JPH09503393A - 二本鎖ｄｎａの核酸類似体による誘導転写 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡと転写開始部位を形成することができるＰＮＡ型の１個又は２個以上のオリゴ核酸類似体を所望の転写開始部位で鋳型とハイブリダイズさせて複合体を形成させ、そしてこの複合体をヌクレオシド三リン酸の存在下にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用に付することにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡが転写される。転写開始部位の下流にブロックを置くことにより又はかかる選択された位置で鋳型を切断することにより、等しい長さの転写物を得ることができる。この開始部位は、ＤＮＡの一本鎖のＰＮＡハイブリダイゼーションによる置換により形成される。

Description

【発明の詳細な説明】二本鎖ＤＮＡの核酸類似体による誘導転写 本発明は二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写開始のための部位を作成すること、そ れによるＲＮＡ転写物の生産、そのような転写物の増幅及び／又は検出及びこれ らに基づくインビトロ診断技法を目的とする、天然に生ずる核酸の類似体の使用 に関する。 ＷＯ９２／２０７０３（ＰＮＡ’ｓ）に記載された核酸塩基のようなペンダン ドリガンドを持つペプチド又は類似のバックボーンを有する核酸の類似体類は幾 つかの異常な性質をもっている。これらには、一方のＤＮＡ鎖に配列が相補的な ＰＮＡの二本鎖が他方のＤＮＡ鎖と置き換わってＤＮＡとハイブリダイズして二 本鎖ＤＮＡと複合体を形成する能力が含まれる。配列特異性は高レベルにあるこ とが示された。 対応する配列のＲＮＡ鎖を形成するＤＮＡの転写は、自然界ではＲＮＡポリメ ラーゼによる又は補助転写因子による二本鎖ＤＮＡプロモーター領域の配列特異 的認識によって開始される。続いて、転写開始可能な複合体が形成される。この 複合体は、合成されるＲＮＡ鎖と対となる塩基に対する鋳型鎖の塩基が露出する ようにＤＮＡヘリックスの約１２個の塩基対が溶解している。大腸菌ポリメラー ゼやファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖と一本鎖ＤＮＡ のＤループとを含む合成された“ＲＮＡ／ＤＮＡバブル二本鎖”を転写開始の目 的に利用することができる。 われわれはここに、開始がＰＮＡと二本鎖ＤＮＡの間に形 成される一本鎖置換複合体から同様に開始することができることを発見した。こ れは、二本鎖鋳型から一本鎖転写物を調製する容易かつ単純な方法を入手すると いう期待を提供する。 一般的に、ＤＮＡ配列を同定する技法は一本鎖型のＤＮＡの作成に依存する。 いったん一本鎖となれば、ＤＮＡは相補的配列のプローブにハイブリダイズする ことができ、そしてこのようなハイブリダイゼーションは種々の方法で検出する ことができる。二本鎖鋳型ＤＮＡからのＲＮＡの転写は、検出用の一本鎖産物を 取得する方法の別法を提供し、そしてこの方法は元のＤＮＡの変性処理と異なり 、検出プロセスで競合し得る相補的な一本鎖の同等量の存在を回避する。 さらに、ＲＮＡ転写物の作成は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することなく、 そして３ＳＲ増幅技法に通常伴う困難の多くを避けて元のＤＮＡ配列の増幅のた めの路を拓くものである。３ＳＲでは、出発ＲＮＡを、まずそれをＴ７ポリメラ ーゼプロモーター配列を含むように構築されたＤＮＡプライマーにハイブリダイ ズさせることにより増幅する。プライマーＤＮＡ／鋳型ＲＮＡを逆転写酵素によ りそのＤＮＡ鎖中で伸長し、このＲＮＡ鎖をＲＮアーゼＨで消化し、生ずる一本 鎖ＤＮＡ転写物を逆転写酵素で二本鎖としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写 のための鋳型を提供し、多数のＲＮＡコピーを作成する。このプロセスはＴ７プ ロモーター配列の下流の正確な配列を持つＤＮＡプライマーの構築に左右される 。それはさらに目的の核酸配列をＲＮＡの形で取得すること に依存する。 しかしながら、本発明によれば、二本鎖ＤＮＡの形で得られる目的の核酸配列 は、核酸類似体のプライマーすなわち多重プライマー配列を合成することにより 多重一本鎖ＲＮＡコピーとして増幅され得る。これは、先行技術法よりも一般的 にはるかに直接的な方法である。産生されたＲＮＡ転写物は必要であればＤＮＡ に変換することができる。 従って、本発明は二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する方法であって、所望 の転写開始部位で該ＤＮＡと転写開始部位を形成することができる１又は２個以 上のオリゴ核酸類似体を該鋳型にハイブリダイズさせることにより複合体を形成 させ、そして該複合体をヌクレオシド三リン酸の存在下にＤＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼの作用に付することを含んでなる方法を提供する。 また、１対の該オリゴ核酸類似体は、該ＤＮＡにその同一又は異なる鎖上の隔 てられた位置でハイブリダイズさせられる。 該オリゴ核酸の対は、好ましくは該ＤＮＡの０〜１０塩基対、さらに好ましく は０〜５塩基対だけ隔てられる。 該オリゴ核酸類似体又はそのそれぞれはまた、５〜６０核酸類似体単位の長さ を有することが好ましい。 該所望の開始部位の下流の位置に転写に対するブロックを置き該転写の転写物 の長さを等しくすることもできる。該ブロックを作成する方法としては、転写を ブロックすることができるオリゴ核酸類似体を該ＤＮＡにハイブリダイズさせる 方法が適当である。