGB seta prajmer probe. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultazi su prikazani u Tabeli 4 kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Tabela 4
1
2
Primer 5: Od doze zavisna inhibicija virusne HBV RNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0137] Određeni gapmeri iz studije opisani u Primerima 3 i 4 su testirani u različitim dozama u humanim HepG2.2.15 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču u gustini od 25,000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom elektroporacije sa 2.5 µM, 5.0 µM, 10.0 µM i 20.0 µM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 5. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0138] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena u Tabeli 5. Kao što je ilustrovano u Tabeli 5, nivoi HBV iRNK su značajno redukovani na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidom.
Tabela 5
Primer 6: Od doze zavisna inhibicija viurusne HBV RNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0139] Dodatni gapmeri iz studije opisani u Primerima 3 i 4 su dalje testirani na različitim dozama u humanim HepG2.2.15 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču u gustini od 28,000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 15.625 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125.0 nM i 250.0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 6. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen u merenju nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0140] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena u Tabeli 6. Kao što je ilustrovano u Tabeli 6, nivoi HBV iRNK su značajno smanjeni na način zavisan od doze u nekim ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidom.
Tabela 6
4
[0141] Nivoi iRNK su takođe mereni sa setom prajmer probe RTS3371. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 7.
Tabela 7
Primer 7: Tolerabilnost MOE gapmera usmerenih ka HBV u BALB/c miševima
[0142] BALB/c miševi (Charles River, MA) su višenamenski model miševa, koji se često koristi za testiranje bezbednosti i efikasnosti. Miševi su tretirani ISIS antisens oligonukleotidima izabranih iz studija opisanih u prethodnom tekstu i procenjivani za promene u nivoima različitih metaboličkih markera.
Studija 1
[0143] Grupe od po četiri BALB/c miša su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 50 mg/kg of ISIS 146779, ISIS 146786, ISIS 505317, ISIS 505319, ISIS 505330, ISIS 505332, ISIS 505339, ISIS 505346, ISIS 505347, ISIS 505358, ISIS 509929, ISIS 509931, ISIS 509932, ISIS 509934, ISIS 509957, ISIS 510100, ISIS 510106, ISIS 510116 i ISIS 510140. Grupa od četiri BALB/c miša je primala subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC (SEQ ID NO: 320)), 5-10-5 MOE gapmera bez poznate homogije sa bilo kojom humanom ili mišjom genskom sekvencom. Sledeća grupa od 4 BALB/c miša je primala subkutanu injekcije dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS. Ova grupa miševa je služila kao kontrolna grupa. Tri dana posle poslednje doze na svakoj vremenskoj tački, merena je telesna težina, miševi su eutanizirani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Težina tela i organa
[0144] Telesna težina miševa je merena pre doziranja i na kraju svakog perioda tretmana. Telesne težine su predstavljene u Tabeli 8 i izražene su kao procenat promene od težine izmerene pre početka tretmana. Težine jetre, slezine i bubrega su merene na kraju studije, i predstavljene su u Tabeli 9 kao procenat razlike od respektivnih težina organa PBS kontrole. Rezultati pokazuju da većina ISIS oligonukleotida nije uzrokovala nikakve štetne efekte na težinu tela ili organa.
Tabela 8
Tabela 9
Funkcija jetre
[0145] DA bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, koncentracije transaminaza u plazmi su merene upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Merene su koncentracije ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi i rezultati su predstavljeni u Tabeli 10 izraženi u IU/L. Nivoi holesterola i triglicerida u plazmi su takođe mereni upotrebom istog kliničkog hemijskog analizatora i rezultati su takođe predstavljeni u Tabeli 10.
Tabela 10
Funkcija bubrega
[0146] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, koncentracije azota uree u krvnoj plazmi (BUN) su mereni upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 11, izraženi u mg/dL.
Tabela 11
Studija 2
[0147] Grupe od po četiri BALB/c miša su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 505329, ISIS 509926, ISIS 509927, ISIS 509958, ISIS 509959, ISIS 509960, ISIS 509974, ISIS 509975, ISIS 510038, ISIS 510039, ISIS 510040, ISIS 510041 i ISIS 510050. Grupa od 4 BALB/c miša je primala subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS. Ova grupa miševa je služila kao kontrolna grupa. Tri dana posle poslednje doze na svakoj vremenskoj tački, merena je telesna težina, miševi su eutanazirani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Težina organa
[0148] Težina jetre, slezine i bubrega je merena na kraju studije i takođe je predstavljena u Tabeli 12 kao procenat promene u odnosu na respektivne težine organa PBS kontrole.
Tabela 12
1
Funkcija jetre
[0149] Da bi se odredio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, koncentracije transaminaza u plazmi su merene upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Merene su koncentracije ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi i rezultati su predstavljeni u Tabeli 13 izraženi u IU/L.
Tabela 13
Funkcija bubrega
[0150] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, koncentracije azota uree u krvnoj plazmi (BUN) su merene upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 14, izraženi u mg/dL.
Tabela 14
2
Primer 8: Potvrda odgovora na dozu MOE gapmera usmerenih ka HBV u HepG2.2.15 ćelijama
[0151] Gapmeri su izabrani na osnovu konzervativnosti, aktivnosti i tolerabilnosti sekvence, kao što je mereno u studiji opisanoj u Primerima 7 i 8, i testirano u različiti9m dozama u HepG2.2.15 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploči u gustini od 28,000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000 reagensa sa 15.625 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125.0 nM i 250.0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida. Dva dana posle transfekcije, medijum je zamenjen svežim medijumom. Uzorci su sakupljeni 4 dana posle transfekcije. Nivoi DNK, RNK, HBsAg i HBeAg su mereni u supernatantu.
[0152] Nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set HBV prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Kao što je ilustrovano u Tabeli 15, nivoi HBV iRNK su redukovani na način zavisan od doze u većini ćelija tretiranih antisens oligonukleotidom.
[0153] HBV antigeni u supernatantima su detektovani sa ELISA tehnikom. Nivoi HBs antigena (HBsAg) su detektovani pomoću ELISA iz Abazyme LLC, MA. Kao što je predstavljeno u Tabeli 16, tretman sa ISIS oligonukleotidima 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 i 510116 uzrokovao je značajnu redukciju u nivoima HBsAg. Nivoi HBe antigena (HBeAg) su detektovani pomoću ELISA iz International Immuno-diagnostics, CA. Kao što je predstavljeno u Tabeli 17, tretman sa ISIS oligonukleotidima 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 i 510116 uzrokovao je značajnu redukciju u nivoima HBeAg. Nivoi HBV DNK su mereni upotrebom seta prajmer probe RTS3370. Kao što je predstavljeno u Tabeli 18, tretman sa ISIS oligonukleotidima 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 i 510116 uzrokovao je značajnu redukciju u nivoima HBV DNK. Ukupan protein u supernatantima je meren pomoću analize DC proteina (BioRad), kao što je predstavljeno u Tabeli 19.
Tabela 15
Tabela 16
4
Tabela 19
Primer 9: In vivo inhibicija HBV iRNK preko MOE gapmera kod HBV-transgenih miševa
[0154] ISIS 146786, 5-10-5 MOE gapmer, i ISIS 510100, 3-10-4 MOE gapmer, od kojih oba pokazuju značajnu inhibiciju HBV iRNK, su testirani kod transgenih miševa koji sadrže HBV gen (Chisari 1.3.32 linija) (Guidotti, L. G. et al., J. Virol.1995, 69, 6158-6169) i procenjivana je efikasnost gapmera.
