JPH09504374A - ヒト自己抗体を検出するための免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗ＬＫＭ−１自己抗体を含むと推測される試験試料中のＬＫＭ−１自己抗体の定量用アッセイ及び試験キット。該方法は、好ましくは微粒子である固相を用い、標準化され、自動システムによって実施可能な方法により、試験試料中の抗ＬＫＭ抗体の量を定量し得るものである。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト自己抗体を検出するための免疫検定法 発明の背景 本発明は概して自己抗体に関し、より特定的には、自動又は半自動手段による 肝臓−腎臓ミクロソーム（ＬＫＭ）自己抗体を検出するための免疫検定法に関す る。 肝臓−腎臓ミクロソーム（ＬＫＭ）自己抗体は、炎症性肝臓疾患に関わりがあ ることが知られている。特発性自己免疫性慢性活動性肝炎（ＡＩ−ＣＡＨ）に関 わるＬＫＭ自己抗体は、「ＬＫＭ−１」自己抗体と称されている。Ｍ．Ｐ．Ｍａ ｎｎｓ，ｉｎ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，第ＩＩ 巻，第３：２０５−２１４号（１９９１）。 ＬＫＭ−１自己抗体は、最初にラット肝臓シトクロムＰ４５０ｄｂ１及びｄｂ ２として同定された５０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質を認識することが 見いだされ、それによって個体のＬＫＭ−１を定量する方法が開発された。Ｍ． Ｇｕｅｇｕｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ，第１５９（２）巻：５４ ２− ５４７（１９８９）。最近のリポートにより、炎症性肝臓疾患にかかっている患 者の自己抗原として３種のＰ４５０シトクロムが同定され得ることが示唆されて いる。３種のＰ４５０シトクロム（ＩＡ２、IIＤ６及びIIＣ９）はいずれも、強 力な阻害性自己抗体によって認識される薬剤代謝酵素である。Ｍ．Ｐ．Ｍａｎｎ ｓら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃｓ ，第２８０（１）巻：２２９−２３２（１９９０）。 ＬＫＭ−１のような循環性自己抗体は、自己免疫性肝炎の診断を決定する重要 な指標となっている。自己免疫性肝炎にかかっている患者には、免疫抑制剤を用 いた治療は効果的であるが、ウイルス誘発性肝炎の治療に用いられているインタ ーフェロンによる治療は効果がないことから、自己免疫性肝炎であるかどうかの 診断は重要なものとなってきている。従って、正しい治療を得るためには、ウイ ルス誘発性肝炎と自己免疫性肝炎とを区別することが重要である。最近のリポー トにより、排除法又はＣ型ウイルス性肝炎（ＨＣＶ）検定法により慢性非Ａ型、 非Ｂ型ウイルス性肝炎（ＮＡＮＢＨ）と診断され、インターフェロンによる治療 を受けた患者が、実は自己免疫性肝炎にかかっていた ことが指摘された。Ｍ．Ｒｕｉｚ−Ｍｏｒｅｎｏら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，第 １２（２）巻：２６５−２６６（１９９１）及びＴ．Ｐａｐｏら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ，第１１６（１）巻：５１−５３ （１９９２）。これらの最近のリポートは、自己免疫性肝炎にかかっている患者 にはインターフェロン療法が禁忌であるために、自己免疫性肝炎の診断は少なく ともインターフェロン療法を開始する前に考慮すべきであると示唆している。 歴史的に見ると、ＬＫＭ−１自己抗体の検出法には、間接蛍光抗体（ＩＦＡ） 法、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、電子顕微鏡及び免疫ブロットが含まれていた 。Ｍ．Ｍａｎｎｓら，Ｊ．Ｃｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：３４４−３ ５２（１９８７），Ｍａｎｎｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第５ ７巻：６００−６０８（１９８４）。最近になって、酵素結合免疫吸着検定法（ ＥＬＩＳＡ）が報告された。Ｍ．Ｇｕｅｇｕｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ ｏｎｓ ，第１５９（２）巻：５４２−５４７（１９８９）。慣用的には、そ のようなＥＬＩＳＡは、ＬＫＭ陽性参照血清（他の自己抗体に対しては陰性）の ＩｇＧ画分の精製、該ＩｇＧ画分の固体表面へのコーティング及びそのようにし て調製された固相と試験試料との反応を含むか、又は該ＥＬＩＳＡ検定法を特定 のシトクロムに対する抗体の検出に用いた。しかし、自己免疫性肝炎と診断され た患者は５０ｋＤａ抗原とは反応しても、特定のシトクロムとは反応し得ない。 これら公知の方法は、ＬＫＭ自己抗体の存在を定量する種々の技術を研究者に 提供しはしたが、これらの技術は、手動法、非標準化評価及び主観的評価である ことによって制限され、せいぜい半定量が可能であるに過ぎなかった。定量的で 、標準化され、高度に再現可能であり且つ時間がかからない、抗ＬＫＭ自己抗体 用の改良型免疫検定法を提供することが有利である。そのような標準化免疫検定 法は、示差的な診断にも、自己免疫性肝炎と診断された患者の免疫抑制療法のモ ニターにも有用である。発明の要旨 本発明は、試験試料中のＬＫＭ自己抗体の存在の自動測定法を提供し、該方法 は、（ａ）試験試料と、固相に結合したＬＫＭ特異結合メンバーとを、ＬＫＭ抗 原／抗ＬＫＭ 抗体特異結合ペアを形成するに十分な時間及び条件下にインキュベートする段階 、（ｂ）そのようにして形成された特異結合ペアと共に、測定可能なシグナルを 生成し得るシグナル生成化合物に付着した種特異抗体を含むインジケーター試薬 をインキュベートする段階、（ｃ）検出されたシグナルを測定し、検出されたシ グナルの量と試験試料中に存在する抗ＬＫＭ抗体の量とを相関させる段階からな る。固相は、ＬＫＭミクロソーム画分又はＬＫＭ−１（シトクロムＰ４５０ｄｂ １）アミノ酸１２５−４９７からなる群から選択されたＬＫＭ−１抗原が付着し た微粒子の懸濁液であってよい。段階（ａ）を実施する前に該試験試料を希釈し てもよい。