JPH09504434A - スフィンゴ脂質塩基を生成する微生物菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び／又はそれらの誘導体を、変異の誘発及び選択技術により、高い水準で生成可能な微生物菌株の製造方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 スフィンゴ脂質塩基を生成する微生物菌株 本発明は、変異の誘発及び選択技術によりスフィンゴ脂質塩基を生成する微生 物菌株の改良方法に関するものである。 発明の背景 用語“スフィンゴ脂質”は、スフィンゴシンから誘導される一群の脂質を指す 。スフィンゴ脂質はしばしば動物や植物、微生物の細胞膜に存在する。生体内に おけるスフィンゴ脂質の正確な機能は未知なままであるが、この化合物群が神経 系における電気信号の伝達や細胞膜の安定性に関係していることは明らかである 。グリコスフィンゴシンが免疫系において有する機能：細菌毒素の受容体として 、又あるいは細菌及びウイルスの受容体としてのグリコスフィンゴシンの特異的 な機能も示唆されている。 スフィンゴ脂質はスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン又はフィトスフィ ンゴシンを塩基として脂肪酸とのアミド結合に含んでいる。スフィンゴシンある いはフィトスフィンゴシン塩基は、スフィンゴ脂質の特殊な群、すなわちセラミ ド類の合成の出発物質として使用してもよい。セラミド類は角質層、つまり皮膚 上層の主要脂質化合物である。角質層には重要なバリヤー機能があり、外部の化 合物をバリヤーの外に通常引き留めたり、水分の損失を抑制する。セラミド類の ようなスフィンゴ脂質を皮膚化粧品に添加することにより、バリヤー機能や皮膚 の水分保持機能が向上する(Curatolo,1987; Kerscher et al.,1991)。 現在、化粧品に利用する異種のスフィンゴ脂質製造物はほとんどが動物源から 抽出されている。明らかに、これは工業スケールではかなり費用がかかる。また 、これらの物質は潜在的に危険であり、例えば、牛の組織における海綿状脳脊髄 炎(BSE)の存在が考えられるためである。このように、化粧品産業は、動物の組 織とは別の源から得られる純粋で、はっきりしたスフィンゴ脂質の新しいへの興 味を増している。 以前はハンゼヌラ シフェーリ(Hansenula ciferrii)やエンドミコプシス シフェーリ (Endomycopsis ciferrii)と表されていた酵母ピチア シフェーリ(Pi chia ciferrii) (Barnett et al.,1990; Stodola and Wickerhaｍ,1960; Wickerh am and Stodola,1960; Wickerham et al.,1954; Wickerham,1951）のような微生 物が、スフィンゴシンと同様、フィトスフィンゴシン及び／又はそれらの誘導体 のようなスフィンゴ脂質を生成することが見出された。この発見は、スフィンゴ 脂質自身用の源と、他の商業的に価値のある化合物を製造するための出発物質用 の源を与えるものであり、これらの化合物の動物源の使用に対して生育可能な代 替物を提供し得る。 例えば、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン及びフィトスフィンゴシン のアセチル化誘導体を脱アセチル化してもよく、このようにして得られたスフィ ンゴシン、ジヒドロスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシンは、セラミド類 、疑セラミド類及び／又はグリコセラミド類のような、引き続いて化粧品や治療 用製品に利用可能な関連する化合物に化学的に転化してもよい（Smeets and Web er,1993）。 フィトスフィンゴシン及び／又はそのアセチル化誘導体の製造は、カンジダユ チリス (Candida utilis)及びサッカロミセス セレビジエ(Saccharomyces cerev isiae )(Wagner and Zofcsik,1966; Oda and Kamiya,1958)、ハンセニアスポラ バルビエンシス (Hanseniaspora valbyensis)(Braun and Snell,1967)及びトルロ プシス ユチリス(Torulopsis utilis)(Kulmacz and Schroepfer Jr.,1978)のよ うな酵母中で具体的に示されてきた。