JPH09501830A

JPH09501830A - タグ試薬およびアッセイ法

Info

Publication number: JPH09501830A
Application number: JP7505687A
Authority: JP
Inventors: サザーン，エドウィン; カミンズ，ウィリアム・ジョナサン
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1997-02-25
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: AU7269194A; EP0778280B1; ES2108479T3; DE69431967D1; HU220967B1; DK0711362T3; ATE159767T1; ATE230409T1; US20010031472A1; US5770367A; HUT73802A; GB9315847D0; HU9600027D0; EP0778280A2; CN1088758C; US20020115091A1; EP0778280A3; EP0711362B1; CN1131440A; DE69406544T2

Abstract

(57)【要約】試薬は：ａ）少なくとも二つの被検残基を含み、およびｂ）に連結された被検部分；ｂ）質量分析法による検出に適応した一つまたはそれ以上のレポーター基を含むタグ部分を含んでおり、ここでレポーター基は被検残基を示し、およびタグ部分の各々の位置のレポーター基は被検部分の決められた位置の被検残基を示すように選ばれる。各々異なった被検部分を含む多数のそのような試薬は、標的物質を含むアッセイ法に使用されるであろう。タグ部分の分析は標的物質に結合された被検部分の性質を示している。核酸配列決定法は標的核酸の配列を決定するために本試薬のライブラリーを使用している。

Description

【発明の詳細な説明】タグ試薬およびアッセイ法生化学的および化学的分析において、レポーター基で標識された被検体分子の使用は日常のことである。本発明は一つまたはそれ以上のレポーター基に連結された少なくとも二つの被検基を持つ試薬を提供する考えを提出している。以下に記載する方法においてそのような試薬は、一つのもので標識された被検体よりもはるかに多くの分析的情報を発生させるために使用できる。多被検基および多レポーター基を運ぶ試薬が一緒に合成でき、同時に使用できかつレポーター分子が分析段階で分解できるようにレポーター基を設計することは可能である。ＷＯ９３／０６１２１（Ａｆｆｙｍａｘ）は多数の異なるメンバーを含む合成オリゴマーライブラリーを記載しており、各々のメンバーはオリゴマー中のモノマーの配列を同定する一つまたはそれ以上の同定タグに連結されたモノマーの配列からなるオリゴマーを含んでいる。オリゴマーと同定タグ間の結合は好適には固形粒子を含む。同定タグは好適にはオリゴヌクレオチドである。本発明の一つの態様ではａ）少なくとも二つの被検基を含み、およびｂ）に連結された被検部分、ｂ）質量分析法による検出に適応した一つまたはそれ以上のレポーター基を含むタグ部分を含む試薬が提供され、ここでレポーター基は被検残基を示し、かつタグ部分の各々の位置のレポーター基は被検部分の決められた位置の被検残基を示すように選択される。好適には被検部分は切断可能な（例えば、光切断可能な）結合でタグ部分に連結されている。被検部分およびタグ部分が両方結合される連結基が提供されるであろう。好適には、被検部分はｎ個の被検残基の鎖であり、およびタグ部分はｎ個までのレポーター基の鎖であり、タグ鎖の各々の位置のレポーター基は被検鎖の対応する位置の被検残基を示すように選択される。ｎは２以上の整数であり、好適には３から２０である。本発明は興味あるすべての被検体の検出に使用されるであろう。これらには蛋白質／ペプチド鎖、したがって被検残基はアミノ酸残基；核酸／オリゴヌクレオチド鎖、したがって被検残基はヌクレオチド残基；炭化水素鎖、したがって被検残基は糖残基；が含まれるが、これらに制限されるわけではない。さらに、被検体は生物学的、薬学的または治療的活性を持つ小さな分子の類でもよい。例えば、質量分析タグと組合わさった様式で種々の置換基（例えば、アルキル、エステル、アミン、エーテルなど）を変化させる能力を持つコア分子であってもよい。タグ部分および／またはその中の各々のレポーター基は被検部分および／またはその中の被検残基の性質についての情報を提供するように観察可能／検出可能／分析可能である。一つの実施態様において、試薬は式Ａ−Ｌ−Ｒを持っており、式中Ａは被検部分を構成するｎ個の被検残基の鎖であり、およびＬは連結基であり、Ｒはタグ部分を構成するｎ個までのレポーター基の鎖であり、ｎは２−２０であり、ここでタグ部分は被検部分の被検残基の位置を規定する情報を含んでいる。タグ部分は質量により区別可能な一つまたはそれ以上のレポーター基から成っており、従って質量分析法により分析可能である。レポーター基は化学的に異なっていてもよく、従ってお互いに分子量により区別される。または、レポーター基は化学的には同じであるがお互いに異なった同位元素（例えば、以下に説明されるように¹²Ｃ／¹³Ｃおよび¹Ｈ／²Ｈ）を含むことにより区別されてもよい。タグ部分（および／またはレポーター基）は、例えば光化学的にまたは他の手段で試薬から切断された後、質量分析法による分析に適しまたは適応している。検出系としての質量分析法の利点は：その高い感度−良好な信号を与えるのに数百の分子しか必要とされない；その広いダイナミックレンジおよび高い分解能 −１００から２００，０００ダルトンの質量範囲の分子が０．０１より小さい分解能で分析できる；その融通性−多くの異なった化学構造の分子が容易に分析される；質量分析法と例えば走査レーザー脱離法を組み合わせることによる画像分析の可能性；単に定性的測定ではなく定量的測定ができる能力である。質量標識は放射能および蛍光の利点をあわせたものであり、新規の応用を示唆するさらなる特質を持っている。別の態様において、本発明は上記試薬のライブラリーを提供し、ここでライブラリーは各々ｎ個の被検残基の異なった被検部分を含む多数の試薬から構成されている。例えば、ライブラリーは各々ｎ個のヌクレオチド残基の異なったオリゴヌクレオチド鎖を含む４ⁿの試薬から成っているであろう。ライブラリーの試薬は溶液中に一緒に混合されて存在するであろう。別の態様において、本発明は：標的物質を用意し；少なくとも一つの試薬の標的物質への結合が生じる条件下で標的物質と前記試薬のライブラリーをインキュベートし；非結合試薬を除去し；各々の結合試薬のタグ部分を回収し；標的物質へ結合された被検部分の性質の指標として回収されたタグ部分を分析する、の各工程を含むアッセイ法を提供する。標的物質は、非結合試薬から結合試薬を分離するのに都合のよい手段を提供するために固定化されているであろう。一つの態様では、標的物質は微生物または組織または細胞の集団であり、本アッセイは候補薬剤の一群をスクリーニングするために実施されるであろう。別の態様において標的物質は核酸であり、この態様は以下に非常に詳細に説明される。付随する図を参照されたい： −図１は本発明による試薬合成のための一般的スキームである。 −図２はレポーター基を含んでいるタグ鎖の３つの異なったシステムを持つ試薬を示している。 −図３ａはコードされたオリゴヌクレオチドの合成を示している図であり、および −図３ｂはタグ鎖のコードの読みとりを示している図である。 −図４は累進的ライゲーションによる配列分析を示している図である。 −図５はオリゴヌクレオチドアッセイでのハイブリッド形成により読みとられた配列の伸長を示す図である。図１および２の説明は本明細書の最後に含まれている。以下の応用の実施例を参照すると、本方法が如何に核酸配列の分析および候補薬剤のスクリーニングに応用されるかが説明されている。コードされたタグの合成同時に多被検体にタグを付けるために使用された方法の原理は、結合された核酸配列でペプチドをコードするためにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ（１９９２）により提案されたものと同様である。彼らの考えの概念は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されおよび産生されたＤＮＡ分子の配列決定により読みとられることができるタグを付加することである。試薬の構造は如何にしてそれらを作製しうるかを考えることにより最もよく示される。一つの方向に被検体へ残基を付加し、別の方向に残基特異性レポーター基を付加して段階的に伸長できる二価または多価連結基から合成が始まる（図１）。もし有機化合物の混合物を作りたいならば、合成の各々の段階で異なった残基が導入される。例えば、混合物は異なったアミノ酸配列を持つペプチドまたは異なった塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、またはコア構造に結合された異なった基を持つ医薬活性を持つの可能性のある変異体の組を含むことができる；各々の場合において各々の構造変異体を独特のタグで標識することが望まれる。このことは異なった残基が問題とする化合物に加えられる各々の工程において合成物を分割し、対応する残基をタグに加えることにより達成される。例として、各々が独特のタグを持つ４０９６のヘキサヌクレオチドの混合物を作りたいと仮定する。二価連結基の四つの試料が各々の塩基および塩基に対して独特のレポーターと結合されるであろう（図３ａ）。四つの試料は次に混合され、四つに分割され、この過程を再度繰り返す。結果は各々独特のタグを持つジヌクレオチドの組である。この過程を６回の結合工程が完了するまで繰り返す。連結基およびレポーター基連結基は被検体合成と合致する一つの基を持たなければならない−ヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル基はすべてオリゴヌクレオチド合成の開始に適しており、例えばポリペプチド合成などの他の経路の開始には類似の基を見いだすことができる。ある種の化合物に対しては、被検体の一部を形成する”コア”化合物から出発するのが望ましいであろう。レポーターの付加を開始するための基の選択はレポーター基の性質およびそれらの結合に使用される化学に依存している。この化学は被検体の合成に使用される化学と合致されていなければならない。オリゴヌクレオチド合成の例では、多くの変法が存在する。確立された方法は塩基を保護するためにベンゾイルおよびイソプロピル基、カップリング間の５’ −ＯＨ基の一時的保護に酸に反応活性なトリチル基、およびリン酸を保護するのにβ −シアノエチル基を使用している。レポーターのカップリングのために使用される方法はこれらの保護基またはオリゴヌクレオチドのその他の結合を攻撃してはならず、タグの合成はオリゴヌクレオチドの伸長に使用されるカップリング、酸化および脱保護により影響されるべきではない。被検体はレポーター構造の組合わさった組へ結合されるので、レポーターモノマーのカップリングまたは鎖のキャッピングは各々の工程で不完全であろう（図２、ＢおよびＣ）。このことはタグの組成からの被検体の構造の演鐸をより簡単にするであろう（図１；図３）。合成をより容易にするため、連結基は被検体またはレポーター基の分解を起こさずに切断できる結合により固形支持体へ結合されているのが望ましい。もしくは、連結基は試薬からの中間体および最終生成物の分離を可能にするような荷電基または親油性基のような基を持っているであろう。レポーター基は多くの形をとることができるが、質量分析法によりタグの組成または配列が読み取れるという要求を主として考慮する。可能性としては、異なった長さまたは異なった同位元素組成の脂肪族鎖のような異なった原子または式量の基が挙げられる。同位元素で標識したメチレン基を用いて、独特の式量の基を四つの異なったレポーターの各々に帰属させることが可能である（表１）。オリゴヌクレオチドを例にすると、これらのタグはそのシリーズの部分生成物の質量の増加からオリゴヌクレオチド中の各々の位置の塩基を読み取ることを可能にするセットを作ることができる（表２）。レポーターを加えることによる最も少ない増加分が最も小さいレポーターと最も大きいレポーターの間の質量相違より大きいならば、すべてのオリゴヌクレオチド配列は一連の独特のタグ断片質量を与えるであろう。質量分析のためには、被検体からタグ鎖を切断する簡単な方法があることが望まれるであろう。いくつかの可能性が存在する。オリゴヌクレオチドおよびペプチド被検体に合致する方法には：光反応活性連結の光誘導切断；酵素切断、例えばエステル連結；フリーラジカル誘導切断がある。