段階（ａ）後に形成された混合物を多孔質要素上での微粒子分離によ り分離し、次いで、固相を洗浄し得る。好ましい実施態様において、段階（ｂ） のインジケーター試薬のシグナル生成化合物は、アルカリホスファターゼであり 、種特異抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧである。 本発明はさらに、ＬＫＭ−１自己抗体検定法を実施するための試験キットを提 供する。該試験キットは、固相に結合したＬＫＭ抗原を含む容器と、測定可能な シグナルを生成し得るインジケーター試薬を含む容器とからなる。好ま しい実施態様において、固相は、ＬＫＭミクロソーム画分又はＬＫＭ−１（シト クロムＰ４５０ｄｂ１）アミノ酸１２５−４９７からなる群から選択されたＬＫ Ｍ抗体が付着した微粒子である。アルカリホスファターゼに付着したヤギの抗ヒ トＩｇＧを含むインジケーター試薬も好ましい。図面の簡単な説明 図１は、ＬＫＭ検定原理の概略的な記述である。 図２は、種々の肝臓細胞抗原でコーティングした微粒子を用いる自動検定法に おける自己免疫血清の反応性のグラフである。 図３は、ＲＩＡの力価とＡｂｂｏｔｔのＩＭｘ（登録商標）システムを用いて 得られた速度とを相関させるグラフであり、該グラフにおいて、ＲＩＡ力価のｌ ｏｇはＹ軸上にプロットされ、ＩＭｘ（登録商標）速度のｌｏｇはＸ軸上にプロ ットされている。 図４は、コーティングしたミクロソームから得られた抗ＬＫＭ測定結果と、組 換え体ＬＫＭ−１でコーティングした微粒子とを相関させるグラフであり、該グ ラフにおいて、組換え体タンパク質コーティングはＹ軸上にプロットされ、ミク ロソーム画分コーティングはＸ軸上にプロットされて いる。 図５は、免疫抑制療法のモニターを示す２つのグラフ（Ａ及びＢ）である。発明の詳細な説明 本発明は、試験試料中の分析物であるＬＫＭ自己抗体を検出・定量するための 改良型免疫検定法を提供する。一般的には、検定に先立ち、ＬＫＭ自己抗体に対 する特異結合パートナーを固体表面に付着させる。次いで、そのようにして形成 された固相をＬＫＭ自己抗体を含むと推測される試験試料に接触させて第１混合 物を形成し、ＬＫＭ抗原／ＬＫＭ自己抗体複合体を形成するに十分な時間及び条 件下にインキュベートする。次いで、抗体特異結合メンバー又は複合体特異結合 メンバー及びシグナル生成化合物を含むインジケーター試薬を抗原／抗体複合体 に接触させて第２混合物を形成する。第２混合物を、抗原／抗体／インジケータ ー試薬複合体の形成に十分な時間及び条件下に接触させる。試験試料中に存在す るＬＫＭ抗体の量は、検出されたシグナルの量に比例する。 本明細書に用いられている「特異結合メンバー」とは、特異結合ペアのメンバ ーである。即ち、一方の分子が化学 的又は物理的手段により他方の分子に特異的に結合する２種の異なる分子のメン バーである。従って、一般的な免疫検定法の抗原・抗体特異結合ペア以外の他の 特異結合ペアには、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオ チド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵 素などが含まれ得る。さらに、特異結合ペアには、原特異結合メンバーの類似体 であるメンバー、例えば分析物−類似体が含まれ得る。免疫反応性特異結合メン バーには、抗原、抗原断片；モノクローナル及びポリクローナル抗体及び該抗体 断片；並びに組換えＤＮＡ法により形成されたものを含むその複合体が含まれる 。 本明細書に用いられている「分析物」とは、試験試料中に存在し得る検出すべ き物質である。分析物は、天然産生特異結合メンバー（例えば、抗原）が存在す るか、又は特異結合メンバーを調製し得る任意の物質であってよい。従って、分 析物は、検定において１種以上の特異結合メンバーに結合し得る物質である。「 分析物」には、任意の抗原物質、ハプテン、抗体及びその組み合わせも含まれる 。分析物は、特異結合ペアのメンバーとして、ビタミンＢ１２ を定量するための捕獲及び／若しくはインジケーター試薬における内因子タンパ ク質の使用又は炭水化物を定量するための捕獲及び／若しくはインジケーター試 薬におけるレクチンの使用のような天然産生特異結合パートナー（ペア）を用い て検出し得る。分析物には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステ ロイド、ビタミン、治療目的で投与されるもの並びに違法な目的で投与されるも のを含む薬剤、細菌、ウイルス並びに上記物質のいずれかの代謝物又は該物質の いずれかに対する抗体が含まれ得る。 本明細書に記載の方法により試験し得る「試験試料」には、当該抗体を含み得 る、全血、血清、血漿、髄液、尿、腹水のような生体液又は任意の他の身体構成 成分若しくは任意の組織培養上清が含まれる。 本明細書に用いられている「固相」とは、不溶であるか又はその後の反応によ り不溶とされ得る任意の物質を指す。固相は、捕獲試薬を惹き付けて固定化する 内在能力を有するものを選択し得る。あるいは、固相は捕獲試薬を惹き付けて固 定化する能力を有する追加のレセプターを保持し得る。追加レセプターには、捕 獲試薬自体とは反対の電荷の荷電物質、又は捕獲試薬に連結した荷電物質とは反 対の電 荷の荷電物質が含まれ得る。さらに別の代替物質として、レセプター分子は、固 相上に固定化（付着）され、特異結合反応により捕獲試薬を固定化する能力を有 する任意の特異結合メンバーであってよい。レセプター分子は、検定の実施前又 は実施中に捕獲試薬を固相材料に間接的に結合し得る。従って、固相は、プラス チック、誘導体化プラスチック、磁気若しくは非磁気金属、試験管のガラス又は シリコン表面、マイクロタイターウエル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び 当業者には公知の他の形態のものであってよい。 固相には、検出抗体がアクセスし得るに十分な多孔度と、抗原に結合するのに 適当な表面親和力とを有する適当な多孔質物質も含まれ得ることが予測され、こ れも本発明の範囲内に包含される。一般的には微孔質構造が好ましいが、水和状 態のゲル構造を有する物質を用いてもよい。