JPH09503121A

JPH09503121A - 哺乳動物のストレスプロモーターを利用する化合物の毒性測定方法および診断用キット

Info

Publication number: JPH09503121A
Application number: JP6517147A
Authority: JP
Inventors: ビー．ファー，スペンサー; ディー．トッド，マーク
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1997-03-31
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: ATE160178T1; CA2154265C; US20030219714A1; JP3509100B2; EP0680517A1; DE69406772D1; GR3026129T3; DK0680517T4; US20030027127A1; AU6124394A; EP0680517B2; WO1994017208A1; ES2111289T3; DK0680517T3; AU692434B2; DE69406772T3; EP0680517B1; CA2154265A1; HK1004920A1; DE69406772T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、毒性化合物を同定および特徴付けるための方法および診断用キットを提供する。これらの方法および診断用キットにより、真核生物の天然のストレスプロモーター、特に哺乳動物のストレスプロモーターに連結した遺伝子からの転写または翻訳レベルが測定される。本発明のキットおよび方法は、以下の群のそれぞれから少なくとも一つのストレスプロモーターを利用する：酸化還元ストレス、DNAストレス、タンパク質ストレス、およびエネルギー／イオンストレス。本発明はまた、特定の器官（例えば、皮膚および眼）に対して有毒な化合物を同定および特徴付けるための、ならびに上記の個々のストレスのそれぞれのための方法および診断用キットも提供する。本発明の方法および診断用キットは、細胞下レベルに及ぼす化合物の作用に関する情報を与える。この情報は、有毒な化合物に対する抗毒素の設計、および活性な薬剤の設計に利用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物のストレスプロモーターを利用する化合物の毒性測定方法および診断用キット発明の技術分野本発明は、毒性の化合物を同定および特徴付けるための方法および診断用キットを提供する。これらの方法および診断用キットにより、天然(native)の真核生物ストレスプロモーター、特に哺乳動物のストレスプロモーターに連結される遺伝子からの転写および翻訳レベルを測定する。本発明のキットおよび方法は、以下の群のそれぞれに由来する少なくとも一つのストレスプロモーターを利用する：酸化還元ストレス、DNAストレス、タンパク質ストレス、およびエネルギー／イオンストレス。本発明は、特定の器官、例えば、皮膚および眼、に対して毒性の化合物を同定および特徴付けるための、ならびに上記の個々のストレスのそれぞれのための方法および診断用キットもまた提供する。本発明の方法および診断用キットは、細胞下(subcellular)レベルに及ぼす化合物の作用に関する情報を与える。この情報を利用することにより、有毒な化合物に対する抗毒素の設計、および活性な薬剤の設計が可能である。発明の背景現在少なくとも約55,000の化学薬品が合衆国で生産されている。毎年2,000を超す化学薬品が市場に導入されている。これらの薬品の内、急性あるいは慢性の毒性を包括的にテストされているものはほとんどない。例えば、完全な健康障害評価を受けている商品化された化学薬品は１％に満たない。環境保護庁(「EPA」)には、商業的生産の前に、毒物学的試験を要求する権限があるが、その権限は滅多に行使されない。EPAによって詳しい調査の対象となる新しい化学薬品は10％未満である。コストおよび市場への迅速なアクセスのために、EPAはしばしば、以前に試験された同族の化合物の毒性を用いて新しい化学薬品の毒性を評価する。新しい薬剤の潜在的な毒性は、米国食品医薬品局(「FDA」)によってモニターされる。新薬の申請（New Drug Application(NDA)）について、FDAは、代表的には、少なくとも２種類の生存動物における毒性、癌原性、変異原性、および生殖／繁殖力の一連の試験を要求する。これらの試験は１年まで継続することを要求される。ラットにおける２年間の毒性試験にかかる費用は、およそ800,000ドルである[Casarett and Doull's Toxicology、第４版、M．O．Amdurら編、Pergamo n Press、New York、New York、p.37(1991)]。費用の他に、動物試験はまた、時間、動物の犠牲、および正確さという点で欠点を有する。代表的な毒性試験は、急性、短期および長期の３段階に分けられる。急性試験は、化合物のLD₅₀（試験動物の５０％が死亡する用量）を測定し、死亡を除く、約60〜100匹の動物、ならびにLD₅₀、用量−応答曲線を決定するための一連の試験および臨床終点の監視を必要とする。短期試験は、通常少なくとも24匹のイヌおよび90匹のラットを用い、そしてラットにおける90日以上から、イヌにおける6〜24ヶ月まで継続する。短期試験では、体重、食餌量、血液、尿、組織サンプルが頻繁に測定される。さらに、死亡動物を死後検査する。長期試験は短期試験と同様であるが、ラットでは２年、そしてイヌまたはサルでは７年まで継続する。動物試験は、動物が受ける厳しい受難のため動物保護活動家および一般の人々から批判を受けるようになった。さらに、最近の証拠は、動物試験の正確さに疑問を差しはさんでいる。例えば、変動因子（例えば動物の規定飼料）は、癌原性の性質を決定する動物試験の予測可能性を損なう（P．H．Abelson、"Diet and C ancer in Humans and Rodents"、Science、255、p.141(1992)。そして、モルモット試験に基づいたダイオキシンの毒性に関する以前の測定が、現在再評価されている（B．J．Culliton、"US Government Orders New Look At Dioxin"、Natur e 、352、p.753(1991)；L．Roberts、"More Pieces in the Dioxin Puzzle"、Re search News 、October、1991、p.377）。従って、迅速、低価格、および信頼性のある動物毒性試験の代替物を緊急に必要とするということは明らかである。いくつかの短期代替試験を利用し得る。例えば、エームスアッセイは、Salmon ella typhimuriumの変異株の遺伝的復帰を引き起こす癌原性物質を検出する。しかし、このエームスアッセイでは、非変異原性癌原性物質または非癌原性毒素のいずれも検出できない。米国特許第4,99 7,757号に記載の酵母の癌原性物質アッセイ系は、エームスアッセイのいくつかの欠点を克服しているが、なお非癌原性毒素を検出し得ない。これら両アッセイは、DNAレベルのみで改変および変異を検出するために設計されている。従って、これら先行技術試験は、タンパク質または脂質膜への直接損傷だけでなくDNA 合成のインヒビターも検出し得ない。さらに、これらの先行技術試験は、突然変異原または毒素がどのようにその影響を奏するかについての情報を提供し得ない。出願人による1992年7月6日に出願された同時係属中の米国特許出願番号第910, 793号は、その開示を本明細書中で参考として援用するが、細菌のストレスプロモーターに融合したレポーター遺伝子を用いて、化合物の毒性を同定、および特徴付けることを記載する。このアッセイは、タンパク質または脂質膜への損傷およびDNA合成の阻害を検出し得る。従って、このアッセイは、非癌原性毒物の同定のために提供される。残念ながら、細菌毒性と哺乳動物および他の高等真核生物に対する毒性との間の相関には一定の制限があり、高等動物における毒性の正確な測定ではあり得ない。従って、細菌性ストレスアッセイの有する時間および費用節約の特徴を持つ、真核細胞に基づくアッセイの必要性がなお存在する。発明の要旨出願人は、潜在的な毒素が動物細胞に及ぼす細胞性および細胞下性効果を同定および特徴付けるインビトロ診断用キットおよびアッセイ法を提供することによりこの必要性を満たした。これらのキットおよび方法は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の天然のストレスプロモーターを用い、そしてこれらに作動可能に連結する遺伝子の転写または翻訳のレベルを測定する。用いるストレスプロモーターの選択に依存して、本発明のキットおよび方法は、動物の全身またはその動物の特定の器官に毒性である化合物を、同定および特徴付けるために設計され得る。一つの実施態様においては、本発明のキットおよび方法は、真核細胞内に存在する種々のストレス遺伝子の転写レベルを測定することによって化合物の毒性を特徴付ける。これらのキットおよび方法は、オリゴヌクレオチドを用いるが、このオリゴヌクレオチドは、種々のストレス遺伝子のメッセンジャーRNAの少なくとも一部分に相補的あるいは相同であり、細胞内のこれらの遺伝子の転写を検出する。この実施態様においては、単一細胞が、与えられた化合物が誘導する特定のストレスは何かを決定する効果的なインビボ診断試薬である。他の実施態様においては、複数の類似の真核細胞のそれぞれが、レポーター遺伝子に作動可能に連結した異なるストレスプロモーターを有している。各細胞を別々に化合物に曝し、そしてレポーター遺伝子産物の発現を測定することにより、この化合物の毒性が特徴付けられ得る。本発明のキットおよび方法は、動物試験に必要とされる月または年よりむしろ日に関して化合物の毒性を測定するために最適化して設計される。さらに、本発明のキットは、これらの結果を、動物試験の費用の一部で、そして生きた動物に対するいやな結果を伴うことなく達成する。そして、本発明の診断用キットおよび方法は、哺乳動物細胞に対する毒素の作用の性質についての直接的な情報を与える。これは先行技術の短期アッセイがなし得なかったことである。図面の簡単な説明図１は、種々の濃度のテトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン(TCDD)存在下で、異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図２は、種々の濃度の３−メチルコラントレン(3-MC)存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図３は、種々の濃度のベンゾ[ａ]ピレン存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図４は、種々の濃度の硫酸カドミウム存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図５は、種々の濃度のジメチルスルホキシド(DMSO)存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図６は、種々の濃度のエタノール存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図７は、種々の濃度のメタピリレン塩酸塩存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図８は、種々の濃度のメチルメタンスルホン酸(MMS)存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図９は、種々の濃度のヒ酸ナトリウム存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図10は、種々の濃度のホルボール12−アセテート−13−ミリステート(PMA)存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。図11は、種々の濃度のレチノイン酸存在下で異なるストレスプロモーターの制御を受けるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの相対的な発現を示す。発明の詳細な説明本明細書で用いられる用語「ストレス」および「毒性」は、交換可能に用いられ、そして細胞の生化学的および生物物理学的恒常性を乱すものをいう。本願を通じて用いられる用語「酸化還元ストレス」は、細胞の正常な還元／酸化ポテンシャル（「酸化還元」）状態から変化する条件をいう。酸化還元ストレスは、増加したレベルのスーパーオキシドラジカル、増加したレベルのペルオキシド、−−過酸化水素および有機ペルオキシドの両方−−、低下したレベルのグルタチオンおよび細胞の酸化還元ポテンシャルを変化させる任意の他の条件（例えば、強い還元剤、特定の芳香族炭化水素、求電子化合物、アルデヒド、細胞内チオール、ステロイド、メチルコラントレン、フェノバルビタールおよびCCl₄への曝露ような）を包含する。この用語は、ペルオキシソームの増殖を引き起こす任意の付加的な条件も包含する。本明細書中で用いられる用語「DNAストレス」は、デオキシリボ核酸または前駆体ヌクレオチドに対する改変をいう。例えば、DNAストレスは、DNA鎖の切断、 DNA鎖の架橋、DNAインターカレーション剤への曝露、超らせん構造(superhelici ty)の増加および減少の両者、酸化的DNA損傷、DNAのアルキル化、ヌクレオチド三リン酸の酸化およびヌクレオチド三リン酸のアルキル化を包含するが、これらに限定されない。この用語は、DNA合成および複製の阻害、ならびに有糸分裂または減数分裂の阻害もまた包含する。そしてこの用語は、成長因子、インターフェロン、腫瘍プロモーター、腫瘍壊死因子、ホルボールエステル、疎水性細胞毒性薬剤、炎症性物質、有糸分裂促進剤、癌原性物質、Ｘ線、UV照射、およびジメチルニトロソミン(dimethylnitrosomine)に曝することによって引き起こされる状態を包含する。本願を通じて用いられる用語「タンパク質ストレス」は、タンパク質または個々のアミノ酸の改変および酵素機能阻害ならびにタンパク質の細胞内移動の混乱をいう。この用語は、タンパク質の変性、タンパク質の誤折り畳み、タンパク質コファクターのキレート化、タンパク質の架橋、鎖内および鎖間結合の酸素依存性および非依存性酸化（たとえばジスルフィド結合）、タンパク質のアルキル化、個々のアミノ酸の酸化、ならびに重金属（例えばカドミウム）および熱に曝すことによって引き起こされるタンパク質損傷を包含するがこれらに限定されない。用語「エネルギー／イオンストレス」は、細胞内のATPレベルまたは細胞膜を横切るイオン勾配に影響を与える条件を包含するために用いられる。エネルギーストレスの例は、酸素存在下での強制嫌気的代謝、電子移動の混乱、結合解離剤への曝露、膜の脱分極化、浸透圧ショック、Ca²⁺のようなイオンへの曝露、高レベルのcAMPへの曝露、およびエタノールへの曝露である。用語「細胞表面レセプター介在性ストレス」は、発現が細胞表面レセプターのリガンドとの相互作用によって制御される遺伝子の転写レベルを改変する条件をいう。このようなストレスの例は、皮膚、眼または粘膜を、刺激剤、アレルゲン、または炎症性化合物に曝すことを包含する。用語「ストレスプロモーター誘導」は、天然のストレスプロモーターまたは応答要素を含む組換え由来のストレスプロモーターに作動可能に連結された遺伝子産物の発現レベルを増加させる条件をいう。用語「作動可能な結合」、「作動可能に連結」または「作動連結」は、遺伝子の転写がプロモーターにより制御されるような遺伝子に対するプロモーターの相対的な位置関係をいう。この用語は、組換え構築物、ならびに天然に存在するプロモーターとそれに伴う遺伝子との構造を包含する。用語「化合物の毒性を測定および特徴付ける」は、化合物を毒素と同定すること、およびその細胞内での作用機能を明らかにすることを包含する。本願で用いられる用語「核酸配列」は、RNA、１本鎖または２本鎖cDNAあるいはそれらの部分、１本鎖または２本鎖ゲノムDNAあるいはそれらの部分、あるいは、１本鎖または２本鎖の合成オリゴヌクレオチドを包含する。いずれの遺伝子も、独特のプロモーターで制御されているが、同一のストレスに応答する遺伝子は、それらプロモーター内に共通の応答要素を含んでいる。従って、同じ応答要素が、特定のストレスに曝される際、ある遺伝子ファミリーの誘導性発現を任っている。単離され、そして最小限プロモーターに作動可能に連結された構造遺伝子の場合、得られる構築物はストレスプロモーターのように機能する。このことは、複数のストレスに応答する天然のストレスプロモーターを、その構成部分に解剖することにおいて有用である。個々の細胞は、部分的に、刺激を解毒するまたはそれによって引き起こされた損傷を修復するタンパク質産物を有する特定の遺伝子を活性化することにより毒物刺激に応答する。