そうしなければ、個々の転写事象は開始部位の下流で不規則 に終了し、長さのさまざまな長い転写産物を生成する。 転写物の長さは、転写前に特定の下流位置で制限酵素によりＤＮＡ鋳型を切断 することによっても制御することができる。 転写開始部位を形成することができる核酸類似体は、アミノエチルグリシンバ ックボーン又はポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミド及びポリス ルホンアミドなどの他の同様なバックボーンに付着した核酸塩基を有する化合物 、すなわちわれわれがペプチド核酸すなわちＰＮＡと呼ぶ化合物であることが好 ましい。この種の化合物はＲＮＡとＤＮＡの両者に驚くべき程強くそして配列特 異的に結合する。 このタイプの化合物の合成はＷＯ９２／２０７０３に詳細に記載されている。 ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのＰＮＡによる認識は少なくとも５塩基長 の配列において生じ得る。より好ましい認識配列長は５〜６０塩基対長である。 １０塩基と２０塩基の間の配列は特に興味がある。なぜならこれは原核生物及び 真核生物のユニークＤＮＡ配列が見出される範囲であるからである。１７〜１８ 塩基配列は、ヒトゲノムのユニーク配列の長さであるから特に興味深い。 使用される核酸類似体は、核酸の相補的配列にハイブリダイズし、該類似体と 該核酸の配列に相当する通常のデオキシリボ核酸間のハイブリッドよりも熱変性 に対してより安定な ハイブリッドを形成し得ることが好ましい。 また、使用される核酸類似体又はそのいずれも、該バックボーンがポリアミド バックボーンであり、該リガンドがそれぞれ該バックボーンのアザ窒素原子に直 接又は間接に結合しており、そして窒素原子を持つ該リガンドが主として該バッ クボーンの中で４〜８個の介入原子だけ相互に隔てられている、ペプチド核酸で あることが好ましい。 また、使用される核酸類似体は、一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有して おりそのため該類似体が他方の鎖を該一方の鎖から置き換えることができる二本 鎖核酸にハイブリダイズすることができることが好ましい。 さらに、本発明の使用に好適なＰＮＡ化合物は下記式を有する、 式中、ｎは少なくとも２であり、Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（ Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基 類、芳香族部分、ＤＮＡインターカーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分 、及びレポーターリガンド類からなる群より選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿはそれぞれ（ＣＲ⁶Ｒ⁷−）ｙであり（好ましくはＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨＲ⁶Ｃ ＨＲ⁷又はＣＲ⁶Ｒ⁷ＣＨ₂）、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生ずるαアミ ノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶とＲ⁷は独立に水素 、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、水 酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチオ基、ＮＲ³Ｒ⁴及び ＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴は以下に定義され 、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、又はアルキル チオ置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一緒になって脂環系又 は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z（好ましくはＣＲ⁶Ｒ⁷、ＣＨ₂ＣＲ⁶Ｒ⁷、又 はＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷）であり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定義される、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は少なくとも２ であり、好ましくは２より大きく１０以下、例えば３であり、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³Ｃ⁵−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は−Ｎ Ｒ³ＳＯ₂−でありいずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義される、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ²〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に水素、水酸基−，アルコキシ基−，又はアルキルチオ 基−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、 アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、 そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基−，アルコ キシ基−，アルキルチオ基−置換さ れた（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基及びアミ ノ基からなる群から選択されるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体、 及び Ｉは−ＮＲ''' Ｒ''''又は−ＮＲ''' Ｃ（Ｏ）Ｒ''''であり、ここでＲ’、Ｒ'' 、Ｒ''' 及びＲ''''は独立に水素、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリガ ンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物、 リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌ クレオチド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチ ドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性及び不溶 性ポリマーからなる群より選択されるものである。“オリゴヌクレオシド類”は リボースに結合した核酸塩基を含みそして核酸の通常のリン酸塩バックボーン以 外のバックボーンを介して連結される。 Ｒ’、Ｒ''、Ｒ''' 及びＲ''''がオリゴヌクレオチド類又はオリゴヌクレオシ ド類である上の構造においては、このような構造はＰＮＡ化合物とオリゴヌクレ オチド又はオリゴヌクレオシドとのキメラ構造であると考えることができる。 一般的に、Ｌ¹〜Ｌⁿの少なくとも一つは、天然に生ずる核酸塩基、天然に生じ ない核酸塩基、ＤＮＡインターカーレ ーター、又は核酸塩基結合基である。 ＰＮＡを含む化合物は式III 、IV、又はＶの化合物であることが好ましい、 式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基 、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 ｋ、１及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そしてＲ¹はＨ又はＣＯＣＨ₃ である。 本発明は上記のような本発明の方法を用いてＲＮＡを生産するために転写を行 い、そして該ＲＮＡの産生を検出することを含んでなる診断方法を包含する。こ のような方法は、用いられた１個又は２個以上のＰＮＡの配列にマッチする配列 を持つ試料中のＤＮＡの存在又は不存在のテストに用いることができる。 該ＲＮＡは、相補的配列の核酸プローブに捕捉されそして検出可能標識を持つ 核酸プローブにも結合するものが適当である。 本発明は、上記の方法によりそしてＤＮＡ鋳型分子のそれぞれから多重ＲＮＡ 転写物コピーを生産する方法によりＤＮＡからＲＮＡ転写物を調製することを含 む核酸増幅法を包含する。 所望であれば、本発明により転写されたＲＮＡをさらに３ ＳＲ技法を用いて増幅することができる。 本発明のさらなる主題は（出発物質である）核酸をＲＮＡ転写用の基質に変換 する方法であって、特定結合配列を取り込んでいる該核酸の対鎖を作成し、該核 酸をその特定結合配列に相補的な核酸類似体、好ましくはペプチド核酸とハイブ リダイズさせ、そして新たに創出されたプロモーター部位の制御下に転写に適し た条件のもとでこの混合物を処理することを含む方法である。 特定の態様の一つ（図６を参照して記述）では、転写の対象となるＲＮＡを該 ＲＮＡの３’−末端領域で該ＲＮＡとハイブリダイズすることができる少なくと も１個の核酸配列Ｓ１を含むＤＮＡ−オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ る。この配列は少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは約２０ヌクレオチドの 長さを有すればよい。このオリゴヌクレオチドはそのＲＮＡのさらに３’側の位 置でそのＲＮＡにハイブリダイズすることができる付加的なヌクレオチド配列Ｓ ２を含むことが特に好ましい。この配列は１５ヌクレオチド長よりも長くてもよ いが、約４０ヌクレオチド長が好ましい。この好ましい態様においては、オリゴ ヌクレオチドの二つの配列は、プロモーター開始部位として用いられる核酸類似 体への特異的ハイブリダイゼーションに適応させた配列、すなわち特定結合配列 である第三の配列Ｓ３により相互に連結されている。従って、この第三の配列は ８ヌクレオチド長よりも長いことが好ましく、約１０ヌクレオチドが好ましい。 これらのヌクレオチドは核酸塩基としてピリミジン塩基のみ を含むことが好ましい。第三の配列はホモピリミジンストレッチよりなることが 特に好ましい。 オリゴヌクレオチドの第一及び第二配列に相当する出発物質であるＲＮＡの配 列は、第三の配列とほぼ同じ長さの配列だけ相互に隔てられているが、第三の配 列にハイブリダイズすることはできない。 特定結合配列（第三配列）の取込みのために、オリゴヌクレオチドを核酸にハ イブリダイズさせ、そして出発物質であるＲＮＡを鋳型として用いて付加的なモ ノヌクレオチドにより伸長する。これは、当技術分野で既知の逆転写酵素反応に より行われる。これにより、特定結合配列に相補的な配列とハイブリダイズする ことができるストレッチを含む部分的な二本鎖核酸が得られる。次の段階で、こ のハイブリッドを該特定配列とハイブリダイズさせるため核酸類似体と接触させ る。ホモピリミジンストレッチの場合には、核酸類似体は対応するホモプリンス トレッチを含むことになる。 