Tretman
[0155] Dve grupe od deset-jedanaest HBV-transgenih mužjaka i ženki miševa su primale subkutano dva puta nedeljno tokom četiri nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786 ili ISIS 510100. Sledeća grupa od 14 mužjaka i ženki HBV-transgenih miševa je primala Entecavir, oralni antivirusni lek korišćen za lečenje infekcije hepatitisa B, u 1 mg/kg na dan tokom dve nedelje. Sledeća grupa od 10 mužjaka i ženki HBV-transgenih ženki miševa primala je subkutanu injekciju sa PBS dva puta nedeljno tokom četiri nedelje. Miševi injektirani sa PBS služili su kao kontrolna grupa. Mereni su nivoi HBV iRNK i DNK u jetri, ALT u plazmi i težina tela i organa.
Analiza RNK
[0156] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV upotrebom setova prajmer probe RTS3370, RTS3371 i RTS3372. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK, u odnosu na PBS kontrolu. Kao što je prikazano u Tabeli 20, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima je rezultovao u značajnoj redukciji HBV iRNK u poređenju sa PBS kontrolom, bez obzira na set prajmer probe korišćen za merenje. Entecavir nije smanjio ekspresiju HBV iRNK.
Tabela 20
Analiza DNK
[0157] DNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV upotrebom setova prajmer probe RTS3370 i RTS3371. Nivoi su normalizovani prema RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao proenat inhibicije HBV DNK, u odnosu na PBS kontrolu. Kao što je prikazano u Tabeli 21, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je u značajnoj redukciji HBV DNK u poređenju sa PBS kontrolom, bez obzira na set prajmer probe korišćen za merenje. Tretman Entecavirom je takođe smanjio nivoe DNK, kao što je očekivano.
Tabela 21
Funkcija jetre
[0158] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, koncentracije transaminaza u plazmi su merene upotrebom ručnog kliničkog hemijskog analizatora (Teco Diagnostics, Anaheim, CA). Koncentracije ALT (alanin transaminaze) u plazmi su merene i rezultati su predstavljeni u Tabeli 22, izraženi u IU/L. Rezultati pokazuju da antisens inhibicija HBV nije imala nikakve štetne efekte na funkciju jetre miševa.
Tabela 22
[0159] Podaci iz studije pokazuju da su oba ISIS 146786 i ISIS 510100 uzrokovala snažne redukcije u HBV RNK i DNK u jetri i tretman ovim oligonukleotidima je dobro tolerisan u transgenim miševima.
Primer 10: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0160] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Nekoliko antisens oligonukleotida iz studija opisanih u prethodnom tesktu su takođe uključeni u analizu. Kultivisane HepG2.2.15 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici su transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 100 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Srt virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0161] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 23 su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima MOE šećernu modifikaciju. Svaki nukleozid u centralnom gap segmentu ima deoksi šećernu modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.
[0162] "Virusno ciljno početno mesto" označava 5’-krajni nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. "Virusno ciljno mesto zaustavljanja" označava 3’-krajnji nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabeli 23 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. U95551.1).
Tabela 23
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
Primer 11: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0163] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Nekoliko antisens oligonukleotida iz studija opisanih u prethodnom tekstu su takođe uključeni u analizu. Kultivisane HepG2.2.15 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici su transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 70 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi HBV iRNK su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK nekih od gapmera su takođe mereni upotrebom RTS3372. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što su mereni pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0164] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama 24 i 25 su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima MOE šećernu modifikaciju. Svaki nukleozid u centralnom gap segmentu ima deoksi šečernu modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.
[0165] "Virusno ciljno početno mesto" označava 5’-krajni nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. "Virusno ciljno mesto zaustavljanja" označava 3’-krajnji nukleotid prema kome je usmeren gapmer u virusnoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabeli 24 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. U95551.1). Svaki gapmer naveden u Tabeli 25 je usmeren ka virusnoj genskoj sekvenci, označen ovde kao SEQ ID NO: 1286 (permutovana verzija GENBANK pristupni br. U95551.1). ’n/a’ označava da podaci o inhibiciji za taj određeni gapmer nisu mereni da tim određenim setom prajmer probe.
Tabela 24
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
Tabela 25
Primer 12: Od doze zavisna inhibicija virusne HBV RNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0166] Određeni gapmeri iz studije opisane u Primerima 11 i 12 testirani su u različitim dozama u humanim HepG2.2.15 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču u gustini od 28000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 5.56 nM, 16.67 nM, 50.0 nM i 150.0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 26. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i Mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom
12
sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0167] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena u Tabeli 26. Kao što je ilustrovano u Tabeli 26, Nivoi HBV iRNK su redukovani na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidom.
Tabela 26
12
[0168] Neki od ISIS-oligonukleotida su takođe testirani upotrebom seta prajmer probe RTS3372. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 27.
Tabela 27
1
Primer 13: Od doze zavisna inhibicija virusne HBV RNK u HepG2.2.15 ćelijama preko MOE gapmera
[0169] Određeni gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu testirani su u različitim dozama u humanim HepG2.2.15 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču uu gustini od 30,000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 7.8125 nM, 15.625 nM,
1 1
31.25 nM, 62.5 nM, 125.0 nM i 250.0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 28. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0170] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena u Tabeli 28. Kao što je ilustrovano u Tabeli 28, Nivoi HBV iRNK su redukovani na način zavisan od doze u nekoliko ćelija tretiranih antisens oligonukleotidom.
Tabela 28
Primer 14: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2 ćelijama preko MOE gapmera
[0171] Dizajnirani su antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama. ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 i ISIS 510100, iz studija opisanih u prethodnom tekstu, su takođe uključeni. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom LipofectAMINE2000® sa 70 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 („forward“ sekvenca CTTGGTCATGGGCCATCAG, označena ovde kao SEQ ID NO: 2; reverzna sekvenca CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, označena ovde kao SEQ ID NO: 3; sekvenca probe TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, označena ovde kao SEQ ID NO: 4) je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi su takođe mereni upotrebom seta prajmer probe RTS3371 („forward“ sekvenca CCAAACCTTCGGACGGAAA, označena ovde kao SEQ
1 2
ID NO: 311; reverzna sekvenca TGAGGCCCACTCCCATAGG, označena ovde kao SEQ ID NO: 312; sekvenca probe CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, označena ovde kao SEQ ID NO: 313). Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. U nekim od analiza prikazanih u Tabelama 32, 35, 42, 45 i 46, potencija ISIS 146786 je merena u dve komorice u jednoj ploči. U tim slučajevima, predstavljene su vrednosti nivoa inhibicije u obe komorice.
[0172] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u daljem tekstu su dizajnirani kao 2-9-5 MOE gapmeri, 2-9-6 MOE gapmeri, 2-10-8 MOE gapmeri, 3-9-4 MOE gapmeri, 3-9-5 MOE gapmeri, 3-10-3 MOE gapmeri, 3-10-4 MOE gapmeri, 3-10-7 MOE gapmeri, 4-9-3 MOE gapmeri, 4-9-4 MOE gapmeri, 4-10-6 MOE gapmeri, 5-9-2 MOE gapmeri, 5-9-3 MOE gapmeri, 5-10-5 MOE gapmeri, 6-9-2 MOE gapmeri, 6-10-4 MOE gapmeri, 7-10-3 MOE gapmeri, ili 8-10-2 MOE gapmeri.2-9-5 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže dva i pet nukleozida respektivno. 2-9-6 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže dva i šest nukleozida respektivno. 2-10-8 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže dva i osam nukleozida respektivno. 3-9-4 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže tri i četiri nukleozida respektivno. 3-9-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže tri i pet nukleozida respektivno. 3-10-3 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po tri nukleozida. 3-10-4 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže tri i četiri nukleozida respektivno. 3-10-7 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže tri i sedam nukleozida respektivno. 4-9-3 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže četiri i tri nukleozida respektivno. 4-9-4 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže
1
po četiri nukleozida. 4-10-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže četiri i šest nukleozida respektivno. 5-9-2 MOE gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže pet i dva nukleozida respektivno. 5-9-3 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2 ’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže pet i tri nukleozida respektivno. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. 6-9-2 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži devet 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže šest i dva nukleozida respektivno. 6-10-4 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže šest i četiri nukleozida respektivno. 7-10-3 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže sedam i tri nukleozida respektivno. 8-10-2 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže osam i dva nukleozida respektivno. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima MOE šećernu modifikaciju. Kolona pod nazivom “Motiv” ouznačava motive sa određenim brojem nukleozida u krilima i gap segmentu svakog od oligonukleotida. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom oligonukleotidu su 5-metilcitozini.