さらに要求されることは、タグは分析に使用される化学的および生化学的過程に合致可能でなければならないことであり：分子ハイブリッド形成に使用されるオリゴヌクレオチドの例または提案された配列決定法の一つについては、それらは溶解可能でなければならず、および分析で使用されるであろうある種の酵素反応を阻害してはならない。表１に示されたメチレン類似体と同様なオリゴエチレングリコール結合がオリゴヌクレオチドの分子再会合に合致することが経験から示された。さらに、そのような結合は、ヘキサエチレングリコール連結基を通してガラスにつながれたオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰ処理により５’−ホスホモノエステルへ変換できることを示したように、少なくともいくつかの酵素反応と合致している。連結基の望まれる性質考えられる応用のために、連結基分子は以下の性質を持っていることが望まれる：中間体の煩わしい精製を必要とせずに、被検体および対応するタグを産生する合成サイクルを進行させることを可能にするため、連結基は固形支持体に連結可能でなければならない。合成サイクルに続いて、連結基は被検体およびタグが無傷のまま残される条件下で固形支持体から除去可能でなければならない。タグ合成のための官能基は、質量分析によりお互いに区別可能であるタグの容易な合成を可能にするようなものでなければならない。連結基は、被検体およびタグの別々の伸長を、その一つのための化学が他方の化学を妨害しない条件下で可能にするような保護された官能基を持っていなければならない。連結基は好適には質量分析をマトリックス非存在下で実施できるように荷電された基を持っていなければならない。さらにこの目的のために、タグは電気噴霧のような複雑な技術によらずに質量分析器内で十分に蒸発するように揮発性である化合物を含むことが望まれる。タグは安定なイオンかまたは対応する被検体の同定に使用できる特徴的なパターンに断片化するイオンを生じるべきである。タグをレーザー照射により質量分析器内で直接切断できるように、タグと被検体の間の結合は好適には光で切断可能でなければならず、ライゲーションなどのような生化学的工程を可能にするように完全に除去するための更なる切断はランプに暴露することにより都合良く実施できる。連結された生成物は好適には、生化学的反応に使用できるように水性溶媒に可溶でなければならない。ここに記載された実施例はこれらの望まれる性質を持つ連結基を示している。光切断可能基光切断可能基は既知の光反応活性ｏ−ニトロベンジル基に基づいてきた。この基はオリゴヌクレオチド合成においてリン酸基および２’ヒドロキシ基の両方の保護基として使用されてきた［ＰｉｌｌａｉＳｙｎｔｈｅｓｉｓ１（１９８０）の総説を参照されたい］。それ自身ではｏ−ニトロベンジル基は、タグおよび被検体間の連結基の続いての結合のための更なる官能化が欠けている。商業的に入手可能なものは化合物５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコールである。光反応活性性を有意に減少させることなく５、４位にＯＭｅ基を付加させることができることが知られている（Ｐｉｌｌａｉ総説参照）。従って、５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコールがベンジルアルコールからのＤＮＡ合成の伸長を目的とする出発点として、および５−ヒドロキシ基でのエーテルカップリングからタグへの連結基鎖として使用された。存在すべき官能基に必要とされることは被検体とタグの組合わさった合成を可能にすることである。従って、光切断可能な基からタグ合成のために必要とされる官能基への連結基の腕が必要とされる。組み合わせ合成が固形支持体上で実施されることもまた一層高く評価される。このように、連結基の腕は官能基が二価でなければならず、選択的な合成的変換を可能にするため直交する保護基を持っている。好適なタグ試薬はグリコール結合／エーテル結合を含んでいる。合成のため、オリゴヌクレオチドは通常３’ヒドロキシおよびコハク酸エステル結合を通して長鎖アミノＣＰＧ支持体に結合されている。このように、必要とされる官能基はアルコールであるべきと思われた。下記の中間体化合物が合成された。この中間体は： −被検体合成のためのメトキシトリチル基（−ＣＨ₂ＯＤＭＴ）； −光切断のためのｏ−ニトロ基； −タグ合成のためのｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル基（ＯＴＢＤＰＳ）； −質量分析法による分析のために正に荷電した基への転換のための三級アミン基； −および支持体への結合のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を持つ芳香族連結基を含んでいる。被検体がペプチドである場合、条件の少しの変更しか考えなくて良い。２−ニトロベンジル基はペプチド合成のほとんどの条件下で安定であり、それおよび関連する類似体はペプチド合成においてすでに光反応活性基として使用されている（Ｐｉｌｌａｉの総説およびそこに含まれている文献を参照されたい）。異なった切断様式によるペプチド合成に適したいくつかの樹脂が存在する。被検体およびタグ合成のための直交保護基はｔ−ブトキシカルボニルおよび２−メトキシエトキシメチルに基づいているであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基はトリフルオロ酢酸処理により影響される切断からアミノ酸のアミノ基を保護するために使用される。２−メトキシエトキシメチルはタグ形成基および上記のような１の質量相違のｎアルキルジオール誘導体に基づいたタグの保護に使用されるであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基の切断は２−メトキシエトキシメチル保護基と合致することが示されている。２−メトキシエトキシメチル保護基はジクロロメタン中、臭化亜鉛により選択的に切断できる。本方法を上に例示してきたが、当業者は直交保護基のこの組は代表的な例として出されたものであり、それによって制限されるわけではないことを認識するであろう。レポーターの検出および分析光切断は被検体からのタグの放出に好ましい方法である；迅速であり、乾燥状態で実施でき、および非常に小さい規模での画像化に走査型レーザーが使用でき、すなわち細胞内の様相を画像化するのに十分に小さいので（ｄｅＶｒｉｅｓら、１９９２）、提案された方法は細胞の表面または内部または組織切片中の異なった細胞の”染色”に使用された特異的被検体（例えば候補薬剤などのようなリガンドとそれらの受容体間の相互作用の画像化に必要とされるであろうもの）の位置を検出するのに使用できる。光感受性保護基は非常に広い範囲の化学残基に利用可能であろう（Ｐｉｌｌａｉの総説、１９８０）。広い範囲の化合物に対して保護基として使用できる光反応活性ｏ−ニトロベンジル基は考えられる多くの被検体（中でもペプチドおよびオリゴヌクレオチド）のための連結基の理想的出発物質である。オリゴヌクレオチドを例にとると、定量的に分解できてヒドロキシ基を与える光感受性連結基が提供される。これは以下の配列決定法に記載されるように脱保護オリゴヌクレオチドのライゲーション伸長を起こすことを可能にするであろう。さらに、この基はオリゴヌクレオチド合成の間は安定であることが知られている。タグ合成を開始するために使用できる基を与えるためにベンジル環を修飾する必要があろう；上記のオリゴエチレングリコール系列のようなレポーターはｏ−ニトロベンゾイル基の光化学切断反応を妨害しない（Ｐｉｌｌａｉ前掲文献中に）。切断を促進する他の基を芳香環に加えることができる；そのような基は質量分析計での分析を簡単にするための荷電基の付加に利用できるであろう。現在の質量分析計は１００分の１ダルトンより高い分離能で、全質量２００ｋＤまでを数百分子で測定できる。好適な光反応活性連結基は以下のように表現できるであろう；正に荷電した基Ｒは芳香環に直接結合されているか、または連結基の腕の一つに存在してもよい。計測提案された分子タグは質量分析法のいくつかの型の一つで分析されるであろう。被検体からタグを切断するのが望ましいであろうが、多くの目的にはタグを断片化する必要はないであろうし、そのことは曖昧さのもとになるので実際には望まれないであろう。質量分析計の最近の進歩は多くの断片化をしなくても非常に大きな分子の測定が可能であり；および残りのタグが安定な条件下で容易に切断できるように連結基を設計することが可能であるので、測定の間のタグ断片化は避けられるべきである。ほとんどの場合、被検基はタグより揮発性が低いであろうし、および多くの応用では固形基質に結合されているであろうので質量分析法を妨害しない。上に例示した連結基はほとんど大多数の共有結合の切断を起こさない条件下、光子照射に対して非常に反応活性である。適した装置はすでに記載されている（ｄｅＶｒｉｅｓら、１９９２）。これは１μｍより小さな点に焦点を合わすことができるレーザーを使用している。２５０ｍｍまでの画像が台を０．１μｍ間隔で動かしてスキャンできる。この装置はまた脱離レーザーにより持ち上げられた化学種と相互作用させるように台の表面を横切ってイオン化レーザーを放つことにより測定されるべき標本のイオン化が可能である。このことは、もしタグ中に荷電残基を含ませることが不可能であったならば、またはタグの読みとりに断片化が望まれるならば本方法に有用でありうる。別の態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を提供し、その方法は以下の工程を含んでいる：ａ）支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドを提供し、ｂ）標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ｃ）ライブラリーの第一の試薬のオリゴヌクレオチド鎖が固定化オリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハイブリダイズするようにｂ）からのハイブリッドと、定義したように試薬が溶液中に一緒に混合されているライブラリーをインキュベートし、ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、このようにライゲーションされた第一の試薬を形成させ、ｅ）他の非結合試薬を除去し、およびｆ）標的核酸の最初の部分の配列を示すものとして、ライゲーションされた第一の試薬のタグ部分を回収し分析する。応用例核酸分析においてコードされたオリゴヌクレオチドが使用できる方法を参照することにより応用の可能性を例示する。１．累進的ライゲーションによる核酸配列の決定。（図４）決定されるべき配列は最初に工程ｂ）で固形支持体に結合されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。もし配列決定されるべきＤＮＡがバクテリオファージＭ１３のような一本鎖ベクターにクローン化されていたら、固形支持体上の”プライマー”オリゴヌクレオチドはベクター配列の一部であるように選ぶことができる。工程ｃ）において、工程ｂ）からのハイブリッドを運ぶ固形支持体をコードされたオリゴヌクレオチド試薬の溶液とインキュベートする（例えば、与えられた長さのすべての配列、４０９６のヘキサヌクレオチド（一般には４ⁿ のｎ−ｍｅｒ）の前記のライブラリーと）。工程ｄ）において、標的ＤＮＡの最初の六つの塩基と相補的なヘキサヌクレオチドが固定化プライマーオリゴヌクレオチドに連結されるようにリガーゼが導入される。この工程によりライブラリーからの第１のコードされたオリゴヌクレオチド試薬が、そのオリゴヌクレオチド鎖の固定化プライマーオリゴヌクレオチドへのライゲーションにより連結され、ここではライゲーションされた第一の試薬と称される。工程ｅ）において、例えば洗浄によりライゲーションされていない試薬が除去される。工程ｆ）において、結合ライゲーシされた第一の試薬の連結基がタグ鎖を離すために破壊され、タグ鎖は回収されて標的ＤＮＡの第１の部分の配列の指標として分析される。好適には、連結基の除去はまた第１のオリゴヌクレオチド鎖の末端のヒドロキシまたはリン酸基を露出させ、第二の試薬のオリゴヌクレオチド鎖との結合に利用可能にする。光化学的および酵素的および化学的加水分解を含む連結基分解のためのいくつかの方法はさらなる結合のために必要とされる３’−ヒドロキシルまたは５’−リン酸基の発生に使用できる。次に工程ｃ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）を繰り返す。これらの工程にはライブラリーからの第二の試薬のハイブリッド形成、ライゲーション、ライゲーションされた第二の試薬のタグの回収および分析、およびさらなるライゲーションのために必要とされる別の３’−ヒドロキシルまたは５’−リン酸基の発生を含んでいる。