JPH09501842A

JPH09501842A - クローン化プルラナーゼ

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Publication number: JPH09501842A
Application number: JP7510981A
Authority: JP
Inventors: エー．バウワー，パトリシア
Original assignee: ミラーブルーイングカンパニー
Priority date: 1993-10-05
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 1997-02-25
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: JP3007159B2; EP0722501B1; WO1995009922A1; DE69423361T2; DK0722501T3; DE69423361D1; US5514576A; CA2173453C; EP0722501A1; CA2173453A1

Abstract

(57)【要約】微生物宿主内て活性プルラナーゼ酵素を発現するための方法が開示されている。一つの様相では、ＤＮＡ構造物は、成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸をコード化するために必要なヌクレオチドを除いて、プルラナーゼ酵素をコード化する配列を含み、かつ調節配列が微生物宿主におけるコーディング配列の発現を許す。有利なＤＮＡ構造物は、酵母細胞内でプルラナーゼの発現を許す調節配列を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】クローン化プルラナーゼ発明の背景技術分野本発明は、一般的に遺伝物質の操作に関するものであり、特に、組換え操作に有用な特異的ＤＮＡ配列を作製および使用して、プルラナーゼ酵素の１つ以上の特性を有するペプチドを確実に製造することに関係する。より詳細に言えば、本発明は酵母にプルラナーゼ酵素を発現させる方法に関係する。背景技術プルラナーゼは、低カロリービール製造の目的で醸造業で利用され、高デキストロース（Ｄ−グルコース）シロップの製造の目的で飲料工業で利用される枝切り酵素である。例として米国特許第４３５５１１０号及び第４３５５０４７号参照。これらの特許は、この後に参照する他の特許及び／または参考文献と共に、参照してここに挿入され完全に示される。プルラナーゼ遺伝子は細菌微生物から分離され、塩基配列が決定され、特徴づけられた。例えばクリキ（Kuriki）ら、J．Bacteriology、170巻、1554ページ（ 1988）を参照。米及びその他の穀類がプルラナーゼを含むことは公知である。例えば米国特許第４３５５１１０号は米にプルラナーゼが存在することを開示している。プルラナーゼ酵素は、米国特許第４３５５１１０号に開示された方法で米から分離できる。しかしこの方法の１つの問題点は、著しく多量の廃棄副産物が生ずることである。そこでこの廃物に関連して廃棄処理の問題に直面する。プルラナーゼのもう一つの別の供給源は細菌培養物である。しかし細菌の使用は公共的観点からいくつかのマイナスの面をもつ。また細菌プルラナーゼは概して米プルラナーゼより活性が低い。よって、低カロリービールまたは高デキストロースシロップの製造に使用する米酵素プルラナーゼ酵素の別の供給源が必要とされている。本発明は、米プルラナーゼ酵素を発現し、適切に処理し、分泌するように作られた酵母を提供することによって上記の諸問題を解決する。酵母は食物の加工成分の生産のために良い宿主微生物であると考えられる、なぜならば酵母は概ね安全とみなされるし、或る異種蛋白質を発現し、適切に処理し、分泌するように作ることができるからである。問題は、酵母では生産できない（例えば毒性のあるもの）蛋白質や、適切な処理及び／または分泌が不可能という蛋白質があることである。各蛋白質を、成功の確率を先験的に予想できないまま個別的に処理しなければならない。本発明は、成熟プルラナーゼ酵素が酵母中で発現するように方向づけることのできる発現構造物（construct ）を提供することによってこれらの問題を解決する。本発明のより驚くべき点は、その構造物が天然米プルラナーゼアミノ酸配列に似ない酵素を発現することである。用語“成熟プルラナーゼ”は、米の種子から分離したプルラナーゼを意味する。成熟プルラナーゼにおいてはメチオニン、またはメチオニン含有ペプチドが翻訳後−修飾中に除去されてしまったと予想される。しかしながらｍＲＮＡ配列はコード化されたメチオニン残基をもっているに違いない、なぜならばそれは翻訳開始コドンだからである。本発明におけるようにプルラナーゼ酵素を酵母系に発現させる場合、これは解決しなければならなかい問題の１つであった。発明の開示本発明の一つの面は、プルラナーゼ酵素をコード化する配列を含む、活性プルラナーゼ酵素を発現できるＤＮＡ構造物を提供し、ここでその配列は、成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸をコード化するために必要なヌクレオチドを含まず、かつ調節配列がコーディング配列（coding sequence ）の微生物宿主における発現及び分泌を可能にする。