そのような有用な固体担体には：天 然高分子炭水化物及びそれらの合成的改質架橋誘導体又は置換誘導体、例えば、 寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーガム、特に硝酸及びカ ルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、及びセルロースエ ーテル；窒素を含む 天然ポリマー、例えば、架橋又は改質ゼラチンを含むタンパク質及び誘導体；天 然炭化水素ポリマー、例えば、ラテックス及びゴム；適当な多孔質構造で製造し 得る合成ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポ リビニルクロリド、ポリビニルアセテート及びその部分的加水分解誘導体、ポリ アクリルアミド、ポリメタクリレートを含むビニルポリマー、上記重縮合物のコ ポリマー及びターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、並びに他のポ リマー、例えば、ポリウレタン又はポリエポキシド；多孔質無機物質、例えば、 硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含む、アルカリ土類金属及び マグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩、アルカリ金属及びアルカリ土類金属、アルミ ニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；及びアルミニウム又はシリコン酸化物又は 水和物、例えば、粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル 又はガラス（これらの物質は上記高分子物質と共にフィルターとして用い得る） ；並びに上記種の混合物又はコポリマー、例えば、先在する天然ポリマー上に合 成ポリマーを重合して得られるグラフトコポリマーが含まれる。これらの物質は 全て、適当な形状、例えば、フィルム、 シート又はプレート状で用いたり、あるいは、適当な不活性担体、例えば、紙、 ガラス、プラスチックフィルム又は繊維上にコーティング、接着又は貼り合わせ たりし得る。 ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体を含む多様な試薬に対 して優れた吸収・吸着特性を有している。同様な特性を有するナイロンも適当で ある。 上記のような多孔質固体支持体は、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは 約０．１ｍｍのシート形態であるのが好ましいと考えられる。孔径は、広い限度 内で変化し得、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特には約０．１５〜１ ５ミクロンである。そのような支持体の表面は、該支持体に対する抗原又は抗体 の共有結合を生起させる化学プロセスにより活性化され得る。しかし、一般に、 よく理解されていない疎水力によって多孔質物質上に吸着されることにより、抗 原又は抗体の不可逆結合が得られる。 流動検定装置用の好ましい固相材料には、濾紙、例えば、多孔質ガラス繊維材 料又は他の繊維マトリックス材料が含まれる。該材料の厚さは重要ではなく、主 として、定量する試料又は分析物の特性、例えば、試験試料の流動性に基づいて 選択する。 固相の内在電荷を変更又は増強するために、電荷物質を材料に直接、又は微粒 子上にコーティングし、次いで固相支持体材料により保持することができる。あ るいは、微粒子をカラム内に保持するか若しくは可溶試薬と試験試料との混合物 中に懸濁して固相として作用させたり、又は、該粒子自体を固相支持体材料で保 持・固定化し得る。「保持・固定化」とは、支持体材料上又は該材料中の粒子が 支持体材料中のどの位置にも実質的に移動し得ないことを意味する。微粒子は、 当業者が任意の適当な粒状材料種から選択し得、ポリスチレン、ポリメチルアク リレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリア クリロニトリル、ポリカーボネート、又は類似の材料からなるものが含まれる。 粒径は重要ではないが、粒子の平均直径が、用いられる支持体材料の平均孔径よ り小さいのが好ましい。従って、種々の他の固相を用いる実施態様も予測され、 これも本発明の範囲内に包含される。例えば、負電荷のポリマーとの固定化性反 応複合体を固定化するためのイオン捕獲手順は、欧州特許出願公開第０３２６１ ００号に対応する同時係属出願の米国特許出願第１５０，２７８号及び同第３７ ５，０２９号（欧州特許出願公開第０ ４０６４７３号）に記載されており、本発明に従って該手順を用い、高速溶液− 相免疫化学反応を実施し得る。固定化性免疫複合体を、負電荷ポリアニオン／免 疫複合体とすでに処理されている正電荷多孔質マトリックスとの間のイオン相互 作用により反応混合物の残りから分離し、ＥＰＯ特許出願公開第０，２７３，１ １５号に対応する同時係属出願の米国特許出願第９２１，９７９号の化学ルミネ センスシグナル測定に記載のものを含む既に記載されている種々のシグナル生成 系を用いて検出する。 さらに本発明の方法は、固相が微粒子を含む、自動又は半自動システムを含む 微粒子技術を利用するシステムに使用するように適合させ得る。そのようなシス テムには、それぞれ公開ＥＰＯ出願、ＥＰ０４２５６３３号及びＥＰＯ０４２４ ６３４号に対応する係属出願の米国特許出願第４２５，６５１号及び米国特許第 ５，０８９，４２４号に記載のものが含まれる。 「インジケーター試薬」には、ＬＫＭ自己抗体の特異結合メンバーに連結（付 着）した外部手段により検出し得る測定可能なシグナルを生成し得るシグナル生 成化合物（標識）を含み得る。本明細書に用いられている「特異結合メ ンバー」とは、特異結合ペアのメンバー、即ち、一方が化学的又は物理的手段に より他方に特異的に結合する２種の異なる分子のメンバーを意味する。インジケ ーター試薬は、ＬＫＭ自己抗体の特異結合ペアの抗体又は該抗体断片メンバーで あることに加えて、ハプテン−抗ハプテン系、例えば、ビオチン又は抗ビオチン 、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エ フェクター分子又はレセプター分子、酵素補因子又は酵素、酵素阻害剤又は酵素 などを含む、任意の特異結合ペアのメンバーであり得る。 