この過程は全ＤＮＡ配列が読み取られるまで、または反応の収率が非常に低くなって有効でなくなるまで繰り返すことができる。この系列の四つの段階は図式的に図４に示されている。最初の図は一回目の工程ｅ）の最後の状態に対応している。第二の図は工程ｆ）の最後の状態に対応している。第三の図は二回目の工程ｅ）の最後の状態に対応している。第四の図は二回目の工程ｄ）の最後の状態に対応している。本技術の循環的性質が示されている。２．連続的ライゲーションによる多数の鋳型の核酸配列決定第一の例を拡大して、多くの配列が同時に分析できるであろうことが考えられる。例えば、配列決定されるべきＤＮＡの個々のクローンが固定化できるであろう：ａ）各々の末端に固定化された同一のベクターオリゴヌクレオチドを持つ針のアレイが使用できる。標的ＤＮＡの個々のクローンを各々の個々の針に固定化されたオリゴヌクレオチドへハイブリダイズさせる。次にこれらのハイブリッドを運ぶ針のアレイはコードされたオリゴヌクレオチド試薬のライブラリー溶液（ライゲーションのための成分も含んでいる）とインキュベートする。この工程の結果、各々の針は異なったライゲーションされた試薬を運んでいる。最後に、前記のように各々のライゲーションされた試薬のタグ鎖を回収し分析する。もしアレイの針が適切に配置されていたら、それらはマイクロタイタープレートのウェル内へ浸してもよく、第一のプレートは配列決定されるべき鋳型を含んでおり、第二のプレートは試薬のライブラリーおよびライゲーション溶液、および第三のプレートは針からタグ鎖を切断するための試薬を含んでいる。ｂ）もしくは、表面がプライマーオリゴヌクレオチドで被覆されていてもよく、好適にはその５’末端またはさもなくばいくつかの他の場所を通して共有結合で結合されている。配列決定されるべきＤＮＡの個々のクローンを被覆された支持体上の離れた位置へスポットし、標的ＤＮＡの各々の個々のクローンが支持体上の個々の離れた位置で固定化されたオリゴヌクレオチドへハイブリダイズするようにする。支持体は次に試薬のライブラリーおよびライゲーションのための成分を含んだ溶液とインキュベートする。非結合試薬を除去する。続いて各々離れた位置のライゲーションされた試薬の連結基を切断し、タグを回収し分析する。切断は表面の小さな領域に向けることができるレーザー脱離のような方法により好適に達成される。この方法の利点は非常に多数のＤＮＡ配列が一緒に分析できることである。３．オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成による配列決定のための伸長法ａ）型Ｉ膜上に高濃度でＤＮＡをスポッティングする方法はよく確立されている（Ｈｏｈｅｉｓｅｌら、１９９２；Ｒｏｓｓら、１９９２）。フィンガープリンティングおよび配列決定のためには、ハイブリッド形成パターンが解釈するには複雑すぎないようにオリゴヌクレオチドは単一でまたは小さな組で適用されなければならない；その結果、分析の各々の回では鋳型の少しの比率しか信号を与えない。各々のハイブリッド形成からの信号が配列の決定を可能にするコード情報を含んでいたら、より複雑な混合物が使用できハイブリッド形成の各々の回でより多い情報が集められる。混合物の複雑さはＤＮＡ鋳型の長さおよび混合されたオリゴヌクレオチド中の配列を分割する分析法の能力に依存しているであろう。これらの質量分析法タグまたはレポーター基でコード化された核酸プローブは多プローブの使用が便利である場合（例えば、ＤＮＡフィンガープリンティングまたは突然変異分析）に非常に有用であろう。質量分析法タグは多重送信の利点を提供する。各々が自身の独特で適切な質量分析法タグで標識された多数の異なったプローブは典型的な核酸ハイブリッド形成アッセイに一緒に使用できる。ハイブリダイズする各々の個々のプローブの配列は、質量分析におけるタグの分離および分割のため他のものの存在下で特異的に決定できる。この態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる；ｉ）支持体上に固定化された標的核酸を用意する。好適には、標的核酸の個々のクローンは支持体上離れた位置に固定化されている。ｉｉ）異なった試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上の標的核酸にハイブリダイズするようにｉ）からの固定化された標的核酸と上記の多数のコードされたオリゴヌクレオチド試薬をインキュベートし、ｉｉｉ）ハイブリダイズしていない試薬を除去し、およびｉｖ）標的核酸の一部の配列の指標として各々の試薬のタグ部分を回収して分析する。好適にはその後、試薬のライブラリーをハイブリッド形成に使用し、ライゲーション、切断および分析工程を循環的に繰り返し、標的核酸の配列についての追加の情報が提供される。ｂ）型II オリゴヌクレオチドのアレイへハイブリダイズした場合、形成されたデュープレックスのパターンから核酸配列を決定することが可能である。決定できる配列の長さは大体アレイの大きさの平方根であり；もし全部で６５，５３６のオクタヌクレオチドのアレイが使用されたならば、決定されるべき配列は約２００ｂｐであろう（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９９２）。大きさの制限は、決定されるべき配列において８塩基の並びが２度以上生じてはならない束縛により課せられている。アレイおよび配列決定におけるその使用は国際特許出願ＷＯ８９／１０９７７に記載されており；固定化された（例えば、表面上にそれらの５’−末端またはそれらの３’−末端により）オリゴヌクレオチドのアレイを提供する方法は国際特許出願ＷＯ９０／０３３８２に記載されている。本発明の方法によると決定できる配列長を非常に長くすることができる。本発明のこの態様において、本方法は以下の工程を含んでいる：ａ）支持体上の間隔をとった位置に固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイを提供し、一つの位置のオリゴヌクレオチドは別の位置のオリゴヌクレオチドと異なっている。好適には支持体上の各々間隔をとった位置に共有結合で固定されているオリゴヌクレオチドの配列が知られている、ｂ）支持体上の一つまたはそれ以上の間隔をとった位置でハイブリッドを形成するように標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドのアレイをインキュベートし、ｃ）ライブラリーの試薬のオリゴヌクレオチド鎖が各々の固定化されたオリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハイブリダイズするようにｂ）からのハイブリッドとコードされたオリゴヌクレオチド試薬のライブラリーをインキュベートし、ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、このことにより支持体上の一つまたはそれ以上の間隔をとった位置でライゲーションされた試薬を形成し、ｅ）他のライゲーションしていない試薬を除去し、およびｆ）標的核酸の一部の配列の指標として各々のライゲーションされた試薬のタグ部分を回収して分析する。好適には、各々間隔をとった位置のタグ鎖の切断はレーザーにより光化学的に達成される。好適には、タグ鎖の分析は質量分析法による。好適には上記のように、標的核酸の配列についての追加の情報を得るためにハイブリッド形成、ライゲーション、切断および分析工程が循環的に繰り返される。好適な操作の順番は図５を構築する四つの図に示されている。最初の図は工程ｂ）の出発時の状態を示している。第二の図は工程ｂ）の最後の状態を示しており、標的核酸の一部がアレイの一部を形成している繋がれたオリゴヌクレオチドへハイブリダイズしている。第三の図は工程ｃ）の最後の状態を示しており、第四の図は工程ｄ）の最後の状態を示しており；ライブラリーからの試薬が標的核酸にハイブリダイズされ、固定化オリゴヌクレオチドにライゲーションされた。既知の方法のこの伸長の結果は劇的である。タグを読み取るのに用いられる方法が混合物を分離することができれば、アレイ中のオリゴヌクレオチドの長さに等しい長さ分の一回の伸長は、読みとることができる全部の長さと一致している。この場合、八つの塩基により伸長されたオクタヌクレオチドの配列から読みとることができる長さは約６０，０００塩基である。タグを付けたオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド分析と下記の方法の比較：ａ）ゲルに基づく方法自動化配列分析について最も進歩した装置は一日当たり約４００００塩基を読みとることができる。これはゲルに加えられる反応液を提供するのに必要な生物学的および生化学的過程のための時間は含まれていない。もし鋳型を表面にミリメートル平方当たり１の密度で適用できると仮定すると（Ｈｏｈｅｉｓｅｌら、１９９２；Ｒｏｓｓら、１９９２）、１００ｘ１００ｍｍの領域に１００００を適用できるであろう。ハイブリッド形成後、各々のセルのタグを付けたオリゴヌクレオチドは数ｆモルであろうので、レーザーの一回の２ナノ秒パルスは読みとりに十分なタグを放出するであろうが、たとえ１００のパルスが必要とされると仮定しても、読みとられるべきセルに対しての総時間は数ミリ秒であり、したがって１００００のセルすべてを数分間で読み取ることができる。もしオリゴヌクレオチドがヘキサマーであったとしても、得られた生のデータは６００００塩基であろう。配列決定に対して、このことはゲルからの等しい生データほど情報が豊かではないであろう、なぜなら、より長い連続的な長さがゲルから読みとられるからである。ゲルにおけるこの利点は、もちろん、もしアレイから読まれた配列がそれ以上の回数の分析により伸長できるならば失われるであろう。しかし、アレイに基づいた方法の基本的利点は、数千の鋳型を一緒に分析することを可能にする平行法であり；ゲル上で分析できる数はゲルの巾により制限され、１５未満である。ｂ）現在のアレイに基づく方法現存のアレイに基づく方法の主たる欠点は：ａ）大きさＮのアレイから読むことができる配列は≒√Ｎのみであり、アレイのほとんどのセルは空である。タグを付けたオリゴヌクレオチドを加えることにより、アレイの占拠率はほとんど完全に近くなり、そのためほとんどのセルから情報が得られるであろう。この理由はタグからの付加的な情報が、標的配列中に短い列が多く存在することによる曖昧さを除く助けとなるからである（表３）。ｂ）ハブリッド形成によるオリゴヌクレオチドとの各々の相互作用から読み取れる配列の長さは必然的にオリゴヌクレオチドの長さに制限される。このことは単一塩基の並びのような繰り返し配列の読みとりに問題を起こしている。ライゲーションによる読みとりの拡大は繰り返しされたライゲーションにより通過できるかぎり読みとりを可能にするであろう。ｃ）現在の検出法のうち、放射能は高い感度を持っているが分解能が悪く、蛍光は低い感度と高い分解能を持っている；両方とも比較的遅い。質量分析法を使用する案は分解能、速度および感度を改良でき、ならびにタグの配列を読みとる可能性を加えた。薬理活性の可能性を持つ被検体多くの薬剤は組織特異的である。それらの作用はしばしば細胞表面レセプターとの相互作用に依存している。コア構造に基づいた薬剤の一群がある；例えば、短いペプチドを含むいくつかのもの。候補薬剤を追跡してどの細胞または組織を標的としているのかを観察できることは有用である。多くの異なった候補を同時に追跡できることは有用であろう。コードされた質量タグでタグを付けた被検体のライブラリーを用いると、質量分析計中で細胞または組織を試験することにより相互作用を追跡することが可能であろう。もしタグに光反応活性保護基が結合されているとしたら、質量分析計と組み合わされた走査レーザー切断を用いて動物全体または組織切片を画像化できるであろう。以下の実施例は本発明をさらに例示している。実施例１から６は、被検体合成のためのメチルオキシトリチル基（−ＣＨ₂ＯＤＭＴ）；光切断のためのｏ−ニトロ基；タグ合成のためのＯ−ｔ−ブチルジフェニルシリル基（ＯＴＢＤＰＳ）；質量分析法による分析のための正に荷電した基への変換のための三級アミノ基；および支持体への結合のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有する芳香族連結基を含む化合物（８）の合成における反応スキーム１に従った工程を示している。実施例７および８は反応スキーム２に従った続いての工程を示している。実施例９および１０は反応スキーム３に従った、プロパン−１，３−ジオールに基づいたレポーター基（１３）を合成する工程を示している。実施例１１から１３は反応スキーム４に従った、レポーター基としての保護プロパン−１，３−ジオール残基の化合物（６）への結合に関与する工程を示している。実施例１４から１９は本発明に従った種々の試薬の調製、特徴づけおよび使用を記載している。