真核細胞は、損傷およびストレスに対して多数の遺伝的および生化学的応答を有している。少なくとも50の異なる哺乳動物ストレス遺伝子が既に単離および特徴付けられている。これらの遺伝子は種々の化学的および物理的ストレスまたは細胞損傷により誘導される。これらの同定された遺伝子の１つまたはそれ以上を誘導する化学的ストレスには、細胞を、水銀、重金属、ニトロキシド、芳香族炭化水素、酸性、塩基性、アルキル化剤、過酸化剤、架橋剤、イオノフォア、酸化還元活性剤、求電子化合物、炎症性因子、疎水性細胞毒性薬剤、エタノール、ステロイド、結合解離剤、腫瘍プロモーター、および細胞性因子（例えば、腫瘍壊死因子、成長因子、およびインターフェロン）に曝すことがある。物理的ストレスは、UV照射、熱またはＸ線への曝露を含む。これらの同定された遺伝子を誘導する細胞損傷の例は、脂質酸化、ペルオキシソーム増殖、DNA鎖切断、DNAアルキル化、 DNA架橋、DNA酸化、浸透圧不均衡、タンパク質酸化、タンパク質の誤折り畳み、タンパク質アルキル化、ATP枯渇、膜透過性化、グルタチオン枯渇、およびシグナル伝達の改変である。より多くのストレス遺伝子の存在が確信されている。これらの付加的なストレス遺伝子の同定と特徴付けは、種々の化学的ストレスがどのような影響を細胞に及ぼすかを理解するうえで非常に望ましい。本発明は、細胞内で化合物の毒性が引き起こす損傷のタイプの見地から、即ち、DNA損傷、タンパク質損傷、酸化還元損傷、エネルギー損傷、イオン損傷、などによって化合物の毒性を測定し、および特徴付けるキットおよび方法を提供する。１つの実施態様によれば、本発明の各診断用キットは、複数の真核細胞を含み、その各々がストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは１つのプロモーター要素を有する。複数の細胞は、全体として、前述のタイプのストレス--酸化還元、DNA、タンパク質、およびエネルギー／イオン--のそれぞれに応答し、検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターまたはプロモーター要素を包含していなければならない。１つの実施態様によれば、このキットの複数の細胞は、実際には単一の細胞系で、各細胞は異なるタイプのストレスプロモーターの全てを包含し、そしてこれらのプロモーターのそれぞれは、適切なストレスに曝される際に活性化される。この実施態様においては、ストレスプロモーターに作動可能に連結される遺伝子は、最も好ましくは天然のストレス遺伝子である。この方法では、アッセイを行う前に細胞に対して遺伝子操作を行う必要がない。この好ましい実施態様では、キットはさらに、特定のストレスプロモーターの制御下にあるコーディングまたは非コーディング鎖のどちらかの少なくとも一部分に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはcDNAを包含する。オリゴヌクレオチドを用いてこれらの遺伝子またはそれらのcDNA相補物のmRNA転写物を検出および定量する。それらのいずれかが本実施態様において検出可能な産物である。全ての真核生物細胞は、それらのゲノム中に多数のストレスプロモーターを含んでいるが、これらプロモーターのいくつかは、適切なストレスに曝される際、活性化され得またはされ得ないことを銘記されたい。このことは、哺乳動物のような高等真核生物で特に真実である。ストレスプロモーターがほとんど全ての適切なストレスに応答する細胞系が本発明のキットに好ましい。これらは、哺乳動物の肝臓、心臓、肺、腎臓、脳、または他の器官由来の主要組織、ならびにこれらの組織から確立され、American Type Culture Collection (ATCC、Rockville 、MD)より入手可能な哺乳動物由来の細胞系を包含する。より好ましくは、HepG2 細胞、Hela細胞、およびWIL-2細胞である。最も好ましくはHepG2細胞である。本発明の上記診断用キットおよび方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、比較的高いストリンジェンシー条件下で、種々のストレスプロモーターに作動可能に連結される遺伝子の転写産物またはその相補物（即ち、そのmRNAから逆転写された１本鎖cDNA）のいずれかと特異的にハイブリダイズするそれらの能力に基づいて選択される。相補的あるいは相同オリゴヌクレオチドの利用の選択は、転写産物を検出するために用いる方法に依存する。これらの種々の方法は、本願の後の方で記載する。多くの哺乳動物のストレス遺伝子のDNA配列が知られているので、ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドの構築は容易である。オリゴヌクレオチドとストレス遺伝子mRNAとの間の100％の相同性または相補性は要求されないことを銘記されたい。何故なら、このオリゴヌクレオチドは、本発明のキットおよび方法で利用される細胞の供給源とは異なる種に由来するストレス遺伝子の配列に基づいて設計され得るからである。異なる哺乳動物種由来の類似のストレス遺伝子は、緊密に関係し得るということが期待されるが、それらの遺伝子からの転写物が同一のヌクレオチド配列を有するということはほとんどあり得ない。従って、本発明のキットおよび方法で利用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも95％相同または相補的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは20から500塩基対の間である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、50から100塩基対の間である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成機を用い、次いで必要に応じてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって合成する。この方法では、テンプレート鎖または非コーディング鎖のいずれかの一部分と同じ配列を有し、そして既知の、配列決定されたストレス遺伝子のコーディング領域内にあるオリゴヌクレオチドが合成される。オリゴヌクレオチドの量を増やすためにPCRを用いる場合は、各末端に追加の６〜12ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが合成される。これらの付加的なヌクレオチドは、PCR反応における相補的プライマーのための標的として提供される。好ましくは、各末端の付加的なヌクレオチドは、互いに相補的である。このことが、単一のプライマーが元のオリゴヌクレオチドおよびそのPCR産物の両方をプライムオフさせる。最も好ましくは、各末端の付加的なヌクレオチドは、相補的な相同ヘキサマー、即ち一方の末端にAAAAAA、他方の末端にTTTTTT、である。 PCRの間に、一つまたはそれ以上の標識ヌクレオチドがポリメラーゼ反応に含まれるのが好ましい。好ましくは、その標識は³²P、ビオチン、または蛍光性マーカーである。このことによって、標識産物を用いて転写産物のレベルを直接検出し得るようになる。このオリゴヌクレオチド合成機／PCRを混合した技術の利点は、マイクログラム量の標識オリゴヌクレオチドが単一の手順によって生成され得るということである。得られるオリゴヌクレオチドは、合成および精製の後、必要に応じてビオチン化され得る。オリゴヌクレオチドを用いて転写産物のcDNA逆転写産物を検出する場合には、それらが標識されていないことが好ましい。この実施態様では、標識はオリゴヌクレオチドよりむしろcDNAに組み込まれている方が好ましい。本発明のキットおよび方法で用いるための適切なオリゴヌクレオチドプローブの設計は、比較的容易である。明らかに、それらは、ストレス遺伝子mRNA（これに対してハイブリダイズするようにそれらのヌクレオチドプローブが設計される）に対して高い配列類似性または相補性を有するはずである。任意の特定のキット中のオリゴヌクレオチドは、ほぼ同じ融解温度(Tm)を有しているはずなので、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄工程を行う場合、単一の加温装置（水浴などのような）を利用し得る。好ましくはこのオリゴヌクレオチドは、0.2 ×SSCにおけるTmが、70℃以上であるように設計される。ストレス遺伝子のコーディング領域のどの部分がオリゴヌクレオチドプローブの設計に用いられるかを決定するために、OLIGO(National Biosciences、Plymouth、MN)のような、商業的に入手可能なコンピュータープログラムを利用し得る。他の実施態様によれば、本発明の診断用キット中の複数の真核細胞のそれぞれは、検出可能な産物をコードしている異種遺伝子に作動可能に連結されたストレスプロモーターまたはストレス応答要素を有する。この実施態様では、同一の異種遺伝子がキット中の種々のストレスプロモーターまたは応答要素に連結していることが好ましい。この方法では、任意のストレスプロモーターおよびストレス応答要素の誘導を検出するために、一回のアッセイを行うことのみが必要である。このキット中の各細胞は、単一のストレスプロモーターまたは応答要素／異種遺伝子構築物のみを含むことがまた好ましい。従って、キット中の任意の与えられた細胞における検出可能な産物の発現は、単一のストレスプロモーターまたは応答要素の誘導と特異的に相関し得る。本発明の診断用キットおよび方法は、複数の真核細胞を用い、それらは、全体として、以下のそれぞれに応答するプロモーターまたは応答要素を包含する：酸化還元ストレス、DNAストレス、タンパク質ストレス、およびエネルギーストレス。哺乳動物細胞を用いる使用について本発明の好ましいプロモーターおよび応答要素を、以下の表１に示す。好ましくは、本発明の方法およびキットにおける酸化還元ストレスに応答するプロモーターまたは応答要素は、CYP1A1、GST Ya、JUN、ALDH1、およびHMO遺伝子のプロモーター、ならびにXRE、NFkBRE、PPRE、RARE、ERE、およびThREの応答要素から選択される。 CYP1A1遺伝子は、チトクロムP450 1A1をコードし、この酵素はベンゾ(a)ピレンのような多環芳香族炭化水素の代謝に関わる。この遺伝子は、芳香族炭化水素、植物フラボンにより、そしてまたテトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD )、最も強い催奇形原および腫瘍プロモーターの一つによっても誘導され得る[L．A ．Neuholdら、Mol．Cell．Biol.、9、pp.2378-2386(1989)；Y．Fujii-Kuriyama ら、The FASEB J.、6、pp.706-710(1992)；D．W．Nebertら、Env．Health Persp ec. 、pp.13-25(1990)；R．A．Dixonら、Biol．Rev.、61、pp.239-241(1986)]。この遺伝子の配列は、K．Sogawaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、pp.8044-804 8(1986)に記載され、その開示は参考として本明細書中で援用される。 GST Ya遺伝子は、ユニークな生体異物応答性要素であるグルタチオンS-トランスフェラーゼのYaサブユニットをコードする。GST Yaプロモーターの酸化還元ストレス感受性部分は、求電子性除草剤、殺虫剤、およびβ-ナフトフラボンおよび3-メチルコラントレンのような平面状の芳香族炭化水素によって強力に誘導される[T．H．Rushmoreら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、87、pp.3826-3830(1990 )]。この遺伝子の配列は、T．H．Rushmoreら（前出）に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 JUN癌遺伝子は、AP-1複合体（転写アクティベーター）の形成に参与するc-jun をコードする。JUN遺伝子を活性化する酸化還元ストレスは、スーパーオキシドラジカルおよびUVA照射である。この遺伝子の配列は、R．De Grootら、EMBO J. 、10、pp.2523-2532(1991)に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 ALDH 2遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、そしてアルデヒドおよびペルオキシソーム増殖因子によって誘導される[D．W．N ebert、Env．Health Persp.、88、pp.13-25(1990)]。この遺伝子の配列は、L．C ．Hsuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82、pp.3771-3775(1985)に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 HMO遺伝子はヘムオキシゲナーゼをコードする。プロモーターは、以下の酸化還元ストレスにより誘導される：酸化的ストレス、過酸化水素、および亜ヒ酸塩ナトリウム[S．T．KeyseおよびR．M．Tyrell、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、86 、pp.99-103(1989)]。この遺伝子の配列は、上記論文に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 XREは、酸化還元ストレス応答要素である。それは、芳香族炭化水素のような生体異物に応答する[T．H．Rushmoreら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、87、pp. 3826-3830(1990)]。この応答要素の配列は、上記論文に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 NFkBREは、酸化還元ストレス応答要素で、細胞内チオールによって活性化される転写因子をコードしている[R．Schreckら、EMBO J.、10、pp.2247-2258(1991) ；B．Nelsonら、Molec．Cell．Bio1.、8、pp.3526-3531(1988)]。それはまたDNA ストレスに応答する。この応答要素の配列は、K．LeungおよびG．J．Nabel、Nat ure 、333、pp.776-778(1988)に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 PPREは、ペルオキシソーム増殖応答要素である。それはペルオキシソーム増殖因子によって誘導される酸化還元ストレス応答性要素である [C．Dreyerら、Cell、68、pp.879-887(1992)]。この応答要素の配列は、上記論文に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 RAREは、レチノイン酸応答要素である。それは、ステロイドホルモンレチノイン酸およびそのアナログに応答する酸化還元ストレス感受性応答要素であり[H． de Theら、Nature、343、pp.177-180(1990)]、この開示は、参考として本明細書中で援用される。 EREは、エストロゲン応答要素である。それは、エストロゲン性化合物によって誘導される酸化還元ストレスに応答する。このEREの配列は、V．Kumerら、Cel l 、55、pp.145-156(1988)に記載され、その開示は、参考として本明細書中で援用される。 ThREは、甲状腺ホルモン応答要素である。それは、甲状腺ホルモンおよびそのアナログにより誘導される酸化還元ストレスに応答する。ThREの配列は、M．Bea to、Cell、56、pp.335-344(1989)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。酸化還元に応答しそして本発明のキットおよび方法で利用され得るその他のプロモーターおよび応答要素は、以下の表２に挙げられるそれらから選択され得る。これら各遺伝子および各応答要素の以下の簡潔な記載において、特定遺伝子の DNA配列を開示する文献は括弧内に示される。これら各文献の開示は、本明細書に参考として援用される。 UGTは、UDP-グルコロノシルトランスフェラーゼをコードし、そしてその酸化還元応答は、3-メチルコラントレンにより誘導される[T．Iyanagiら、J．Biol． Chem ．261、pp.15607-14(1986)]。CYP11B2は、酸化還元応答がステロイドにより誘導されるチトクロム P450をコードする[T．Kawamotoら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA 、89、pp.1458-62(1992)]。