本発明によれば、この構築物は転写反応におけるＲＮＡ生産のためのＲＮＡポ リメラーゼの基質として作用する。この単純なハイブリダイゼーション及び伸長 反応は、殊にＮＡＳＢＡ又は３ＳＲのような増幅サイクルに付される必要がある ときは、ＲＮＡの簡単な取得法を提供する。 別の態様（図７を参照して記述）においては、一本鎖ＤＮＡを、特定ストレッ チを含む上述の二本鎖核酸を作成するために使用することができる。この態様に おいては、一本鎖ＤＮＡを参照する図１に記載するようにＤＮＡ−オリゴヌクレ オチドにハイブリダイズさせる。次いで、逆転写酵素又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポ リメラーゼを添加しＤＮＡをマトリックスとして用いこのオリゴヌクレオチドを 伸長する。変性した後に伸長産物に相補的なプライマーを添加しそして伸長して 最初の伸長産物に相補的な伸長産物を作成する。次いで、核酸類似体を添加し、 転写を開始させる。 本発明は以下の実施例及び添付の図面を参照してさらに説明する。 図１は実施例１で作成されたゲルのオートラジオグラフである。 図２は実施例２で作成されたゲルのオートラジオグラフである。 図３は実施例３で作成されたゲルのオートラジオグラフである。 図４は図５の実験で用いられた異なるＰＮＡプロモーターの構築を示すモデル の図である。 図５はＰＮＡプロモーターとｌａｃＵＶ５プロモーターの間の競合を示す実験 のオートラジオグラフである。 図６及び図７は本発明の好ましい態様に対するスキームを示す。実施例１ （１）一本鎖オリゴ−ＰＮＡによる、（２）トランス配置の二つのオリゴ−ＰＮ Ａによる、及び（３）シス配置の二つのオリゴ−ＰＮＡによる転写開始 ｐＴ９Ｃ、ｐＴ９ＣＴ９Ｃ（それぞれ配列Ｔ９Ｃ及びＴ９ ＣＴ９Ｃを含むｐＵＣ１９の誘導体）及びｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳ（Ｔ９ＣＡ９Ｇ配 列を含むブルースクリプトＫＳ＋誘導体）の３個のプラスミドの制限断片をＰｖ ｕII消化により単離し、ポリアクリルアミドゲルで精製して３３８塩基対（ｐＴ ９Ｃ）、３５４塩基対（ｐＴ９ＣＴ９Ｃ）及び４７７塩基対（ｐＴ９ＣＡ９ＧＫ Ｓ）の断片を得た。このＤＮＡ断片とＰＮＡを１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．０ 及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ中、総容量１５μｌ、３７℃で１時間インキュベート することによりＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を作成した。この反応混合物を、最終濃度 として４０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．９、１２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣ ｌ₂、９．１ｍＭのＤＴＴ、及び１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及び０．１ｍ ＭのＵＴＰ及び５μＣｉの³²Ｐ ＵＴＰを含むように調節した。使用したＰＮＡ はそれぞれの場合において、Ｔ９Ｃ−ｌｙｓＮＨ₂であった。 転写は１００ｎＭの大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ・ホロ酵素（ベーリンガー・マ ンハイム ＧｍｂＨ）の添加により開始された。混合物（総容量３０μｌ）を３ ７℃で２０分間インキュベートし、続いて転写により生じたＲＮＡをエタノール 沈澱により回収した。ＲＮＡ転写物を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分析 し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化して図１に示すゲルを作成した 。 図１の図式で示すように、使用した３個のプラスミドはそれぞれ、ＰＮＡ（モ ノ）に対する１個の結合部位、同一ＤＮＡ鎖（シス）上の１対の結合部位、及び 反対鎖のＤＮＡ（ト ランス）上の１対の結合部位を提供する。 ゲルのレーンは以下のようなさまざまな濃度のＰＮＡの効果を示す、 レーン１、６及び１１： ０Ｍ レーン２、７及び１２： ３ｎＭ レーン３、８及び１３： １０ｎＭ レーン４、９及び１４： ３μＭ レーン５、１０及び１５： １０μＭ レーンに使用されるプラスミドは以下のとおりである、 レーン１〜５： ｐＴ９Ｃ レーン６〜１０： ｐＴ９ＣＴ９Ｃ レーン７〜１５： ｐＴ９ＣＡ９Ｇ レーン５は、対応する図式に示す方向で転写がＰＮＡ結合部位から進行すると 予想されるサイズを持つ１個のＲＮＡ産物の生産を示す。 レーン１０は、同様にＲＮＡ転写物の生産を示すが、転写はシス配置の結合部 位に２個のオリゴＰＮＡが存在することによりより効率的にプロモートされるこ とを示す。 レーン１３〜１５は、転写が図式に示されるようにＤＮＡの二本鎖のそれぞれ の上で開始し、そしてそれぞれの結合部位からＤＮＡ断片の端まで進行すると考 えるとき予想されるサイズの２個の転写物の生産を示す。 これらのレーンでは転写物であるＲＮＡが見られ、ＲＮＡポリメラーゼと２０ 分間インキュベートする間にＤＮＡ鋳型分子当たり１〜５個のＲＮＡ分子が生産 されるものと計算さ れる。実施例２ さまざまな塩基配列の１個のＰＮＡオリゴマーによる転写開始 Ｔ９Ｃ、Ｔ９Ａ、及びＴ９Ｇの配列を含むプラスミドの制限断片を単離した。 実施例１に記載したように、対応する配列のＰＮＡオリゴマーを用いて、ＰＮＡ −ＤＮＡ複合体を作成し、これも実施例１に記載したように、大腸菌ポリメラー ゼを用いて転写を開始した。