一般的項目５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコールは、Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入し、長鎖アルキルアミノ制御孔ガラスはＳｉｇｍａより購入した。無水溶媒は、窒素雰囲気下で包装したＡｌｄｒｉｃｈＳｕｒｅＳｅａｌ等級のものである。トリエチルアミンは水素化カルシウムから前蒸留し、使用まで窒素雰囲気下に保存した。他の溶媒および試薬は、市販の範囲のものから入手可能である。 ¹Ｈ−ＮＭＲは、Ｊｅｏｌ２７０ＭＨｚ機器で、指示された溶媒を用い、テトラメチルシランを参照として得た。赤外吸収は、Ｎｉｃｏｌｅｔ５ＤＸＣＦ．Ｔ．ＩＲ機器で、指示されるように、臭化カリウムディスクまたはクロロホルム溶液として得た。融点は、Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ融点装置を用いて求め、修正しなかった。ＴＬＣは、指示された溶媒系を用いて、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ₂₅₄アルミニウム裏張ＴＬＣプレートで行った。プレートは、紫外線および／またはモリブドリン酸の３％ｗ／ｖエタノール性溶液に浸漬し次にホットエアガンで加熱することの両方により可視化した。トリチル含有種は明るいオレンジ色のスポットとして、アルコールは青いスポットとして現れる。シリカゲルクロマトグラフィーは、粒子サイズ４０→６３μｍのフラッシュ等級シリカゲルを用いて実施した。反応スキームおよび本文中においては、次の略号を使用する。ＤＭＴ４，４’−ジメトキシトリチルＴＨＦテトラヒドロフランＴＢＤＰＳｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシランＤＭＡＤ４−ジメチルアミノピリジンＤＣＣＩジクロロヘキシルジカルボジイミドＣＨ₂Ｃｌ₂ ジクロロメタンＣＰＧ制御孔ガラスＭｅｌヨードメタンＴｒｅｓｙｌ２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル実施例１５−ヒドロキシ−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−ニトロベンジルアルコール（化合物２、スキーム１）の合成無水ピリジン（４０ｍｌ）に溶解した５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコール（５．１１ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）に、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（１０．２５ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）を加え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合計７２時間撹拌した。ＴＬＣ分析（エーテル／石油エーテル４０−６０℃，６５％／３５％）は、Ｒ_F＝０．２７の新たなトリチル陽性含有物質の存在および出発アルコールの消失を示した。次に、回転蒸発によりピリジンを除去し、最後の痕跡量はトルエンとの共蒸発（×２）により除去した。得られたガムを酢酸エチルに溶解し、溶液を水（×１）およびブライン（×１）で洗浄した。次に、酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて、赤茶色ガムを得た。ガムをＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）に溶解し、次にシリカゲルカラム（１４ｃｍ×６．５ｃｍ）にかけ、エーテル／石油エーテル４０−６０℃ ，６５％／３５％で溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、灰白色固体を得た（１３．４９ｇ，９５％，ｍｐ．８０−８２℃（分解））。分析用試料は、クロロホルム／石油エーテル４０−６０℃から再結晶することにより調製した。ｍｐ．１３４−７℃（分解）。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：３．７９（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ− ＯＣＨ ₃），４．６３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂−ＯＤＭＴ），６．７７−６．８５（ｍ，５Ｈ，アリール），７．２２−７．４９（ｍ，９Ｈ，アリール），７．６３（ｓ，１Ｈ，アリール），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０６Ｈｚ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：１６１０，１５０９，１４４７，１３３４，１２４８，１０９０，１０６０，１０３３，８２８ｃｍ^-1。実施例２Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［１−（３−ブロモ−１−オキシプロピル）］−２−ニトロベンジルアルコール（化合物３、スキーム１）の合成アセトン（１５０ｍｌ）に溶解した化合物２（１０．１８ｇ，２１．６ｍｍｏｌ）に、１，３−ジブロモプロパン（１１ｍｌ，１０８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４．４７ｇ，３２．３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、反応混合物を８０℃ で合計３時間加熱し、次に室温でさらに１６時間撹拌した。ＴＬＣ分析（エーテル／石油エーテル４０−６０℃，６０％／４０％）は、出発材料が完全に消失し、Ｒ_F＝０．４８（メジャー）およびＲ_F＝０．２３（マイナー）の２つの新たなトリチル含有物質の形成を示した。次に、回転蒸発によりアセトンを除去し、得られた残渣を水とジクロロメタンとの間に分配した。ジクロロメタン溶液を分離し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。ガムをジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、次にシリカゲルカラム（６．５ｃｍ×１４ｃｍ）にかけ、エーテル／石油エーテル４０−６０℃，６０％／４０％で溶出した。純粋生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、化合物３を白色固体として得た（８．１８ｇ，６４％，ｍｐ．１３２→４℃，Ｒ_F＝０．４８エーテル／石油エーテル４０ −６０℃，６０％／４０％。分析のために、少量の試料を酢酸エチル／石油エーテルから再結晶した。ｍｐ．１３２−４℃。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：２．４０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ ₂−ＣＨ₂−），３．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ，ＣＨ ₂Ｂｒ），３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ ₃），４．２７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０４Ｈｚ，− ＯＣＨ ₂ＣＨ₂），４．６６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．８４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，ＤＭＴアリール），７．２０−７．５０（ｍ，１０Ｈ，９ＤＭＴアリール、１アリール），７．６８（ｓ，１Ｈ，アリール），８．１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０６Ｈｚ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：１６０８，１５７７，１５１１，１２８９，１２５３，１２３０，１１７４，１０６５，１０３０ｃｍ^-1。実施例３Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２−オキシエチル）］−Ｎ −（２−ヒドロキシエチル）アミン（化合物５、スキーム１）の合成水素化ナトリウム（油中６０％分散液０．７６ｇ，１９ｍｍｏｌ）に、Ｎ₂雰囲気下で無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）を加え、次に、水素を発生させるような速度でＴＨＦ（３０ｍｌ）中のジエタノールアミンのスラリー（２ｇ，１９ｍｍｏｌ）を加えた。次に、反応混合物をＮ₂雰囲気下で室温で３０分間撹拌し、この間に灰色の析出物が形成した。ｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（４．９５ｍｌ，１９ｍｍｏｌ）を加えることにより生成したアルコキシドを急冷し、次に反応液をＮ₂雰囲気下で室温で撹拌した。ＴＬＣ分析（酢酸エチル）は、出発物質に対して２つの新たなＵＶ陽性スポットの生成を示した。Ｒ_F＝０．０５（メジャー）、Ｒ_F＝０．６０（マイナー）。回転蒸発によりＴＨＦを除去し、残渣を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解した。次に生成物を酢酸エチル（×２）で抽出した。次に酢酸エチル抽出物を合わせ、ブライン（×１）で洗浄した。次に酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。この油状物をシリカゲルカラムにかけ、クロロホルム／メタノール、９０％／１０％で溶出した。Ｒ_F＝０．３３の分画を合わせ、回転蒸発させて、化合物５を白色結晶質固体として得た（３．９３ｇ，６０％）。ｍｐ．７３→７５℃。分析のために、少量の試料を酢酸エチル／石油エーテル４０−６０℃から再結晶した。ｍｐ．７６→７７℃。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０６（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），２．１３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ，Ｄ₂Ｏ交換可能），２．７８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂ ＮＨＣＨ ₂−），３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２２Ｈｚ，−ＣＨ ₂ＯＳｉ− ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２２Ｈｚ，ＣＨ ₂ＯＨ），７．４０（ｍ，６Ｈ，アリール），７．６６（ｍ，４Ｈ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：３１００，１４３０，１１１４，１０８０，９６９，７４９，７３８，７０７ｃｍ^-1。実施例４Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２−オキシエチル］−Ｎ− ［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４ −ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン（化合物６、スキーム１）の合成１−メチル−２−ピロリジノン（６５ｍｌ）中に溶解した化合物３（７．４６ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）に、化合物５（８．６３ｇ，２５．２ｍｍｏｌ）を加えた。次に、反応混合物を８０℃で合計５時間加熱し、放置して冷却させ、室温でさらに１６時間撹拌した。ＴＬＣ分析（酢酸エチル）は、Ｒ_F＝０．５１の新たなトリチル含有種の形成および残余量の２つの出発物質を示した。反応混合物を水（６００ｍｌ）とブライン（１００ｍｌ）との混合物中に注ぎ、生成物を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出した。次に、酢酸エチル抽出物を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、回転蒸発により酢酸エチルを除去して、茶色ガムを得た。