Cu.ZnSODは、銅-および亜鉛-で触媒されるスーパーオキシド形成により誘導されるスーパーオキシドジスムターゼをコードする[E．Dancigerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、83、pp．3619-23(1986)]。Mn SOD遺伝子は、腫瘍壊死因子、インターロイキン-2およびリポポリサッカライドにより活性化され得るスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子をコードする[M．K ．St．ClairおよびJ．C．Holland、Cancer Res.、51、pp．939-943(1991)]。ADP RTは、リボシルトランスフェラーゼをコードし、そして酸化ストレスにより誘導される。GPは、グルタチオンペルオキシダーゼをコードし、そしてその酸化還元応答はペルオキシドにより誘導される[S．Chada、Genomics、6、pp.268-71(1990 )]。FAOクスアーゼ(FAOxase)は、脂肪酸アシル-CoAオキシダーゼをコードし、そしてペルオキシソーム増殖因子(proliferator)により誘導される[S．Miyazawaら、J．Biol．Chem.、262、pp．8131-37(1987)]。PBEは、ペルオキシソームエノイル-CoAヒドラターゼ/3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ二官能性酵素をコードし、そしてペルオキシソーム増殖因子により誘導される[J．K．Reddyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 、83、pp.1747-51 (1986)]。PPARは、ペルオキシソーム増殖因子-活性化レセプターをコードし、そしてペルオキシソーム増殖因子により誘導される[C．Dreyer ら、Cell、68、pp．879-87(1992)]。EHは、フェノバルビタールにより引き起こされる酸化還元ストレスに応答するエポキシドヒドロラーゼをコードする[R．K ．Skodaら、J．Biol．Chem.、263、pp．1549-54(1988)]。CYP2B2[J．S．Milesら、Nucl．Acids Res.、16、pp.5783-95(1988)]、CYP2E1[J．E．Freemanら、Bioch em．J. 、28、pp．689-95(1992)]およびCYP3A3[N．K．Spurrら、GenBank受託番号 X12387]は、３種の異なるチトクロムP450コードする。それらはフェノバルビタール(2B2)、CCl₄(2E1)、およびアフラトキシン、シクロスポリン、テストステロンおよびニフェジピン(3A3)によりそれぞれ引き起こされる酸化還元ストレスに応答性である。P450b遺伝子は、フェノバルビタールにより誘導されるチトクロムP450bをコードする[C．M．Giachelliら、J．Biol．Chem.、264、pp.7046-7053 (1989)]。P450d遺伝子は、チトクロムP450d遺伝子は、多環芳香族炭化水素、イソサフロール、および3-アミノ-1-5H-ピリド[4,3-b]インドール(Trp-P-2)により誘導されるチトクロムP450dをコードする[K．Sogawaら、J．Biol．Chem.、260、 pp．5026-5032(1985)]。PPaは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼをコードし、そして脂質過酸化および酸化ストレスに応答するストレス感受性成分を有する[K ．Uchidaら、Bi ochem．Biophys．Res．Comm. 、148、pp．617-22(1987)]。PKCは、プロテインキナーゼCをコードし、そしてその酸化還元ストレス感受性成分は、脂質過酸化により誘導される。ALDH1は、アルデヒドおよびペルオキソーム増殖因子により誘導される別のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする[L.C．Hsuら、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 、82、pp．3771-75(1985)]。NMO1遺伝子は、NAD(P)Hメナジオンオキシドレダクターゼをコードし、そして平面状芳香族化合物、アゾ染料およびフェノール性抗酸化剤を含む種々の生体異物により誘導される[L．V．Favreau およびC．B．Pickett、J．Biol．Chem.、266、pp.4556-4561(1991)]。GST2遺伝子は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-2をコードし、そしてGST Yaと同様の酸化還元ストレスに応答する[P．G．Boardら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、84 、pp．2377-81(1987)]。GAPDH遺伝子は、グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする[L．Ercolaniら、J．Biol．Chem.、263、pp．15335 -41(1988)]。NQO遺伝子は、NAD(P)Hキノンオキシレダクターゼをコードし、そしてNMOと同じ酸化還元ストレスに応答する[A．K．Jaiswal、Biochemistry、30、p p．10647-53(1991)]。本発明の方法およびキットで有用なDNAストレスに応答するプロモーターおよび応答要素は、好適には、GST Ya、GADD45、JUN、FOS、XHFおよびGADD153遺伝子のプロモーター、ならびにTREおよびp53RE応答要素から選択される。 GST Ya遺伝子は上記に記載される。そのDNAストレス-感受性成分は、アルキル化DNAで誘導される。 GADD45遺伝子は、成長阻止およびDNA損傷応答タンパク質をコードする。GADD4 5遺伝子は、UV照射、X-線、およびDNA損傷剤メチルメタンスルホネート(MMS)により誘導される。この遺伝子は、Q．Zhanら、Mol．Cell Biol.、13、pp.4242-50 (1993)に記載され、その開示は参考として援用される。 JUN遺伝子は、UVA照射、腫瘍プロモーターおよび成長因子により誘導されるDN Aストレス感受性成分を有する。 FOS遺伝子は、発ガン遺伝子c-fosをコードする。そのプロモーターのDNAストレス感受性成分は、腫瘍プロモーターおよび成長因子により誘導される[E．M．H aliday、EMBO J.、10、pp．109-115(1991)]。この遺伝子の配列は、F．van Stra atenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、80、pp．3183-3187(1983)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。 XHF遺伝子はコラゲナーゼをコードし、そして有糸分裂誘発(mitogenesis)、炎症薬剤、UV照射により活性化され、そしてまた腫瘍プロモーター、12-O-テトラデカノイル-ホルボール-13-アセテート(TPA)に応答する。この遺伝子の配列は、 P．Angelら、Mol．Cell．Biol.、7、pp．2256-2266(1987)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。 GADD153遺伝子は、成長阻止シグナルおよびDNA損傷薬剤に応答して発現する[J ．D．LuethyおよびN．J．Holbrook、Cancer Res.、52、pp．5-10(1992)]。この遺伝子の配列は、A． J．Fornaceら、Mol．Cell．Biol.、9、pp．4196-4203(1989)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。 TREはTPA応答要素である。それは、ホルボールエステルにより誘導されるDNA ストレスに応答する。TREの配列は、P．Angelら、Cell、55、pp．875-85(1988) に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。 p53REはp53応答要素である。それは、DNAストレスに対して応答性であり、そしてX-線およびMMSにより誘導される。p53REの配列は、Q．Zahnら、Mol．Cell． Biol. 、13、pp．4242-4250(1993)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。 DNAストレスに応答しそして本発明の方法およびキットで有用なその他のプロモーターは、以下の表２に挙げられる。これら各遺伝子の以下の簡潔な記載において、特定遺伝子のDNA配列を開示する文献は括弧内に示される。これら各文献の開示は本明細書に参考として援用される。 EGR-1遺伝子は初期成長応答因子をコードし、そして有糸分裂誘発およびホスファターゼインヒビターにより誘導される[S．V．Suggs、Nucl．Acids Res.、18 、pp．4283-89(1990)]。GAS 2,3遺伝子は、成長阻止に応答する遺伝子をコードする[C．Schneiderら、Cell、54、pp．787-793(1988)]。MGMTは、O-6-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼをコードし、そしてアルキル化DNAにより誘導される［K．Tanoら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA. 、87、pp．686-90(1990)]。DNA Polは、DNAポリメラーゼA をコードし、そして有糸分裂促進物質(mitogen)により誘導される。TK(チミジンキナーゼをコードする)[H．D．Bradshaw Jr.ら、Mol．Cell．Biol.]、4、pp．23 16-20(1984)]、DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする)[C．Morandi、J． Mol．Biol. 、156、pp．583-607(1982)]およびPCNA(増殖細胞核抗原をコードする )[D．Jaskulskiら、J．Biol．Chem.、263、pp．10175-79(1988)]のそれぞれは、細胞増殖により誘導される。PGHSは、プロスタグランジンエンドペルオキシダーゼシンターゼをコードし、そして有糸分裂促進物質により誘導される[S．A．Kra emerら、Arch．Biochem．Biophys.、293、pp．391-400(1992)]。LOXは、5/12-リポキシゲナーゼをコードし、そして腫瘍壊死因子に曝露することにより活性化される[P．A．Dixonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85、pp．416-20(1988)]。インターフェロンで刺激される遺伝子をコードするISG15は、α-インターフェロンにより誘導される[N．Reichら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、84、pp．6394- 98(1987)]。2'-5'オリゴアデニレートシンセターゼをコードする2'-5'ASは、β- インターフェロンにより誘導される[M．Waltheletら、FEBS Lett.、196、pp．11 3-20(1986)]；上記で論議されるEHは、癌原性物質により活性化されるDNAストレス感受性成分を含む。CYP2E1は、ジメチルニトロソアミンに応答するDNAストレス感受性要素を含む。TPO1およびTPO2はトポイソメラーゼをコードし、そしてDN A鎖切断およびプロモーター組換えを引き起こす薬剤により誘導される[P．D'arpaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85、pp.2543-47(1988)；M．Tsai-Pflufelderら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85、pp．7177-81(1988)]。また上記で論議されるPPaも、DNA損傷により引き起こされるDNAストレスに応答する。DRAは、HLAクラスIIをコードし、そしてγ−インターフェロンにより誘導される[A．J．Korma nら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、79、pp．6013-17(1982)；D．A．Shackelfor dら、Immunol．Rev.、66、pp．133-(1982)]。上記のMnSODプロモーターはまた、腫瘍壊死因子により誘導されるDNAストレス-応答要素を含む。MDR-1遺伝子は、多剤耐性を担うタンパク質をコードし、そして主に疎水性の細胞毒性薬剤により誘導される[J．A．Silvermanら、Gene、106、pp．229-236(1991)]。β-pol遺伝子は、DNA修復酵素DNAポリメラーゼβをコードし、そしてN-メチル-N’ニトロ-N -ニトロソグアニジン(MNNG)、メクロレタミンハイドロクロライド(HN2)、およびシス-プラチナ(II)ジアミンジクロライド(cis-Pt)[S．G．Widenら、J．Biol．Ch em. 、263、pp．16992-98(1988)]。ストロメリシン-1(stromelysin-1)遺伝子は、 PMAのようなホルボールエステルにより誘導される[K．L．Sirumら、Biochemistr y 、28、pp．8691-98(1989)]。PCNA遺伝子は、腫瘍プロモーターにより誘導される増殖細胞核抗原をコードする[S．Travaliら、J．Biol．Chem.、264、pp．7466 -72(1989)]。本発明の方法およびキットで有用なタンパク質ストレスに応答するプロモーターは、好適には、GRP78、JUN、FOS、HSP70およびMTIIAから選択される。 GRP78遺伝子は、主要な小胞体成分である78-kDaタンパク質をコードする。GRP 78は、折りたたみ誤りタンパク質およびグリコシル化ブロックにより誘導される [S．K．Woodenら、Mol．Cell．Biol.、11、pp．5612-23(1991)]。この遺伝子の配列は、E．Resendezら、Mol．Cell．Biol.、5、pp．1212-19(1985)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。上記のJUNおよびFOSは、両者とも熱により誘導されるタンパク質ストレス応答性要素を含む。 HSP70遺伝子は、ヒートショックタンパク質70をコードし、そして熱、変性タンパク質、アミノ酸アナログ、重金属、酸素欠乏およびエネルギー代謝のインヒビターにより誘導される[D．D．Mosserら、Mol．Cell．Biol.、8、pp．4736-44( 1988)]。この遺伝子の配列は、C．HuntおよびR．I．Morimoto、Proc．Natl．Aca d．Sci USA 、82、pp．6455-59(1985)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。メタロチオネインIIAをコードするMT IIAは、重金属およびグルココルチコイドにより誘導される[M．Karinら、Nature、299、pp.797-802(1982)]。その遺伝子の配列は上記の文献に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。タンパク質ストレスを検出するための本発明のキットおよび方法で使用され得るその他のプロモーターは、タンパク質ストレスに応答する、以下の表２に挙げられるブロモーターから選択され得る。以下のこれら各遺伝子の簡潔な記載において、特定遺伝子のDNA配列を開示する文献は括弧内に示される。これら各文献の開示は、本明細書に参考として援用される。 MT 1A[R．I．Richardsら、Cell、37、pp.263-72(1984)]およびMT III[R．D．P almitterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、89、pp．6333-37(1992)]のそれぞれは、重金属、カドミウムにより誘導されるメタロチオネイン遺伝子をコードする。GPはタンパク質障害性の重金属、セレンに応答する要素を含む。本発明の方法およびキットで、エネルギー/イオンストレスに応答する好適なプロモーターおよび応答要素は、FOSおよびGRP78遺伝子のプロモーターおよびCR E応答要素である。上記のFOSは、cAMP応答要素(「CRE」)を含む［W．