得られた転写物をオートラジオグラフィーにより可 視化し図２に示すオートラジオグラフを作成した。これは、塩基Ａ、Ｃ及びＧの いずれが存在しても転写が達成され得ることを証明する。レーン１、３及び５は 、ＰＮＡ不存在下で転写が行われた対照のレーンである。実施例３ Ｔ７及びＴ３ポリメラーゼを用いる１個のＰＮＡオリゴマーによる転写開始 プラスミドｐＴ９Ｃ由来の制限断片及び実施例１に記載したＰＮＡオリゴマー Ｔ９Ｃを用いて、一般的には実施例１に記載したように、ただしＴ３及びＴ７ポ リメラーゼを別々に使用して、転写を開始し、図３に示すオートラジオグラフを 得た。レーン１と２は、Ｔ７（レーン１）及びＴ３（レーン２）による転写の際 ＰＮＡの不存在下で行われた対照であり、レーン５と６はＴ７（レーン５）及び Ｔ３（レーン６）により媒介される転写に対するＰＮＡの存在の効果を示す。実施例４ 第一の転写開始部位の下流でハイブリダイズする第二のＰＮＡオリゴマーを用い る転写開始 実験は、ＰＮＡ−依存性転写開始の強さを評価するために行われた。これは、 強力なｌａｃＵＶ５大腸菌プロモーターと同一ＤＮＡ断片上の１個又は２個以上 のＰＮＡ標的の両者を用いて行われた。これらの構築物及び転写実験の結果を図 ４及び５に示す。ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流の鋳型鎖上の１個又は２個の ＰＮＡ Ｔ₁₀標的（図４Ａ及びＢ）を含む構築物を用いて、二つの新たな転写物 がＰＮＡ濃度を増すにつれ観察される。一方の転写物はＰＮＡ標的で開始される と考えられるが、他方はＵＶ５プロモーターから開始されそしてＰＮＡ部位で停 止すると考えられる。二つのＰＮＡ Ｔ４ＣＴ５標的を鋳型鎖上及び非鋳型鎖上 に有する構築物は、二つのＰＮＡループで開始されそして反対方向に進行すると 考えられる転写物のみを生産した。ＲＮＡバンドの強度はＰＮＡ濃度が高くなる と減少した。これは、すべてのＰＮＡ部位が全部占拠され、ＰＮＡループの下流 のＰＮＡに占拠された部位がこのループからの合成を停止させる（ａｒｒｅｓｔ ）結果である可能性が最も高い。より大きなループからの転写に対応するバンド の強度は小さなループからの転写のそれよりも顕著に強度が強い。このことは、 より大きなループからの転写がより効率的であることを示すものである。この相 違は、転写物のサイズの相違を考慮に入れると、オートラジオグラフから見られ るよりも遙かに大きい。 ハイブリダイゼーションの相対位置を図５に示す。配列の 左側はモデル中の５’から３’への上部鎖に対応するＰＮＡ標的を示す。ＰＮＡ 結合は太いバーで示す。転写の方向は指示されたＲＮＡ産物の近似的長さと共に 示してある。 一重の、二重の、又は三重のＰＮＡ結合部位をｌａｃＵＶ５プロモーターと共 に含む断片を、所望の量のＰＮＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。転 写反応は２０ｎＭの大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いたことを除き上記のように 実施した。 プラスミドｐＴ９Ｃ、ｐＴ９ＣＴ９Ｃ（ｐＵＣ１９誘導体）、ｐＴ９ＣＡ９Ｇ ＫＳ、ｐＴ１０ＫＳ、及びｐＡ１０ＫＳ（ブルースクリプトＫＳ＋誘導体）を文 献記載のように構築した（ニールセン(Nielsen，P.E.)、エグホルム（Egholm，M .）、ベルグ（Berg，R.H.）及びブチャード（Buchardt，O.）（１９９３）アン チ−キャンサー・ドラッグ・デス．８、５３−６３頁、ニールセン(Nielsen，P. E.)、エグホルム（Egholm，M.）、ベルグ(Berg，R.H.)及びブチャード（Buchard t，O.) （１９９３）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ２１、１９７−２００ 頁）。プラスミドｐＵＶ５をｌａｃＵＶ５プロモーター（−１５０〜＋９３位） を含む２０３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクローニン グすることにより構築した。ｐＴ９Ｃ−ＵＶ５はそれぞれ６ｂｐだけ隔てられて いる３個のＰＮＡ Ｔ₄ＣＴ₅を含む。ｐＡ１０ＵＶ５はｐＵＶ５のＢａｍＨＩ部 位（鋳型鎖上のＡ₁₀）にクローニングされた１個のＰＮＡ Ｔ₁₀標的を含むが、 ｐＡ１０Ａ１０ＵＶ５は、ｐＵＶ５のＢａｍＨＩ部位（ 両Ａ₁₀とも鋳型鎖上）にクローニングされた６ｂｐリンカーだけ隔てられた２個 のＴ₁₀ＰＮＡ標的を含む。このＰＮＡは文献記載のように合成された（エグホル ム（Egholm，M.）、ブチャード（Buchardt，O.）、ニールセン（Nielsen，P.E. ）及びベルグ（Berg，R.H.）（１９９２）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ ミカル・ソサイアティ、１１４、１８９５−１８９７頁、エグホルム（Egholm， M.）、ブチャード（Buchardt，O.）、ニールセン(Nielsen，P.E.)及びベルグ（B erg，R.H.）（１９９２）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイ アティ、１１４、９６７７−９６７８）。 これらのプラスミドの制限酵素断片をＰｖｕII消化により単離し、低温溶解性 アガロースゲル上で精製して３３８ｂｐ（ｐＴ９Ｃ）、３５４ｂｐ（ｐＴ９ＣＴ ９Ｃ）、４６１ｂｐ（ｐＡ１０ＫＳ及びｐＴ１０ＫＳ）、４７７ｂｐ（ｐＴ９Ｃ Ａ９ＧＫＳ）、３５４ｂｐ（ｐＡ１０ＵＶ５）、３７０ｂｐ（ｐＡ１０Ａ１０Ｕ Ｖ５）、又は３８６ｂｐ（ｐＴ９ＣＵＶ５）の断片を得た。 １個のＰＮＡＴ₁₀標的（ｐＡ１０ＵＶ５）（Ａ）、シス位の２個のＰＮＡＴ₁₀ 標的（ｐＡ１０Ａ１０ＵＶ５）（Ｂ）又は３個のＰＮＡＴ？？