[0173] “Virusno ciljno početno mesto” označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je gapmer usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. “Virusno ciljno mesto zaustavljanja” označava 3’-krajni nukleotid prema kome je gapmer usmeren u ciljnoj virusnoj genskoj sekvenci. Kolona pod nazivom “Motiv” označava strukturu proreda i krila svakog gapmera. Svaki gapmer naveden u Tabelama je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1). Potencija novo dizajniranih oligonukleotida je upoređivana sa ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 i ISIS 510100, i ta informacija je postavljena na vrh svake tabele.
Tabela 29
1 4
1
1
Tabela 30
1
1
Tabela 31
1
14
Tabela 32
14
Tabela 33
14
Tabela 34
14
14
Tabela 35
14
14
1
Tabela 36
11
12
Tabela 37
1
14
Tabela 38
1
1
1
Tabela 39
1
1
Tabela 40
1
11
Tabela 41
12
1
Tabela 42
14
1
1
Tabela 43
1
1
Tabela 44
1
1
Tabela 45
11
12
1
Tabela 46
14
1
Primer 15: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2 ćelijama preko deoksi, MOE i (S)-cEt gapmera
[0174] Dizajnirani su antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim u daljem tekstu. ISIS 146786 i ISIS 509934, koji su opisani u ranijoj prijavi (U.S. privremena prijava br. 61/478,040 koja je podneta 21.04.2011.), su takođe uključeni u ove studije zradi poređenja. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom LipofectAMINE2000® sa 70 nM antisens oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3370 („forward“ Sekvenca CTTGGTCATGGGCCATCAG, označena ovde kao SEQ ID NO: 1; reverzna sekvenca CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, označena ovde kao SEQ ID NO: 2; sekvenca probe TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, označena ovde kao SEQ ID NO: 3) je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi su takođe mereni upotrebom seta prjamer probe RTS3371 („forward“ sekvenca CCAAACCTTCGGACGGAAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 311; reverzna sekvenca TGAGGCCCACTCCCATAGG,
1
označena ovde kao SEQ ID NO: 312; sekvenca probe CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, označena ovde kao SEQ ID NO: 313). Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0175] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u daljem tekstu su dizajnirani kao deoksi, MOE i (S)-cEt gapmeri. Gapmeri su dužine 16 nukleozida, pri čemu nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, (S)-cEt šećernu modifikaciju ili deoksi modifikaciju. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećermne modifikacije svakog oligonukleotida. ’k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; i ’e’ označava MOE modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom oligonukleotidu su 5-metilcitozini.
[0176] “Virusno ciljno početno mesto” označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je gapmer usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. “Virusno ciljno mesto zaustavljanja” označava 3’-krajni nukleotid prema kome je gapmer usmeren u ciljnoj virusnoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabelama je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1). Potencija novo dizajniranih oligonukleotida je upoređivana sa ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 i ISIS 510100.
Tabela 47
1
1
1
1
Tabela 48
11
12
1
Tabela 49
14
1
1
1
Tabela 50
1
1
1
11
Tabela 51
12
1
14
Tabela 52
1
1
1
1
Primer 16: Od doze zavisna antisens inhibicija HBV iRNK u HepG2 ćelijama preko MOE gapmera
[0177] Antisens oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 14 koji ispoljavaju in vitro inhibiciju HBV iRNK su izabrani i testirani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču u gustini od 28000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE2000® sa 9.26 nM, 27.78 nM, 83.33 nM i 250.00 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 53. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set HBV prajmer probe RTS3371 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
1
[0178] Kao što je ilustrovano u Tabeli 53, nivoi HBV iRNK su redukovani na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidom. ’n/a’ označava da podaci za tu dozu nisu dostupni.
Tabela 53
2
21
22 Primer 17: Od doze zavisna antisens inhibicija HBV iRNK u HepG2 ćelijama preko deoksi, MOE i (S)-cEt gapmera
[0179] Antisens oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 15 koji ispoljavaju in vitro inhibiciju HBV iRNK izabrani su i testirani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Ćelije su postavljene na ploču u gustini od 28000 ćelija po komorici i transficirane upotrebom LipofectAMINE2000® sa 9.26 nM, 27.78 nM, 83.33 nM i 250.00 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabeli 54. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set HBV prajmer probe RTS3371 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0180] Kao što je ilustrovano u Tabeli 54, nivoi HBV iRNK su redukovani na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidom.
Tabela 54
2
Primer 18: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2 ćelijama preko deoksi, MOE i (S)-cEt gapmera
[0181] Dizajnirani su dodatni antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. ISIS 5808 i ISIS 9591, otkriveni u US5985662, kao i ISIS 146781, ISIS 146786, 524518, ISIS 552859 i ISIS 552870 su takođe uključeni u ove studije radi poređenja i označeni su zvezdicom. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom LipofectAMINE2000® sa 100 nM antisens oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probes RTS3370 i RTS3371 korišćeni su za posebno merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0182] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli u daljem tekstu su dizajnirani kao MOE gapmeri ili deoksi, MOE i (S)-cEt gapmeri. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20
2 4
nukleozida, pri čemu centralni gap segment sadrži deset 2’-deoksinukleozida i flankiran je na obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. Deoksi, MOE i (S)-cEt gapmeri su dužine 16 nukleozida pri čemu nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, (S)-cEt šećernu modifikaciju ili deoksi modifikaciju. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećernu modifikaciju svakog oligonukleotida. ’k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinulleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom oligonukleotidu su 5-metilcitozini.
[0183] “Virusno ciljno početno mesto” označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je gapmer usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. “Virusno ciljno mesto zaustavljanja” označava 3’-krajni nukleotid prema kome je gapmer usmeren u ciljnoj virusnoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabeli 55 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1).
2
55 la abeT
Primer 19: Efikasnost gapmera koji su usmereni ka HBV kod transgenih miševa
[0184] Transgeni miševi su tretirani ISIS antisens oligonukleotidima u određenom broju studija za procenu efikasnosti gapmeai. Procenjivani su nivoi HBV DNK i RNK.
Studija 1
[0185] Grupe od po 12 miševa su primali subkutanu imnjekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 510106, ISIS 510116, ISIS 505347 ili ISIS 509934. Kontrolna grupa od 12 miševa je primala subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i jetre su sakupljene za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0186] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom setova prajmer probe RTS3370, RTS3371 i RTS3372. Nivoi DNK su normalizovani prema „picogreen“. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setovima prajmer probe RTS3370 i RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 56, izraženi kao procenat inhibicije u poređenju sa kontrolnom grupom. Kao što je prikazano u Tabeli 56, većina antisens oligonukleotida postigla je redukciju HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 56
Studija 2
2
[0187] Grupe od po 6 miševa su primali subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelja sa 50 mg/kg of ISIS 146779, ISIS 505358, ISIS 146786, ISIS 509974, ISIS 509958 ili ISIS 509959. Kontrolna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i jetre su sakupljene za dodatnu analizu.
Analiza DNK i RNK
[0188] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom setova prajmer probe RTS3370. Nivoi DNK su normalizovani prema „picogreen“. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setovima prajmer probe RTS3370 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 57, izraženi kao procenat inhibicije u poređenju sa kontrolnom grupom. Kao što je prikazano u Tabeli 57, većina antisens oligonukleotida postigla je redukciju HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 57
Studija 3
[0189] Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 509960, ISIS 505329, ISIS 146786, ISIS 505339 ili ISIS 509927. Sledeća grupa od 6 miševa je primala entecavir, oralni antivirusni lek korišćen za lečenje infekcije hepatitisa B, u 1 mg/kg na dan tokom dve nedelje. Kontrolna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i jetre su sakupljene za dodatnu analizu.