J．Roeslerら、J．Biol．Ch em. 、263、pp．9063-9066(1988)］。また、上記のGRP78は、カルシウムイオノホアに応答するエネルギー/イオンストレス応答性要素を含む。 CREは、cAMP応答要素である。それは増加するcAMPレベルに応答するエネルギー/イオンストレス感受性応答要素である[J．Roeslerら、J．Biol．Chem.、263 、pp．9063-66(1988)、その開示は本明細書に参考として援用される。] 本発明のキットおよび方法で使用され得るその他のエネルギー/イオンストレスプロモーターを、以下の表２に挙げる。以下のこれら各遺伝子の簡潔な記載において、特定遺伝子のDNA配列を開示する文献は括弧内に示される。これら各文献の開示は、本明細書に参考として援用される。２つのチトクロームP450遺伝子--cAMPにより誘導されるCYP11B2；およびエタノールにより誘導されるCYP2E1--はエネルギー/イオンストレス応答要素を含む。2'-5'ASは、エタノールにより誘導されるエネルギー/イオンストレスに応答する要素を含む。ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼをコードするDBH[B．Grima、Nat ure 、326、pp.707-11(1987)]、および、チロシンヒドロキシラーゼをコードする TH[A．Lamourouxら、EMBO J.、6、pp.3921-37(1987)]の両者は、膜脱分極化により誘導される。オルニチンデカルボキシラーゼをコードするODCは、浸透圧ショックにより誘導される[N．J．Hickokら、DNA、6、pp．179-87(1987)]。G6PDは、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードし、ATP枯渇により誘導される。 PKCは、Na/K ATPアーゼ枯渇により誘導されるエネルギー/イオンストレス応答性要素を含む。PVALBは、パルブアルブミンをコードし、そしてカルシウムイオンにより誘導される[C．Lutumら、GenBank 受託番号X63070]。ストロメリシン-1 は、カルシウムイオノホアにより誘導されるエネルギー/イオンストレス応答性要素を含む。応答要素は、それらを含むプロモーターからのみ、組換えDNA法により単離され得るので、本発明のキットおよび方法におけるそのような要素の使用は、プロモーター-異種遺伝子構築物を利用する実施態様に限られる。異種遺伝子に応答要素を作動可能に連結するため、それは最初に最小プロモーターに連結されねばならない。最小プロモーターは、それに作動可能に連結された遺伝子の基礎の発現を構成的に引き起こすプロモーターである。好適な最小プロモーターは、SV40最小プロモーター、TK最小プロモーター、またはβ-インターフェロン最小プロモーターである。これらの最小プロモーターは、当該技術分野で周知である。この最小プロモーター/応答要素構築物は、次いで周知の組換えDNA法により異種遺伝子に作動可能に連結される。多数の上記プロモーターまたはそれらの機能的等価物は、線虫、酵母、昆虫、は虫類、両生類および植物のような他の真核生物に存在する。例えば、酵母は、重金属への曝露により誘導されるタンパク質ストレスに応答する、メタロチオネイン遺伝子CUPを含む[T．R．Buttら、Gene、27、pp.23-33(1 984)；T．R．Buttら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、81、pp．3332-36(1984)]。酵母はまた、HSP70およびGRP 78遺伝子の等価物を含む[E．A．Craig、Stress Pr oteins In Biology And Medicine 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Col d Spring Harbor、New York、pp．301-21(1990)；W．R．Boorsteinら、J．Biol ．Chem. 、265、pp．18912-21(1990)；およびM．D．Roseら、Cell、57、pp．1211 -21(1990)]。アルコール、エネルギー/イオンストレスにより誘導される酵母遺伝子のファミリーである、アルコールデヒドロゲナーゼはまた、配列決定されている[T．Youngら、Basic Life Sci.、19、pp．335-361(1982)]。また、多くのDNAストレス遺伝子が酵母中で同定されそして配列決定されている。これらとしては、DNAアルキル化損傷に応答するメチルアデニンDNAグリコシラーゼMAG、およびMGT1[W．Xiaoら、Mol．Cell．Biol.、13、pp．7213-21(1993) ]；RAD51、RAD54、RAD6、RAD23、RAD2、RAD18およびRAD7、これらすべてはDNA鎖破壊に応答する[G．Basileら、Mol．Cell．Biol.、12、pp．323 5-46(1992)；G．M．Coleら、Mol．Cell．Biol.、9、pp．3314-3326(1989)；K．M aduraら、Nucleic Acids Res.、18、pp．771-78(1990)；Nucleic Acids Res.、1 8、pp．4737-42(1990)；K．Maduraら、J．Bacteriol.、166、pp．914-23(1990) ；J．S．Jonesら、Nucleic Acids Res.、19、pp．893-98(1991)；J．S．Jonesら、Nucleic Acids Res.、18、pp．3281-85(1990)]；DNA損傷薬剤により誘導されるPHR1[J．B．Sebastionら、Mol．Cell．Biol.、10、pp．4630-37(1990)]；DNA 損傷により誘導される酵母リボヌクレオチドレダクターゼRNR2およびRNR3[S．J ．Elledgeら、Mol．Cell．Biol.、9、pp．5373-86(1989)；S．J．Elledgeら、Ge ne Dev. 、4、pp.740-51(1990)；Z．Zhouら、Genetics、131、pp．851−66(1992) ]；CDC9、酵母DNAリガーゼ[T．A．Petersonら、Mol．Cell．Biol.、5、pp．226- 35(1985)]；DNA損傷に応答する別の遺伝子UBI4[J．M．Tregerら、Mol．Cell．Bi ol. 、8、pp．1132-36(1988)]；および変異原に応答する遺伝子DDR48[J．M．Treg erら、Mol．Cell．Biol.、10、pp．3174-84(1990)]が挙げられる。さらに、酵母においていくつかの他のDNAストレス遺伝子もまた同定されている[G．W．Robins onら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、83、pp．1842-46（1986)；S．W．Rubyら、Mol．Cell．Biol. 、5、pp．75-84(1985)；E．C．Friedberg、Microbiol．Rev.、 52、pp.70-102 (1988)；T．McClanahanら、Mol．Cell．Biol.、4、pp．2356-236 3(1 984)]。これらプロモーターの任意またはすべての適切な組み合わせ、および他の既知の酵母ストレスプロモーターは、本発明の方法およびキットにおいて利用され得る。酵母ストレスプロモーターが使用される場合、酵母宿主が好適であり、そしてそのような宿主に適切な条件下で生育されるべきことが理解される。そのような条件は当該技術分野で周知である。毒性を検出するためにオリゴヌクレオチドを利用する最も好適なキットおよび方法は以下のストレスプロモーターを包含する：ALDH1、CYP1A1、FOS、GADD153 、HMO、HSP70、JUNおよびMTIIA。毒性を検出するためにレポーター遺伝子発現を利用する最も好適なキットおよび方法は以下のストレスプロモーターおよび応答要素を包含する：CYP1A1、GST Ya、GADD45、FOS、XHF、HSP70、MT IIA、GADD153 、CRE、XRE、NFkBRE、RAREおよびp53RE。本発明の別の実施態様によれば、診断用キットおよび方法は、さらに、少なくとも１つの細胞表面レセプター介在性のストレスプロモーターを使用する。そのようなキットおよび方法は、皮膚、眼または粘膜のような外部器官に対する化合物の毒性を決定および特徴付けるために特に有用である。細胞表面レセプター介在性のストレスプロモーターの使用は、そのような外部器官の局所刺激または炎症を引き起こし得る化合物の検出を可能にする。刺激および炎症薬剤は、組織学的に検出され得ない致死的に近い細胞損傷を引き起こし得る。そのような毒素は全体として標準的な知覚(c lassic sense)を有する動物には毒性でないかも知れず、そしてそれ故生存動物試験のような方法による検出をのがれ得る。本発明のキットおよび方法における細胞表面レセプター介在性のストレスプロモーターの使用は、そのような局所刺激物または炎症薬剤の検出および特徴付け、および細胞下レベルで２者を区別する能力--全動物試験が達成できない事柄、を可能にする。このようなキットに使用される好適な細胞表面レセプター介在性のストレスプロモーターは、IL-1 α、G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-3、IL-6、IL-8、ICAM-1およびストロメリシン-1遺伝子のプロモーターから選択される。インターロイキン(IL)-1α遺伝子は、マイトジェン、リポポリサッカライド(L PS)、PMA、シリカ、その他のサイトカイン、およびUVB照射、により誘導されるサイトカインをコードする[T．A．Lugerら、J．Invest．Dermatol、95、pp．100 S-104S(1990)]。その遺伝子の配列は、Y．Furutaniら、Nucleic Acids Res.、1 4、pp．3167-79(1986)に記載され、そしてその開示は、本明細書に参考として援用される。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)遺伝子は、エンドトキシン、インターフェロン、およびPMAにより誘導されるタンパク質を産生する[T．A．Lugerら、J．Inve st．Dermatol. 、95、pp.100S-104S(1990)]。この遺伝子の配列は、S．Nagataら、EMBO J.、5、pp．575-581(1986)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)遺伝子は、G-CSFと同じ刺激に応答して産生されるタンパク質をコードする(T．A．Lugerら、前述)。この遺伝子の配列は、S．Miyatakeら、EMBO J.、4、pp．2561-2568(1985)中に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。腫瘍壊死因子(TNF)α遺伝子は、IL-1αおよびIFNγにより誘導されるタンパク質をコードする[B．J．Nickoloffら、J．Invest．Dermatol.、94、pp．151S-157 S(1990)]。この遺伝子の配列は、D.Semonら、Nucleic Acids Res.、15、pp．908 3-9084(1987)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。 IL-3遺伝子は同じ名前の産物をコードし、そしてインターフェロン(IFN)γ、P MA、およびUVB照射により誘導される[T．A．Lugerら、前述]。その遺伝子の配列はD．R．Cohenら、Nucl．Acids Res.、14、pp．3641-58(1986)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。 IL-6遺伝子は、他のサイトカイン、細菌毒素、ウイルス、腫瘍プロモーターおよびラウリル硫酸ナトリウムに応答して発現するタンパク質を産生する[T．Hunz ikerら、Brit．J．Dermatol.、127、pp．254-57(1992)およびT．A．Lugerら、J ．Invest．Dermatol、95、100S-104S(1990)]。この遺伝子の配列は、K．Yasukaw aら、EMBO J.、6、pp.2939-45(1987)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。 IL-8遺伝子は、サイトカインIL-1α、腫瘍壊死因子(TNF-α)、およびIFN-γ、ならびにLPS、および腫瘍プロモーターにより誘導される[I．C．Oliveiraら、Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 、89、pp.9049-53(1992)]。その遺伝子の配列は、N． Mukaidaら、J．Immunol.、143、pp.1366-71(1989)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。細胞内粘着分子(ICAM)-1遺伝子は、サイトカイン、LPS、ハイドロコルチゾン、およびPMAにより誘導されるタンパク質をコードする[S．W．Caughmanら、J．I nvest．Dermatol. 、98、pp．61S-65S(1992)]。この遺伝子の配列はB．G．Stade ら、Immunobiology、181、pp．851-56(1990)に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。ストロメリシン-1遺伝子は、上皮成長因子により誘導される細胞表面レセプター介在ストレス要素を含む。本発明のキットおよび方法で利用され得るその他の細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターは、IL-1β、TGF-α、IL-10およびM-CSF遺伝子のプロモーター、ならびに上記の任意の遺伝子の発現を調節する細胞表面レセプターをコードする遺伝子のプロモーターを含む。これら各遺伝子の以下の簡潔な記載において、特定の遺伝子のDNA配列を開示する文献は括弧内に示される。これら各文献の開示は本明細書に参考として援用される。 IL-1β遺伝子は、IL-1αと同じ因子により誘導される[J．J．Huangら、J．Imm unol. 、140、pp．3838-43(1988)]。形質転換成長因子(TGF)α遺伝子は、単独で、およびIFN-γにより誘導されるタンパク質をコードする[F．Irisら、Nature Genetics、3、pp．137-45(1993)]。IL-10 は、トニリトロクロロベンゼン(TNCB)およびハプテンのような接触アレルゲンにより誘導される[J．M．Kimら、J．Immunol.、148、pp．3618-23(1992)]。その他の細胞表面レセプター介在ストレス遺伝子もまた、当該技術分野で記載されている。本発明の診断用キットおよび方法は、特定のストレスプロモーターまたはストレス応答要素の誘導、およびそれに作動可能に連結した遺伝子の転写および/または翻訳に依存する。哺乳類ストレスプロモーターまたはストレス応答要素に作動可能に連結した異種遺伝子を使用する本発明の実施態様において、遺伝子の選択は本質的に制限がない。要求されるパラメーターは、(１)アッセイ可能な産物をコードするDNA配列が特徴付けられていること；および(２)遺伝子の産物が検出され得ること、のみである。十分な特徴付けは、完全なコーディング配列の知識、ゲノムクローンの入手可能性、または遺伝子操作によりストレスプロモーターに作動可能な結合をつくり得るように、ゲノムDNA配列内の十分な数の制限部位の知識を含む。大部分の哺乳類ストレス遺伝子のプロモーターは、１種を超えるタイプのストレスにより誘導可能である。これは、そのようなプロモーターがそれらの配列の中に、それぞれが異なるタイプのストレスに応答性である多数のストレス応答要素を含むからである。そのような複合ストレスプロモーターを利用する実施態様において、複数のストレスの１つのみに応答する別のプロモーターをさらに使用することが好ましい。このことは、天然のプロモーター-遺伝子系または組換えプロモーター-アッセイ可能な遺伝子の融合物のいずれが使用される場合にもあてはまる。例えば、HMOプロモーターおよびJUNプロモーターは、ペルオキシドおよびUVA線の両者により誘導される。従って、これらプロモーターは、酸化還元ストレスおよびDNAストレスの両者に応答する。酸化ストレスにのみ応答するNMO 1プロモーターは、HMOまたはJUNプロモーターとともに使用され得る。プロモーターのこの組合わせによって、複合ストレスプロモーターの誘導が酸化還元ストレスまたはUVA光によるか否か決定することが可能となる。このように、化合物により引き起こされるストレスの性質はより正確に測定され得る。