ＣＴ₄標的（１個 はトランスに、２個はシスに）（ｐＴ９ＣＵＶ５）（Ｃ）並びにｌａｃＵＶ５プ ロモーターを含む精製ＤＮＡ断片からのインビトロ転写において。ＰＮＡの濃度 は次のとおりである、レーン１は０ｎＭ、レーン２は１ｎＭ、レーン３は３ｎＭ 、レーン４は１０ｎ Ｍ、レーン５は３０ｎＭ、レーン６は０．１μＭ、レーン７は０．３μＭである 。すべての実験に７０ｎＭのＤＮＡが用いられた。ＵＶ５プロモーターとＰＮＡ プロモーターからの転写は転写停止と同様に矢印を付してある。 これらの実験は、第一開始部位（ＵＶ５）で開始した転写は第二部位で停止し 、一定の長さのＲＮＡを生産する。これに加えて、第二の部位は第二部位で開始 する転写のための開始因子(initiator)として作用する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９５年１０月１６日 【補正内容】 原文明細書第５頁の補正 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は少なくとも２ であり、好ましくは２より大きく１０以下、例えば３であり、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³Ｃ⁵−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は−Ｎ Ｒ³ＳＯ₂−でありいずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義される、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ²〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺ であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数 【手続補正書】 【提出日】１９９６年９月２４日 【補正内容】 (1) 明細書、第１６頁第７行目の「３μＭ」を「３０ｎＭ」に訂正する。 (2) 明細書、第１６頁第８行目の「１０μＭ」を「１００ｎＭ」に訂正する。 (3) 明細書、第１６頁第１０行目の「１〜５」を「６〜１０」に訂正する。 (4) 明細書、第１６頁第１１行目の「６〜１０」を「１〜５」に訂正する。 (5) 明細書、第１６頁第１２行目の「７〜１５」を「１１〜１５」に訂正する 。 (6) 明細書、第１６頁第１３行目の「５」を「７〜１０」に訂正する。 (7) 明細書、第１６頁第１６行目の「１０」を「２〜５」に訂正する。 (8) 明細書、第１６頁第１９行目の「１３」を「１２」に訂正する。 (9) 明細書、第１８頁下から１行目の「５」を「４」に訂正する。 (10) 請求の範囲を別紙の通りに訂正する。 (11) 図面の図１を別紙の通りに訂正する。 請求の範囲 １．二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する方法であって、該鋳型を所望の転写 開始部位で、該ＤＮＡと転写開始部位を形成することができる１個又は２個以上 のオリゴ核酸類似体（oligo-nucleic acid analogues）とハイブリダイズさせる ことにより複合体を形成させること、及び該複合体をヌクレオシド三リン酸の存 在下にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用に付することを特徴とする方法。 ２．該オリゴ核酸類似体の１対が、該ＤＮＡの同一又は異なる鎖の上の隣接位置 又は隔てられた位置にハイブリダイズしているものである、請求項１記載の方法 。 ３．該１対のオリゴ核酸類似体が該ＤＮＡの０から１０塩基対だけ隔てられてい るものである、請求項２記載の方法。 ４．該オリゴ核酸類似体又はその各々が５から６０の核酸類似体ユニット長を有 するものである、請求項１〜３いずれか記載の方法。 ５．下記の工程を含むことを特徴とするＲＮＡポリメラーゼによる核酸の転写方 法、 −一本鎖核酸を特異的結合配列を含む二本鎖ＤＮＡに酵素的に変換する工程、 −該二本鎖ＤＮＡを該特異的結合配列に相補的な核酸塩基配列を含む核酸類似体 とハイブリダイズさせる工程、及び −該ハイブリッドをＲＮＡポリメラーゼの作用に付して核酸を転写する工程。 ６．転写に対するブロックが該転写において等しい長さの転写物が得られるよう に所望の該開始部位の下流の位置に置かれるものである、又は転写物の長さが該 開始部位の下流の選択された位置で鋳型を切断することにより制御されるもので ある、請求項１〜５いずれか記載の方法。 ７．該ブロックが、転写を阻止することができるオリゴ核酸類似体を該ＤＮＡに ハイブリダイズさせることにより作成するものである、請求項５記載の方法。 ８．核酸類似体がアミド、チオアミド、スルフィンアミド、又はスルホンアミド バックボーンを有するものである、請求項１〜７いずれか記載の方法。 ９．使用される該核酸類似体が、ペプチド核酸であって、該バックボーンがポリ アミドバックボーンであり、該リガンドのそれぞれが該バックボーン中のアザ窒 素原子に直接的又は間接的に結合しており、そして窒素原子を持つ該リガンドが 主として該バックボーン中で相互に４〜８介入原子だけ隔てられているものであ る、請求項１〜７いずれか記載の方法。 １０．使用される該核酸類似体が、相補的配列の核酸にハイブリダイズし、該類 似体及び該核酸に配列において相当する通常のデオキシリボヌクレオチド間に形 成されるハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成する ことができるものである、請求項１〜９いずれか記載の方法。 １１．