考えられる種々のシグナル生成化合物（標識）には、色原体；酵素、例えばア ルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼな どのような触媒；フルオレセイン及びローダミンのようなルミネセンス化合物； アクリジニウム、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノールなどのよう な化学ルミネセンス化合物；放射性元素；並びに着色固相及び着色微粒子を含む 直視標識が含まれる。特定の標識の選択は重要ではないが、標識はそれ自体で又 は１種以上の追加物質との組み合わせでシグナルを生成し得る。 本発明は、第１の実施態様において、ＬＫＭ自己抗体の存在及び量を定量する 免疫検定法を提供し、該免疫検定法は、（ａ）試験試料をＬＫＭ抗原、好ましく はミクロソーム画分（以下に記載）と接触させ、そのようにして形成された混合 物をＬＫＭ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下にインキュベートす る段階；（ｂ）ＬＫＭ抗原／抗体複合体を、検出し得る測定可能なシグナルを生 成し得るシグナル生成化合物に付着した抗ヒト抗体又はその断片を含むインジケ ーター試薬に接触させ、そのようにして形成された第２混合物をＬＫＭ抗原／抗 体／インジケーター試薬複合体を形成するに十分な時間及び条件下にインキュベ ートする段階；及び（ｃ）試験試料中のＬＫＭ自己抗体の存在の指標としてシグ ナル生成化合物により生成された測定可能なシグナルを検出する段階からなる。 ＬＫＭ自己抗体用の捕獲抗原を、検定に用いる前に固相に付着させるのが好まし い。固相を用いる場合、シグナル生成化合物を検出する前に固相を液相から分離 することができる。さらに、段階（ａ）及び（ｂ）は同時に行い得る。検定のい ずれの実施態様の場合にも試験試料を希釈し得、洗浄は、本明細書に記載の全て の検定フォーマット段階の間に行う か又は行い得ることも予測され、これも本発明の範囲内に包含される。 あるいは、ＬＫＭ自己抗体用の試験試料を、ＬＫＭ抗原、好ましくはミクロソ ーム画分と接触させ、ＬＫＭ抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間および条 件下にインキュベートする。次いで、ＬＫＭ抗原／抗体複合体を、特異的にＬＫ Ｍ抗原に結合する既に反応性のＬＫＭ抗体を含む固相捕獲試薬と接触させる。複 合体及び固相をＬＫＭ抗体／抗原／抗体複合体を形成するに十分な時間及び条件 下にインキュベートする。次いで、そのようにして形成された反応混合物から固 相捕獲試薬を分離し、測定可能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に付 着しているモノクローナル又はポリクローナル抗ＬＫＭ抗体又はその断片を含む インジケーター試薬に接触させて、混合物を形成する。該混合物をＬＫＭ抗体／ 抗原／抗体／インジケーター試薬複合体を形成するに十分な時間及び条件下にイ ンキュベートする。生成された測定可能なシグナルを検出して固定化抗体の存在 を定量する。生成されたシグナルの量が初期のスクリーニングに比べて減少して いれば、試験試料中に存在するＬＫＭ自己抗体の存在が確認される。 別の実施態様においては、適当なＬＫＭ抗原、好ましくはミクロソーム画分を ニトロセルロース膜上に固定化する。ニトロセルロース膜上に固定化する前に、 抗原を、抗原自体、ペプチド又は種々の担体タンパク質、例えばＢＳＡ、ＫＬＨ 、オボアルブミンなどに結合又は架橋し得る。次いで、該膜上で試験試料をＬＫ Ｍ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下にインキュベートする。結合 していないタンパク質を除去した後、該膜を、シグナル生成化合物で標識した抗 ヒト抗体を含むインジケーター試薬と共にインキュベートする。測定可能なシグ ナルを検出して、試験試料中に存在するＬＫＭ自己抗体の存在及び／又は量を決 定する。シグナルの量は、試験試料中に存在する抗ＬＫＭの量に比例する。 他の種々の固相を用いる他の実施態様も予測され、これも本発明の範囲内に包 含される。例えば、欧州特許出願公開第０３２６１００号に対応する同時係属出 願の米国特許出願第１５０，２７８号及び同第３７５，０２９号（欧州特許出願 公開第０４０６４７３号）（該両米国特許出願は、いずれも本出願人が所有し、 本明細書に参照として組み込むものとする）に記載の負電荷ポリマーに固定化性 反応複 合体を固定化するためのイオン捕獲手順を本発明に用いて、高速溶液−相免疫化 学反応を実施することができる。固定化性免疫複合体を、負電荷ポリアニオン／ 免疫複合体と既に処理されている正電荷多孔質マトリックとの間のイオン相互作 用により反応混合物の残りから分離し、ＥＰＯ公開第０２７３１１５号に対応す る同時係属出願の米国特許出願第９２１，９７９号（本出願人が所有し、本明細 書に参照として組み込むものとする）の化学ルミネセンスシグナル測定に記載さ れているものを含む既に記載の種々のシグナル生成系を用いて検出する。 さらに、本発明の方法は、固相が微粒子からなる、自動又は半自動システムを 含む微粒子技術を利用するシステムに用いるように適合させ得る。該システムに は、公開ＥＰＯ出願であるＥＰ０４２５６３３号及びＥＰ０４２４６３４号に対 応する同時係属出願の米国特許出願第４２６，６５１号及び同第４２６，６４３ 号（該両米国特許出願は、本明細書に参照として組み込むものとする）に記載の ものが含まれる。 好ましくは、本発明により、ＬＫＭ−１自己抗体の微粒子をベースとするサン ドイッチ免疫検定を以下のように実 施する：抗ＬＫＭ−１自己抗体を含み得る試験試料を、ＬＫＭミクロソーム画分 又はＬＫＭ−１（シトクロムＰ４５０ｄｂ１）アミノ酸１２５−４９７を含む組 換え体タンパク質でコーティングした微粒子と接触させる。該混合物を、ＬＫＭ 抗原／抗ＬＫＭ抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下にインキュベートする 。次いで、そのようにして形成された反応混合物を、固相をガラス繊維マトリッ クス上に保持・固定化したガラスマトリックス（本明細書に記載）に移し、過剰 な反応液を洗い流すか、又は同一槽内で反応させてもよい。次いで、抗ヒトＩｇ Ｇ及び測定可能なシグナル生成化合物を含むインジケーター試薬（又はいわゆる 抱合体）をガラス繊維マトリックスに加え、この第２反応混合物をＬＫＭ抗原／ 抗ＬＫＭ抗体／インジケーター試薬複合体の形成に十分な時間及び条件下にイン キュベートする。