本発明の別の実施態様によれば、プロモーターの個々の応答要素が単離され得、そして次いで哺乳類最小プロモーター、および検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結され得る。従って、化合物の存在下における検出可能な産物の発現は、ある特定のタイプのストレスの１つのみに相関する。検出可能な産物をコードする遺伝子を使用する実施態様において、アッセイ可能な産物は好ましくは(lacZ遺伝子によりコードされる)β-ガラクトシダーゼ、( CAT遺伝子によりコードされる)クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、(galK遺伝子によりコードされる)ガラクトースキナーゼ、(gus遺伝子によりコードされる)β-グルコシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、(hGH遺伝子によりコードされる)ヒト成長ホルモン、または(lux遺伝子によりコードされる)ホタルルシフェラーゼである。最も好適にはCAT遺伝子が使用される。本発明の特定の診断用キットおよび方法で使用される宿主が有するストレスプロモーター-アッセイ可能な産物融合は、当該技術分野で周知である標準組換えD NA技術を用いて作製され得る。技術の選択は、株において使用される特定のストレスプロモーターについての既知の事項に依存する。ストレスプロモーターおよびその遺伝子を含むゲノムフラグメントが単離されたか、またはベクター中にクローン化された場合、このプロモーターは、適切な制限酵素消化により除去される。プロモーターフラグメントは、次いで単離され、そしてプラスミド中で、アッセイ可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結される。ベクターはまた、安定なトランスフェクタントを同定するためにNe oのようなマーカーを含むべきである。機能的な融合のためのスクリーニングは、トランスフェクタントを、特定のストレスプロモーターを誘導することが知られているストレスに曝し、そして検出可能な遺伝子産物についてアッセイすることにより達成される。ストレスプロモーターおよびその遺伝子のヌクレオチド配列が既知の場合、ポリメラーゼ連鎖反応技術が、アッセイ可能なタンパク質融合物を生成するために使用され得る。より詳細には、遺伝子のストレスプロモーター部分の5'および3'末端に相補的なプライマーを合成し、これらプライマーを、適切な条件下で、変性した哺乳類の全DNAにハイブリダイズし、そしてPCRを行う。この方法で、クローン可能な量の任意の配列決定されたストレスプロモーターが得られ得る。一旦ストレスプロモーターDNAが得られたなら、上記のように、適切なベクター中で、アッセイ可能なタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結する。このような方法は当該技術分野で周知である。検出可能な産物をコードする遺伝子へのストレスプロモーター応答要素の作動可能な融合の構築はまた、標準の組換えDNA技術により実施される。応答要素は小さいので、それらをコードするDNAは、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて生成され得る。応答要素の両鎖に対応するオリゴヌクレオチドが合成され、ともにアニールされ、そして最小プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むプラスミド中にクローン化される。あるいは、二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ベクター中に挿入する前に自己連結によりマルチマー化され得る。応答要素の多重コピーは、ストレス誘導に際し、検出可能な産物のより高い発現を可能にする。アッセイ可能な産物をコードする遺伝子として天然のストレス遺伝子を使用する本発明の実施態様は、毒性をアッセイする前に遺伝的操作を必要としない。本発明のキットおよび方法で使用するための細胞株の選択は、毒性を測定するために使用されるアッセイに依存する。ストレスプロモーター-アッセイ可能な産物遺伝子融合体を利用するこれらの実施態様において、細胞はアッセイ可能な形態で発現産物を産生することができなければならない。さらに、これら細胞は、それらゲノム中の遺伝子の別のコピーからアッセイ可能な産物を構成的に産生すべきではない。細胞の天然のストレス遺伝子を利用する実施態様において、細胞の選択は、これら遺伝子のストレスにより誘導される能力に基づく。細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターを使用しない実施態様における好適な細胞は、HeLa、HepG 2およびWIL-2である。細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターを使用するキットおよび方法には、好適な細胞株は、関連した器官に由来する細胞株である。例えば、ストレスキットおよび方法が、皮膚に影響する化合物を同定することを意図する場合、SCC12、またはC6C1のようなその誘導体などの皮膚線維芽細胞またはケラチノサイト細胞株が好適である。眼に対する毒素を同定しようとするキットおよび方法には、角膜細胞株が最も好適である。ストレスプロモーター-アッセイ可能な産物融合を利用する場合、本発明のキットおよび方法で使用される各宿主は、唯一のそのような融合を持つことが好ましい。この方法では、化合物が、任意の特定の宿主細胞中でアッセイ可能な遺伝子産物の発現を誘導する場合、この化合物により引き起こされるストレスの特定のタイプは、明白に同定され得る。いくつかの化合物は、それらの天然の形態では哺乳類に毒性でないが、肝臓によりプロセッシングされた後、毒性になることが知られている。従って、本発明の別の実施態様によれば、本発明の方法およびキットで試験される化合物は、S9 肝臓抽出物で前処理される。S9肝臓抽出物(「S9」)を調製する方法は、S．Venni ttら、Mutagenicity Testing‐A Practical Approach、S．Vennittら編、IRL Pr ess、Oxford、England、pp．52-57(1984)、により記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。S9は、一般に、低速遠心分離により除去される不溶性粒子を伴うラット肝臓の粗製ホモジネートであるが、ヒトまたはその他の哺乳類の肝臓からもまた調製され得る。S9は、毒性アッセイを実施する前に、哺乳類肝臓により通常なされる化合物のステージＩおよびステージＩＩ生物学的変換を模倣するために、NAD(P)Hを含むカリウム緩衝液中で試験化合物とインキュベートされる。しかし、主要哺乳類肝臓細胞が本発明のキットおよび方法で使用される場合、S9による前処理は必要でない。これら細胞は、アッセイ成長条件下で、化合物のステージＩおよびステージII生物学的変換を行うことができる。あるいは、本発明のキットおよび方法で使用される細胞は、ステージＩおよび IIの生物学的変換を行い得る細胞、好適には、主要肝臓細胞株と供に培養される。アッセイされる化合物の生物学的変換は、この例では、肝臓細胞に由来する酵素画分よりむしろこれらの他の細胞により行われる。本発明の方法およびキットを用いて未知の毒性を有する化合物についてアッセイを実施する前に、未知化合物をスクリーニングするために使用されるそれぞれ特定のストレスプロモーターまたは応答要素を誘導することが知られている少なくとも１種の、そして好適には少なくとも３種の化合物を用いて標準曲線を作成すべきてある。それぞれの既知の化学物質は、より好適には、誘導することが知られているプロモーターだけでなく、すべてのプロモーターについて試験されるべきである。そしてそれぞれの化学物質は、好適には１ピコモラーから１ミリモラーおよびいくつかの時間点で、有用な標準曲線を提供するに十分広範囲の濃度についてアッセイされるべきである。一旦標準曲線が作成されたなら、これらの曲線を含むコンピューターデータベースが作成される。このデータベースは、次いで、試験される化合物のストレスプロモーター-誘導プロファイルと、標準曲線を作成するために使用された既知の毒素の誘導プロファイルとを比較するために使用される。従って、任意の試験されなかった化合物についての結果が、ストレスプロモーターの既知のインデューサーと比較した相対毒性で表される。本発明のそれぞれの特徴付けおよび毒性測定方法は、可能な毒性化合物に曝す前および後の両方で細胞を培養する第１の工程を包含する。培養条件は、使用する細胞タイプに依存して変化する。最も好適には、不死化したヒト肝臓細胞(HepG2)が使用される。これら細胞の増殖は、標準的な組織培養条件(37℃、5％CO₂の最小必須培地)で行われる。細胞は、それらが約5×10⁶細胞/mlの密度に達するまで、165 cm²フラスコ中で常法により成長させる。この初期成長の後、細胞を継代培養し、そして試験化合物に曝する。代表的なアッセイでは約2.75×10⁵細胞/mlを使用する。化合物に関する初期試験では、化合物の一連の10倍希釈物を使用すべきである。S9画分とプレインキュベートした化合物の別の一連の希釈物もまた調製されるべきであり、そして各培養物の第２の部分に添加される。各培養物の第３の部分を対照として供し、化合物に曝されないが、但し以下の記載と同様の方法で処理される。すべての培養は、次いで、５分〜48時間の範囲の期間、通常の生育温度でインキュベートされる。より好適には、毒性または試験化合物への曝露は、約２〜32 時間である。試験化合物への曝露に続いて、アッセイ可能な産物またはストレス遺伝子mRNAのレベルが測定される。アッセイ可能な産物を測定する実施態様が使用される場合、定量は当該技術分野で周知の多くの方法で行われ得る。例えば、発現産物が酵素の場合、比色基質が利用され得る。特定の酵素の適切な比色基質は、当該技術分野で周知である。あるいは、RIAまたはELISAのような特異抗体を使用するアッセイが、発現産物を検出するために使用され得る。使用するアッセイの性質に依存して、溶解した培養物または上清液の緩衝液条件は調整される必要があり得る。従って、適切な緩衝液が、溶解した培養物または上清液に添加され得、特定のアッセイに対する最適条件が得られる。例えば、アッセイ可能な産物がRIAまたはELISAアッセイにより検出される場合、最大の抗体-抗原複合体形成を可能にし、および非特異的抗体結合を最小限とするために、緩衝液条件は中性pHに調整されなければならない。そのような条件は当該技術分野で周知であり、そして50 mMリン酸緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.0の最終緩衝液条件により例示される。アッセイ可能な産物が酵素であり、そして検出が比色基質アッセイにより達成される場合、緩衝液条件は、最大の酵素活性および基質に対する最小の非触媒的切断のために最適化されねばならない。これらの条件は、従来どおりであり、そしてアッセイする酵素に依存して変化する。本発明のこの局面の最も好適な実施態様において、検出可能な産物は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)である。この酵素のアッセイは、当該技術分野で周知であり、そしてJ．Sambrookら、「Molecular Cloning‐ A Laboratory Manual、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、pp． 16.60-16.65(1989)に記載され、その開示は、本明細書に参考として援用される。この文献はまた、β‐ガラクトシダーゼのアッセイについて記載し、これは本発明の方法およびキットに有用な別のアッセイ可能な産物である(pp．16.66-16.67 )。ストレス遺伝子誘導を測定するために転写レベルを利用する実施態様では、本発明のキットおよび方法で利用されるストレスプロモーターに作動可能に連結した遺伝子から転写されるmRNAのレベルが測定されねばならない(「ストレス遺伝子mRNA」)。このことは、全RNAまたはmRNAが曝露細胞から単離されることを必要とする。これは、任意の、多くのおよび周知の方法論により達成され得る。Stra tegene[La Jolla、CA]から入手できるような、市販のmRNAまたは全RNA単離キットがまた、利用され得る。好適には、細胞はイソチアシアン酸グアニジニウム(G TC)で溶解する。次いで溶解液を、酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.2)で酸性化し、そして夾雑物をフェノールで抽出する。次いでRNAをエタノールで２回沈殿させ、乾燥し、そして水に再溶解させる。一旦RNAが単離されたなら、ストレス遺伝子mRNAのレベルが、直接的にまたは間接的に多くの方法で測定され得る。直接法では、ストレス遺伝子mRNAに相補的なオリゴヌクレオチドが使用される。この方法では、細胞から単離されたmRNAは、スロットブロット装置中のニトロセルロースペーパーまたはナイロン膜フィルターに付与される。装置中のRNAを適切な塩溶液(好適には２倍容量の20× SSC) で希釈し、そしてスロットを洗浄した後、ニトロセルロースペーパーまたはフィルターを、真空オーブン中80℃で２時間ベーキングするか、または uv架橋してRNAを固定する。次いで、ニトロセルロースに固定されたRNAを、適切な緩衝液および温度条件下で、ストレス遺伝子mRNAに相補的な標識オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。間接法は、ストレス遺伝子mRNAに相同なオリゴヌクレオチドを検出に利用する。この方法は、ストレス遺伝子mRNAを鋳型として用い、逆転写を用いて標識一本鎖cDNAを作製することにより、転写を測定する。これらcDNAは、次いで、固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチド(または変性二本鎖cDNA)にハイブリダイズすることにより検出され、そして定量される。好適には、固体支持体は負に荷電した膜であり、そしてオリゴヌクレオチドは、膜に結合する前に、3'末端上に正に荷電したアミダイト(amidite)またはアミノ基の付加により改変される。この3'改変は、オリゴヌクレオチドがその3'末端を介してのみ膜に結合することを可能にし、固体支持体にDNAを結合する他の方法に比べより効果的なハイブリダイゼーションを可能にする。いずれの方法においても、特定の実験試料により誘導されないβ-グロビン、 β-チューブリン、β-アクチン、またはγ-アクチンのような、構成的に発現する「ハウスキーピング遺伝子」を示す対照がまた、使用される。これは、細胞の適切な生育および機能の対照、ならびに特異的な誘導量を計算するためのバックグラウンド標準を提供する。ハイブリダイゼーションの後で、ハイブリダイゼーション量が定量される。定量化は、オリゴヌクレオチドまたはcDNA上の標識に合致する方法により達成される。ラジオアイソトープが標識として使用される場合、膜をＸ線フィルムに曝した後、デンシトメトリートレーシングまたは液体シンチレーション計測が好適な定量法であり得る。蛍光標識が使用される場合、蛍光光度計が定量に用いられる。このように、種々のストレス遺伝子誘導のレベルが測定され得る。ビオチン化標識が使用される場合、定量化は、測定可能な比色産物を生じ得る酵素に結合したストレプトアビジンを用いることにより達成される。個々の化合物は毒性であり得ないが、非毒性化合物の組み合わせが実際に毒性であり得ることが知られている。従って、本発明のキットおよび方法はまた、上記の方法と同一の方法で、既知および未知の化合物の組み合わせ(例えば、薬剤の相互作用)の可能な毒性を測定するために利用され得る。本発明はまた、ストレス特異的な診断用キットおよび方法を提供する。例えば、本発明は、酸化還元ストレスキットおよび方法；DNAストレスキットおよび方法；タンパク質ストレスキットおよび方法；エネルギー/イオンストレスキットおよび方法；およびレポーター介在ストレスキットおよび方法を提供する。これらストレス特異的キットに使用するプロモーターの選択は、上記の表１および２で記載または挙げられた任意の適切なプロモーターからなされ得る。好適には、これらのキットは、少なくとも３種、そしてより好適には、少なくとも８種の、より大きな群にあるストレスの異なるサブセットに応答するプロモーターを使用する。最も好ましくは、これら特異的なキットおよび方法は、適切なストレスに応答するこれら表中の少なくとも12種のブロモーターを使用する。これらのキットおよび方法は、化合物により引き起こされるストレスのより正確かつ特異的な分析を可能にする。別の実施態様によれば、本発明は、本発明の方法により毒性であると決定された化合物の抗毒素を同定する方法を提供する。