使用される核酸類似体が、その一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有す る二本鎖核酸にハイブリダイズして該一方の鎖から他方の鎖を該核酸類似体に置 換することができるものである、請求項１〜１０いずれか記載の方法。１２ ．請求項１〜１１いずれか記載の方法に従って、ＲＮＡ作成のための転写を 行い、そして該ＲＮＡ生成を検出することを特徴とする、オリゴ核酸類似体と特 異的に結合する試料中の核酸を検出する方法。 １３ ．該ＲＮＡが相補的配列の核酸プローブに捕捉され、そして検出可能な標識 を持つ核酸プローブにも結合させるものである、請求項１２記載の方法。１４ ．ＤＮＡ鋳型分子のそれぞれから複数のＲＮＡコピーを作成する方法におい て、請求項１〜１１いずれか記載の方法 により、ＤＮＡからＲＮＡ転写物を調製することを特徴とする核酸増幅方法。 【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 ニールセン，ペーター，アイギル デンマーク国 コッケダール デーカー― 2980 ヒョルテヴァンゲット 509 (72)発明者 ベルク，ロルフ，ヘンリック デンマーク国 フレデリックスベルク デ ーカー―2000 ランゲランドスヴェイ 20 ベー ３ テーハー (72)発明者 ブチャルト，オーレ デンマーク国 ヴァルロース デーカー― 3500 ソンデルガルトヴェイ 73 (72)発明者 エグホルム，マイケル アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02173，レキシントン，レキシントン リ ッジ ドライブ 1231 (72)発明者 ニールセン，ペーター，アイギル デンマーク国 コッケダール デーカー― 2980 ヒョルテヴァンゲット 509

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する方法であって、該鋳型を所望の転写 開始部位で、該ＤＮＡと転写開始部位を形成することができる１個又は２個以上 のオリゴ核酸類似体（oligo-nucleic acid analogues）とハイブリダイズさせる ことにより複合体を形成させること、及び該複合体をヌクレオシド三リン酸の存 在下にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用に付することを含んでなる方法。 ２．該オリゴ核酸類似体の１対が、該ＤＮＡの同一又は異なる鎖の上の隣接位置 又は隔てられた位置にハイブリダイズしているものである、請求項１記載の方法 。 ３．該１対のオリゴ核酸が該ＤＮＡの０から１０塩基対だけ隔てられているもの である、請求項２記載の方法。 ４．該オリゴ核酸類似体又はその各々が１０から２０の核酸類似体ユニット長を 有するものである、請求項１〜３いずれか記載の方法。 ５．下記の工程を含むＲＮＡポリメラーゼによる転写のための基質に１本鎖核酸 を変換する方法、 −核酸を特異的結合配列を含む２本鎖ＤＮＡに酵素的に変換する工程、 −該ハイブリッドを特異的結合配列に相補的な核酸塩基配列を含む核酸類似体と ハイブリダイズさせる工程、及び −該ハイブリッドをＲＮＡポリメラーゼの作用に付する工程。 ６．転写に対するブロックが該転写において等しい長さの転写物が得られるよう に所望の該開始部位の下流の位置に置かれるものである、又は転写物の長さが該 開始部位の下流の選択された位置で鋳型を切断することにより制御されるもので ある、請求項１〜５いずれか記載の方法。 ７．該ブロックが、転写を阻止することができるオリゴ核酸類似体を該ＤＮＡに ハイブリダイズさせることにより作成するものである、請求項５記載の方法。 ８．核酸類似体がアミド、チオアミド、スルフィンアミド、又はスルホンアミド バックボーンを有するものである、請求項１〜７いずれか記載の方法。 ９．使用される該核酸類似体が、ペプチド核酸であって、該バックボーンがポリ アミドバックボーンであり、該リガンドのそれぞれが該バックボーン中のアザ窒 素原子に直接的又は間接的に結合しており、そして窒素原子を持つ該リガンドが 主として該バックボーン中で相互に４〜８介入原子だけ隔てられているものであ る、請求項１〜７いずれか記載の方法。 １０．使用される該核酸類似体が、相補的配列の核酸にハイブリダイズし、該類 似体及び該核酸に配列において相当する通常のデオキシリボヌクレオチド間に形 成されるハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成する ことができるものである、請求項１〜９いずれか記載の方法。 １１．使用される核酸類似体が、その一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有す る二本鎖核酸にハイブリダイズして該一方の鎖から他方の鎖を置換することがで きるものである、請求項１〜１０いずれか記載の方法。 １２．該核酸類似体が一般式１の化合物を含んでなるものである、請求項１１記 載の方法、 式中、ｎは少なくとも２であり、Ｌ¹〜Ｌⁿはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（ Ｃ₁〜Ｃ₄）アルカノイル基、天然に 生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、ＤＮＡインターカ ーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターリガンド類からな る群より選択されるものであり、 Ｃ¹〜Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）ｙであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天 