このガムから、結晶質生成物がゆっくり形成した。結晶質生成物（化合物５の臭化水素塩）を濾過しうるように、最少量の酢酸エチルを加えて残渣ガムを溶解した。次に、酢酸エチル溶液をシリカゲルカラム（１３ｃｍ×６．５ｃｍ）にかけ、酢酸エチルで溶出した。このカラムでは、残余の化合物３と所望の生成物との分離が不十分であったため、生成物分画を合わせ、蒸発させてガムを得た。このガムを必要最少量の酢酸エチルに溶解し、別のシリカゲルカラム（１４ｃｍ×６．５ｃｍ）にかけ、最初に酢酸エチル／石油エーテル４０−６０ ℃，５０％／５０％で、次に酢酸エチルで、勾配溶出を用いて溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、化合物６をガムとして得た。最後の痕跡量の溶媒は、ガムを高真空下に１時間置くことにより除去した。生成物の収量は７．６４ｇ，７１％であった。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０４（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９７（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂−），２．７（ｍ，６Ｈ，ＮＣＨ ₂），３．５６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＨ），３．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ ₃），４．１２（ｍ，２Ｈ，ＡｒＯＣＨ ₂ＣＨ₂ ），４．６４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．７４−６．８５（ｍ，５Ｈ，アリール），７．２−７．６５（ｍ，２０Ｈ，アリール），８．０５（ｄ，１Ｈ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：１６０８，１５７９，１５０９，１２８７，１２５１，１２３２，１１１２，１０９２，１０６４，１０３５，８２６，７５４，７０３，６１３ｃｍ^-1。実施例５Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２−オキシエチル］−Ｎ− ［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４ −ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［Ｏ−（３−カルボキシラートプロピオニル）−２−オキシエチル］アミン（化合物７、スキーム１）の合成無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）および無水ピリジン（５０ｍｌ）に溶解した化合物６（５．６４ｇ，６．５９ｍｍｏｌ）に、コハク酸無水物（２．０６ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（２１０ｍｇ，１．７２ｍｍｏｌ）を加え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合計７２時間撹拌した。ＴＬＣ分析（メタノール／酢酸エチル、１０％／９０％）は、Ｒ_F＝０．４５の新たなトリチル含有種の形成および出発物質の消失を示した。回転蒸発により溶媒を除去し、トルエンとの共蒸発（×２）により最後の痕跡量のピリジンを除去した。次に、得られたガムをクロロホルムと水との間に分配した。有機相を分離し、水相をさらにクロロホルム（×１）で抽出した。次に、有機相を合わせ、ブライン（×１）で洗浄した。次に、クロロホルム溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。次に、ガムを高真空下に１時間置くことにより最後の痕跡量の溶媒を除去し、化合物７を得た。６．７５ｇ。この生成物を、さらに精製することなく次の段階で用いた。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．５（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ ₂ＣＨ ₂ＣＯＯＨ），２．７（ｍ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ ₂），３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），３．７５（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ ₃），４．１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂ＯＣＯおよびＡｒ−ＯＣＨ ₂ＣＨ₂），５．６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．７（ｄ，１Ｈ，アリール），６．８（ｄ，４Ｈ，アリール），７．２→７．７（ｍ，２０Ｈ，アリール），８．０２（ｄ，１Ｈ，アリール）。ＩＲ（ＣＨＣｌ₃溶液）：１７３６，１６０８，１５７９，１５０９，１２８８，１２５１，１２３２，１１７５，１１５８，１１１２，１０９３，１０６５，１０３５，７５５，７０３ｃｍ^-1。実施例６Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２−オキシエチル］−Ｎ− ［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４ −ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［（Ｏ−（スクシニル（３− カルボキシラートプロピオニル）））−２−オキシエチル］アミン（化合物８、スキーム１）の合成無水ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解した化合物７（２．９９ｇ，３．１３ｍｍｏｌ）に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７１０ｇ，３．４５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３９６ｇ，３．４４ｍｍｏｌ）を加え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で１８時間撹拌し、この間に白色析出物が形成した。白色析出物を濾別し、ジクロロメタン溶液を水（ ×１）およびブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発させて、泡状物３．２６ｇ（９９％）を得た。ＴＬＣ分析（酢酸エチル）は、Ｒ_F＝０．７４の唯一のトリチル含有種を示し、有意の混入物はなかった。少量の物質をシリカゲルカラムに通すことにより、分析用試料を得ようと試みたが、活性エステルが分解して酸に戻った（化合物７）。したがって、この物質をさらに精製することなく、以下のすべての実験において用いた。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０４（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．５０→２．７５（ｍ，６Ｈ，スクシニルＣＨ₂＋−ＯＣＣＨ ₂），２．７６−２．８６（ｍ，６Ｈ，ＮＣＨ ₂），３．０８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＣＯ₂スクシニル），３．７７（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴＯＣＨ ₃），３．８６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），４．１→４．２（ｍ，４Ｈ，ＡｒＯＣＨ ₂＋ＣＨ ₂Ｏ₂Ｃ），４．６３（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．７→６．９（ｍ，５Ｈ，アリール），７．０１→７．７（ｍ，２０Ｈ，アリール），８．０５（ｄ，１Ｈ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：１７４２，１７１３，１５０９，１２８８，１２５１，１２１１，１１７５，１０９０，１０６７ｃｍ^-1。実施例７誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、スキーム２）長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．３．５ｇ）を、ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解したトリクロロ酢酸（１．５ｇ）で２．５時間前処理し、ジクロロメタン（総量１００ｍｌ）および無水エーテル（総量１００ｍｌ）のアリコートで洗浄し、真空下に乾燥した。次に、ＣＰＧ支持体に、無水ピリジン（３５ｍｌ）、ジメチルアミノピリジン（４２ｍｇ，３４４μｍｏｌ）、トリエチルアミン（２８０μｌ，２０１ｍｍｏｌ）および化合物８（スキーム１を参照のこと）（７３６ｍｇ，７００μｍｏｌ）を加えた。次に、混合物を合計１８時間穏やかに撹拌し、その後、ビーズをピリジン（７×１０ｍｌ）、メタノール（５×１５ｍｌ）およびクロロホルム（５×１５ｍｌ）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。実施例８ＣＰＧ支持体に結合した第３アミノ基のメチル化（化合物１０、スキーム２）誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、スキーム２）（１．０１ｇ）に、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）およびヨードメタン（０．５ｍｌ，８ｍｍｏｌ）を加えた。次に、混合物を合計１８時間穏やかに撹拌し、その後、ビーズを無水ＴＨＦ（５×１０ｍｌ）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。実施例９モノ保護１，３−プロパンジオール誘導体の合成（化合物１２ａおよび１２ｂ、スキーム３）−一般的方法Ｎ₂雰囲気下で、水素化ナトリウム（油中６０％分散物１．０５ｇ，２６．３ｍｍｏｌ）に、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）を加え、続いて無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した１，３−プロパンジオール誘導体（２６．３ｍｍｏｌ）を滴加した。さらにＮ₂雰囲気下で３０分間撹拌して、灰色析出物の形成により示されるアルコキシド形成を確実にした。無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解したｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（７．２４ｇ，２６．３ｍｍｏｌ）を滴加することにより生成したアルコキシドを急冷し、反応混合物をＮ₂雰囲気下でさらに４０分間撹拌した。次に、回転蒸発によりＴＨＦを除去し、残渣をジクロロメタンと０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液との間に分配した。ジクロロメタン溶液を分離し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。この油状物をシリカゲルカラム（１６ｃｍ ×５ｃｍ）にかけ、エーテル／石油エーテル４０−６０℃、３０％／７０％混合物で溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発させて、所望の１，３−プロパンジオール誘導体を得た。化合物の個別の詳細は以下のとおりである。１２ａ１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−１，３−プロパンジオール，白色結晶質固体，Ｒ_F＝０．２１エーテル／石油エーテル４０−６０℃，３０％／７０％，７．６１ｇ，９２％，ｍｐ．４０→４２℃。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：３４００，１４４８，１１１２，８２２，７３４，７０２，６８９，５０６，４８８ｃｍ^-1 １Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０６（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．