Analiza DNK i RNK
2
[0190] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom setova prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setovima prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 58, izraženi kao procenat inhibicije u poređenju sa kontrolnom grupom. Kao što je prikazano u Tabeli 58, većina antisens oligonukleotida postigla je redukciju HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 58
Studija 4
[0191] Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786, ISIS 552176 i ISIS 552073. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0192] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 59. Kao što je prikazano u Tabeli 59, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK
21
ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 59
Funkcija jetre
[0193] Radi procene efekta ISIS oligonukleotida u funkciji jetre, koncentracije ALT u plazmi su merene upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY) (Nyblom, H. et al., Alcohol & Alcoholism 39: 336-339, 2004; Tietz NW (Ed): Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. W. B. Saunders, Philadelphia, PA, 1995). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 60 izraženi u IU/L. Oba ISIS oligonukleotida se smatraju tolerablim kod miševa, kao što je pokazano preko njihovog profila transaminaze jetre.
Tabela 60
Studija 5
[0194] Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786, ISIS 552056, ISIS 552088 i ISIS 552309. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0195] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli 61, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 61
Studija 6
[0196] Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786, ISIS 505330, ISIS 509932, ISIS 552032, ISIS 552057, ISIS 552075, ISIS 552092 i ISIS 552255. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0197] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli 62, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV mRNA ili DNA, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija označava motiv gap-krila svakog gapmera.
Tabela 62
Studija 7
[0198] Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 20 mg/kg ISIS 552859, ISIS 577121, ISIS 577122, ISIS 577123, ISIS 577132, ISIS 577133 i ISIS 577134. Ovi gapmeri imaju deoksi, MOE i (S)-cEt hemiju. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0199] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli 63, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ’k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju.
Tabela 63
21
Studija 8
[0200] Grupa od 6 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786, 5-10-5 MOE gapmera. Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 10 mg/kg ISIS 552803, ISIS 552903, ISIS 552817, ISIS 552822 i ISIS 552907. Ovi gapmeri su svi imali deoksi, MOE i (S)-cEt hemiju. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0201] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 64. Kao što je prikazano u Tabeli 64, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ‘k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju; u slučaju MOE gapmera, kolona pod nazivom Hemija definiše strukturu gap-krila.
Tabela 64
Studija 9
[0202] Grupa od 6 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786. Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 10 mg/kg ISIS 552853, ISIS 552854, ISIS 552932 i ISIS 552938. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0203] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli 65, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV mRNA ili DNA, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ‘k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju; u slučaju MOE gapmera, kolona pod nazivom Hemija definiše strukturu gap-krila.
Tabela 65
21
Studija 10
[0204] Grupa od 6 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786. Grupe od po 6 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 10 mg/kg ISIS 552922, ISIS 552923, ISIS 552942, ISIS 552872, ISIS 552925, ISIS 552937 i ISIS 552939. Jedna grupa od 10 miševa primala je subkutanu injekciju dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS. Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0205] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom seta prajmer probe RTS3371. Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setom prajmer probe RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Kao što je prikazano u Tabeli 66, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ‘k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju; u slučaju MOE gapmera, kolona pod nazivom Hemija definiše strukturu gap-krila.
Tabela 66
21
Primer 20: Efikasnost gapmera usmerenih ka HBV kod transgenih miševa
[0206] Korišćeni su miševi sa HBV genskim fragmentom (Guidotti, L. G. et al., J. Virol. 1995, 69, 6158-6169). Miševi su tretirani ISIS antisens oligonukleotidima izabranim iz studija opisanih u prethodnom tekstu i procenjenih za njihovu efikasnost u ovom modelu. Procenjivali su nivoi HBV DNK, RNK i antigena.
[0207] Grupe od po 10 miševa su primale subkutanu injekciju dva puta nedeljno prve nedelje sa 50 mg/kg i, zatim, dva puta nedeljno tokom sledeće 3 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 146786 ili ISIS 510100. Kontrolne grupe od po 10 miševa su tretirane na sličan način sa ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, SEQ ID NO: 320; 5-10-5 MOE gapmerom sa poznatim mišjim ciljnim mestom) ili ISIS 459024 (CGGTCCTTGGAGGATGC, SEQ ID NO: 1351; 3-10-4 MOE gapmerom bez poznatog mišjeg ciljnog mesta). Miševi su eutanazirani 48 časova posle poslednje doze, i organi i serum su sakupljeni za dalju analizu.
Analiza DNK i RNK
[0208] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu HBV DNK, upotrebom setova prajmer probe RTS3370, RTS3371, ili RTS3372 („forward“ sekvenca ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT, označena kao SEQ ID NO: 314; reverzna sekvenca CGACGCGGCGATTGAG, označena kao SEQ ID NO: 315; sekvenca probe AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG, označena kao SEQ ID NO: 316). Nivoi DNK su normalizovani preko “picogreen”. Uzorci HBV RNK su takođe analizirani setovima prajmer probe RTS3370 i RTS3371 posle RT-PCR analize. Nivoi iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®. Podaci su predstavljeni u Tabeli 67. Uzorci DNK seruma su analizirani posle perioda tretmana. Podaci su predstavljeni u Tabeli 68, izraženi u odnosu na nivoe merene u
21
kontrolnoj grupi. Kao što je prikazano u Tabelama 67 i 68, antisens oligonukleotidi su postigli redukciju nivoa HBV DNK i RNK u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV iRNK ili DNK, u odnosu na kontrolu. Kolona pod nazivom Hemija definiše strrukturu gap-krila svakog gapmera.
Tabela 67
Tabela 68
Analiza HBV antigena
[0209] HBV antigeni u supernatantima su detektovani sa ELISA tehnikom. Nivoi HBs antigena (HBsAg) detektovani su pomoću ELISA iz Abazyme LLC, MA. Kao što je predstavljeno u Tabeli 57, tretman ISIS oligonukleotidima 146786 ili 510100 uzrokovao je redukciju u nikvoima HBsAg. Nivoi HBe antigena (HBeAg) su detektovani pomoću ELISA iz International Immunodiagnostics, CA. Kao što je predstavljeno u Tabeli 69, tretman ISIS oligonukleotidima 146786 ili 510100 takođe je uzrokovao redukciju u nivoima HBeAg.
Tabela 69
21
Primer 21: Antisens inhibicija HBV virusne iRNK u HepG2 ćelijama preko deoksi, MOE i (S)-cEt gapmera
[0210] Dizajnirani su antisens oligonukleotidi koji su usmereni ka HBV virusnoj nukleinskoj kiselini i testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. ISIS 146786, ISIS 505358, ISIS 509932 i ISIS 510100, otkriveni u U.S. privremenoj prijavi br. 61/478,040 podnetoj 21.4.2011.; ISIS 552859 otkriven u U.S. . privremenoj prijavi br. 61/596692 podnetoj 8.2.2012.; ISIS 577121, ISIS 577122, ISIS 577123, ISIS 577132, ISIS 577133 i ISIS 577134, otkriveni u studiji opisanoj u prethodnom tesktu, takođe su uključeni u analizu. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom citofektina sa 9.375 nM, 18.75 nM, 37.50 nM, 75.00 nM, 150.00 nM ili 300.00 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3371 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN ®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije HBV, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0211] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama u daljem tekstu su dizajnirani kao deoksi, MOE i (S)-cEt gapmeri. Deoksi, MOE i (S)-cEt gapmeri su dužine 16, 17 ili 18 nukleozida gde nukleozidi imaju MOE šećernu modifikaciju, (S)-cEt šećernu modifikaciju ili deoksi modifikaciju. Kolona pod nazivom ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ‘k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; broj označava broj deoksinukleozida; inače, ’d’ označava deoksinukleozid; i ’e’ označava MOE modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom oligonukleotidu su 5-metilcitozini.