本発明の一つの好適な面は、酵母における発現及び分泌を可能にする調節配列を有する上記ＤＮＡ構造物である。本発明のまた別の好ましい面は、配列番号：２のコーディング配列を有するＤＮＡ構造物であり、より好適には、ここで調節配列が酵母構造遺伝子、ＭＦα１、からのプロモーター及び分泌シグナルを含むことである。ＭＦα１はα−因子交配フェロモンをコード化する。本発明のもう一つの面は、クローン化プルラナーゼ酵素であり、ここで、プルラナーゼは成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸を含まない。本発明のもう一つの面は、配列番号：７の配列に相同のコーディング配列を含むＤＮＡ構造物であり、ここで、相同性が十分なため遺伝子は活性プルラナーゼ酵素を発現することができる。好適なコーディング配列は配列番号：７を含むものである。こうして本発明は活性プルラナーゼ酵素を発現、分泌し得るＤＮＡ構造物、並びに成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸が欠けたクローン化プルラナーゼを提供する。本発明の活性プルラナーゼは低カロリービール及び高デキストロースシロップの製造に有用である。本発明の一利点は、活性プルラナーゼ酵素が非細菌性宿主から得られ、米からこの酵素を分離するときに生ずる廃物が出ないことである。本発明のこれらの、そしてまた別の目的及び利点は次に述べる説明から明らかになる。図面の簡単な説明図１は、プルラナーゼクローンがｐＳＥＹ２１０のＭＦα１配列に付着したときに生ずるアミノ酸配列の模式図である。図２は、プルラナーゼゲノムクローンの５’領域のＰＣＲ増幅の線図である。図３は、プルラナーゼｃＤＮＡクローンの３’領域のＰＣＲ増幅の線図である。図４は、ｐＰＢ／３’ｐｕｌ−８．６ｋｂ及びｐＰＢ／５’−３’ｐｕｌ−８．７３ｋｂの生成図である。図５は、ｐＰＢ／プルラナーゼ−１０．９ｋｂの生成図である。図６は、本発明の酵母トランスフォーマントのためのプルラナーゼ活性のグラフである。発明を実施するための最長の態様Ａ．概論本発明は活性プルラナーゼ酵素を発現、分泌することのできるＤＮＡ構造物である。一実施態様において、この構造物は、成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸をコード化する領域が欠けたプルラナーゼコード領域を含む。その構造物はクローン化プルラナーゼを微生物に発現するために適した調節領域も含んでいる。好適にはその微生物は酵母であり、調節領域はＭＦα１プロモーターおよび分泌リーダー（leader）配列（これは翻訳開始コドン、メチオニンを含む）並びに停止−及びポリアデニル化シグナルを含む。つまり、本発明は、プルラナーゼゲノムクローンとｃＤＮＡクローンの両方を単離することによって好適に作製される。しかしながら微生物学に熟練せる当業者は、以下に記載する遺伝的構造物及びアミノ酸配列を誘導する他の可能な生化学的方法、例えば抗体及びこれと同等のもののスクリーニングを思い描くであろう。下記の例は、酵母ＭＦα１プロモーターと分泌シグナルとを融合させる好適な方法、および本発明のために好適な２つのアミノ酸欠失をもたらすプルラナーゼｃＤＮＡをも開示する。この例において、プルラナーゼ配列を第３のアミノ酸のところでＭＦα１プロモータ／シグナル配列に結合するために必要なヌクレオチド配列を含むプライマーを用いて、ゲノムクローンの５’−領域を増幅した。しかし、もし他の調節領域または別の発現系、例えばＡＤＨＩ、が必要な場合は、これらの領域を、プルラナーゼ配列の第３番目のアミノ酸またはいずれかのアミノ酸で始まるプルラナーゼ配列に対応するヌクレオチドを含むプライマーに、付着させることもでき、成熟プルラナーゼに付加的アミノ酸を付加することを含む。この方法で、プルラナーゼ遺伝子から最初の２つのアミノ酸を引いた（除去した）配列、またはアミノ末端で種々のアミノ酸を付加、または欠失した成熟プルラナーゼの配列である、本発明の発現構造物が得られる。ひとたびプルラナーゼ酵素の発現構造物を得たならば、酵母宿主におけるベクター増殖のために必要な、適切な配列を含む適したベクターにこの発現構造物を入れることが必要になる。Ｂ．プルラナーゼｃＤＮＡクローンの作製下記の例は特に適したプルラナーゼコード領域の作製を開示する。それらの例が開示するように、先ず最初にプルラナーゼ遺伝子を分離する。好適にはその分離物は米プルラナーゼ遺伝子である。下記の例におけるように、先ず最初にプルラナーゼ含有生物からゲノムＤＮＡを分離し、このＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、これらのＤＮＡ断片を適したベクターに挿入する。これらのゲノムクローンを、プルラナーゼの遺伝子または酵素の公知のアミノ酸またはヌクレオチド配列を用いて作ったプローブでスクリーニングして、どのクローンがプルラナーゼ遺伝子を含むかを決定する。配列番号：１は成熟プルラナーゼ遺伝子の配列である。下記の例はゲノムクローンの好適スクリーニング法を開示する。