８０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．４５（ｔ，１Ｈ，ＯＨ），３．８４（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ ₂ＣＨ₂ＣＨ ₂Ｏ−），７．４０（ｍ，６Ｈ，アリール），７．６８（ｍ，４Ｈ，アリール）。１２ｂ２−メチル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−１，３−プロパンジオール，無色油状物，Ｒ_F＝０．２１エーテル／石油エーテル４０− ６０℃，３０％／７０％，６．６０ｇ，７７％。ＩＲ（薄膜）：３４００，１４７２，１４２８，１０８７，１０４０，８２３，７４０，７０２ｃｍ^-1 ¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：０．８２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８７Ｈｚ，ＣＨ ₃），１．０６（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），２．０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ− ＣＨ₃），２．６８（ｔ，１Ｈ，ＯＨ），３．６４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂ＣＨ（ＣＨ₃ ）ＣＨ ₂），７．４０（ｍ，６Ｈ，アリール），７．６８（ｍ，４Ｈ，アリール）。対称１，ｎ−ジオールのモノシリル化の一般的方法については、Ｐ．Ｇ．ＭｃＤｏｕｇａｌｅｔａｌ．，ＪＯＣ，５１，３３８８（１９８６）を参照のこと。実施例１０トレスレート（ｔｒｅｓｌａｔｅ）誘導体（化合物１３ａおよび１３ｂ、スキーム３）の合成−一般的方法無水ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解したアルコール誘導体（４．９４ｍｍｏｌ）および乾燥トリエチルアミン（０．８４ｍｌ，６．０３ｍｍｏｌ）に、Ｎ₂ 雰囲気下で、−１５℃から−３０℃に冷却して、無水ジクロロメタン（５ｍｌ）中の塩化トレシル（１ｇ，５．４８ｍｍｏｌ）を、２０−４０分間かけて滴加した。Ｎ₂雰囲気下で−１５℃から−３０℃においてさらに３０分間撹拌して反応を完了させた。次に、反応混合物を分離フラスコに移し、氷冷１．０Ｍ塩酸（ ×１）、氷冷水（×１）および氷冷ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発させて、トレスレートを得た。このトレスレートは、必要となるまでＮ₂下で−２０℃で保存した。化合物の個別の詳細は以下のとおりである。１３ａ１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ−トレシル−１，３−プロパンジオール，白色結晶質固体，１．７４ｇ，７７％，ｍｐ．３４→３５℃。他の反応に加えるために、反応の後処理の前にこの反応混合物３ｍｌを除去した。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０６（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．４９Ｈｚ，ＣＨ ₂−Ｏ−Ｓｉ），３．８４（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，ＣＦ₃− ＣＨ ₂−Ｏ），４．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０５Ｈｚ，トレシルＯ−ＣＨ ₂），７．４２（ｍ，６Ｈ，アリール），７．６４（ｍ，４Ｈ，アリール）。ＩＲ（ＫＢｒディスク）：１３８６，１３２９，１２７４，１２５８，１１８５，１１６４，１１３７，１０９４，９４１，７６３，５０６ｃｍ^-1 １３ｂ２−メチル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−３−Ｏ−トレシル−１，３−プロパンジオール，無色油状物，２．５７ｇ，９９％。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：０．９７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８７Ｈｚ，ＣＨ₃），１．０６（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），２．１０（ｍ，１Ｈ，ＣＨＣＣＨ₃），３．６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），３．８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ，ＣＦ₃ＣＨ ₂），４．４０（ｔ，２Ｈ，トレシルＯ−ＣＨ ₂），７．４０（ｍ，６Ｈ，アリール），７．６４（ｍ，４Ｈ，アリール）。トレスレートの一般的詳細については、Ｒ．Ｋ．Ｃｒｏｓｓｌａｎｄｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ，９３，４２１７（１９７１）を参照のこと。実施例１１Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−２−ヒドロキシエチル］アミン（化合物１５、スキーム４）の合成無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した化合物１１（１．７２ｇ，１．９２ｍｍｏｌ）に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中１Ｍ溶液０．５５ｍ１，１．９２ｍｍｏｌ）を加えた。次に、反応混合物を室温で合計２時間撹拌した。次に、反応混合物を水（５０ｍｌ）で希釈し、回転蒸発によりＴＨＦを除去した。次に、水性溶液をクロロホルム（×１）で抽出した。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、カラムを酢酸エチルで溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発させて、化合物１２を無色ガムとして得た。これは放置するとゆっくり結晶化した。０．７３ｇ，５８％，ｍｐ．９５→９７℃，Ｒ_F＝０．２６酢酸エチル。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．７５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．０→２．１（ｍ，５Ｈ，Ｏ₂ＣＣＨ₃＋ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．７０→ ２．８１（ｍ，６Ｈ，ＣＨ ₂Ｎ），３．５８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），３．７９（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ ₃），４．１７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂Ｏ），４．４６（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．８３（ｄ，４Ｈ，ＤＭＴ−アリール），７．２→７．５（ｍ，１０Ｈ，アリール），７．６９（ｓ，１Ｈ，アリール），８．１０（ｄ，１Ｈ，アリール）ＩＲ（ＫＢｒディスク）：３４５９，１７３８，１６０８，１５７７，１５０６，１４４４，１３１３，１２８８，１２５０，１２３０，１１７５，１１５４，１０７０，１０３５，９８４ｃｍ^-1 実施例１２Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２−オキシエチル］−Ｎ− ［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４ −ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］アミン（化合物１４、スキーム４）の合成無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解した化合物６（１．７３ｇ，２．０２ｍｍｏｌ）に、無水酢酸（０．５ｍｌ，４．５４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（５５ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を加え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合計１６時間撹拌した。この後、ＴＬＣ分析（メタノール／酢酸エチル，５％／９５％）は、出発物質の完全な消失および新たなトリチル含有スポット，Ｒ_F＝０．８０の形成を示した。回転蒸発によりピリジンを除去し、最後の痕跡量はトルエン（×２）との共蒸発により除去した。得られたガムをクロロホルムと水との間に分配した。クロロホルム溶液を分離し、ブライン（× １）で洗浄した。次に、クロロホルム溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発させて、無色ガムを得た。１．９４ｇ。この物質は、さらに精製することなく次の段階で用いるのに十分純粋であった。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０４（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．０１（ｓ，３Ｈ，−Ｏ₂ＣＣＨ₃），２．７４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ ₂Ｎ），３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），３．８（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ ₃），４．１（ｍ，４，ＣＨ ₂Ｏ），４．６３（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．７８（ｄ，１Ｈ，アリール），６．８３（ｄ，４Ｈ，ＤＭＴアリール），７．２→７．８（ｍ，２ＯＨ，アリール），８．０５（ｄ，２Ｈ，アリール）。実施例１３Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−３−オキソ− ６−オキシヘキシル］アミン（化合物１６、スキーム４）の合成無水アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解した化合物１２（６６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）に、炭酸カリウム（５５ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）および化合物１３ａ（反応混合物１ｍｌ，約０．３０ｍｍｏｌ）を加え、次にフラスコに塩化カルシウム乾燥チューブで栓をした。次に、反応混合物を室温で合計２２時間撹拌し、その後、炭酸カリウムを濾別し、回転蒸発により溶媒を除去した。次に、得られた油状物をシリカゲルカラム（１４ｃｍ×１ｃｍ）にかけ、生成物をエーテル／石油エーテル４０−６０℃，７５％／２５％混合物で溶出した。純粋生成物分画を合わせ、蒸発させて透明ガムを得た。６ｍｇ，６％，Ｒ_F＝０．４７エーテル／石油エーテル４０−６０℃，８０％／２０％。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：１．０５（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨＣＨ₂ＯＳｉ），１．９（ｍ，５Ｈ，Ｏ₂ＣＣＨ₃ ＋ＡｒＯＣＨ ₂−），２．７６−２．９２（ｍ，６Ｈ，ＣＨ ₂Ｎ），３．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＯＣＨ ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＳｉ），３．７９（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ₃），３．８５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＯＳｉ），４．