[0212] “Virusno ciljno početno mesto” označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je gapmer usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. “Virusno ciljno mesto zaustavljanja” označava 3’-krajni nukleotid prema kome je gapmer usmeren u ciljnoj virusnoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabeli 70 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, koja je označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1).
21
Tabela 70
Tabela 71
22
Tabela 72
Primer 22: Analiza potencije ujednačenih deoksioligonukleotida u inhibiciji HBV iRNK u HepG2 ćelijama
[0213] Dodatni antisens oligonukleotidi testirani su za njihove efekte na HBV iRNK in vitro. ISIS 5808 i ISIS 9591, otkriveni u US5985662 takođe su uključeni u analizi. ISIS 146786 je uključen u analizu kao standard. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 28,000 ćelija po komorici transficirane su upotrebom LipofectAMINE2000® sa 18.75 nM, 37.50 nM, 75.00 nM, 150.00 nM ili 300.00 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časova, RNK je izolovana iz ćelija i mereni su nivoi HBV iRNK pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set virusne prajmer probe RTS3371 je korišćen za merenje nivoa iRNK i DNK. Nivoi HBV iRNK su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je meren pomoću RIBOGREEN®. Nivoi S antigena i E antigena su takođe mereni pomoću ELISA. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0214] Testirani antisens oligonukleotidi, ISIS 582699, ISIS 582700 i ISIS 582701, su dizajnirani prema sekvencama i hemijskim postupcima otkrivenim Korba and Gerin, Antiviral Research, 1995, Vol.28, 225-242; odgovarajući nazivi za oligonukleotide u referenci su S1, C1, i L2c, respektivno. Antisens oligonukleotidi u Tabelama u daljem tekstu su dizajnirani kao ujednačeni deoksi oligonukleotidi, dužine 16 ili 21 nukleozida gde nukleozidi imaju deoksi modifikacije. "Virusno ciljno početno mesto" označava 5’-krajnji nukleotid prema kome je oligonukleotid usmeren u virusnoj genskoj sekvenci. "Virusno ciljno mesto zaustavljanja" označava 3’-krajnji nukleotid prema kome je usmeren oligonukleotid u virusnoj genskoj sekvenci. Svaki oligonukleotid naveden u Tabeli 73 je usmeren ka virusnoj genomskoj sekvenci, koja je označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. U95551.1). Rezultati ukazuju na to da su deoksi oligonukleotidi imali zanemarljiv efekat na nivoe ekspresije HBV iRNK, nivoe DNK i nivoe HBV antigena.
Tabela 73
Tabela 74
Tabela 75
Tabela 76
Tabela 77
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Jedinjenje koje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa HBV-om kod subjekta, pri čemu, bolest, poremećaj ili stanje je žutica, inflamacija jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, insuficijencija jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija jetre povezana sa bolešću, pri čemu se jednolančani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu prema SEQ ID NO: 226 i sadrži:
gap segment koji se sastoji od deset vezanih deoksinukleozida;
5’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; i
3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida;
pri čemu je gap segment postavljen između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, pri čemu svaki nukleozid svakog krilnog segmenta sadrži 2’-O-metoksietil šećer, pri čemu, svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza, i pri čemu, svaki citozin je 5-metilcitozin.
2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što se jedinjenje sastoji od jednolančanog modifiovanog oligonukleotida.
3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što, jedinjenje je konjugovano antisens jedinjenje.
4. Kompozicija za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa HBV-om kod subjekta, pri čemu, bolest, poremećaj ili stanje je žutica, inflamacija jetre, fibroza jetre, inflamacija, ciroza jetre, insuficijencija jetre, kancer jetre, difuzna hepatocelularna inflamatorna bolest, hemofagocitni sindrom, serum hepatitis, HBV viremija ili transplantacija jetre povezana sa bolešću, pri čemu kompozicija sadrži jedinjenje ili njegovu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, pri čemu jedinjenje sadrži jednolančani modifikovani oligonukleotid, pri čemu su jednolančani modifikovani oligonukleotid sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu prema SEQ ID NO: 226 i sadrži:
gap segment koji se sastoji od deset vezanih deoksinukleozida;
5’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida; i
3’ krilni segment koji se sastoji od 5 vezanih nukleozida;
pri čemu je gap segment postavljen između 5’ krilnog segmenta i 3’ krilnog segmenta, pri čemu svaki nukleozid svakog krilnog segmenta sadrži 2’-O-metoksietil šećer, pri čemu, svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza, i pri čemu, svaki citozin je 5-metilcitozin.
5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što se jedinjenje sastoji od jednolančanog modifikovanog oligonukleotida.
6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačena time da jedinjenje je konjugovano antisens jedinjenje.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20210190A 2011-04-21 2012-04-20 Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv) RS61447B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161478038P 2011-04-21 2011-04-21
US201161478040P 2011-04-21 2011-04-21
US201261596690P 2012-02-08 2012-02-08
US201261596692P 2012-02-08 2012-02-08
EP19155538.2A EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2012-04-20 Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61447B1 true RS61447B1 (sr) 2021-03-31

Family

ID=47041953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210190A RS61447B1 (sr) 2011-04-21 2012-04-20 Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv)

Country Status (35)

Country Link
US (7) US8642752B2 (sr)
EP (4) EP3505528B1 (sr)
JP (3) JP6042871B2 (sr)
KR (3) KR20200110822A (sr)
CN (3) CN103582648B (sr)
AU (1) AU2012245243B2 (sr)
CA (1) CA2833766C (sr)
CL (1) CL2013003053A1 (sr)
CO (1) CO6862103A2 (sr)
CR (2) CR20190207A (sr)
CY (1) CY1124327T1 (sr)
DK (1) DK3505528T3 (sr)
DO (1) DOP2013000246A (sr)
EA (1) EA029137B1 (sr)
ES (1) ES2856266T3 (sr)
HR (1) HRP20210244T1 (sr)
HU (1) HUE053401T2 (sr)
IL (2) IL228874B (sr)
LT (1) LT3505528T (sr)
MX (2) MX340408B (sr)
MY (1) MY169474A (sr)
NZ (2) NZ616512A (sr)
PE (2) PE20181267A1 (sr)
PH (2) PH12019502377A1 (sr)
PL (1) PL3505528T3 (sr)
PT (1) PT3505528T (sr)
RS (1) RS61447B1 (sr)
RU (1) RU2667524C2 (sr)
SG (2) SG194555A1 (sr)
SI (1) SI3505528T1 (sr)
SM (1) SMT202100084T1 (sr)
TW (1) TWI548745B (sr)
UA (1) UA118951C2 (sr)
WO (1) WO2012145697A1 (sr)
ZA (1) ZA201307620B (sr)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
ES2526295T5 (es) 2006-10-18 2021-05-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos antisentido
MX341084B (es) 2009-11-02 2016-08-05 Univ Washington Composiciones de nucleasas terapéuticas y métodos.