フィトスフィンゴシンの製造は、真菌類ア スペルギルス シドウィ(Aspergillus sydowi)及びペニシリウム ノテータム(P enicillium notatum) (Stodola and Wickerham,1960)でも報告されている。 さらに、サッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyes) 、デバロミセス(Debaromyces)、ピチア(Pichia)、ハンゼヌラ(Hansenula)、リポ ミセス (Lipomyces)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、クリプトコッカス(Cr yptococcus )、トルロプシス(Torulopsis)、カンジダ(Candida)、トリコスポロン (Trichosporon)及びロードトルラ(Rhodotorula)の属から選んだ30種の酵母を調 べた研究において、全種類が、少なくとも一種のスフィンゴ脂質 (セラミドモノヘキソサイド(ceramide monohexoside))を含み、スフィンゴ脂質 製造に潜在的に使用できることが分かった(Kaneko et al.,1977)。 スフィンゴ脂質製造はスフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)(Yano et a l.,1983)、アセトバクター(Acetobacter)、バクテロイデス(Bacteroides)、デロ ビブリオ (Bdellovibrio)、ザントモナス(Xanthomonas)及びフラボバクテリウム(Flavobacterium )(Tahara et al., 1986)のような細菌属の菌株にも具体的に示さ れてきた。 Stoffelら(1968)は、酵母ハンゼヌラ（ピチア）シフェーリ(Hansenula(Pichia )ciferrii )が、研究の中で先駆物質として使用した全ての長鎖塩基をアセチル化 することを見出した。スフィンゴシンはトリアセチルスフィンゴシンに転化され 、ジヒドロスフィンゴシンはトリアセチル-、ジアセチル-及びN-アセチル-ジヒ ドロスフィンゴシンに転化される。また、フィトスフィンゴシンの３つのアセチ ル誘導体、すなわち、テトラアセチル-、トリアセチル-及びN-アセチル-フィト スフィンゴシンが単離された。これらのアセチル誘導体に加えて、ハンゼヌラ シフェーリ (Hansenula ciferrii)は長鎖塩基を含む媒質中で長鎖セラミド類を生 成した。 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)中でのテトラアセチルフィトスフィン ゴシン(TAPS)の生合成経路は、Barenholzらによって記述されている(1973)。ス フィンゴシン及びジヒドロスフィンゴシンの生合成経路はDimariらによって提案 されている(1971)。 Barehnholzら（1971及び1973）は、TAPS及び他のスフィンゴ脂質塩基生成の代 謝背景をハンゼヌラ（ピチア）シフェーリ(Hansenula(Pichia)ciferrii)の４株 で検した。後の研究では、４つのミクロゾーム酵素、すなわちアセチル化スフィ ンゴシン塩基の生合成に特異的な酵素の、低い生産者(ハンゼヌラ シフェーリ(Hasenula ciferrii) NRRL Y-1031,E-11,sex b,8-20-57)と高い生産者(ハンゼヌラ シフェーリ(Hansenula ciferrii)NRRL Y-1031,F-60-10)の特性を比較した。3- ケト ジヒドロスフィンゴシンシンセターゼ及び長鎖塩基アセチル-補酵素Ａア セチルトランスフェラーゼの特異活性が、低い生産者と比較した場合、それぞれ ５−10倍及び30倍に増加し、一方、パルミチルチオキナーゼ及び3-ケト ジヒドロスフィンゴシンリダクーゼは同じような結果となった。これは、低い生 産者においては、3-ケト ジヒドロスフィンゴシンシンセターゼ及び長鎖塩基ア セチル-補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼの活性がアセチル化スフィンゴシ ンの合成過程では律速段階であることを示している。一定の生育条件下では、ハ ンゼヌラ シフェーリ(Hansenula ciferrii)NRRL Y-1031 F-60-10 が300μmoles /lのスフィンゴシン塩基(約0.15g/l)を産生し、そのうち少なくとも250μmoles/ lが細胞外のものであることが分かった。