微粒子が未だガラス繊維マトリックス上に分離されていない場 合には、この段階で分離が発生し、混合物が洗浄される。次いで、アルカリホス ファターゼ基質、ＭＵＰ、を分離した粒子に加え、反応させる。生成された測定 可能シグナルの量は、蛍光産物の形成速度を指数較正レートによって決定される カットオフ速度と比較することによる、 試験試料中に存在する抗ＬＫＭ自己抗体の量の指標である。 さらに、試験試料中に存在するＬＫＭ自己抗体の濃度又はレベルは、本発明の 試薬及び免疫検定法法を用いることにより、蛍光偏光免疫検定法（ＥＰＩＡ）で 正確に定量し得る。蛍光偏光検定を実施し得る市販の自動装置の例としては、Ｉ Ｍｘ（登録商標）システム、ＴＤｘ（登録商標）システム及びＴＤｘＦＬｘ（商 標）システム（全て、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）が挙げられる。ＬＫＭ自己抗体の特異的定量用 ＦＰＩＡを実施するために、既知量のＬＫＭ自己抗体を用い、試験試料中のＬＫ Ｍ自己抗体の量を定量する較正曲線を形成した。本明細書に記載のＬＫＭ自己抗 体の特異的定量用蛍光偏光免疫検定法を実施する場合、トレーサーの検出可能部 分は、フルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセインなど のような蛍光部分、好ましくは、５−及び６−アミノメチルフルオレセイン、５ −及び６−アミノフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボ キシフルオレセイン、チオ尿素フルオレセイン及びメトキシトリアジノリル−ア ミノフルオレセイン並びに類似の蛍光誘導体である。蛍光ト レーサーは、該トレーサー及びＬＫＭ自己抗体の両方に結合し得る抗体と組み合 わせて用いることができる。コンペティティブ免疫検定法の場合、トレーサー及 びＬＫＭ自己抗体は、ＬＫＭ抗原に競合的に結合し得なければならない。ＬＫＭ 自己抗体の定量の場合、抗原試薬は、ＬＫＭ自己抗体に結合又は該抗体を認識し 得るＬＫＭを含むミクロソーム断片を含む。 抗体に結合したトレーサーの量は、試験試料中に存在するＬＫＭ自己抗体の量 に反比例して変化する。従って、抗体結合部位に対するＬＫＭ自己抗体及びトレ ーサーの相対結合親和力は、検定系の重要な特性である。 一般に蛍光偏光法は、蛍光トレーサーが、特性波長の平面偏光光により励起さ れると、所与の媒質のトレーサーの回転速度と反比例する入射刺激光に関する偏 光度を保持する別の特性波長の光（即ち、蛍光）を放出するという原理に基づい ている。この特性の結果として、束縛回転するトレーサー物質は、例えば粘性溶 液相中又は比較的低速度で回転する抗体のような別の溶液成分に結合している場 合、自由溶液中におけるよりも比較的大きい偏光度を有する放出光を保持してい る。 本発明によりＬＫＭ自己抗体を特異的に定量するために蛍光偏光免疫検定を実 施する場合、本発明の免疫原を用いて調製した抗血清又はモノクローナル抗体の 存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を生成し得る本発明の標識試薬の存在下に 、チロキシンを含むと推測される試験試料を、本発明の免疫原を用いて調製した 抗血清又はモノクローナル抗体に接触させる。次いで、平面偏光光を溶液に通し 、蛍光偏光応答を得、該応答を、試験試料中に存在するチロキシンの量の測定値 として検出する。 本発明のＬＫＭミクロソーム断片を用い、該断片を慣用の担体材料に結合して 免疫原を調製し、抗体の取得に用いた。 さらに、免疫検定に走査プローブ顕微鏡検査（ＳＰＭ）を用いる方法は、本発 明の検定法が容易に適合し得る方法である。走査プローブ顕微鏡検査、特に原子 力顕微鏡検査において、捕獲相、例えばＬＫＭミクロソーム断片を固相に付着さ せ、次いで試験試料を該固相に接触させ、走査プローブ顕微鏡を用いて、固相表 面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。ＳＰＭのようなシステムで定量が 可能である。走査プローブ顕微鏡検査を用いることにより、通 常多くの免疫検定システムにおいて抗原／抗体複合体の検出に用いなければなら ない標識の必要がなくなる。そのようなシステムが、同時係属米国特許出願第６ ６２，１４７号（本出願人が所有し、本明細書に参照として組み込むものとする ）に記載されている。 ＳＰＭを特異結合反応のモニターに用いる場合には多くの態様を取り得る。１ つの実施態様においては、特異結合パートナーの一方のメンバー（ＬＫＭミクロ ソーム画分のような適当なＬＫＭ抗原である抗体特異物質）を走査に適当な表面 に付着させる。当業者には公知の方法により、抗体特異物質をプラスチック又は 金属表面の固相を含む試験片に吸着させ得る。あるいは、誘導体化プラスチック 、金属、シリコン又はガラスからなる固相を含む試験片に特異結合パートナー（ 抗体特異物質）を共有結合させてもよい。共有結合法は当業者には公知であり、 特異結合パートナーを試験片に不可逆的に連結させる種々の手段が含まれる。試 験片がシリコン又はガラスの場合、特異結合パートナーを付着させる前に、その 表面を活性化させなければならない。活性化シラン化合物、例えば、トリエトキ シアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｕｉｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒ ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、及び（３− メルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、反応性基、例えば、アミノ、ビ ニル及びチオールをそれそれ導入し得る。