US9029341B2 (en) * 2010-08-17 2015-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP2673361B1 (en) 2011-02-08 2016-04-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
ES2666303T3 (es) 2011-04-29 2018-05-03 University Of Washington Composiciones terapéuticas de nucleasa y métodos
EA024762B9 (ru) 2011-06-30 2017-04-28 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн Композиции и способы ингибирования экспрессии генов вируса гепатита в
US10202599B2 (en) 2011-08-11 2019-02-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
WO2013159108A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
SG11201500125QA (en) 2012-07-11 2015-02-27 Blueprint Medicines Corp Inhibitors of the fibroblast growth factor receptor
SG11201501255PA (en) 2012-08-30 2015-03-30 Replicor Inc Methods for the treatment of hepatitis b and hepatitis d infections
US9695418B2 (en) 2012-10-11 2017-07-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and uses thereof
CN104968783B (zh) 2012-10-15 2019-12-10 Ionis制药公司 用于调节c9orf72表达的组合物
ES2762326T5 (es) 2012-10-15 2023-04-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Métodos para modular la expresión de C9ORF72
EP2906697A4 (en) 2012-10-15 2016-06-22 Ionis Pharmaceuticals Inc METHOD FOR MONITORING THE C9ORF72 EXPRESSION
CN104837996A (zh) 2012-11-15 2015-08-12 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 抗apob反义缀合物化合物
AU2014211406B2 (en) 2013-01-30 2019-07-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S LNA oligonucleotide carbohydrate conjugates
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
WO2015042447A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
US10221414B2 (en) 2013-10-11 2019-03-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating C9ORF72 expression
RS63405B1 (sr) 2013-10-25 2022-08-31 Blueprint Medicines Corp Inhibitori receptora faktora rasta fibroblasta
HRP20192080T1 (hr) 2013-10-31 2020-02-07 Resolve Therapeutics, Llc Terapeutske fuzije nukleaza-albumine i postupci
US9695165B2 (en) 2014-01-15 2017-07-04 Blueprint Medicines Corporation Inhibitors of the fibroblast growth factor receptor
HUE050704T2 (hu) * 2014-04-01 2020-12-28 Biogen Ma Inc Összetételek a SOD-1 expressziójának modulálására
EA036496B1 (ru) 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b
US9382540B2 (en) 2014-05-01 2016-07-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
EP2966170A1 (en) * 2014-07-10 2016-01-13 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - HBV inactivation
KR102545316B1 (ko) * 2014-11-10 2023-06-22 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스(ｈｂｖ) ｉｒｎａ 조성물 및 그의 이용 방법
EA039127B1 (ru) * 2015-03-24 2021-12-08 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBV) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RS60230B1 (sr) * 2015-04-16 2020-06-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozicije za moduliranje ekspresije c9orf72
US20170137821A1 (en) 2015-07-17 2017-05-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Molecules and agents for treating hepatitis b virus
CA2996722A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against hepatitis b virus and uses thereof
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
WO2017079291A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating c90rf72
KR20250078597A (ko) 2015-11-06 2025-06-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포리포프로테인 (a) 발현 조정
CA3011946A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Targeting ligands for therapeutic compounds
RU2747822C2 (ru) 2016-03-14 2021-05-14 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1
EP4219767A1 (en) 2016-06-17 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Papd5 and papd7 inhibitors for treating a hepatitis b infection
CA3029627A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
SG11201901841TA (en) 2016-09-02 2019-03-28 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Targeting ligands
KR102533038B1 (ko) * 2016-09-14 2023-05-17 얀센 바이오파마, 인크. 변형된 올리고뉴클레오티드 및 사용 방법
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
CN110234763A (zh) * 2016-11-11 2019-09-13 詹森生物制药有限公司 针对hbv cccdna的寡核苷酸靶向策略
CA3043768A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
MX2019006803A (es) * 2016-12-13 2019-11-18 Am Sciences Inc Composicion farmaceutica para prevenir o tratar la hepatitis b.
BR112019012057A2 (pt) 2016-12-15 2019-11-12 Meharry Medical College agente antiviral, composição farmacêutica para a administração do mesmo e métodos de redução na replicação do vírus zika (zikv) e tratamento de doença mediada pelo vírus zika (zikv)
CN106729753A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 谭旭 抗乙型肝炎病毒的递送系统和生物制剂
CN106701763B (zh) * 2016-12-30 2019-07-19 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA
CN106916905B (zh) * 2017-01-17 2018-06-08 重庆医科大学附属儿童医院 隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法
CA3059446A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (hbv) infection
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
CA3073537A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Sanabio, Llc Soluble interferon receptors and uses thereof
JP7332585B2 (ja) * 2017-09-01 2023-08-23 アンスティトゥート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシャルシュ・メディカル・（インセルム） Ｂ型肝炎ウイルス感染症を予防し且つ／又は処置するのに使用するための阻害剤
CN111511914B (zh) 2017-10-16 2023-11-17 豪夫迈·罗氏有限公司 减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染
UA128786C2 (uk) 2017-10-20 2024-10-23 Дайсерна Фармасьютикалз, Інк Олігонуклеотид для лікування інфекції гепатиту в
WO2019157531A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
SG11202009680XA (en) 2018-04-05 2020-10-29 Hoffmann La Roche Use of fubp1 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
US20210047646A1 (en) * 2018-04-09 2021-02-18 The Trustees Of Princeton University Compositions Comprising Immune System Activators and Method of Using Same
PE20210346A1 (es) 2018-07-03 2021-02-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de tau
CN112534055A (zh) 2018-07-13 2021-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节rtel1表达的寡核苷酸
JP7625512B2 (ja) 2018-08-13 2025-02-03 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｄｓＲＮＡ物質組成物およびその使用方法
CN109234275A (zh) * 2018-08-30 2019-01-18 山东省立医院 一种可以同时抑制乙肝病毒dna和乙肝表面抗原的反义核苷酸
CA3132601A1 (en) * 2019-03-05 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b immunisation regimen and compositions
EP3947680A2 (en) * 2019-04-03 2022-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Angptl2 antisense oligonucleotides and uses thereof
SG11202112741XA (en) 2019-05-31 2021-12-30 Aligos Therapeutics Inc Modified gapmer oligonucleotides and methods of use
WO2021107097A1 (ja) * 2019-11-28 2021-06-03 株式会社ボナック Ｂ型肝炎治療用核酸分子
WO2021122735A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077669A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122921A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506954A (ja) 2019-12-19 2023-02-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓａｒａｆ阻害剤の使用
WO2021122869A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021226019A2 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating viral infections
AU2021318943A1 (en) * 2020-07-27 2023-03-02 Aligos Therapeutics, Inc. HBV binding oligonucleotides and methods of use
CN116157522A (zh) 2020-08-21 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 A1cf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CN114507663A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 寡核苷酸及其在抗乙型肝炎和丁型肝炎病毒中的应用
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
JP2024518788A (ja) * 2021-05-10 2024-05-02 キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ナトリウムチャネル１．６を標的とする組成物
CA3235672A1 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for inhibiting expression of hepatitis b virus (hbv) protein
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
TW202340468A (zh) * 2022-01-10 2023-10-16 中國大陸商杭州浩博醫藥有限公司 B型肝炎病毒(hbv)表現之調節
US20250092401A1 (en) 2022-01-28 2025-03-20 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy for treating hepatitis b virus infections
KR20240168390A (ko) 2022-03-29 2024-11-29 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 만성 b형 간염을 치료하는 방법
AU2024255686A1 (en) 2023-04-12 2025-10-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating chronic hepatitis b
CN119816597A (zh) * 2023-08-10 2025-04-11 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种抑制HBV基因表达的dsRNA分子及其应用
CN118667808B (zh) * 2023-08-22 2025-04-18 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 双‐Gap修饰寡核苷酸及其在抗乙型肝炎和丁型肝炎病毒中的应用
WO2025061204A1 (zh) * 2023-09-21 2025-03-27 华辉安健（北京）生物科技有限公司 用于hbv相关疾病的化合物及其应用
WO2025242321A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.3) Limited Novel use
WO2025262623A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Method of treating hbv/hiv coinfection
CN120796266A (zh) * 2024-07-08 2025-10-17 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种降低hbv基因表达的反义寡核苷酸及其应用
CN119799705B (zh) * 2024-07-08 2025-12-12 杭州天龙药业有限公司 靶向调控HBV基因表达的siRNA及其应用

Family Cites Families (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US4806463A (en) 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5004810A (en) 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5780219A (en) 1989-07-11 1998-07-14 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid amplification oligonucleotides and probes to human hepatitis B virus
GB9006924D0 (en) 1990-03-28 1990-05-23 Imperial College Prognosis of hepatitis infection
US5610050A (en) 1990-04-20 1997-03-11 The General Hospital Corporation Methods of preventing viral replication
ATE142690T1 (de) 1990-04-20 1996-09-15 Gen Hospital Corp Methoden zur verhinderung von viralen replikationen
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
AU8412991A (en) * 1990-07-27 1992-03-02 Chiron Corporation Large comb-type branched polynucleotides
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
EP0618924B1 (en) 1991-12-23 2001-02-14 Bayer Corporation Hbv amplifier probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US20040054156A1 (en) * 1992-05-14 2004-03-18 Kenneth Draper Method and reagent for inhibiting hepatitis B viral replication
US6017756A (en) 1992-05-14 2000-01-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting hepatitis B virus replication
US20030068301A1 (en) * 1992-05-14 2003-04-10 Kenneth Draper Method and reagent for inhibiting hepatitis B virus replication
US20030206887A1 (en) 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040127446A1 (en) 1992-05-14 2004-07-01 Lawrence Blatt Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis B virus and hepatitis C virus replication
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5736334A (en) 1993-04-12 1998-04-07 Abbott Laboratories Nucleotide sequences and process for amplifying and detection of hepatitis B viral DNA
EP0785996A1 (en) 1993-07-13 1997-07-30 Abbott Laboratories Nucleotide sequences and process for amplifying and detection of hepatitis b virus
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
WO1995017414A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Apollon, Inc. Anti-hepatitis b viral oligonucleotides
US5728518A (en) * 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
GB9401987D0 (en) 1994-02-02 1994-03-30 Imperial College Modified nucleic acid
US5646262A (en) 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US5856459A (en) 1995-06-06 1999-01-05 Hybridon, Inc. Oligonucleotides specific for hepatitis B virus
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US6217858B1 (en) 1997-02-11 2001-04-17 Hadasit & Medical Research Services & Development Company, Ltd. Pharmaceutical composition for treating hepatitis B virus (HBV) infection
US5843770A (en) * 1996-03-11 1998-12-01 The Immune Response Corporation Antisense constructs directed against viral post-transcriptional regulatory sequences
ZA973367B (en) 1996-04-19 1997-11-18 Innogenetics Nv Method for typing and detecting HBV.