上記のように、一旦、ストレスプロモーター誘導プロファイルが、未知の化合物について生じると、そのプロファイルがデータベース中の既知化合物のプロファイルと比較される。未知化合物に対する可能な抗毒素は、類似のストレスプロモーター誘導プロファイルを有する化合物に対する既知の解毒剤である。そのような抗毒素の効力を試験するために、ストレスプロモーターアッセイが、未知の化合物により誘導されたストレスプロモーターを含む宿主のみを用いて繰り返される。これら宿主のそれぞれは、誘導性濃度の未知化合物を添加する前に、種々の濃度の提案された抗毒素とプレインキュベートされる。提案された抗毒素とのプレインキュベーションが未知化合物の効果を低減またはいん滅する場合、そのような抗毒素は有効であり得る。最後に、本発明は、活性薬剤設計を改良する方法を提供する。この実施態様によれば、新規な薬剤は、最初、上記の任意のキットおよび方法を用いて試験され、そしてその毒性が測定される。そのような方法およびキットにより提供される情報は、薬剤の毒性の細胞メカニズムを示す。次いで、示された特定の細胞損傷を引き起こしやすい薬剤の部分は、薬剤の薬学的活性においてその部分が演じる役割に依存して、適切に改変または除去される。得られる改変薬剤は、次いで、本発明のキットおよび方法を用いて再試験され、その毒性が十分に減少したかまたは除去されたかを測定する。この方法により改良および改変された薬剤もまた、本発明の範囲内にある。本明細書に記載された発明がより十分に理解され得るために、以下の実施例が提示される。これら実施例は例示の目的のみであり、そしていかなる方法でも本発明を制限すると解釈されないことが理解されるべきである。以下に記載する特定の基礎的な分子生物学技術は詳細には提示されない。このような技術は、当該技術分野で周知であり、そして Molecular Clonin‐A Labor ator Manual 第２版、J．Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press 、New York(1989)の開示に記載され、その開示は本明細書に参考として援用される。実施例１ストレス遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの設計と合成本明細書中に記載のストレス遺伝子の各々のヌクレオチド配列は公知である。従って、特異的オリゴヌクレオチドの設計は、単に、遺伝子のどの部分を型どるかの選択の問題である。コンピュータプログラム「オリゴ(0 LIGO)」により、所望の遺伝子のヌクレオチド配列を入力しそして配列を解析して、ユーザーにより選択された塩濃度および温度で所望の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置、長さ、および組成を決定し得る。このプログラムを用いて、本発明のキットおよび方法に使用するための、以下のストレス遺伝子特異的相補性オリゴヌクレオチドが設計された：上記オリゴヌクレオチドの合成を、以下のように行った。特異的オリゴヌクレオチドを、自動オリゴヌクレオチド合成装置（モデル392、Applied Biosystems 、Foster City、CA）を用いて合成した。種々の遺伝子またはそれらのcDNAの報告されたヌクレオチド配列に基づいて、所定のストレス遺伝子mRNAに相同性である以下のオリゴヌクレオチドも設計した：ハウスキーピング遺伝子転写物に相同性の以下のコントロールオリゴヌクレオチドも設計した：アミノ基の付加により、これらのオリゴヌクレオチドをそれぞれ3'末端で改変した結果、これらはその3'末端を介してのみ、負に荷電した膜に結合し得た。このようなオリゴヌクレオチドをOperon Technologies，Inc.，Alameda，CAによる指示に従って合成した。本発明に用いられ得るあらゆる他のストレス遺伝子mRNAに相補性かつ相同性のオリゴヌクレオチドプローブは、上記のソフトウェアを用いて同様に設計され得る。実施例２放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた未知の化合物の毒性アッセイＩ．オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによる、ストレス遺伝子mRNAの直接定量未知の化合物「Ｘ」が毒性であるかどうか、およびもしそれが毒性であれば、いかなる種類の損傷を哺乳類細胞に引き起こすのかを知ることが望ましい。 HepG2細胞を、最小必須培地(Gibco/BRL、Gaithersburg、M D)を含む165cm²のフラスコ中で、それらが約８×10⁶細胞／mlの密度に達するまで増殖する。次いで、これらを５×10⁶細胞／mlまで希釈することにより細胞を継代培養し、そして10ml／プレートでプレートする。各継代培養物の数枚のプレートを異なる濃度の化合物Ｘに曝す（一連の10倍希釈物で１pM〜１mM）。以下に記載するように、２、４、８、16、および32時間後、継代培養物からメッセンジャーRNAを単離する。吸引により細胞単層から培地を除去し、そして細胞を冷リン酸緩衝化食塩水で２回洗浄する。次いで、２mlの冷リン酸緩衝化食塩水を単層に添加し、ゴム製ポリスマンを用いて15mlの使い捨てポリプロピレンチューブ内に溶解産物をかき取る。RNAゾルＢ試薬(Biotecx Laboratories，Houston，TX)を製造者の指示に従って用い、全RNAを単離した。RNAペレットを乾燥し、そして10μlの水に再溶解する。RNAの通常の収量は、約100〜200μｇ／プレートである。次いで、それぞれ２枚の重複プレートから得たRNAを、以下のようにスロットブロット装置の20個の異なるスロットに付与する。このスロットブロット装置は、使用前に、0.1ＮのNaOH中で洗浄する。１片のニトロセルロースペーパーまたはナイロン膜フィルター（0.45μmポアサイズ）を軽く水に湿らせ、次いで１時間室温で20×SSC中に浸漬する。次いで、このフィルターを装置中に置く。各プレートからのRNAサンプルを20μlの100％ホルムアミド、７μlの37％ホルムアルデヒド、および２μlの20×SSCと混合し、68℃で15分間インキュベートし、次いで氷上で冷却する。 20μgのRNAを２倍容量の20×SSCと共に装置の各スロットに付与する。溶液をフィルターを通して排出した後、スロットを１mlの10×SSCで２回すすぐ。次いで、真空オーブン中で２時間80℃でフィルターを乾燥しそしてベーキングする。次いで、異なる濃度のＸに種々の時間曝したサンプルを個々のストレス遺伝子特異的プローブにハイブリダイズされ得るように、フィルターを細片にカットする。それぞれ別個のプローブにつき１個の細片を用いる。細片と個々のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを、RN A-DNAハイブリダイゼーションのための周知の条件下で行う。種々のプローブをR NAにハイブリダイズするための温度および塩濃度は、オリゴヌクレオチドの性質に依存する。これらの条件は、周知の数式を用いて計算され得る。以下の遺伝子に対するプローブを用いる：ハイブリダイゼーションの後、細片を洗浄し、乾燥し、そしてmRNAレベルを２つの方法のうちの一つにより定量する。１つの方法では、細片をＸ線フィルムに曝し、そしてハイブリダイゼーションをデンシトメトリーにより定量する。あるいは、細片をカットして個々のスロット内に入れ、そしてシンチレーションカウントを行う。実際には、前者を最初に行うのであれば、両方の方法を行い得る。 II．cDNAとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによる、ストレス遺伝子mRNAの間接的定量Ａ．オリゴヌクレオチドと負に荷電した膜との架橋 Y.Zhandら、Nucleic Acids Res.，19，pp.3929-33(1991)に記載の方法を本質的に用いて、以下のストレス遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のmRNAに相同性のオリゴヌクレオチドをBiodyne C膜(Pall Corporation，East Hills，New Yo rk)に別個に架橋した：まず、Biodyne C膜を0.1N HClで軽くすすいだ。次いで、この膜を15分間、新たに調製した20％(w/v)EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド)）で処理した。次いで、この膜をH₂Oですすぎ、そして96ウェルのドットブロット装置に置いた。次いで、15分間の真空を用いて、0.5MのNaHCO₃(pH 8.4)中のアミノ修飾オリゴヌクレオチドを個々のウェルの膜に付与した。ウェルあたりの全容量は、３μl を越えてはならない。個々のオリゴヌクレオチドのそれぞれを４個の隣接するウェルに付与した。オリゴヌクレオチドを付与した後、膜を１×TBS/0.1％Tween-20ですすぎ、次いで、0.1NのNaOHで10分間処理することにより、膜上のいかなる残存活性基をもクエンチした。次いで、dH₂Oで膜をすすぎ、風乾し、そして乾燥した膜を密閉プラスチック袋中で保存した。Ｂ．細胞の処理およびRNAの単離 HepG2細胞を100mm細胞培養皿中の最小必須培地で80％を越えない集密度まで増殖させる。次いで、培地を異なる濃度の化合物Ｘに曝し、そして所望の時間37℃ でインキュベートする。培地を吸引により除去した後、細胞を10mlの室温のリン酸緩衝食塩水溶液で３回洗浄する。次いで、５mlのリン酸緩衝食塩水溶液を細胞培養皿に添加し、細胞をゴム製ポリスマンで皿からかき取り、そして15mlの遠心分離チューブに入れる。次いで血球計を用いて細胞を計数し、そして遠心分離によりペレットにする。リン酸緩衝食塩水を捨てる。全RNAの単離が望ましい場合には、RNAゾルＢ(Biotecx Laboratories，Inc.，H ouston，TX)を製造者の指示に従って用いる。mRNAのみが望ましい場合には、メッセンジャーRNA単離キット(Stratagene I nc.，La Jolla，CA)を製造者の指示に従って用いる。３．ストレス特異的cDNAの逆転写および選択的PCR 次に、上記の方法により単離された全RNA(50μg)またはmRNA(２μg)を、SUPER SCRIPT II（逆転写酵素）(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)および以下のプロトコルを用いて逆転写する。 RNAをDEPC H₂OおよびオリゴdTプライマーと共にマイクロ遠心分離チューブに添加する。反応混合物に添加するDEPC H₂Oの量は、他の試薬の容量を決定した後に決定される。容量が全最終容量の10％となるように、オリゴdTプライマー(0.5 μg/μl)を添加する。反応混合物を70℃まで10分間加熱し、次いで、氷上で急冷する。以下の成分を順に添加する：５×SUPERSCRIPT第１鎖(first strand)緩衝液（全容量の20％）；0.1M DTT（全容量の10％）；10mMのdNTP混合物（全容量の５％）；SUPERSCRIPT II（全容量の５％）。反応混合物を短時間遠心分離にかけ、次いで反復ピペッティングにより混合する。この混合物を37℃で１時間インキュベートする。次いで２μlのRNAse A(10mg/ml)を反応混合物に添加し、ピペッティングにより混合する。次いで、反応混合物を37℃でさらに１時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、ddH₂Oを添加し、最終容量を450μl とする。50μlの３Ｍ酢酸ナトリウム、次いで１mlの100％エタノールを添加することによりcDNAを沈澱させる。次いで、混合物をマイクロ遠心分離機で12,000×ｇにて30分間遠心分離する。上清を除去し、そしてcDNAを100μlのddH₂Oに再懸濁する。次いで、２μlの再懸濁cD NAを取り出し、そしてシンチレーションカウンターで読みとる。ハイブリダイゼーションには、全量で1,000,000cpmが必要である。 cDNAは、反応にα-³²Ｐ dCTP(100μCi)を用いることにより放射性標識され得るか、または、GENIUS 1キット(Boehringer Mannheim Biochemical，Indianapol is，IN)を用いるジゴキシゲニン−dUTPを用いることにより化学標識され得るかのいずれかである。上記の方法により充分な量のストレス遺伝子cDNAが得られない場合には、増幅のためにPCRが用いられ得る。逆転写は、cDNA内に標識を組み込まないこと以外は、上記のように行われる。所望のストレス遺伝子の報告された5'および3'コード配列に基づくプライマーがPCR反応に用いられる。全てのストレス遺伝子cDNA の増幅は、同一の反応チューブ内で行われる。全cDNAをdH₂Oで１:10に希釈し、そして10μlをPCR反応のために用いる。次いで、以下の成分を添加し、所定の最終濃度を得る：１×TAQ緩衝液(Boehringer M annheim Biochemical)；300μMずつのdNTP；25pmolずつのPCRプライマー；2.5単位のTAQポリメラーゼ(Boehringer Mannheim Biochemical)；全反応容量を50μl にするためのdH₂O。混合物をピペッティングにより混合し、次いで第２の遠心分離にかける。２滴の軽鉱油を反応混合物の上部に入れる。PCRをセットし、次いで95℃で１分間30サイクル；Ｔ_m＋２℃で２分間；72℃で３分間（最終サイクルの間は10分間）実施する。PCR生成物は、１サイクルのPCR反応におけるキナーゼ反応を介し、連立した(nested)プライマー内に組み込まれた³²Ｐで標識されている。連立した(nested)プライマーは、PCRのプライマーのベースとなっている配列の中に位置するストレス特異的ヌクレオチド配列をベースとするプライマーである。これらのプライマーは、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成されるか、または、商業的請負業者から購入される。連立プライマーは、1.2μl(0 .5μg/μl)の連立プライマーと、1.0μlの10×キナーゼ緩衝液（0.5M トリス、p H 8.2、0.1M MgCl₂、50mM DTT）；5.0μlのα−³²Ｐ ATP；1.0μlのポリヌクレオチドキナーゼ、および1.8μlのdH₂Oとを混合することにより標識される。反応混合物をピペッティングにより混合し、そして37℃で１時間インキュベートする。反応を70℃で10分間インキュベートすることにより停止させ、次いで素早く遠心分離し、そして氷冷する。次いで90μlのdH₂Oを加え、続いて100μlのフェノール／クロロホルム(1:1)を添加する。混合物を充分に混合し、10分間遠心分離し、次いで水相を新たなチューブに移す。次いで、10μlの３Ｍ酢酸ナトリウム、１μｌの10mg/ml tRNA、および400μlの100％エタノールを添加し、そして10 分間氷上に置くことにより、標識されたプライマーを沈澱させた。次いで、混合物を室温で30分間遠心分離する。ペレットを80％エタノールで洗浄し、５秒間遠心分離し、そして乾燥する。このペレットを４μl のdH₂O、0.5μlの10×TAQ緩衝液、および0.5μlのTAQ酵素と共に再懸濁する。次いで、５μlの標識された連立プライマーを上記PCR混合物の鉱油下の水相に添加し、そして95℃まで２分間加熱し、（標識されたプライマーの）Ｔ_m＋２℃ まで２分間冷却し、そして72℃まで1０分間加温することにより、追加のPCRサイクルを行う。次いで、水相の50μlを新たなチューブに取り、50μlのdH₂O、100μlのフェノール／クロロホルムを添加し、よく混合し、そして10分間遠心分離する。水相を新たなチューブ内に回収する。スピンカラムを用いて、組み込まれなかったプライマーを除去する。４．ハイブリダイゼーション架橋オリゴヌクレオチドを含有する膜を、ピンセットで膜の一端を挟みそして膜をゆっくりと浸すことにより、15mlのRAPID HYB緩衝液(Amersham，Arlington Heights，IL)中で濡らす。次いで、密閉式保存袋(Seal-a-Meal bag)に移すことによりこの膜をプレハイブリダイズし、濡らす工程からの15mlのRAPID HYB緩衝液を添加し、そして袋を密封する。次いで、これを68℃の振とう水浴に１時間浸ける。標識されたcDNA（15,000,000cpm）を１ml(1)RAPID HYB中に希釈し、そして10 分間沸騰させ、次いで氷上で急冷する。プレハイブリダイゼーションの後、RAPID HYBを除去し、そして65℃まで予め加熱した14mlの新鮮なRAPID HYBと取り替える。次いで、標識されたcDNAを袋に加え、そして端部を再度密閉する。次いで、袋を68℃の振とう水浴に１晩浸ける。ハイブリダイゼーションの後、膜を袋から取り出し、そして低ストリンジェント緩衝液（２×SSC/0.1％SDS）を含むトレイに室温で20分間置く。