そのような活性化表面を用いて結合パ ートナーを直接連結する（アミノ又はチオールの場合）か、又は、活性化表面を さらにリンカー、例えば、グルタールアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）ス ベレート、ＳＰＰＤ（スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネ ート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘ キサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードア セチル］アミノベンゾエート）、及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−［１− マレイミドフェニル］ブチレート）と反応させて、該表面から結合パートナーを 分離し得る。ビニル基を酸化して共有結合手段を得ることができる。ビニル基は ポリアクリル酸のような種々のポリマーの重合用アンカーとして用いることも可 能であり、それによって特異結合パートナ ー用の多重結合ポイントが得られる。アミノ表面を種々の分子量の酸化デキスト ランと反応させて、種々のサイズ及び能力の親水性リンカーを得ることができる 。酸化性デキストランの例には、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−４０（分子量４０，００ ０ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１１０（分子量１１０、０００ダルトン） 、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒ ａｎ Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（これらは全て、Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手し得る）、又はＦｉｃｏｌ ｌ（分子量７０，００ダルトン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓ ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）が含まれる。さらに、１９８８年１月２９ 日出願の同時係属米国特許出願第１５０，２７８号及び１９８９年７月７日出願 の同第３７５，０２９号（該両米国特許出願は、本出願人の所有になるものであ り、本明細書に参照として組み込むものとする）に記載の手順及び化学を用いて 、高分子電解質（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）相互作用を試験片の表面に 対する特異結合パートナーの固定化に用いてもよい。好ましい付着法は共有法に よる。特異結合メンバーを付着させた後、該表面 をさらに血清、タンパク質又は他のブロッキング剤で処理して、非特異結合を最 小限にし得る。該表面の製造部位又は使用ポイントを走査して、該表面がアッセ イに適合し得るかどうかを確認し得る。走査プロセスは、試験片の特異結合特性 を変化させるとは思われない。 本発明の試験キットは、試験試料中のＬＫＭ自己抗体を定量するために本発明 の所望の特異蛍光偏光免疫検定を実施するのに必要な必須試薬を全て含む。該試 験キットは、必要な試薬を該試薬が適合し得る組成物又は混合物として保持する １個以上の容器を組み合わせた市販のパッケージ形態のものである。 特に好ましいのは、試験試料中のＬＫＭ自己抗体の蛍光偏光免疫検定定量用試 験キットであり、該キットは、ＬＫＭ自己抗体の定量について上述した、蛍光ト レーサー化合物及び抗体並びにＬＫＭミクロソーム断片でコーティングした固相 からなる。試験キットには、ユーザーの見地から見て望ましいと思われる当業者 には公知の他の材料、例えば、洗浄、プロセシング及びインジケーター試薬とし て有用な緩衝液、希釈剤、標準液などが当然含まれ得ることを理解されたい。 本発明を実施例により説明するが、該実施例は、例示を目的としており、本発 明の精神及び範囲を限定するものではない。 実施例 実施例１：ミクロソーム画分の調製 ｅｓｃｈｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻：８９−９４（１ ９７２）に記載のようにミクロソーム画分を調製した。実施例２．組換え体ＬＫＭ及びＣＫＳ−ＬＫＭタンパク質 Ａ．組換え体ＬＫＭ 患者の抗ＬＫＭ抗体との複合体を形成するための捕獲抗原として用いた組換え 体ＬＫＭタンパク質は、Ｍａｎｎｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，第８３ 巻：１０６６−１０７２により記載のようにシトクロムＰ４５０ｄｂ１のアミノ 酸１２５−４９７を含む。このＬＫＭ−１配列に加えて、ＣＫＳタンパク質（Ｃ ＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ）の最初の１４アミノ酸を、Ｔ．Ｂｏｌｌｉｎｇ及び Ｗ．Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第８巻，４８８−４９０ ページ（１９９０）及び“ＣＫＳ Ｍｅｔｈ ｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”と題する米国特許第５，１ ２４，２５５号に従って、ＬＫＭのＮ末端に融合させた。微粒子のコーティング には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞溶解物を用い、該溶解物は、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ＭのＮａＣｌ及び４Ｍの尿素による連 続洗浄段階を実施することにより組換え体タンパク質の濃度を濃厚にした。 Ｂ．組換え体ＣＫＳ−ＬＫＭ シトクロムＰ４５０ｄｂ１（ＬＫＭ−１）配列（Ｍａｎｎｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ ．Ｉｎｖｅｓｔ ，第８３巻：１０６６−１０７２により公開されたアミノ酸１２ ５−４９７をコードする）をＮ末端でＣＫＳに再クローニングして融合タンパク 質を形成した。Ｔ．Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＷ．Ｍａｎｄｅｃｋｉ，前出）及び“Ｃ ＫＳ Ｍｅｔｈｏｄ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（前出）に 記載の修飾ｌａｃプロモーターの制御下に、ＣＫＳ遺伝子を含む発現ベクターに ＬＫＭ−１遺伝子をクローニングし、ＬＫＭ−１−ＣＫＳ融合タンパク質のＤＮ Ａを調製した。