プルラナーゼｃＤＮＡクローンを作製するためには下記の例のように進めるのが最も好適である。ｃＤＮＡは当業者には公知の方法によって米ｍＲＮＡから作る。このｃＤＮＡを適したベクターに挿入し、プルラナーゼ含有クローンの存在をスクリーニングする。下記の例は２つのゲノムＤＮＡ断片でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法を開示する。プルラナーゼの５’末端及び３’末端両方を含むｃＤＮＡクローンを作った後、発現構造物を作るのが一般的である。“発現構造物”とは、活性プルラナーゼ遺伝子に翻訳されるようにデザインしたヌクレオチド配列を意味する。例えば、発現構造物はゲノムクローンに見いだされるイントロンを含まない。配列番号：２には天然蛋白質の最初のアミノ酸がないが、適切な３’配列を含む。本発明の好適発現構造物は配列番号：２である。下記の例はこのような構造物の好適作製法を開示する。例において、標的ＤＮＡとしてプルラナーゼゲノムクローン９−２を用いる標準ＰＣＲ法によって、プルラナーゼ遺伝子の１４７ヌクレオチド５’末端が増幅され、増幅後に最初の２つのアミノ酸が欠けるようにされた。これは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と、天然プルラナーゼの第３番目のアミノ酸で始まるヌクレオチド配列を含むＰＣＲプライマーの使用によって行った。下記の例の図１と、配列番号：３及び４は好適プライマーを説明する。次に、プルラナーゼ遺伝子の３’末端を、ｃＤＮＡクローン６−１を標的ＤＮＡとして用いて増幅する。下記の例は０．７ｋｂ断片が作られることを開示している。この例では、その断片は、米の転写停止シグナル及びポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域部分をも含む。これらの構造は酵母構造に配列が似ており、酵母中で機能するかも知れない。転写終止−及びポリアデニル化シグナルは両方とも酵母における適切な発現に必要であることがわかった（ロマノス [Ro manos]ら、酵母 (YEAST)、８巻:423ページ、1992）。これら２つの断片は、当業者には公知の方法で、適切な制限部位を介してプルラナーゼｃＤＮＡクローンの２．３ｋｂ部分と結合し、完全な長さのプルラナーゼ発現構造物を作り出す。生成した発現構造物は、最初の２つのアミノ酸がないことを除けば、プルラナーゼ酵素の正確なコーディング配列を含む。発現構造物は、酵母系に発現する適した配列を含むベクター（上記のように）もしくは自律的に複製するプラスミドに入れるか、または宿主染色体に一体化するのが好適である。特に好適なベクターはｐＳＥＹ２１０である。これはＭＦα １プロモーターと分泌リーダー配列を含むが、転写停止シグナルまたはポリアデニル化シグナルをもたない。ひとたび発現構造物が作られたならば、それを発現し、プルラナーゼ活性を試験しなければならない。下記の例は適切な発現戦略を開示している。酵素検定も下記のように最も好適に行われるが、プルラナーゼ酵素の活性を評価するためにデザインされた他の検定法も同様に適する。Ｃ．微生物宿主本発明のプルラナーゼ発現構造物は他の適した微生物宿主に発現することが可能である。プルラナーゼをコード化する領域（発現構造物）を含むＤＮＡ領域を作り、これを他の微生物宿主に適した調節シグナルを含む適したベクターに挿入することができる。代表的な例は大腸菌（E.coli）、バシラス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、ピチア（Pichia）、またはクルイヴェロミセス（Kluyveromyces）を含む。例Ａ．概論下記の例は、プルラナーゼ−特異的プローブの作製、分離、特徴づけ；米ゲノム−及びｃＤＮＡライブラリーからのプルラナーゼゲノムクローンおよびプルラナーゼｃＤＮＡクローンの分離および特徴づけ；及び、プルラナーゼ発現構造物の作製、を開示する。この発現構造物は、プルラナーゼｃＤＮＡおよびゲノムクローンそれぞれの３’および５’セグメントの増幅、並びにこれら増幅した断片とプルラナーゼｃＤＮＡクローンとの結合によって得られる。この発現構造物は成熟プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸を含まない。この発現構造物を酵母発現ベクター、ｐＳＥＹ２１０に入れた。このベクターから、活性プルラナーゼ酵素が発現し、測定された。Ｂ．プルラナーゼゲノム−及びｃＤＮＡクローンの作製１．プルラナーゼ特異的プローブの分離好適方法は、臭化シアノゲン消化及びＰＣＲ法によって生成するプルラナーゼ蛋白質及びペプチド断片からアミノ酸配列情報を得て、それに基づきプルラナーゼ特異的プローブを分離するというものである。このプローブを用いて、米ゲノム及びｃＤＮＡライブラリー両方についてプルラナーゼ遺伝子をスクリーニングすることができる。３つのＣＮＢｒプルラナーゼペプチド断片を分離し、部分的アミノ酸配列を決定した。ａ．プルラナーゼアミノ酸及びＰＣＲプライマー配列米ゲノムＤＮＡが、プルラナーゼアミノ末端及び４１．