次いで、膜を高ストリンジェント緩衝液（0.2×SSC/0.1％SDS；45℃まで予め加熱）に移し、そして30分間45℃で振とうする。次いで膜を高ストリンジェント洗浄液から取り出し、１片のWhatmanの3MMフィルター上に置き、そして−70℃で１晩、増感スクリーンと共にＸ線フィルムに曝す。現像後、オートラジオグラフをカットして96 ウェルマイクロタイタープレートホルダーにあわせ、そして放射性ドットがホルダーの穴に合うようにテープでとめる。次いで、定量のために、オートラジオグラフを600nmで読みとる。次いで、上記２つのアッセイのうちのいずれの結果も、上記プロモーターおよび公知の毒素を用いて調製された標準のデータベースと比較する。Ｘに関する結果と公知の化合物との相関をとることにより、毒性プロフィールが作成され得る。例えば、Ｘが同程度の濃度でTCDDと同一のストレス遺伝子を誘導するならば、このことは、ＸがTCDDと同程度の濃度で全ての動物に対して毒性であることを示す。実施例３ストレスプロモーター−CAT融合の構築 XHFプロモーター−CAT融合を以下のように調製した。報告されたXHF（コラゲナーゼ）プロモーターの配列[P．Angelら、Mol．Cell Biol.，7，pp.2256-66(19 87)]に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドを合成した。片方は、転写開始部位プライマーから上流の位置-520〜-501に対応していた。他方は、転写開始部位から下流の位置+53〜+73に対応していた。これらのオリゴヌクレオチドを、Operon Technologies(Alameda，CA)により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを最終濃度500ピコモル/mlで水に溶解した。 XHFプロモーター増幅のために、0.1μgのRaji（ヒトゲノムライブラリー）ゲノムDNA、それぞれ20ピコモルの上記２種のプライマー、５μlの10×緩衝液（50 0mMのKCl、100mMのトリス-HCl、pH 8.3、15mMのMgCl₂、0.1％のゼラチン）、それぞれ５μlの2.0mM dNTP、および１単位のAMPLITAQ（Taqポリメラーゼ）(Perki n-Elmer，Norwalk,CT)を混合した。水を添加して全容量を50μlとし、そしてPCR を行った。 PCR反応を94℃で２時間行い、次いで、30サイクルで：56℃で10秒；71℃で30 秒および94℃で10秒行った。混合物を56℃ で1.5分、次いで71℃で４分間インキュベートすることにより、PCR反応を完了させた。次いで、反応生成物を1.0％アガロースゲル上で電気泳動し、増幅された配列をゲルから取り出し、そして精製した。次いで、単離されたフラグメントをキナーゼ処理し、そしてB．Luckowら、Nucl．Acids Res.，15，p.5490（1987）（この開示を本明細書中に参考として援用する）に記載されるpBLCAT3ベクター内に平滑末端連結した。他のストレスプロモーター−CAT融合は、PCRのための適切なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための種々のストレス遺伝子プロモーター領域の、上記引用され報告された任意のヌクレオチド配列を用いても同様に調製され得る。以下のストレスプロモーターを用いるCAT融合物が、本発明のキットおよび方法に使用するために調製された：実施例４応答要素−CAT融合の構築以下のように、生体異物応答要素XRE-CAT融合物を構築した。まず、独立請負業者(Operon Technologies，Inc.，Alameda,CA)にXREの両鎖に対応するオリゴヌクレオチドを合成させた。XREの配列は、M．Denisonら、J．Biol．Chem.，263， pp.17221-24(1988)に記載されている。オリゴヌクレオチドを突出したBamHI適合性末端を用いて合成した。オリゴヌクレオチドを500ピコモル/mlの最終濃度で水に溶解した。次いで、500mMのNaCl、50mMのトリス-HCl、pH 7.8、１mMのEDTAを含有する溶液中に各オリゴヌクレオチド50μgを共に混合し、５分間沸騰させた。次いで、溶液を68℃で１晩インキュベートし、鎖を相互にアニールさせた。次いで、２重鎖になったオリゴを、12％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてバンドを取り出し、DNAを電気溶出させることにより精製した。次いで、精製された応答要素をキナーゼ処理し、そしてtk最小プロモーターのすぐ上流のpBLCAT2のBamHI部位にクローニングした（M.Denisonら、J．Biol．Ch em. 263，pp.17221-24(1988)）。他の応答要素−CAT融合物は、PCRのための適切なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための種々の応答要素の、上記引用され報告された任意のヌクレオチド配列を用いても同様に調製され得る。本発明のキットおよび方法に使用するために、以下の応答要素を用いるCAT融合物を調製した：XRE、NFkB、CRE、p53RE 、およびRARE。実施例５ストレスプロモーター−CAT融合物を用いる、毒素のアッセイ上記実施例３および４に記載の14種の形質転換鎖の各々の約５×10⁴細胞を別々に、２個の96ウェルプレートの１方の横１列(a row)の12ウェル内にプレートした。細胞生存度を測定するために、形質転換していないヒト肝細胞ラインを第２のプレートの最後列のウェル内にプレートした。90％の集密度に達するまで、細胞を10％完全最小必須培地（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）中で37℃、５％CO₂にて増殖させた。５または６つの異なる濃度の、以下の表３に示す種々の化学物質を適切な溶媒に溶解して３回繰り返し試験した。次々と希釈することにより、異なる濃度を作製した。TCDDについては、ます、96 ウェルプレートの縦列(column)３〜10の各ウェルから20μlの培地、および縦列1 1および12から10μl の培地を除去した。試験化学物質の200μM溶液10μlを、縦列11および12の各ウェルに入れた。それらのウェル内の液体を、各横列(row)に対して別々のピペットチップを用いるマルチチャンネルピペットマンを用いてよく混合し、次いで、 20μlを、縦列12のウェルから縦列10に移した。縦列10の液体を混合し、次いで2 0μlを縦列８に移し、そして縦列４までの偶数番号の縦列に対してこの手順を繰り返した。縦列11に始まり縦列３に終わる奇数番号の縦列について、同じ手順を行った。縦列１および２の各横列は、未処理のコントロールを表す。次いで、プレートを37℃、５％CO₂で１晩インキュベートした。インキュベーションの終わりに、第２のプレートの細胞生存度横列以外の全てのウェルから、培地を静かに吸引した。その最後横列以外の全ての細胞を、200 μlのリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した。洗浄後、100μlの細胞溶解緩衝液（５m M Mops、2.5mM NaCl、0.38mM MgCl₂、0.25％TritonX-100、NaOHを用いてpHを6.5 にする）を各ウェルに添加し、30分間室温でインキュベートした。次いで、縦列 12の溶解産物100μlを縦列11に、縦列10を縦列９に、というように移すことにより、溶解産物を倍濃度の化学物質を含むウェルで配合した。以下のように、各ウェルの全タンパク質をアッセイした。２個の新たな96ウェルのプレートにおいて、190μlの１×タンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad Labora tories，Hercules,CA）を縦列１〜７の各ウェルに添加した。毒素試験プレートの縦列１のウェルの細胞溶解産物l0μlをタンパク質アッセイプレートの縦列２に、毒素試験プレートの縦列３からタンパク質アッセイブレートの縦列３に、毒素試験プレートの縦列５からタンパク質アッセイプレートの縦列４に、というように移した。次いで、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、各ウェルの吸光度をOD₆₀₀で読みとった。 CAT ELISAキット（5 Prime-3 Prime Inc.，Boulder，CO）を用いそして製造者の指示に従って、CATアッセイを行った。CAT活性の測定のために、毒素試験プレートの各細胞溶解産物190μlを用いた。CATアッセイを室温で３時間半進行させた。ビオチン化抗CAT抗体、次いでストレプトアビジン結合アルカリホスファダーゼ、および最後に比色基質であるp-ニトロフェニルホスフェートを用いることにより、CAT活性を測定した。発色をOD₄₀₅で測定した。以下の式を用いて誘導倍数（fold-induction）を計算した： OD₄₀₅（試験サンプル）／OD₆₀₀（試験サンプル） OD₄₀₅（コントロール）／OD₆₀₀（コントロール）これらの実験の結果をそれぞれ、視覚的に図１〜11に示す。実施例６抗毒素の同定１種またはそれ以上の哺乳類ストレスプロモーターの誘導に基づいて未知の化合物が毒素であることを見出した後、可能な抗毒素を同定するために同じ手順が用いられ得る。本明細書中に記載のいずれのアッセイにおいても、未知の化合物はHMOプロモーターおよびGADD153プロモーターを誘導することが例証される。このことは、その化合物が酸化ストレスおよびDNA損傷を引き起こしていることを示す。１つの可能性は、その化合物が、DNA鎖が破壊されるに充分高い濃度で過酸化水素の形成を引き起こしているということである。アスコルビン酸は、過酸化水素誘導 DNA鎖破壊の回数を減少させることが知られており、従ってこの未知の化合物に対する可能な抗毒素である。実施例２に記載のように、HepG2細胞を増殖させる。次いで、種々の希釈アスコルビン酸を用いて、この細胞を30分間インキュベートする。次いで、これらの細胞を、HMOおよびGADD153プロモーターを誘導するのに最適であるように予め決定された濃度の未知化合物に曝す。次いで、実施例２に記載のように、プロモーター誘導（およびそれに伴うストレス遺伝子発現）についてのアッセイを行う。アスコルビン酸処理した細胞がコントロール細胞より低いレベルのHMOまたはGAD D153 mRNA転写物を生産する場合、それは抗毒素であると考えられる。以上、多数の本発明の実施態様について述べたが、本発明の診断用キット、方法、および産物を利用する他の実施態様を提供するために、基本的な構築が変更され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、以上の実施例により示された特定の実施態様ではなく、添付の請求の範囲により定義されるものと認められる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１月２１日【補正内容】動物試験は、動物が受ける厳しい受難のため動物保護活動家および一般の人々から批判を受けるようになった。さらに、最近の証拠は、動物試験の正確さに疑問を差しはさんでいる。例えば、変動因子（例えば動物の規定飼料）は、癌原性の性質を決定する動物試験の予測可能性を損なう（P．H．Abelson、"Diet and C ancer in Humans and Rodents"、Science、255、p.141(1992)。そして、モルモット試験に基づいたダイオキシンの毒性に関する以前の測定が、現在再評価されている（B．J．Culliton、"US Government Orders New Look At Dioxin"、Natur e 、352、p．753(1991)；Ｌ．Roberts、”More pieces in the Dioxin puzzle"、Research News 、October、1991、p.377）。従って、迅速、低価格、および信頼性のある動物毒性試験の代替物を緊急に必要とするということは明らかである。いくつかの短期代替試験を利用し得る。例えば、エームスアッセイは、Salmon ella typhimuriumの変異株の遺伝的復帰を引き起こす癌原性物質を検出する。しかし、このエームスアッセイでは、非変異原性癌原性物質または非癌原性毒物のいずれも検出できない。米国特許第4,997,757号に記載の酵母の癌原性物質アッセイ系は、エームスアッセイのいくつかの欠点を克服しているが、なお非癌原性毒物を検出し得ない。これら両アッセイは、DNAレベルのみで改変および変異を検出するために設計されている。従って、これら先行技術試験は、タンパク質または脂質膜への直接損傷だけでなくDNA合成のインヒビターも検出し得ない。さらに、これらの先行技術試験は、突然変異原または毒物がどのようにその影響を奏するかについての情報を提供し得ない。 WO 90/10710は、レポーター遺伝子に融合したTNF、IL-1αまたはIL-1βを用いて、細菌性の発熱物質を検出することを記載している。しかし、開示されるアッセイは、それが特定のストレス（細菌性発熱物質）のみを検出することに制限され、この発熱物質がどのようにその毒性効果を奏するかについての定量的な情報は提供していない。出願人による1992年7月6日に出願された同時係属中の米国特許出願番号第910, 793号は、その開示を本明細書中で参考として援用するが、細菌のストレスプロモーターに融合したレポーター遺伝子を用いて、化合物の毒性を同定、および特徴付けることを記載する。このアッセイは、タンパク質または脂質膜への損傷およびDNA合成の阻害を検出し得る。従って、このアッセイは、非癌原性毒物の同定のために提供される。残念ながら、細菌毒性と哺乳動物および他の高等頁核生物に対する毒性との間の相関には一定の制限があり、高等動物における毒性の正確な測定ではあり得ない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ファー，スペンサービー. アメリカ合衆国コロラド 80304，ロングモント，セイジバレーロード 9823 (72)発明者トッド，マークディー. アメリカ合衆国コロラド 80021，ウエストミンスター，ウエスト 100ティーエイチプレイス 9280

Claims

【特許請求の範囲】１．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)以下により特徴付けられる真核細胞： (i)酸化還元ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーター； (ii)DNAストレスに応答する少なくとも１つのプロモーター； (iii)タンパク質ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーター；および (iv)エネルギー／イオンストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターであって、該プロモーターの各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも４つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。２．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)酸化還元ストレスに応答する少なくとも４つの異なるプロモーターを含む真核細胞であって、該プロモーターの各々は、検出可能な異なる産物をコードする遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも４つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。３．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)DNAストレスに応答する少なくとも４つの異なるプロモーターを含む真核細胞であって、該プロモーターの各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも４つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。４．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)タンパク質ストレスに応答する少なくとも４つの異なるプロモーターを含む真核細胞であって、該プロモーターの各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも４つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。５．