培養条件がTAPS生成に最適であっても 、0.485g/lのTAPS(0.024g TAPS/g 乾燥酵母)しか得られなかった(Maister et al .,1962)。 しかし、今日までのところ研究された酵母菌株で、ピチア シフェーリ(Pichi a ciferrii) NRRL Y-1031 F-60-10でさえ、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシ ン或いはそれらの誘導体のようなスフィンゴ脂質塩基を、有効で、経済的に魅力 あるそのような化合物の源として十分な量だけ生成したものはない。例えば、TA PSをより多く生成できる可能性のある酵母菌株は、この、引き続き商業的に利用 可能な最終生成物、例えばセラミド類、疑セラミド類及びグリコセラミド類に転 化できる重要な出発物質の生産について、経済的可能性と魅力をかなり向上させ るだろう。 発明の概要 本発明は、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン 或いはそれらの誘導体を、変異の誘発及び選択技術により、高い水準で生成可能 な微生物菌株の製造を提供する。このようにして得られた突然変異菌株は、同一 条件下で培養した親菌株の製造水準と比較して、高い水準で所望の製品を生成す る。これらの向上した製造水準は、経済的に魅力あるこれらの化合物、つまり、 それ自体の使用のための、或いは商業的に価値のある最終生成物に転化するため の出発物質の源を提供する。 発明の詳細な説明 本発明は、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン 及びそれらの誘導体の生成が、該化合物を生成することがあらかじめ測定されて いる微生物菌株の変異の誘発と選択の連続サイクルによって増加し得ることを示 す。この方法では、生合成の障害は徐々に除去可能であり、結果としてこれらの 生成物の製造を高める。 本発明は、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン 及び／又はそれらの誘導体を、親株と比べて高いレベルで生成可能な微生物菌株 を製造する方法であって、前記親株を十分な量の適当な変異源で処置して、同一 条件下で培養した場合、親株と比べて高い水準で所望の化合物を生成可能な変異 菌株を提供し、次に所望の生成物の増加した生産性を基礎として変異菌株を選択 する工程を含む少なくとも一つの変異誘発処理を親株に施す。 特に、スフィンゴシン及び／又は3-ケトスフィンゴシン、トリアセチルスフィ ンゴシン、ジアセチルスフィンゴシン及びN-アセチルスフィンゴシンを含む、そ れらのケト、グリコシル化又はアセチル化誘導体；ジヒドロスフィンゴシン、及 び／又は3-ケトジヒドロスフィンゴシン、トリアセチルジヒドロスフィンゴシン 、ジアセチルジヒドロスフィンゴシン及びN-アセチルジヒドロスフィンゴシンを 含む、それらのケト、グリコシル化またはアセチル化誘導体；及び／又はフィト スフィンゴシン及び／又は、テトラアセチルフィトスフィンゴシン、トリアセチ ルフィトスフィンゴシン、ジアセチルフィトスフィンゴシン及びN-アセチルフィ トスフィンゴシンを含む、それらのケト、グリコシル化またはアセチル化誘導体 を高い水準で生成可能な突然変異株を生成する。好ましい化合物はスフィンゴシ ン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び／又はそれらのアセチ ル化誘導体である。さらに好ましい化合物は、フィトスフィンゴシン及びそれら のアセチル化誘導体である。最も好ましいのは、テトラアセチルフィトスフィン ゴシン(TAPS)である。 好ましくは、本発明の方法により生成し、実施例（下記）に記載のように培養 した変異菌株は、0.030g TAPS/g酵母乾燥重量、好ましくは、0.050g TAPS/g酵母 乾燥重量、好ましくは、0.060g TAPS/g酵母乾燥重量、好ましくは、0.075gTAPS/ g酵母乾燥重量、好ましくは、0.10g TAPS/g酵母乾燥重量、好ましくは少なくと も0.15g TAPS/g酵母乾燥重量、最も好ましくは少なくとも0.20g TAPS/g酵母乾燥 重量を産生することができる。 本発明に使用してもよい菌株（すなわち親株）は、スフィンゴシン、ジヒドロ スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び/ 又はそれらの誘導体を天然に生成 可能な、酵母、細菌類菌株及び真菌類菌株を含む。