０ｋｄプルラナーゼＣＮＢｒペプチドからのアミノ酸配列情報に基づき、混合されたオリゴヌクレオチドプライマーとともにＰＣＲ法を用いて増幅された。これらのＰＣＲ条件（下記）のもとで、プライマー２０−５’（配列番号：８）及び４１−３’ｂ（配列番号：９）、約６７５ｂｐのゲノムＰＣＲ産物が分離された。ＰＣＲプライマーは他の２つのＣＮＢｒ断片に対して作られたが、それらはＰＣＲ産物を生産しなかった。６７５ｂｐＰＣＲ産物は適当なベクター（この場合は細菌性ベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位）にサブクローンした。そしてＤＮＡ配列分析は、プルラナーゼのアミノ末端アミノ酸配列データとの比較に基づいて、それがプルラナーゼ遺伝子のアミノ末端の一部を含むことを確認した。このプローブをｐｕｌ−１と名付けた。ｂ．ＰＣＲ条件ＰＣＲ増幅は、Perkin-Elmer Cetus及び Perkin-Elmer CetusDNA Thermal Cyc lerの指示に基づき、GeneAmp ＤＮＡ増幅キットを用いて行った。次の条件を用いた：米ゲノムＤＮＡ（ＰＣＲ反応を促進するために使用前に沸騰させた）１マイクログラムとアミノ末端プライマー配列番号：８及び９それぞれ１マイクログラムづつとを反応混合物 (mix)に加え、次の温度を用いて増幅させた：（１サイクル）９５℃ ２分間；（３０サイクル）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ ３分間;（１サイクル）７２℃ １０分間。米ゲノムは複雑なため、２回目に最初のＰＣＲ増幅反応混合物１０マイクロリットル部分（アリコート）を取り、前と同じＰＣＲ条件とプライマー濃度を用いて増幅した。２．米ゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングラムダファージＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７において作成された、米ゲノムライブラリー(Oryza sativa L．（indica）var.IR 36)をクロンテック社（Clontec h）(Palo Alto，CA)から購入した。そのライブラリーを、マニアティス（Maniat is）らの“分子クローニング(Molecular Cloning) :実験室マニュアル（ALabor atory Manual）”（1982）に概略記載されている方法でスクリーニングした。ハイブリッド形成プローブ（ｐｕｌ−１）をｐＵＣ１８からＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片として分離し(ジンクリーン [GeneClean]、Bio 101、La Jolla、CA)、デュポン／ＮＥＮ研究生産物（ＭＡ）［³²Ｐ］ｄＣＴＰ−ニック（ nick）トランスレーションシステムを用いて放射性標識をつけた。高力価の溶菌液を“仮の(tentative)”プルラナーゼ陽性−組換えファージから調製し（シルヘイヴィー［Silhavy ］ら、遺伝子融合実験［Experiments With Gene Fusions ］、1984）、数種のクローンを第二次スクリーニングのために選択した。３．“仮の”米プルラナーゼ遺伝子クローンの特徴づけａ．方法制限酵素地図のために最初のハイブリッド形成シグナルの強度に基づき４つの“仮の”プルラナーゼクローンを選択した。組換えファージを５０ミリリットル溶菌液から遠心分離によって分離した。フェノール／クロロホルムを用いてファージペレットからファージＤＮＡを抽出した。プルラナーゼＰＣＲ断片（ｐｕｌ−１）を用いてクローンの制限地図を確認した。ｐｕｌ−１はプルラナーゼのアミノ末端をあらわすから、各ゲノムクローンのアミノ末端を含む制限断片は容易に確認されるものであった。ｂ．分析ｉ．制限酵素消化ゲノムクローン９−２は最大のＤＮＡインサートを含むから、完全な制限酵素地図のために、これを選択した。このクローンをＸｈｏＩで消化したところ、２つの断片がｐｕｌ−１プローブにハイブリッド形成することがわかった。これは、ｐｕｌ−１プローブ内に内部ＸｈｏＩ部位があることを示す。ｉｉ．ゲノムクローンの方向づけクローンにＸｈｏＩ部位が存在したために、クローンのアミノ末端に対するゲノムＤＮＡの方向を容易に決定することができた。プライマー配列番号：８（アミノ末端アミノ酸配列）及び配列番号：９（４１．０ｋｄＣＮＢｒ断片）を用いるＰＣＲ増幅によってｐｕｌ−１プローブを分離した。これらのプライマーはゲノムクローン内にある内部ＸｈｏＩ制限部位にフランク (flank)する。４１−３’ｂＰＣＲプライマーを用いてＸｈｏＩ消化サザンブロッツ（サザン［Southern］、J.Mol.Biol．98 巻、503 ページ、1975）を検査することによって、“仮の”プルラナーゼの３’末端をあらわす８．０ｋｂｐＸｈｏＩ断片が同定された。４．３ｋｂｐＢａｍＨＩ断片をこのＸｈｏＩ断片から分離し、米ｃＤＮＡライブラリーの検査に用いた。４．米プルラナーゼｃＤＮＡクローンの分離及び特徴づけａ．プルラナーゼのための米の開花期ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｉ．ｃＤＮＡライブラリー米の開花期ｃＤＮＡライブラリーを、スーザン・ウェスラー博士（Dr.Susan W essler）（ジョージア大学、アテネ）から購入した。それはラムダｇｔ１０ファージベクターに構築され、Nato rice CI 8998 ｍＲＮＡを用いられた。ｉｉ．ハイブリッド形成プローブ及び一次ライブラリースクリーニング４．３ｋｂｐＢａｍＨＩゲノムクローン９−２断片を用い、標準法で180,000組換えファージをスクリーニングした（マニアティスら、同上、198 2）。１０個の陽性プラークが見つかった。高力価溶菌液（シルヘイヴィーら、1 984）を用意し、ｃＤＮＡクローンを２度目にスクリーニングした。ｉｉｉ．二次的ｃＤＮＡライブラリースクリーン２つの二重フィルターを１０個の陽性組換えファージクローンから作り、異なるプローブ、すなわちｐｕｌ−１およびＢａｍＨＩ（４．３ｋｂｐ）ゲノムクローン断片とハイブリッド形成した（マニアティスら、同上、1982）。ＢａｍＨＩプローブは、プルラナーゼ遺伝子の３’末端の大部分をあらわすから、どのプルラナーゼｃＤＮＡクローンでも確認する。もしもｐｕｌ−１プローブがｃＤＮＡクローンにハイブリッド形成するならば、これは完全な遺伝子またはほぼ完全な遺伝子が存在することを示唆する、なぜならばこのプローブはその遺伝子の５’ 末端をあらわすからである。ＢａｍＨＩプローブにハイブリッド形成する１０のｃＤＮＡクローンのうち、たった１つがｐｕｌ−１プローブにハイブリッド形成した。このクローンは“ｃＤＮＡクローン６−１”と名付けられた。ｉｖ．ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図作製プルラナーゼｃＤＮＡクローン６−１の制限酵素地図を、ゲノムプルラナーゼゲノムクローンの場合と同様にして決定した。プルラナーゼインサートをラムダｇｔ１０ベクターから、２つのＥｃｏＲＩ断片、２．５ｋｂｐ及び０．４４ｋｂｐ、として取り出した。両断片を適切なベクターにサブクローンし、ｐＰＢ／２．５プルラナーゼ及びｐＰＢ／．４４プルラナーゼと命名した。ｂ．ＤＮＡ配列分析による真のプルラナーゼであることの確認ゲノムクローン９−２及びｃＤＮＡクローン６−１の部分的ヌクレオチド配列をジデオキシ配列決定法によって決定した（サンガー［Sanger］ら、Proc．Nat' l Acad．Sci USA 74 巻、5463 ページ、1977）。公知のアミノ酸データに基づき、それらは真のプルラナーゼクローンであることが確認された。５．プルラナーゼＤＮＡ塩基配列分析プルラナーゼｃＤＮＡクローン６−１の５個の制限断片を、ブルースクリプトＳＫ＋シーケンシングベクター(Bluescript SK + sequencing vector)の適した制限部位にサブクローンした（ストラタジーン［Stratagene］、LaJolla，CA ）。ｃＤＮＡ６−１の全塩基配列を決定した（サンガーら、同上）。ｃＤＮＡ６−１のＤＮＡ配列分析により、成熟プルラナーゼ蛋白質の最初の１３のアミノ酸残基はそのＤＮＡ配列には存在しないことがわかった。これらのアミノ酸のための実際のＤＮＡ配列を、プルラナーゼＰＣＲ断片ｐｕｌ−１及びゲノムクローン９−２のＤＮＡ配列分析によって決定した。さらに、プルラナーゼゲノムクローン９−２アミノ末端のＤＮＡ配列分析の結果、枠内（in-frame）メチオニンコドン（翻訳開始コドン）はあらわれなかった。プルラナーゼｍＲＮＡの一次翻訳産物は、プルラナーゼの植物の或る部分から別の部分への運搬を引き起こすシグナル配列か、その酵素の安定性の維持に責任をもつ配列（プルラナーゼは例えばリボヌクレアーゼのような酵素前駆体であってもよい）か、または単一のメチオニンを含んでもよい。これらの蛋白質配列の各々は蛋白質輸送中または成熟中に除去されることがある（プロセッシング）。配列番号：７のプルラナーゼアミノ酸配列情報は、成熟した、プロセッシングを受けた蛋白質をあらわす。配列番号：１は成熟プルラナーゼ酵素のための全ヌクレオチド配列を示す。成熟プルラナーゼのコーディング領域は２６４６ｂｐを有する（８８２アミノ酸残基）。その他の３４２ｂｐは、米の転写停止シグナル及びポリアデニル化シグナルを含む３’−非翻訳領域からなる。プルラナーゼの理論的分子量は９８６９５ダルトンで、ｐＩ＝５．３９である。潜在的に９つのグリコシル化部位がある；ＡｓｎＸａａＳｅｒ／Ｔｈｒ。潜在的架橋部位であるシステイン残基も９つある。Ｃ．米プルラナーゼのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisi ae）における発現サッカロミセス属に米プルラナーゼ遺伝子を発現するために、以下のクローニング戦略が開発された。酵母に発現させるためのプルラナーゼ遺伝子調節カセットは、酵母ＭＦα１プロモーター及び分泌シグナル（これは翻訳開始コドンメチオニンを含む）、及び米翻訳停止−及びポリアデニル化シグナルからなるものであった。プルラナーゼ遺伝子とこのプルラナーゼ調節カセットを適当なプラスミドと組み合わせ、自律的複製プラスミドとして適した宿主に導入するか、または染色体に統合した。プルラナーゼはそれを分離可能な培地に分泌し、当業者には公知の方法によってプルラナーゼ活性を検定する。