然に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はＲ⁶ とＲ⁷は独立に水素、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘ テロアリール基、水酸基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ基、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルチ オ基、ＮＲ³Ｒ⁴及びＳＲ⁵からなる群より選択されるものであり、ここでＲ³とＲ⁴ は以下に定義され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル基であり、又はＲ⁶とＲ⁷は一緒 になって脂環系又は複素環系を作り、 Ｄ¹〜Ｄⁿはそれぞれ、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶とＲ⁷は上記のように定 義される、 ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜１０であ り、 Ｇ¹〜Ｇ^n-1はそれぞれ、−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³Ｃ⁵−、−ＮＲ³ＳＯ−、又は− ＮＲ³ＳＯ₂−でありいずれの方向でもよく、ここでＲ³は以下に定義される、 Ａ¹〜Ａⁿ及びＢ²〜Ｂⁿはそれぞれ以下のものから選択される、 （ａ）Ａは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり 、かつＢはＮ又はＲ³Ｎ⁺であり、又は （ｂ）Ａは式(IId)の群であり、かつＢはＣＨであり、 式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、 Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ⁴であり、 ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は１０以下であり、 ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は１０以下であり、 Ｒ¹とＲ²はそれぞれ独立に水素、水酸基−，アルコキシ基−，又はアルキルチオ 基−で置換されていてもよい（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル基、、水酸基、アルコキシ基 、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり 、そして Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立に水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキ ル基、水酸基−，アルコキシ基−，アルキルチオ基−置換（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキル 基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択さ れるものであり、 Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ₃Ｈ又は−ＳＯ₂ＮＲ’Ｒ”、又は− ＣＯ₂Ｈ又は−ＳＯ₃Ｈの活性誘導体、及び Ｉは−ＮＲ''' Ｒ''''又は−ＮＲ''' Ｃ（Ｏ）Ｒ''''であり、ここでＲ’、Ｒ'' 、Ｒ''' 及びＲ''''は、独立に水素、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリ ガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物 、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、 ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性 及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 １３．該核酸類似体が一般式III 、IV、又はＶの化合物を含むものである、請求 項１２記載の方法、 式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基 、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、Ｒ³はそ れぞれ上に定義したとおりであり、 Ｒ⁷はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 ｎは１より大きな整数であり、 各ｋ、ｌ及びｍは独立にゼロ又は１〜５の整数であり、 ｐはそれぞれゼロ又は１であり、 Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂又は−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり、そして Ｒ’はＨ又はＣＯＣＨ₃である。 １４．上に記載した請求項のいずれか１項に従ってＲＮＡ作成のための転写を行 い、そして該ＲＮＡ生成を検出することを含んでなる、請求項１〜１３いずれか 記載の診断方法。 １５．該ＲＮＡが相補的配列の核酸プローブに捕捉され、そして検出可能な標識 を持つ核酸プローブにも結合させるものである、請求項１１記載の診断方法。 １６．ＤＮＡ鋳型分子のそれぞれから複数のＲＮＡコピーを作成する方法におい て、請求項１〜１３いずれか記載の方法により、ＤＮＡからＲＮＡ転写物を調製 することを含んでなる核酸増幅方法。