２５〜３５％硫酸アンモニウム分別により、溶解したＥ．ｃｏｌ ｉから融合タンパク質を調製した。実施例２Ａに記載のよう にして、組換え体タンパク質を濃縮する。 実施例３：固相の調製 Ａ．固相の洗浄 １ｍｌの微粒子懸濁液（バンのスチレン／ビニルカルボン酸、０．２１６μｍ 、１０％固体〔Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ ４６０３２−２８２３，ＵＳＡから入手可能〕を試験管に入れた。１０％固体微 粒子１ｍｌ当たり０．５ｇの混合床樹脂を加え、室温で１時間４５分インキュベ ートした。インキュベーション後、微粒子混合物を濾過し、１０％固体１ｍｌ当 たり５ｍｌの水で洗浄した。濾過・洗浄段階の後、ＭＩＣＲＯＧＯＮ（商標）Ｍ ｉｃｒｏＫｒｏｓシリンジフィルター〔ＭＩＣＲＯＧＯＮ、Ｌａｇｕｎａ Ｈｉ ｌｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能〕を用いて微粒子を１０％固体に再濃縮した 。 Ｂ．コーティング手順 以下の手順を用いて、ミクロソーム画分を微粒子にコーティングした。実施例 ３Ａの手順に従って洗浄した微粒子２００μｌを７５０μｌのリン酸緩衝塩水（ ＰＢＳ：１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．０９ｍＭのＮａ₂Ｈ ＰＯ₄、１．７６ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄）（ｐＨ７． ４）に加えた。次いで、３μｌのＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）を微粒子に加え 、室温で３０秒間混合した。次いで、５０μｌのミクロソーム画分（タンパク質 濃度：１６ｍｇ／ｍｌ）又は実施例１及び２に記載のように調製した組換え体Ｌ ＫＭを５分間音波処理し、反応混合物に加えて、０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度の ミクロソームタンパク質を得た。その直後に、反応混合物に、１０μｌの１０％ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（ Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入 手可能）を加え、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ上、１２００ ｒｐｍで２時間室温で混合した。次いで、ＭＩＣＲＯＧＯＮＭｉｃｒｏＫｒｏｓ シリンジフィルターを用い、０．１％アジ化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝塩水 （ＴＢＳ：５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ） ５ｍｌを用いて、微粒子を含む反応混合物（１ｍｌ）を１回洗浄した。２回目の 洗浄段階後に、微粒子を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｌａｂｏｒ Ｎｅ ｉｄｉｇ，Ｓ 化ナトリウムを含むＴＢＳに、０．１％固体（コーティン グされた微粒子）の最終濃度になるまで再懸濁した。 実施例４：アッセイ手順 使い捨て式試薬及び試験装置を用い、ＩＭｘ（登録商標）システムアナライザ ー（これらは全て、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬから入手し得る）で以下のアッセイを実施した。試験血清を、希 釈緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ ＨＣＶ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ，コード番号４Ａ１４Ｆ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏ ｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）中、１：１０００に手動希釈した。次いで 、希釈した試験血清１５０μｌをＩＭｘ（登録商標）予備希釈ウエルに手動で入 れた。実施例３Ａ及び３Ｂに記載のように調製した微粒子５０μｌ及び希釈した 血清６０μｌは自動的に反応ウエルに移され、３０μｌのＭＥＩＡ緩衝液（Ａｂ ｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳＡ から入手可能）が自動添加された。反応混合物を３５℃で２０分間インキュベー トした。次いで、９０μｌの反応混合物（微粒子／希釈血清及びＭＥＩＡ緩衝液 を含む）が自動的にフィルターに移された。フィルターは２００μｌのＭＥＩＡ 緩衝液で自動的に洗浄され た。次いで、抱合体希釈緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ ｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳＡから入手可能）に希釈した抱合体（ヤギ抗 ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ抱合体）６５μｌが自動的にフィルターに加 えられた。この反応混合物を３５℃で５分間インキュベートした。インキュベー ション後、フィルターは、５０μｌのＭＥＩＡ緩衝液で３回、最後に１００μｌ のＭＥＩＡ緩衝液で１回自動的に洗浄された。次いで、フィルターに５０μｌの ＭＵＰ溶液を加え、ＩＭｘ（登録商標）装置によりフルオレセインとして検出し 得る酵素活性を測定した。実施例５．自動化システムにおける自動免疫血清と種々の肝臓細胞抗原でコーテ ィングした微粒子との反応性の比較 ブタの肝臓のホモジネートを示差超遠心により分離した。第１ペレットＰ１は 主として核及び粗細胞膜断片を含んでいた。上清をより高速で再遠心してＰ２ペ レットを得たが、該ペレットは主として重いミトコンドリアを含んでいた。第２ 上清を用いて同一段階をより高速で繰り返してペレット３（Ｐ３）を得たが、該 ペレットは、主として軽いミトコンドリアを含んでいた。第３上清をより高速で 遠心して、 小胞体断片から自然に形成された小胞であるミクロソームを含むペレットＰ４を 得た。 