１２→４．２３（ｍ，４Ｈ，ＡｒＯＣＨ ₂ＣＨ₂＋ＮＣＨ₂ＣＨ ₂ＯＣＯＣＨ₃），４．６４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ＯＤＭＴ），６．８３（ｍ，５Ｈ，１アリール＋ＤＭＴ−アリール），７．２３→７．５０（ｍ，１６Ｈ，アリール），７．６８（ｍ，４Ｈ，アリール），８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０６Ｈｚ，アリール）。上述と類似の反応条件により、トレスレート１３ｂを用いて以下の化合物も合成した。Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−５−メチル− ３−オキソ−６−オキシヘキシル］アミン。この化合物は、透明ガムである。Ｒ_F ＝０．５３エーテル／石油エーテル４０−６０℃，８０％／２０％。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δ）：０．８８（ｄ，３Ｈ，ＣＨ−ＣＨ ₃ ），１．００（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ），１．９→２．１（ｍ，６Ｈ，Ｏ₂ＣＣＨ₃ ＋ＣＨ−ＣＨ₃＋ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂），２．７→３．０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ ₂Ｎ），３．４→３．７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂Ｏ−），３．７９（ｓ，６Ｈ，ＤＭＴ−ＯＣＨ₃），４．０→４．４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ ₂Ｏ−），４．６４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＣＨ ₂ ＯＤＭＴ），６．８３（ｍ，５Ｈ，アリール），７．２→７．７（ｍ，２０Ｈ，アリール），８．０１（ｄ，１Ｈ，アリール）。実施例１４固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成連結基９および１０（スキーム２の化合物９および１０）を有する制御孔ガラスを自動オリゴヌクレオチド合成器（ＡＢＩ３８１Ａ）において用いられるカラム中に装填した。用いた量は０．２または１μｍｏｌスケールの合成用の量である。カラムを自動合成器中に挿入し、次にこれを適当なサイクル用にプログラムした。２つの異なるタイプのヌクレオチド前駆体を用いた：５’ヒドロキシル上にジメトキシトリチル保護基を有する通常のホスホルアミダイト；５’ホスホルアミダイトおよび３’ヒドロキシル上にジメトキシトリチル保護基を有する「逆シントン」。これらの支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの一覧は表４に示される。ここでＲ９およびＲ１０はそれぞれ化合物９および１０に由来するものである。収量は、それぞれのカップリングにおいて放出されたジメトキシトリチル基の量から監視した。これらの収量は、通常のオリゴヌクレオチド合成について用いられるＣＰＧ支持体上で得られるものに対応した。実施例１５被検体を無傷のまま残す条件下におけるタグの合成支持体９上で５’Ｒ９Ｔ₅を合成した後、固体支持体を分割し、一部をＴＨＦ中の５ｍＭフッ化テトラブチルアンモニウムで室温で１０分間処理して、ｔ−ブチルジフェニルシリル保護基を除去した。両方の試料を２９％アンモニアで室温で一夜処理して、固体支持体から生成物を除去した。真空下にアンモニアを除去し、固体残渣を水に溶解した。ＨＰＬＣは、上首尾にシリル保護基が除去されＤＭＴ基が残っていたことを示した。この実施例は、他方をその場に残す条件下で２つの保護基を除去しうることを示し、さらに、保護基の除去によりオリゴヌクレオチド鎖が無傷で残ることを示す。実施例１６タグを付けた被検体の生化学反応１６ａ．タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的リン酸化５’末端にホスフェート基を有するオリゴヌクレオチドを得ることは、多くの目的のために有用であろう。そのような基は、ライゲーション反応においてオリゴヌクレオチドを供与体として用いようとする場合に必要であり、生化学的特性を試験するために放射性基を導入する有用な方法である。３’末端に結合したタグＲ９およびＲ１０を有するオリゴヌクレオチドＡ₅、Ａ₁₀およびＴ₅を、シリル保護基を除去するかまたは除去せずに製造した（これは、まだ固体支持体上にあるオリゴヌクレオチドを、アセトニトリル中の５ｍＭフッ化テトラブチルアンモニウム溶液で、室温で１５分間処理することにより実施した）。これらのオリゴヌクレオチドを、供給元により推奨される標準的なプロトコールにしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびガンマ−³³Ｐ− ＡＴＰを用いてリン酸化した。０．５Ｍ炭酸水素アンモニウムで発色させたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）充満セルロース上の生成物の薄層クロマトグラフィーは、それぞれの場合において、標識されたリンがほぼ完全にオリゴヌクレオチドに移動したことを示した。１６ｂ．タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションタグを付けたオリゴヌクレオチドのいくつかの応用のためには、これらをレセプターにライゲーションすることが有用であろう。我々は、以下の試験により、タグを付けたオリゴヌクレオチドが酵素的ライゲーションを行い得ることを示した。（１）５’−末端にタグを付けたオリゴヌクレオチドこの試験においては、鋳型は５’−ＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡ（配列番号１）であった。これを、放射性リンを用いて５’−末端でリン酸化した供与体３’−ＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣ（配列番号２）にハイブリダイズさせた。それぞれ、鋳型中の５つのＡの並びにハイブリダイズさせた後に供与体の５’リン酸化末端にライゲーションしうる配列Ｔ₅の修飾を用いて、４つのライゲーション反応を実施した。反応において用いられた４つのオリゴＴは、その５’−末端の性質において異なっていた。１つはヒドロキシルを介して結合したジメトキシトリチル基を有していた。第２および第３のものは、ホスホジエステル結合を介して５’−末端に結合したタグＲ９およびＲ１０を有していた。第４のものは、正常な５’ＯＨを有する正の対照であった。負の対照は、オリゴＴを欠失したものであった。ライゲーション反応は、Ｔ４リガーゼを用いて、供給元の指示にしたがって実施した。反応は、０．７５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液で発色させたＰＥＩ−セルロース上のＴＬＣにより分析した。４つのすべての反応は、クロマトグラム上に、供与体より移動度の低い追加のスポットを示した。予期されたように、負の対照は追加のスポットを示さなかった。このことは、異なるタグを有するオリゴヌクレオチドがいかに配列特異的ライゲーション反応に関与しうるかを示す。Ｃｏｚｚａｒｅｌｌｉら（１９６７）は、相補的鋳型の存在下において、固体支持体に結合したポリヌクレオチドを受容体にライゲーションしうることを示した。実施例１７タグを付けたオリゴヌクレオチドの、固体支持体に繋げられたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション実施例１６ｂは、タグを付けたオリゴヌクレオチドがライゲーション反応に関与しうることを示す。ライゲーションはデュープレックス形成工程に依存するため、このことは、これらのオリゴヌクレオチドが溶液中におけるデュープレックス形成にも関与しうることを意味する。以下の実験は、これらが固体支持体に繋げられたオリゴヌクレオチドともデュープレックスを形成しうることを示す。製造元の指示にしたがって、アミン化されたポリプロピレンのシートの表面上でＴ₁₀ を合成した。このプロセスは１ｍｍ²あたり約１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを生成することが知られている。３．５Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム中の、５’末端において³³Ｐで標識され、かつ３’においてＲ１０でタグを付けたＡ₁₀の溶液（１μｌあたり６５ｐｍｏｌ）を誘導化ポリプロピレンの表面上に置き、４℃で一夜放置した。ハイブリダイゼーション溶媒中で洗浄した後、約１／３のプローブが繋がれたオリゴ−ｄＴにハイブリダイズしたことが観察された。これは、ハイブリダイゼーションの理論的限界に近く、タグを付けたオリゴヌクレオチドが高い効率でハイブリダイゼーション反応に関与しうることが示された。実施例１８タグの光分解光分解によりタグを除去する可能性は、これらの有用性を非常に増強する。これは、質量分析器においてレーザー脱離による直接分析を可能にする。これは、タグの簡単な除去方法を提供し、他の生化学的または化学的プロセスを可能とするであろう。１８ａ．バルク光分解ニトロベンジル基は、３０５ｎｍの照射に対して反応活性であることが知られている。Ｒ１０Ａ₁₀およびＲ１０Ｔ₅の水溶液を、核酸に検出可能な損傷を与えないことが知られている条件下で、トランスイルミネータから２ｃｍの距離で２０分間照射した。ＨＰＬＣによる分析は、予期された光分解生成物を示し、元の化合物の残渣は検出できなかった。１８ｂ．質量分析器におけるレーザー誘導光分解Ｒ１０Ｔ₅およびＴ₅Ｒ１０の試料を、追加のマトリックスを有しない飛行時間質量分析器（ＦｉｎｎｉｇａｎＬａｓｅｒｍａｔ）の金属標的の上に置いた。スペクトルは、ポジティブモードで他の試料中には存在しない質量約２４３の単一の飽和ピークを示した。実施例１９異なる被検体に結合した異なるタグの質量分析法による同定３’末端へのタグとして結合したジメトキシトリチル基を有する一連の５つのチミジン残基を、慣用的な固相法により、但し「逆シントン」を用いて合成した。質量分析器において、この化合物は、ポジティブイオンモードで質量３０４に大きな区別しうるピークを与えた。これに対し、上記にＲ１０と称されるタグを有する一連の１０個のアデノシン残基は、ポジティブイオンモードで質量２４３に大きな区別しうるピークを与えた。いずれの場合においても、レーザー脱離は、マトリックスの不在下において実施した。いずれの場合においても、タグを有しないオリゴヌクレオチドのピークは存在しなかった。これらの実施例は、質量分析のトレース中の、被検体の合成の間に取り込まれたタグに由来するピークの存在から被検体配列を同定することは容易に可能であること、および特有のタグはこれらの異なる質量により容易に同定しうることを示す。図面の説明図１．特定のタグを有する分子の合成の一般的スキーム合成は、被検体合成用の基を付加するための少なくとも１つの部位およびタグの合成用の部位を有する連結基（Ｌ）から開始する。（連結基はまた、合成の間、固体支持体に可逆的に結合させることもでき、また、分析において補助となる荷電基等の基を生成するための部位を有していてもよい）。ＰａおよびＰｒはそれぞれ、被検体前駆体およびレポーターの一時的保護基である。これらは、異なる処理により除去することができる。例えば、Ｐａは酸または塩基に対して反応活性な基、例えばトリチル、Ｆ−ＭＯＣまたはｔ−ＢＯＣであり、Ｐｒはフッ化物で処理することにより除去可能な基、例えばシリル残基である。基Ｕ−Ｚは保護基を有していてもよいが、これらはＰａおよびＰｒを除去するために用いられる試薬に対して安定でなければならない。カップリング化学は、異なるタイプの被検体について異なるであろう。オリゴヌクレオチドおよびペプチド合成については標準的方法を用いることができる。図２には３つの異なるタイプのタグが示されている。第１のスキームについては、タグのそれぞれの伸長は、被検体に加えられる残基の位置およびタイプの両方に特異的なレポーターを用いて実施する。このスキームではカップリングは重要ではない。第２および第３のスキームにおいては、位置は、残基を被検体に加えるときの合成の段階で達成されるレポーターの総質量により規定される。この場合、分子の部分をキャップすることによりタグの伸長の一部を終結させることが重要である。第２および第３のスキームは、レポーターを加える方法において互いに異なる。