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)エネルギー／イオンストレスに応答する少なくとも４つの異なるプロモーターを含む真核細胞であって、該プロモーターの各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも４つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。６．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)細胞表面レセプターストレスに応答する少なくとも３つの異なるプロモーターを含む哺乳類細胞であって、該プロモーターの各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している；および (ｂ)少なくとも３つの異なる核酸配列であって、該核酸配列の各々は、該プロモーターに作動可能に連結している遺伝子のうちの異なる１つのmRNA転写物とハイブリダイズし得るか、または該mRNA転写物から調製される１本鎖cDNAとハイブリダイズし得る。７．請求項１に記載の診断用キットであって、前記真核細胞が、細胞表面レセプター介在ストレスに応答するプロモーターをさらに含む哺乳類細胞であり、該プロモーターが、検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結しており、該細胞表面レセプター介在プロモーターに作動可能に連結している該遺伝子の mRNA転写物、または前記各遺伝子のmRNA転写物から逆転写される１本鎖cDNAのいずれかとハイブリダイズし得る少なくとも１つの核酸配列をさらに備える、キット。８．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、以下を備える、キット： (ａ)酸化還元ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｂ)DNAストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｃ)タンパク質ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞；および (ｄ)エネルギー／イオンストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞；ここで、該プロモーターまたは応答要素の各々は、検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している。９．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、少なくとも４つの異なる真核細胞を備え、その各々が、酸化還元ストレスに応答し、かつ検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している異なるプロモーターまたは応答要素を宿す、キット。１０．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、少なくとも４つの異なる真核細胞を備え、その各々が、DNAストレスに応答し、かつ検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している異なるプロモーターまたは応答要素を宿す、キット。１１．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、少なくとも４つの異なる真核細胞を備え、その各々が、タンパク質ストレスに応答し、かつ検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している異なるプロモーターまたは応答要素を宿す、キット。１２．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、少なくとも４つの異なる真核細胞を備え、その各々が、エネルギー／イオンストレスに応答し、かつ検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している異なるプロモーターまたは応答要素を宿す、キット。１３．毒性化合物を同定しそして特徴付けるための診断用キットであって、少なくとも３つの異なる真核細胞を備え、その各々が、細胞表面レセプター介在ストレスに応答し、かつ検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している異なるプロモーターまたは応答要素を宿す、キット。１４．細胞表面レセプター介在ストレスに応答するプロモーターを宿す哺乳類細胞をさらに備え、該プロモーターが、検出可能な産物をコードする異種遺伝子に作動可能に連結している、請求項８に記載の診断用キット。１５．前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１から５または８から１２のいずれかに記載の診断用キット。１６．前記哺乳類細胞がHepG2細胞である、請求項１５に記載の診断用キット。１７．前記哺乳類細胞が、皮膚または目に由来する細胞である、請求項６から７または１３から１４のいずれかに記載の診断用キット。１８．酸化還元ストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項１、２、７、８、９、または１４のいずれかに記載の診断用キット。１９．DNAストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項１、３、７、８、１０、または１４のいずれかに記載の診断用キット。２０．タンパク質ストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項１、４、７、８、１１、または１４のいずれかに記載の診断用キット。２１．エネルギー／イオンストレスに応答する前記プロモーターが、から選択される、請求項１、５、７、８、１２、または１４のいずれかに記載の診断用キット。２２．細胞表面レセプター介在ストレスに応答する前記プロモーターが、から選択される、請求項６、７、１３、または１４のいずれかに記載の診断用キット。２３．前記プロモーターがALDH1、CYP1A1、FOS、GADD153、HMO、HSP70、JUN、およびMTIIAを包含し；そして前記真核細胞がHepG2細胞である、請求項１に記載の診断用キット。２４．前記プロモーターまたは応答要素が、CYP1A1、GSTYa、GADD45、FOS、XH F、HSP70、MT IIA、GADD153、CRE、XRE、NFkBRE、RARE、およびp53REを包含し；そして前記真核細胞がHepG2細胞である、請求項８に記載の診断用キット。２５．検出可能な産物をコードする前記遺伝子が、CAT遺伝子である、請求項２４に記載の診断用キット。２６．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)酸化還元ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を含む真核細胞； (ii)DNAストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を含む真核細胞； (iii)タンパク質ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を含む真核細胞；および (iv)エネルギー／イオンストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を含む真核細胞；ここで、該プロモーターまたは応答要素の各々は、検出可能な産物をコードする異なる遺伝子に作動可能に連結している； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程；および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。２７．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第１の酸化還元ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２の酸化還元ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第３の酸化還元ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iv)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第４の酸化還元ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程；および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。２８．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第１のDNAストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２のDNA ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第３のDNAストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iv)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第４のDNA ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程；および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。２９．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第１のタンパク質ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２のタンパク質ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第３のタンパク質ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (iv)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第４のタンパク質ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程：および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。３０．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第１のエネルギー／イオンストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２のエネルギー／イオンストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第３のエネルギー／イオンストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第４のエネルギー／イオンストレスプロモーターまたは応答要素を宿す真核細胞； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程；および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。３１．以下の工程を包含する、化合物の毒性を決定する方法： (ａ)以下を培養する工程： (i)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第１の細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す哺乳類細胞； (ii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第２の細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す哺乳類細胞； (iii)検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可能に連結した第３の細胞表面レセプター介在ストレスプロモーターまたは応答要素を宿す哺乳類細胞； (ｂ)該細胞を該化合物に曝す工程；および (ｃ)該遺伝子の各々の産物を検出する工程。３２．細胞表面レセプター介在ストレスに応答する少なくとも１つのプロモーターまたは応答要素を含む哺乳類細胞を培養するさらなる工程を包含する、請求項２６に記載の方法。３３．請求項２６から３２のいずれかに記載の方法であって、ここで： (ａ)前記プロモーターまたは応答要素の各々は、検出可能な産物をコードする同じ遺伝子に作動可能に連結しており、該遺伝子は、該プロモーターまたは応答要素の各々と異種である；そして (ｂ)前記細胞の各々は、該遺伝子に作動可能に連結した異なるプロモーターまたは応答要素を宿し、そして前記化合物に曝す前に別に培養される。３４．前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２６から３０のいずれかに記載の方法。３５．前記哺乳類細胞が、皮膚または目に由来する、請求項３１または３２に記載の方法。３６．前記細胞が哺乳類細胞である、請求項３３に記載の方法。３７．前記哺乳類細胞がHepG2である、請求項３４に記載の方法。３８．酸化還元ストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項２６、２８、または３２のいずれかに記載の方法。３９．DNAストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項２６、２９、または３２のいずれかに記載の方法。４０．タンパク質ストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項２６、３０、または３２のいずれかに記載の方法。４１．エネルギー／イオンストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項２６、３１、または３２のいずれかに記載の方法。４２．細胞表面レセプター介在ストレスに応答する前記プロモーターまたは応答要素が、から選択される、請求項２６、２７、または３２のいずれかに記載の方法。４３．前記遺伝子産物の検出が、以下の工程を包含する、請求項２６に記載の方法： (ａ)前記曝した培養物からmRNAを単離する工程； (ｂ)ストレスプロモーターまたは応答要素に作動可能に連結している前記遺伝子の各々から転写されるmRNAを定量する工程。４４．検出可能な産物をコードする前記遺伝子が、CAT遺伝子である、請求項３６に記載の方法。４５．前記細胞を前記化合物に曝す前に、前記化合物をS9肝臓抽出物と共にインキュベートするさらなる工程を包含する、請求項２６から３０、または３２のいずれかに記載の方法。４６．請求項４４に記載の方法であって、ここで：前記プロモーターまたは応答要素は、CYP1A1、GST Ya、GADD45、FOS、XHF、HSP7 0、MT IIA、GADD153、CRE、XRE、NFkBRE、RARE、およびp53REを包含し；そして前記哺乳類細胞はHepG2細胞である、方法。４７．以下の工程を包含する、新しい毒性化合物に対する抗毒素を同定する方法： (ａ)該新しい毒性化合物により引き起こされるストレスのタイプを、請求項２６から４６のいずれかに記載の方法により決定する工程； (ｂ)請求項２６から４６のいずれかに記載の方法において、該毒性化合物により引き起こされるストレスと同様のストレスを引き起こす公知の毒性化合物を同定する工程；および (ｃ)工程(ａ)に従って、該新しい毒性化合物により引き起こされるストレスのタイプを決定するために使用した方法を繰り返す工程、および、該方法で用いた真核細胞を、工程(ｂ)で同定した該公知の毒性化合物に対する抗毒素で処理するさらなる工程。４８．以下の工程を包含する、薬物の毒性を低下する方法： (ａ)請求項２６から４６のいずれかに記載の方法を使用して、該薬物により引き起こされるストレスのタイプを決定する工程；および (ｂ)該薬物を改変し、該決定されたストレスを引き起こすことが推測されるその部分を変化させるか、または除去する工程。４９．請求項４８に記載の方法であって、工程(ｂ)の後に、以下のさらなる工程をさらに包含する、方法： (ｃ)工程(ａ)に従って前記薬物により引き起こされるストレスのタイプを決定するのに使用した方法を、工程(ｂ)の改変された薬物を用いて繰り返す工程。５０．請求項４９または５０に記載の方法により製造される改変された薬物。