好適な発現ベクターはｐＳＥＹ２１０ＭＦα１−ＳＵＣ２（エムル［Emr ］ら、Proc．Nat'l Acad Sci USA 80巻、7080ページ、1983）であり、これはＭＦα１プロモーター及び分泌シグナルを両方とももつが転写停止シグナルはもたない、２ミクロンベースの多コピープラスミドであった。このベクターの停止シグナルはＳＵＣ２遺伝子を切り取るときに除去される。異なるプロモーター、またはプロモーター−分泌シグナルをもつ他の発現ベクターも適している。ＭＦα１分泌シグナル（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）とプルラナーゼ遺伝子との接合部に正しい読み枠を維持することが必須である。プルラナーゼ遺伝子はＭＦα１分泌シグナルに直接結合することができなかったが、なぜならばプルラナーゼ遺伝子には１つ以上のＨｉｎｄＩＩＩ部位があったからである。結果として、その遺伝子の特異的断片を分離し、下に説明する時期（フェーズ）にＭＦα１発現ベクターにクローンされた。ＭＦα１プルラナーゼ発現ベクターの作製は、プルラナーゼｃＤＮＡクローンに２つのユニークな制限酵素部位（５’末端のＨｐａＩと、３’末端のＫｐｎＩ）が存在するために容易であった。配列番号：２は発現したプルラナーゼ配列をあらわす。ポリメラーゼ連鎖反応法を選び、プルラナーゼ遺伝子の５’−及び３’−末端断片を分離した。これらの領域のＤＮＡ配列は化学的にも合成でき、当業者には公知の方法で発現ベクターに集められた。概して、ＰＣＲを用いて５’−末端の１４７ｂｐ及び３’末端の７０１ｂｐを増幅し、これらのＰＣＲ断片をその後ＭＦα１発現ベクターにクローンした。７０１ｂｐ３’−末端はプルラナーゼ遺伝子の約３４２ｂｐの３’−非翻訳領域を含んでいた。この領域はプルラナーゼ転写停止及びポリアデニル化シグナルを含んでいた；それは構造が酵母シグナルに似ており、この場合にも機能を発揮することをあらわしている。ＰＣＲを用いることによって、プルラナーゼｃＤＮＡクローンのアミノ末端から欠失していた１３のアミノ酸のうち１１のＤＮＡ配列が置換された。これを行ったのは、それらなしでは酵素が不活性だったからである。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し、正しい読み枠を維持し、プルラナーゼ遺伝子の破壊を最小にするために、最初のグルタミン及びグリシンはＤＮＡ配列から排除した。図１は本発明のプルラナーゼのＭＦα１領域と最初の２つのアミノ酸との接合の略図である。残る２３０７ｂｐのプルラナーゼコーディング領域をｐＰＢ／２．５プルラナーゼから分離し、最後に挿入した。ｐＰＢ／プルラナーゼプラスミドはその後サッカロミセス・セレビシエの適当な菌株に形質転換され、プルラナーゼ活性が検定された。１．ポリメラーゼ連鎖反応米プルラナーゼ遺伝子をＭＦα１プロモーターのコントロール下に置くために、遺伝子を３相において逐次的に集める戦略を開発した。各相はプルラナーゼ遺伝子の特異的ＤＮＡ断片によって表わされた。ＰＣＲを使用して遺伝子断片の２つを分離した。ｐＰＢ／プルラナーゼベクターの作製は、プルラナーゼｃＤＮＡクローンに２つのユニークな制限酵素部位−−５’−末端のＨｐａＩと３’−末端のＫｐｎＩ−−の存在のために容易になった。２．３’プルラナーゼＰＣＲ増幅プルラナーゼクローンの３’−末端を先ず最初に作ったのは、そのＰＣＲ産物がより大きいからであった（図３参照）。３’−ＰＣＲプライマーは：プライマーＡ、５’−−ＧＧＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡ（配列番号：３）及びプライマーＢ、５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＡ（配列番号：４）であった。プライマーＢは、ＸｈｏＩ制限部位を含む。プルラナーゼｃＤＮＡクローンをＰＣＲ反応の標的ＤＮＡとして用いた。３’ｐｕｌ／ＰＣＲ産物（３’−末端の７０１ｂｐ）は３’−コーディング領域の部分（ＫｐｎＩ部位を含む）とｃＤＮＡクローンの全３’−非翻訳領域とを含んでいた。全３’−非翻訳領域を含めたのは、米遺伝子の転写停止及びポリアデニル化シグナル両方がこの領域に位置していたからである。その結果、酵母に発現したプルラナーゼ遺伝子は米植物におけると同様に停止し、ポリアデニル化されることがある。酵母では、転写停止シグナルの存在がｍＲＮＡの翻訳効率及び安定性を高め（ザレット [Zaret]及びシェルマン [Sherma n]、J．Mol.Biol．177 巻 107ページ、1979）、より多い蛋白質産物に導くことが報告された。米の転写及びポリアデニル化シグナルが酵母のそれに似ていることも、プルラナーゼ生産を高めるようにはたらくかも知れない。酵母転写停止シグナルは特徴づけられており（ロマノス[Rpmanos]ら、酵母、８巻、423 ページ、1992）、当業者はこれを変形して使用することができる。３．５’−プルラナーゼＰＣＲ増幅プルラナーゼの５’−末端のＰＣＲ増幅（図２参照）は、ｃＤＮＡクローンに欠けていたアミノ酸のＤＮＡ配列の回復を含み、ＭＦα１プロモーター／分泌シグナルと結合するためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を与えた。