好ましくは、本発明の方法に 用いる候補の（親）株は、所望の化合物の生成水準が生来最も高い株である。 本発明で使用する酵母菌株は以下の属の種から選んでもよい：サッカロミセス (Saccharomyces)，クルベロミセス(Kluveromyces)、デバロミセス(Debaromyces) 、ピチア(Pichia)、ハンゼヌラ(Hansenula)、リポミセス(Lipomyces)、スポロボ ロミセス (Sporobolomyces)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トルロプシス(T orulopsis )、エンドミコプシス(Endomycopsis)、カンジダ(Candida)、トリコス ポロン (Trichosporon)、ハンゼニアスポラ(Hanseniaspora)及びロドトルラ(Rhod otorula) 。好ましい酵母菌株は、ピチア(Pichia)、ハンゼヌラ(Hansenula)、エ ンドミコプシス(Endomycopsis) 、カンジダ(Candida)、サッカロミセス(Saccharo myces )及びハンゼニアスポラ(Hanseniaspora)属に、特に、ピチア シフェーリ( Pichia ciferrii （前にハンゼヌラ シフェーリ(Hansenula ciferrii)及びエン ドミコプシス シフェーリ(Endomycopsis ciferrii)として示した）、カンジダ ユチリス(Candida utilis)およびサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) 種に属するものである。最も好ましいのはピチア(Pichia)属に属す る酵母菌株であり、最も好ましいのはピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)種( 特にピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-1031F-60-10)に属するもので ある。 好ましい真菌はアスペルギルス(Aspergillus)及びペニシリウム(Penicillium) 属のものであり、さらに好ましくはアスペルギルス シドウィ(Aspergillus syd owi) 及びペニシリウム ノーテタム(Penicillium notatum)種のものである。 好ましい細菌は、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacteirum)(特にスフィン ゴ ベルサチルス(S.versatilis)、スフィンゴ マルチボラム(S.multivorum)及 びスフィンゴ ミズーテ(S.mizutae))、アセトバクター(Acetobactor)(特にアセ トバクター キシリナム(A.xylinum))、バクテロイデス(Bacteroides)(特にバク テロイデス メラニノゲニカス(B.melaninogenicus)、バクテロイデス フラギ リス(B.fragilis) 、バクテロイデス ルミニコラ(B.ruminicola)及びバクテロイ デス テタイオタオミクロン(B.thetaiotaomicron))、デロビブリオ(Bdell ovibrio) (特にデロビブリオ バクテリオブス(Bdellovibrio bacteriovus))、ザ ントモナス(Xanthomonas )(特にザントモナス カンペストリス(Xanthomonas cam pestris) )及びフラボバクテリウム(Flavobacterium)(特にフラボバクテリウムデ ボランス (Flavobacterium devorans))属のものである。 本発明に従い、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴ シン及び／又はそれらの誘導体の向上した生産性をもたらす適当な変異原を用い て変異の誘発を行ってもよい。好ましい変異原の例は紫外線照射、エチルメタン スルホネート及びN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンである。 変異の誘発は一度だけでもよいが、２回或いはそれ以上行うのが好都合である ことが分かった。菌株がTAPSのような所望の生成物を多く生成する能力は、個々 の変異の誘発段階の後に高まる。 