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE19725803C1 (de) 1997-06-18 1999-02-11 Deutsches Krebsforsch HBV-gerichtete Antisense-Nukleinsäuren
CN1057302C (zh) * 1997-08-27 2000-10-11 中国科学院上海生物化学研究所 抑制乙型肝炎病毒复制的反义脱氧寡核苷酸
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
CN1081069C (zh) * 1998-08-14 2002-03-20 饶纬华 乙型肝炎治疗性疫苗及其制备方法
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US20040002153A1 (en) * 1999-07-21 2004-01-01 Monia Brett P. Modulation of PTEN expression via oligomeric compounds
EP1212416A2 (en) 1999-08-31 2002-06-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
WO2001038498A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Pharmasset, Ltd. A new genotype of hepatitis b virus
AU2358201A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Innogenetics N.V. New hbv sequences
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
EP1152063A1 (en) 2000-05-03 2001-11-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Method of diagnosing HBV infection stages
WO2002000613A2 (en) 2000-06-27 2002-01-03 Axxima Pharmaceuticals Ag Inhibitors of hepatitis b virus infection
US6277640B1 (en) * 2000-07-31 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of Her-3 expression
EP1383782A1 (en) 2001-03-26 2004-01-28 Sirna Therpeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
US20080161256A1 (en) 2001-05-18 2008-07-03 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
CA2452458A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US10590418B2 (en) 2001-07-23 2020-03-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals
US20030143527A1 (en) 2001-10-09 2003-07-31 Venkatakrishna Shyamala Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis B viral DNA
JP2005507660A (ja) 2001-10-16 2005-03-24 アビ バイオファーマ， インコーポレイテッド ｓｓＲＮＡウイルス感染の処置のためのアンチセンス抗ウイルス剤および方法
US20050266422A1 (en) 2002-02-20 2005-12-01 Sirna Therapeutics, Inc. Fluoroalkoxy, nucleosides, nucleotides, and polynucleotides
WO2003087351A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Melbourne Health Hepatitis b viral variants with redused susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof
US7015317B2 (en) 2002-05-02 2006-03-21 Abbott Laboratories Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids
ATE519861T1 (de) 2002-06-14 2011-08-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen zum nachweis von hepatitis-b- virus
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1572095B1 (en) 2002-09-13 2015-06-10 Novartis AG Beta-l-2'-deoxynucleosides for use in the treatment of resistant hbv strains
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7511131B2 (en) * 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
ATE554185T1 (de) 2003-02-27 2012-05-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Verfahren und konstrukte zur bewertung von rnai- zielen und effektormolekülen
CN1257284C (zh) 2003-03-05 2006-05-24 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法
US20040191776A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Pei-Jer Chen Method for genotyping and quantifying Hepatitis B Virus
US20040185452A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Pei-Jer Chen Identification of single nucleotide polymorphisms
US7067249B2 (en) 2003-05-19 2006-06-27 The University Of Hong Kong Inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication by RNA interference
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
EP2270162B1 (en) 2003-06-12 2018-10-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
EP1493822A1 (de) 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller & Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
KR100647277B1 (ko) 2003-08-14 2006-11-17 삼성전자주식회사 Ｂ형 간염 검사용 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 ｂ형 간염 검사 키트
WO2005021800A2 (en) 2003-08-22 2005-03-10 Sirna Therapeutics, Inc. Detection and quantitation of nucleic acid molecules in biological samples
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
DE10339927A1 (de) 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
WO2005021751A1 (en) 2003-09-01 2005-03-10 Patrick Arbuthnot A self-processing rna expression cassette
CA2538252C (en) 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
JP2007520461A (ja) 2003-12-16 2007-07-26 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 肝炎ウイルスの負荷を変えるための方法および化合物
ES2332712T3 (es) 2003-12-16 2010-02-11 Bio-Rad Pasteur Oligonucleotidos para la deteccion del virus de la hepatitis b.