５’−ＰＣＲプライマーは次のものであった：プライマーＡ、５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＣＧＡＧＧＧＣＡＴＡ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をもつ（配列番号：５）；プライマーＢ、５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＡＴＡ、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ制限部位をもつ（配列番号：６）。プルラナーゼゲノムクローン９−２をＰＣＲ標的ＤＮＡとして用いて（米ゲノムＤＮＡも用いることができる）、５’−ＰＣＲプライマーは、１３の欠失されているアミノ酸のうちの１１のアミノ酸のＤＮＡ配列、及び特異的ＨｐａＩ部位にフランク（隣接）するようにデザインされた。α−因子分泌シグナル及びプルラナーゼ遺伝子の正しい枠内読み（in-frame reading）を得るために、結合部にはＨｉｎｄＩＩＩ部位が必要であった。グルタミンとグリシンとを除去し、フェニルアラニンで開始することによって、プルラナーゼ遺伝子から２つだけのアミノ酸が失われ、特別のアミノ酸を付加する必要はなくなる（図１参照）。その結果５’ｐｕｌ／ＰＣＲ断片は長さ１４７ｂｐで、５’−末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、３’−末端にＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位をもっていた。４．ＴＡ−クローニングＰＣＲ断片３’−及び５’−プルラナーゼＰＣＲ産物（それぞれ７０１ｂｐ及び１４７ｂｐ）の両方を先ず最初にインビトロゲン（Invitrogen）（San Diego，CA）のＴＡ−クローニングベクター、ｐＣＲ^TMＩＩにサブクローニングした。このクローニングシステムはＰＣＲに用いる熱安定性ポリメラーゼの活性を利用する；それは鋳型には依存しないやり方で、全ての二本鎖ＰＣＲ分子の３’−末端に１個のｄＡＴＰを付加する。ｐＣＲ^TMＩＩベクターは１個の３’−Ｔオーバーハングを含み、それはＰＣＲ産物のＡ−オーバーハングと直接結合できる。この中間段階を取ることによって、きれいな制限部位が生成され、ＭＦα１発現ベクターへの結合に役立った。当業者はＰＣＲ断片を他の適切なベクターにサブクローンする別の方法を考え、同じ結果を得ることができる。サブクローニングのために用いたすべての断片はアガロースゲル電気泳動法によって分離し、電気溶出によって単離し、カラムクロマトグラフィーによって濃縮した。これらの操作法を用いることによって結合−または形質転換妨害物のない断片が単離された。５．３’ｐｕｌ／ＰＣＲのｐＳＥＹ２１０へのサブクローニングその後３’プルラナーゼ／ＰＣＲ断片をｐＣＲTMＩＩベクターから７５５ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片として切り取った（図４の“Ａ”）。この断片は約５４ｂｐのｐＣＲ^TMＩＩベクターをもっている；これはその後除去した。３’ −ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片を、ｐＳＥＹ２１０ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位にクローンし（ＳＵＣ２遺伝子は除去されている）、大腸菌株ＤＨ５αに形質転換した（ベセスダ研究所［Bethesda Research Laboratories］）。これらのサブクローンは“ｐＰＢ／３’プルラナーゼ−８．６ｋｂ”と名付けられた。６．５’ｐｕｌ／ＰＣＲのｐＰＢ／３’プルラナーゼへのサブクローニングｐＰＢ／３’プルラナーゼ（図６ｂの“Ｂ”）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩで消化し、ｐＣＲ^TMＩＩから切り取った１４７ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ５’ プルラナーゼ／ＰＣＲ断片と結合し、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。これらのクローンはｐＰＢ／５’−３’プルラナーゼ−８．７３ｋｂと名付けられた。７．ｐＰＢ／２．５プルラナーゼクローンの２．３ｋｂｐ断片の、ｐＰＢ／５ ’−３’プルラナーゼへのサブクローニングｐＰＢ／２．５プルラナーゼ及びｐＰＢ／５’−３’プルラナーゼをＨｐａＩ／ＫｐｎＩで消化した。ｐＰＢ／２．５プルラナーゼの２．３ｋｂｐプルラナーゼ断片を単離し、ｐＰＢ／５’−３’プルラナーゼに結合し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。これらのクローンはｐＰＢ／プルラナーゼ（１０．９ｋｂ）と名付けられた。図５はこの操作を説明したものである。８．