変異を誘発する反応が終了した後、得られる変異種として、所望のスフィンゴ シン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び/ 又はそれらの誘導 体の生成を促す条件下で培養した場合、所望の生成物の最高の生成水準を示すも のを選んでもよい。 高生成変異細胞の予選択を、単一コロニーの結晶領域の寒天プレートの目視に よる観察により行い、次いで単離する。コロニーの大きさと比べて結晶の直径が 最大のコロニーを選ぶ。他の予選択の方法を使用してもよく、例えば、アミノ酸 類縁体或いはタンパク質合成抑制剤への耐性を用いてもよい。 この方法で単離した細胞は振盪フラスコ或いは培養管で培養してもよく、適切 な変異種を、発酵培地の適当な希釈液の分析を経て所望の化合物の生成水準を決 定することにより選択する。実施例に詳しく述べたように、生育条件は、本発明 の菌株により所望の生成物を産生する水準を決定する参考として与えられるもの である。しかし、他の培養条件は、所望の生成物の産生を促すものであるが、当 業者にとって既知のものであり、本発明の趣旨から離れることなく使用してもよ い。 定量分析は種々の方法で行ってもよく、例えば、TAPS及び関連する化合物の過 ヨウ素酸塩での酸化を経る連続的脱アセチル化による。アルデヒドは、TAPSおよ び関連する化合物の酸化の分解生成物であり、理論量で生成する。 TAPSの生成水準に基づく選別は追加的に或いは選択的に、CDCl₃で抽出し、NMR で分析し、振盪フラスコ内で行ってもよい。TAPSは好ましくはNMR分析の標準と して使用する。 スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及びジヒドロスフィンゴシン；スフィ ンゴシン、フィトスフィンゴシン及びジヒドロスフィンゴシンのトリアセチル、 ジアセチル及びN-アセチル誘導体；スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン及び ジヒドロスフィンゴシンのグリコシル化誘導体；3-ケトジヒドロスフィンゴシン 、及び／又は3-ケトスフィンゴシンのような他の所望の生成物は、同じ方法でTA PS標準を対照として定量してもよい。 一度所望の生成物が得られたならば、直接使用してもよく、或いは、最終用途 のためににさらに処理してもよい。例えば、スフィンゴシン、ジヒドロスフィン ゴシン及びフィトスフィンゴシンのアセチル化誘導体は、酵素的にあるいは化学 的に脱アセチル化し、続いて、セラミド類、グリコセラミド類、及び疑セラミド 類のような商業的に価値のあるスフィンゴ脂質生成物合成の出発物質として使用 してもよい(Smeets and Weber，1993)。 次の実施例は、当業者に本発明の完全なる開示及び記述を与えるために提供す るものであり、発明者が発明とみなしたものの範囲を制限するためのものではな い。使用した数字の正確さを確保するために努力をしたが（例えば、量、温度、 pH等）、幾つかの実験的誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。特に記載しな い限り、温度は摂氏で、圧力は大気圧かその付近である。 製造例Ａ テトラアセチルフィトスフィンゴシン標準の調製 フィトスフィンゴシン1.0g(2.8mmol)（シグマ）、無水酢酸2.7ml(28mmol)、ト リエチルアミン2.1ml(15mmol)及び純クロロホルム10mlの混合物を加熱し、還流 下で８時間攪拌する。室温まで冷却した後、該混合物を炭酸水素ナトリウム飽和 水溶液でpH７になるまで洗浄する。有機層は、続いてMgSO₄で乾燥、濾過し、真 空中で50℃において蒸発させる。残留物は、メルク(Merck)社製のカラムクロマ トグラフィーを用いて精製する：ローバー フェルティッヒ ザウレ グローセ (Lobor Fertich Saule GroBe) C(440-37) リヒロプレープ(Lichroprep)Si60 (40-60pM)カラム。ジクロロメタン及びメタノールの混合物(25:1)を溶離剤とし て使用する（注入速度10ml/min）。得られた生成物は白色固体で収率80％で形成 し、融点41-43℃である。このようにして得られたTAPSの純度はNMR(プロトンNMR 360MHz)を用いCDCl₃中で定量し(p-ニトロトルエンを内標準として使用した)、9 6％と推定した。 前述したようにして誘導した濃度15mg TAPS/ml CDCl₃本発明に記載した全実施 例において標準として使用する。 