第２のスキームにおいては、レポーターは伸長剤の中にあり、第３のスキームにおいてはレポーターはキャップ中にある。図２．３つのタイプの分子特異的タグＡは、被検体（Ｕ−Ｚ）中の基の位置（下つき）および同一性（上つき）の両方を特定するレポーター（Ｅ）から作成されたタグを示す。このような組は、位置を特定するために、増加する式量の一連の脂肪鎖を含み得る。例えば、１位にメチレン、２位にエチレン、３位にプロピレン等。これらは、炭素および水素の異なる同位体組成により基特異的タイプに区別を生じさせることができる。例えば、上述の表１に示されるように、ＣＨ₂には６個の異なる同位体組成がある。これらのうち４個は１質量単位ずつ異なり、質量分析法によって容易に区別することができる。差異標識の別の方法を考察することもできる。例えば、位置または基を異なる電荷を有するレポーター基で印づけすることができる。このような基は、質量分析法を含む多くの方法により分離し認識することができる。Ｂは、例えば被検体の任意の構造を一連のタグに結合させるような部分合成により作成されたタグを示す。このシリーズの第１のものは、被検体の第１の基に特異的なレポーター基を有し、第２のものは、第１のレポーター基および、被検体の第２の基に特異的なレポーター基を有し、そしてその他も同様である。このようなシリーズは、タグを伸長するために２種類の前駆体を用いることにより容易に作成することができる。１つは、可逆的保護基により保護されたものであり、１つはそれ以上の伸長を回避するものである。例えば、ＲＸとＰ−（ＣＨ₂）_n Ｘ（ここでＲは、メチルまたはエチル等の非反応性脂肪族基であり、Ｐは可逆性保護基であり、ＸはＰにより保護された基と反応しうる活性化残基である）との混合物である。非反応性脂肪族基により「キャップ」された分子は、次回の脱保護および伸長には関与しないであろう。Ｂにおいては、基特異的情報は、合成を伸長させるために用いられる残基に含まれる。Ａと同様に、情報は質量同位体を用いて与えられることができる。例えば、ＣおよびＨの同位体で標識したＣＨ₂残基をＰ−（ＣＨ₂）_nＸに付加するたびに、レポーターに異なる質量を与え得る追加の部位が付加される。（ＣＨ₂）_n の質量は１４ｎから１７ｎの範囲にわたり、この範囲には４＋３（ｎ−１）個の異なる質量がある。したがって、エチレン基については、２８から３４の範囲に７個の区別しうる質量があり、プロピレン基については、４２から５１の範囲に１０個の区別しうる質量がある。Ｃは、いかにして基特異的情報を異なる方法で付加しうるかを示す。この場合、これは鎖停止剤、すなわち例Ｂにおける「キャップ」中に含まれている。ここでもまた、脂肪族残基を標識することにより異なる質量を与えることができる。位置情報は、停止剤が付加された伸長の長さにより与えられる。例えば、Ｅが（ＣＨ₂）₂−Ｏの場合、鎖停止剤は同位体により標識された式量１５から１９のメチル基である。それぞれの伸長は、レポーターに４４質量単位を付加するであろう。最も短いレポーターの質量範囲は、４４＋１５＝５９から４４＋１９＝６３の範囲である。第２の位置の範囲は、８８＋１５＝１０３から８８＋１９＝１０７の範囲である。他のものも同様であり、第６の位置の範囲は、２８４＋１５＝２９９から２８４＋１９＝３０３である。この範囲には重複はなく、停止剤および追加の原子による伸長を用いることにより、レポーターの数および範囲を拡張しうることがわかる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）少なくとも二つの被検残基を含み、かつｂ）に連結された被検部分、ｂ）質量分析法による検出に適応した一つまたはそれ以上のレポーター基を含むタグ部分を含む試薬であって、ここでレポーター基は被検残基を示し、およびタグ部分の各々の位置のレポーター基は被検部分の決められた位置の被検残基を示すように選ばれることを特徴とする試薬。２．被検部分およびタグ部分が結合される連結基が提供される請求項第１項に記載の試薬。３．被検部分がｎ個の被検残基の鎖であり、およびタグ部分がｎ個までのレポーター基の鎖であり、タグ鎖の各々の位置のレポーター基が被検鎖の対応する位置の被検残基を示すように選ばれる、請求項１または２項に記載の試薬。４．被検部分が光切断可能結合によりタグ部分に連結されている請求項１から３のいずれかに記載の試薬。５．式Ａ−Ｌ−Ｒ（式中Ａは被検部分を構成するｎ個の被検残基の鎖であり、Ｌは連結基であり、Ｒはタグ部分を構成するｎ個までのレポーター基の鎖であり、およびｎは２−２０である）を有し、ここでタグ部分は被検部分における被検残基の位置を決定する情報を含む、請求項１から４のいずれかに記載の試薬。６．連結基が被検部分合成のためのヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル基およびタグ部分合成のための反応性基を有する芳香族基を含む、請求項２から５のいずれかに記載の試薬。７．被検部分合成のためのヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル基を有する芳香族基がまた、光切断のためのｏ−ニトロ基も有する、請求項第６項に記載の試薬。８．質量分析法による分析のために荷電基が存在する、請求項１から７のいずれかに記載の試薬。９．被検部分がペプチド鎖である請求項１から８のいずれかに記載の試薬。１０．被検部分がオリゴヌクレオチド鎖である請求項１から８のいずれかに記載の試薬。１１．請求項１から１０のいずれかに記載の試薬のライブラリーであって、各々が異なる被検部分を含む多数の試薬から構成されることを特徴とするライブラリー。１２．ライブラリーがｎ個のヌクレオチドの異なったオリゴヌクレオチド鎖である異なった被検部分を各々が含む４ⁿの試薬から構成される、請求項第１１項に記載のライブラリー。１３．試薬が溶液中に一緒に混合されている請求項第１２項に記載のライブラリー。１４．以下の工程：標的物質を用意し；標的物質と請求項１１から１３のいずれかに記載の試薬のライブラリーを、少なくとも一つの試薬が標的物質との結合を起こす条件下でインキュベートし；非結合試薬を除去し；各々の結合した試薬のタグ部分を回収し；そして標的物質に結合された被検部分の性質の指標として回収されたタグ部分を分析する、を含むアッセイ法。１５．標的物質が生物体または組織または細胞群である請求項第１４項に記載のアッセイ法。１６．標的核酸の配列決定法であって、ａ）支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドを用意し、ｂ）標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ｃ）ｂ）からのハイブリッドと請求項第１３項に記載のライブラリーをインキュベートして、ライブラリーの第一の試薬のオリゴヌクレオチド鎖を固定化オリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、このことによりライゲーションされた第一の試薬を形成し、ｅ）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そしてｆ）標的核酸の第一の部分の配列の指標として、ライゲーションされた第一の試薬のタグ部分を回収して分析するの各工程を含む方法。１７．下記の追加の工程：ｃｉ）ｆ）からのハイブリッドと請求項第１３項に記載のライブラリーをインキュベートして、ライブラリーの第二の試薬のオリゴヌクレオチド鎖を第一の試薬のオリゴヌクレオチド鎖に隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、ｄｉ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、このことによりライゲーションされた第二の試薬を形成し、ｅｉ）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そしてｆｉ）標的核酸の第二の部分の配列の指標として、ライゲーションされた第二の試薬のタグ部分を回収して分析する、を含む請求項第１６項に記載の方法。１８．工程ａ）においてオリゴヌクレオチドは支持体としての一連の針の末端に固定化されており；工程ｂ）において標的ＤＮＡの個々のクローンを各々の個々の針に固定化されているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ；工程ｃ）およびｄ）において、異なるライゲーションされた試薬を有する異なる針を有する一連のライゲーションされた試薬が形成され；および工程ｆ）において各々のライゲーションされた試薬のタグ部分が回収されおよび標的ＤＮＡの一部の配列の指標として分析される、請求項第１６または１７項に記載の方法。１９．工程ｂ）において標的ＤＮＡの各々の個々のクローンを支持体の個々の間隔をとった位置に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ；工程ｃ）およびｄ）において異なるライゲーションされた試薬を有する支持体の、異なる、間隔をとった位置を有する一連のライゲーションされた試薬が提供され；および工程ｆ）において各々のライゲーションされた試薬のタグ部分が回収されおよび標的ＤＮＡの一部の配列の指標として分析される、請求項第１６または１７項に記載の方法。２０．以下の工程：ａ）支持体上の間隔をとった位置に固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイを用意し、一つの位置のオリゴヌクレオチドは他の位置のオリゴヌクレオチドとは異なっており、ｂ）支持体上で一つまたはそれ以上の間隔をとった位置でハイブリッドを形成させるように標的核酸を固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイとインキュベートし、ｃ）ｂ）からのハイブリッドと請求項第１３項に記載のライブラリーをインキュベートして、ライブラリーの試薬のオリゴヌクレオチド鎖を各々の固定化オリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、このことにより支持体上の一つまたはそれ以上の間隔をとった位置でライゲーションされた試薬を形成し、ｅ）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そしてｆ）標的核酸の一部の配列の指標として各々のライゲーションされた試薬のタグ部分を回収して分析する、を含む請求項第１６または１７項に記載の方法：２１．支持体上の各々間隔をとった位置に共有結合で固定化されているオリゴヌクレオチドの配列が知られている請求項第２０項に記載の方法。２２．標的ＤＮＡの分析法であって、ｉ）支持体上に固定化された標的ＤＮＡを用意し、ｉｉ）異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上の標的ＤＮＡにハイブリダイズするように、ｉ）からの固定化された標的ＤＮＡを請求項第１０項に記載の多数の試薬とともにインキュベートし、ｉｉｉ）ハイブリダイズしていない試薬を除去し、そしてｉｖ）標的ＤＮＡの一部の配列の指標として各々の試薬のタグ部分を回収して分析する、の各工程を含む方法。２３．追加の工程：ｉｉａ）異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が標的ＤＮＡにハイブリダイズするように、ｉｖ）からのハイブリッドを請求項第１３項に記載の試薬のライブラリーとともにインキュベートし、ｉｉｉａ）標的ＤＮＡにハイブリダイズした隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションさせ、およびライゲーションされていない試薬を除去し、そしてｉｖａ）標的ＤＮＡの一部の配列の指標として各々のライゲーションされた試薬のタグ部分を回収して分析する、を含む請求項第２２項に記載の方法：２４．標的核酸の個々のクローンが支持体上の間隔をとった位置に固定化され、このことにより工程ｉｉ）において異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上の異なる、間隔をとった位置で標的核酸にハイブリダイズする、請求項第２２または２３項に記載の方法。２５．各々のタグ部分がその付随する試薬から光切断により回収される、請求項第１４から２４のいずれかに記載の方法。２６．タグ部分が質量分析法により分析される、請求項第１４から２５のいずれかに記載の方法。２７．その上に二つまたはそれ以上の間隔をとった位置を持つ支持体；支持体上の間隔をとった位置に固定化された標的核酸の個々のクローン；および支持体上の間隔をとった位置で標的核酸の個々のクローンにハイブリダイズする請求項第１０項の異なる試薬；を含むアッセイ器具。