実施例３Ｂに記載の微粒子のコーティングに、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した４ペ レットを用いた。コーティングした微粒子を、上記実施例４に記載のＩＭｘ（登 録商標）アナライザーで試験した。図２を参照すると、バーは、ブタ肝臓細胞の ミクロソーム画分（Ｐ４）、軽いミトコンドリア（Ｐ３）又は重いミトコンドリ ア（Ｐ２）又は核（Ｐ１） 体陰性対照血清を用いた平均ＩＭｘ（登録商標）速度を示している。 微粒子にコーティングしたＰ４材料は、抗ＬＫＭ抗体に対して最も特異的であ ることを示しているが、該微粒子上では弱い抗ＬＫＭ血清ですらＡＭＡ及びＡＮ Ａ血清よりまだ速い速度を示した。ＡＭＡに対する最も高い反応性はミトコンド リア画分Ｐ２及びＰ３だけでなくＰ１画分にも見られるが、これは、ミトコンド リアを含む溶解していない細胞によるものと思われる。ＡＮＡ血清の反応性は、 核含 有画分ではＰ２及びＰ１が最高である。実施例６．自動システムにおけるＲＩＡ力価と得られた速度との相関関係 既に抗ＬＫＭ放射線免疫検定法（ＲＩＡ）で試験した１８種の抗ＬＫＭ陽性血 清を、抗ＬＫＭ ＩＭｘ（登録商標）検定により試験した。ブタのミクロソーム を用い、微粒子を実施例３に記載のようにコーティングした。ＩＭｘ（登録商標 ）アナライザーを用い、上記実施例４に記載のように試験を実施した。図３では 、Ｙ軸上の１８種の血清のＲＩＡ力価のｌｏｇ（１：ｌｏｇＹ値）をＸ軸上のＩ Ｍｘ（登録商標）速度のｌｏｇに対してプロット（１秒当たりのｌｏｇ対数比） して、２種の異なる検定により得られた結果の相関関係を示した。ＩＭｘ（登録 商標）検定により得られた結果は、ＲＩＡの結果と非常に良く相関していた。相 関係数はｒ＝０．９４である。 次いで、１：ミクロソームでコーティングした微粒子、２：組換え体ＬＫＭで コーティングした微粒子及び３：組換え体ＣＫＳ−ＬＫＭでコーティングした微 粒子を用い、組織スライド上の免疫蛍光検定により抗ＬＫＭに対して陽性である ことが知られている７８種の血清をＩＭｘ（登録 商標）アナライザーで試験した。コーティングは、上記実施例１〜３に記載のよ うに行った。抗原は全て０．５ｍｇ／ｍｌの抗原濃度でコーティングした。上記 のようにしてＩＭｘ（登録商標）アナライザーで試験を実施した。組換え体タン パク質を用いて得られた結果は、ミクロソームを用いて得られた結果と非常に良 く相関していた。図４のグラフに見られるように、Ｙ軸上の２種の異なる組換え 体タンパク質（^■組換え体ＬＫＭ、^□組換え体ＣＳＫ−ＬＫＭ）を用いて得られ た速度のｌｏｇに対してＸ軸上でプロットしたミクロソームでコーティングした 微粒子を用い、７８人の患者を抗ＬＫＭ抗体について分析した後で、ＩＭｘ速度 のｌｏｇを得た。 相関係数は： ・ミクロソーム／組換え体ＣＫＳ−ＬＫＭでは、ｒ＝０．８６６であった。 ・ミクロソーム／組換え体ＬＫＭでは、ｒ＝０．８７２であった。 両方の組換え体タンパク質を比べた相関関数は、ｒ＝０．９９６であった（グ ラフには示さず）。実施例７．抗ＬＫＭ ＩＭｘ検定による、免疫抑制療法中の 抗ＬＫＭ抗体陽性患者のモニター 自己免疫肝炎にかかり、免疫抑制療法による治療を受けた２人の患者から血液 試料を所定の時点で採取し、解析するために−２０℃で貯蔵した。上記実施例１ 〜４に記載のように抗ＬＫＭ力価の分析を行った。図５Ａ及び図５Ｂは、自己免 疫肝炎患者の治療中の一定期間、即ち、Ａ：９ケ月及びＢ：３年にわたるＬＫＭ 力価（ＩＭｘ速度）（Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）を示している。本発明の抗ＬＫＭ検 定法を用いると、患者の臨床状態の改善と相関して、抗ＬＫＭ力価が減少するこ とが認められた。 当業者は、本発明により提供された教示を考慮することにより、反応条件、時 間計画及びシグナルデコンボリューションアルゴリズムを熟考して、同一アッセ イ手順において２種を超える分析物を測定し得る。従って、これらの選択は本発 明の範囲内であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レーリク，カイ ドイツ連邦共和国、65399・キードリツヒ、 シヤルフエンシユタイナーシユトラーセ・ ２ (72)発明者 トーム−クローマー，ビルギツト ドイツ連邦共和国、61440・オーバーウア ゼル、クールマインツエル・シユトラー セ・141

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試験試料中に存在し得る抗ＬＫＭ自己抗体の定量法であって、 （ａ）試験試料を、固相に結合したＬＫＭ特異結合メンバーと共に、ＬＫＭ抗原 ／抗ＬＫＭ抗体特異結合ペアの形成に十分な時間及び条件下にインキュベートす る段階； （ｂ）そのようにして形成された特異結合ペアと共に、測定可能なシグナルを生 成し得るシグナル生成化合物に付着した種特異抗体を含むインジケーター試薬を インキュベートする段階；及び （ｃ）検出されたシグナルを測定し、検出されたシグナルの量を試験試料中に存 在する抗ＬＫＭ抗体の量と相関させる段階 からなる方法。 ２．固相が、ＬＫＭミクロソーム画分又は組換え体ＬＫＭ−１（シトクロムＰ４ ５０ｄｂ１）アミノ酸１２５−４９７からなる群から選択されたＬＫＭ−１抗原 が付着した微粒子の懸濁液である請求項１に記載の方法。 ３．試験試料を段階（ａ）の実施前に希釈する請求項１に 記載の方法。 ４．段階（ｂ）の実施前に、多孔質要素上の微粒子分離により、ＬＫＭ抗原／抗 ＬＫＭ自己抗体を含む固相を特異結合ペアから分離し、該固相を洗浄する段階を さらに含む請求項１に記載の方法。 ５．段階（ｂ）の前記シグナル生成化合物がアルカリホスファターゼである請求 項１に記載の方法。 ６．前記種特異抗体がヤギ抗ヒトＩｇＧである請求項１に記載の方法。 ７．ＬＫＭ自己抗体検定の実施用試験キットであって、 ａ．固相に結合したＬＫＭ抗原を含む容器；及び ｂ．測定可能なシグナルを生成し得るインジケーター試薬を含む容器 からなる試験キット。 ８．前記（ａ）の固相が、ＬＫＭミクロソーム画分又はＬＫＭ−１シトクロムＰ ４５０ｄｂ１アミノ酸１２５−４９７からなる群から選択されたＬＫＭ−１抗原 でコーティングされた微粒子である請求項７に記載の試験キット。 ９．前記インジケーター試薬がアルカリホスファターゼに付着したヤギ抗ヒトＩ ｇＧである請求項７に記載の試験キ ット。