ｐＰＢ／プルラナーゼの酵母への形質転換プラスミドを宿主酵母及びＰＥＧ／酢酸リチウム混合物(エルブル (Elble)、B iotechniques 13 巻、18 ページ、1992)の存在下で１晩インキュベートする手順を用いて、酵母菌ＳＥＹ２１０２(ＭＡＴα；ｕｒａ３−５２；ｌｅｕ２−３、 −１１２；ｈｉｓ４−５１９[エムルら、Proc.Nat'l Acad.Sci．USA，80 ：7080 ,1983])をｐＰＢ/ プルラナーゼで形質転換した。形質転換細胞を次の日、選択的培地上で培養した。５日後約１５０の形質転換細胞が見出だされた。ｐＰＢ／プルラナーゼ構造物を含む、形質転換したサッカロミセス・セレビシエ酵母菌ＳＥＹ２１０２は、ブダペスト条約の規定にしたかって、１９９４年４月１４日、アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Parklawn Dri ve、Rockville 、Maryland 20852 ）に、ＡＴＣＣ受託番号７４２８１として寄託された。９．ｐＰＢ／プルラナーゼ酵母形質転換細胞のプルラナーゼ活性の分析ｐＰＢ／プルラナーゼ酵母形質転換細胞について、強化培地（ＹＰＤ−１％酵母、２％ペプトン、２％デキストロース）におけるプルラナーゼ活性を検定した。形質転換細胞とＳＥＹ２１０２コントロールを各々ＹＰＤ培地２００ｍｌで約３６−４０時間増殖させた；培地にはグルコースはもう存在しなかった。酵母細胞を遠心分離によって除去し、ブロス (broth)を硫酸アンモニウム沈殿（６０％）によって濃縮した。４℃で５時間混合後、沈殿を０．２Ｎ酢酸ナトリウム１０ｍｌ、ｐＨ５．０に再懸濁し、１晩中０．２ＮＮａＯＡＣに対して透析した；ｐＨ５．０。（サンプルをポリエチレングリコールでさらに濃縮した。）ｐＰＢ／プルラナーゼ及びＳＥＹ２１０２の濃縮ブロス２ｍｌを等量の０．２ＮＮａＯＡＣ／１％プルランに加え、プルラナーゼ還元活性の存在を５０℃ で検定した。等量の３，５−ジニトロサリチル酸の添加によって反応を停止した。サンプルを１０分間沸騰し、水１０ｍｌで希釈し、Ａ_540nmを読んだ。形質転換細胞ブロスは、ＳＥＹ２１０２対照に比してプルラナーゼ活性を示した。図６の結果は、プルラナーゼ活性がマルトース等価物ミリグラムによって測定して、時間とともに直線的に増加することを示す。ミリグラムマルトース等価物は、当業者には公知の方法によってマルトース検量曲線から測定した。ベルンフィールド（Bernfield,P ）、酵素学の進歩（Advance in Enzymology ）、ＸＩＩ、１９５１。産業上の利用可能性本発明の活性プルラナーゼは低カロリービール及び高デキストロースシロップの製造に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims

【特許請求の範囲】１．米プルラナーゼ酵素をコード化する配列であって成熟米プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸をコード化するために必要なヌクレオチドを含まない配列と、微生物宿主におけるコーディング配列を発現させ、米プルラナーゼコーディング配列に影響を及ぼすようには全く結合されていない調節配列とを含有する、活性米プルラナーゼ酵素を発現することができるＤＮＡ構造物。２．調節配列が酵母における発現を許容する請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。３．配列番号：２を含んでなる請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。４．調節配列がＭＦα１プロモーターを含む請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構造物。５．構造物がｐＳＥＹ２１０ベクター内に含まれる請求の範囲第４項記載のＤＮＡ構造物。６．調節配列がＭＦα１プロモーターを含む請求の範囲第３項記載のＤＮＡ構造物。７．配列番号：７のコーティング配列に従ったコーディング配列と、そのコーディング配列を微生物宿主に発現させ得る調節配列とを含んでなる活性米プルラナーゼ酵素を発現し得るＤＮＡ構造物であって、前記調節配列は米プルラナーゼコーディング配列とは作用的には全くリンクしていないＤＮＡ構造物。８．配列番号：７のコーティング配列に相同なコーディング配列と、そのコーディング配列を微生物宿主に発現させ得る調節配列とを含んでなるＤＮＡ構造物であって、前記相同性は前記構成物が活性プルラナーゼ酵素を発現し得るのに十分であり、かつ前記調節配列は相同なコーディング配列とは作用的には全くリンクしていないＤＮＡ構造物。９．プルラナーゼが成熟米プルラナーゼの最初の２つのアミノ酸を含まない活性クローン化米プルラナーゼ。１０．請求の範囲第３項記載のＤＮＡ構造物を含む微生物。１１．請求の範囲第３項記載のＤＮＡ構造物を含む酵母。１２．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ構造物を含む微生物。１３．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ構造物を含む酵母。