WO2005116204A1 (ja) 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
EP1789553B1 (en) 2004-06-30 2014-03-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
EP1799814B1 (en) 2004-09-28 2011-03-30 Melbourne Health Variants of hepatitis b virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof
WO2006039739A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Melbourne Health Hepatitis b viral (hbv) mutants detection and application
EP2316942B1 (en) 2004-12-22 2021-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
EP1696040A1 (en) 2005-02-28 2006-08-30 Eurofins Viralliance, Inc. Method of genotyping and phenotyping hepatitis B viruses resistant to antiviral molecules
US20060205040A1 (en) 2005-03-03 2006-09-14 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of adventitious viruses
WO2006096018A1 (en) 2005-03-09 2006-09-14 Mogam Biotechnology Research Institute Small interfering rna and pharmaceutical composition for treatment of hepatitis b comprising the same
US20060258610A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of STAT 6 expression for the treatment of airway hyperresponsiveness
GB0519169D0 (en) 2005-09-21 2005-10-26 Leuven K U Res & Dev Novel anti-viral strategy
GB0522578D0 (en) 2005-11-04 2005-12-14 King S College London Ribozymal nucleic acid
WO2007078029A1 (en) 2006-01-05 2007-07-12 Catch By Gene Co., Ltd. A quantitative method for hbv-dna, a primer and probe for detecting hbv-dna, and a detecting kit comprising the same
WO2007084567A2 (en) 2006-01-17 2007-07-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Detection and discrimination of hepatitis c virus, human immunodeficiency virus type-1 and hepatitis b virus
EP1991677A2 (en) 2006-01-26 2008-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US8178503B2 (en) 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
US8198253B2 (en) * 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
DE602006008150D1 (de) 2006-10-12 2009-09-10 Bio Rad Pasteur Doppelsträngige Sonden zur Fluoreszenzdetektion von Nukleinsäuren
ES2526295T5 (es) 2006-10-18 2021-05-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos antisentido
US8093222B2 (en) * 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CN101589143A (zh) * 2006-11-27 2009-11-25 Isis药物公司 用于治疗高胆固醇血症的方法
AU2007337897A1 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Imuthes Limited Lipids and their use as non-viral delivery vehicle
WO2008101157A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CA2689042A1 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8232257B2 (en) 2007-03-27 2012-07-31 University Of Iowa Research Foundation RNA interference mediated inactivation of hepatitis B virus in a subject
EP2164965B1 (en) 2007-05-29 2013-09-11 University Of The Witwatersrand, Johannesburg A primary micro rna expression cassette
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
US9434997B2 (en) 2007-08-24 2016-09-06 Lawrence Livermore National Security, Llc Methods, compounds and systems for detecting a microorganism in a sample
KR20100069679A (ko) 2007-09-17 2010-06-24 재단법인 목암생명공학연구소 ＨＢＶ 또는 ＨＣＶ의 유전자 발현을 하향 조절하는 ｓｉＲＮＡ의 혈청 안정성 향상 및 면역 반응 저감 방법
EP2205617A4 (en) 2007-11-06 2013-10-16 Siemens Healthcare Diagnostics HEPATITIS B-VIRUS-SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES
KR20100105648A (ko) * 2007-12-03 2010-09-29 엔즌 파마슈티칼스, 인코포레이티드 Ｐｉｋ３ｃａ 발현 조절용 ｒｎａ 길항제 화합물
US20100317599A1 (en) * 2008-02-13 2010-12-16 Alrik Pieter Los Process for the production of a peptide
CN101565756B (zh) 2008-04-25 2013-07-10 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒
CN101603042B (zh) * 2008-06-13 2013-05-01 厦门大学 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点
US20100015708A1 (en) 2008-06-18 2010-01-21 Mdrna, Inc. Ribonucleic acids with non-standard bases and uses thereof
TW201010692A (en) 2008-06-19 2010-03-16 Public Univ Corp Nagoya City Univ Pharmaceutical composition for treatment or prevention of hbv infection
US8293474B2 (en) 2008-07-02 2012-10-23 National Health Research Institutes Oligonucleotides and use thereof for determining deletion in HBV Pre-S region
CN102083983B (zh) 2008-08-01 2014-04-16 苏州瑞博生物技术有限公司 乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用
KR101773551B1 (ko) 2008-10-15 2017-08-31 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 인자 １１ 발현의 조정
US20100211327A1 (en) 2009-02-03 2010-08-19 Prosetta Bioconformatics, Inc. Methods and Systems for Viral Diagnosis
US8815514B2 (en) 2009-07-02 2014-08-26 Co-Diagnostics, Inc. Detection primers for nucleic acid extension or amplification reactions
BR112012008865A2 (pt) 2009-10-16 2019-09-24 Glaxo Group Ltd inibidores de hbv anti-sentido.
US9410189B2 (en) 2010-04-30 2016-08-09 Co-Diagnostics, Inc. Methods of preventing non-specific reactions of nucleotide sequences
US20130137090A1 (en) 2010-07-06 2013-05-30 Aptateck Bio Ltd. Nucleic acid aptamer-based diagnostic methods with novel techniques for signal enhancement
US9029341B2 (en) * 2010-08-17 2015-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2012045894A1 (es) 2010-10-05 2012-04-12 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Compuestos y composiciones para el tratamiento de enfermedades debidas a la infección por el virus de la hepatitis b
LT3124610T (lt) 2010-10-28 2019-08-12 Benitec Biopharma Limited Hbv gydymas
EP2673361B1 (en) 2011-02-08 2016-04-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
WO2012145674A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
EA024762B9 (ru) 2011-06-30 2017-04-28 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн Композиции и способы ингибирования экспрессии генов вируса гепатита в
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
US11511972B1 (en) 2019-09-26 2022-11-29 Versatile, Inc. System for tracking lifting events at a construction site

Also Published As

Publication number Publication date
IL228874A0 (en) 2013-12-31
KR102055331B1 (ko) 2019-12-12
CR20130551A (es) 2014-02-21
KR20200110822A (ko) 2020-09-25
SI3505528T1 (sl) 2021-04-30
TW201249988A (en) 2012-12-16
US20140107184A1 (en) 2014-04-17
US20200190520A1 (en) 2020-06-18
JP6042871B2 (ja) 2016-12-14
PH12013502157B1 (en) 2017-05-29
LT3505528T (lt) 2021-04-26
PL3505528T3 (pl) 2021-08-02
SG10201604074TA (en) 2016-07-28
CN103582648A (zh) 2014-02-12
CY1124327T1 (el) 2022-07-22
IL228874B (en) 2019-08-29
MY169474A (en) 2019-04-12
PH12019502377A1 (en) 2022-11-14
EA029137B1 (ru) 2018-02-28
AU2012245243A1 (en) 2013-05-02
US20170369883A1 (en) 2017-12-28
CN103582648B (zh) 2016-08-31
PT3505528T (pt) 2021-02-23
PE20181267A1 (es) 2018-08-03
IL268257A (en) 2019-09-26
EP3505528A1 (en) 2019-07-03
BR112013027046A2 (pt) 2016-11-29
EP3505528B1 (en) 2020-11-25
PH12013502157A1 (en) 2017-05-29
EP3312189A1 (en) 2018-04-25
JP2019022521A (ja) 2019-02-14
EP3816288A2 (en) 2021-05-05
DK3505528T3 (da) 2021-02-08
BR112013027046A8 (pt) 2017-10-03
PE20141177A1 (es) 2014-09-19
RU2013151843A (ru) 2015-05-27
US20130035366A1 (en) 2013-02-07
CA2833766A1 (en) 2012-10-26
EP2699583A1 (en) 2014-02-26
HRP20210244T1 (hr) 2021-04-30
CA2833766C (en) 2022-05-17
JP2017046713A (ja) 2017-03-09
SG194555A1 (en) 2013-12-30
MX2013012196A (es) 2014-10-06
AU2012245243B2 (en) 2015-03-12
CL2013003053A1 (es) 2014-08-08
US9127278B2 (en) 2015-09-08
US9677076B2 (en) 2017-06-13
US8642752B2 (en) 2014-02-04
DOP2013000246A (es) 2014-04-30
US20140357701A1 (en) 2014-12-04
UA118951C2 (uk) 2019-04-10
CR20190207A (es) 2019-06-26
KR20190140485A (ko) 2019-12-19
NZ705820A (en) 2015-11-27
KR102247463B1 (ko) 2021-05-04
CN111172162A (zh) 2020-05-19
WO2012145697A1 (en) 2012-10-26
ES2856266T3 (es) 2021-09-27
KR20140026498A (ko) 2014-03-05
RU2667524C2 (ru) 2018-09-21
SMT202100084T1 (it) 2021-03-15
US20220064650A1 (en) 2022-03-03
EP3816288A3 (en) 2021-07-14
CN106191060B (zh) 2020-03-31
MX340408B (es) 2016-07-07
MX347253B (es) 2017-04-20
US20160046945A1 (en) 2016-02-18
NZ616512A (en) 2015-05-29
JP2014513954A (ja) 2014-06-19
HUE053401T2 (hu) 2021-06-28
TWI548745B (zh) 2016-09-11
CO6862103A2 (es) 2014-02-10
JP6743106B2 (ja) 2020-08-19
EA201391572A1 (ru) 2014-06-30
EP2699583A4 (en) 2015-04-15
CN106191060A (zh) 2016-12-07
US9034841B2 (en) 2015-05-19
ZA201307620B (en) 2014-08-27
JP6426678B2 (ja) 2018-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS61447B1 (sr) Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv)
US20120295961A1 (en) Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
AU2017201608B2 (en) Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
HK40003952B (en) Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
HK40003952A (en) Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
HK40060878A (en) Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
BR112013027046B1 (pt) Compostos de oligonucleotídeo modificado, seus usos na modulação da expressão do vírus da hepatite b (hbv) e composição farmacêutica dos mesmos