製造例Ｂ TAPS寒天斜面培養基 ネモウテックス(Nemoutex)122g（ジアスタティッシュ プロダクテン(Diastat ische Produkten)B.V.;ライデン、オランダ）を１リットルの水に溶解し、60分 間、110℃で滅菌する。該懸濁液を室温下で一晩培養し、濾過し固体粒子を除去 する。pHは6.4で一定とする。寒天10g/l(バクト)を加え、該溶液を120℃で30分 間滅菌する。 製造例Ｃ TAPS培地（管培養及び振盪フラスコ用） 化合物 量(g/l) KH-フタレート 20 NaCl 0.06 MgSO₄・7H₂O 0.88 CaCl₂・7H₂O 0.20 NH₄Cl 4.83 KH₂PO₄ 1.0 (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ 0.027 ZnSO₄ 0.005 CuSO₄ 0.0075 MnSO₄ 0.0006 H₃BO₃ 0.0006 Na-モリブデート 0.0006 KI 0.00015 Myo-イノシノール 0.059 ニコチン酸 0.003 Ca-D-パンソテネート(panthotenate) 0.003 ビタミン B₁ 0.003 p-アミノベンゾエート 0.002 ビタミン B₆ 0.0003 ビオチン 0.00001 酵母エキス（ディフコ） 1.0 振盪フラスコと培養管に、最終濃度がそれぞれ33g/l、７g/lになるようにグル コースを加える。該化合物が溶解した後、pHを5.4に調節する。 100mlコニカルフラスコ（バッフルなし）に培地30mlを添加し、110℃で30分間 滅菌する。寒天培地の調製に、寒天(バクト)20gを培地に添加し、同じ滅菌操作 を行う。 製造例Ｄ YEP-D培地 バクトペプトン 20g 酵母エキス 10g グルコース 20g バクト-寒天 20g 脱イオン水1000mlを加え、pHを7.0で一定とする。培地を30分間110℃で滅菌 する。 製造例Ｅ 生理食塩培地 脱イオン水１リットルに、NaCl 8.5gを溶解し、20分間、120℃で滅菌する。 製造例Ｆ 細胞培養の生育条件 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-1031 F-60-10及びその突然変異 株をスラントあるいは寒天プレート上で24℃の培養器で培養する。 培養管内での培養は、TAPS培地3.0mlを含む40mlガラス管(直径2.5cm)で行う。 培養管は、ガレンカンプ軌道培養器(Gallenkamp orbital incubator)(300rpm,24 ℃)の棚に垂直にたて、３日間培養する。発酵が完了した後、このようにして得 られたTAPS濃度を、培養している間の蒸発について補正する。該突然変異株を４ 回試験する。 振盪フラスコ（バッフルなし）での培養は、100ml コニカルフラスコに入れた TAPS培地30ml（上記参照）又は500mlコニカルフラスコに入れた培地100ml中で行 う。培養はガレンカンプ軌道培養器(Gallenkamp orbital incubator)(250rpm,24 ℃）で３日間行う。発酵が完了した後、このようにして得られたTAPS濃度を培養 している間の蒸発について補正する。該突然変異株を４倍試験する。 実施例１ 紫外線(UV)照射による変異の誘発 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-1031 F-60-10或いはその突然変 異誘導体の半対数(semi-logarithmic)培養物(100ml)をYEP-D或いはTAPS培地で培 養（24時間、24℃、250rpm）する。培地を遠心分離し（ハラエアス セパテック ミニフュージ RF セントリフュージ(Haraeus sepatech minifuge RF centrifu ge)，5,000×g，５分）、ペレットを生理食塩培地25mlで２回洗浄する。細胞懸 濁液を最終濃度10⁸cells/mlになるように希釈し、該懸濁液10mlを滅菌ペトリ皿( 直径9cm)にピペットで移す。次に、プレート培地を照射源（オズラム ランプ(O sram lamp)HQV，125ワット）から23cmの距離でUV照射し、それぞれ0,15,30,60,9 0秒照射する。さらに照射細胞を暗闇に置く（30分間、20℃）。生菌率を 測定するため、突然変異細胞懸濁液の希釈液をYEP-D寒天培地に塗抹する。残っ ている細胞懸濁液をTAPS培地で一晩培養する。所望ならば、グリセロールを最終 濃度10％まで加えても、懸濁液を-20℃で保存してもよい。24℃で３日間培養し た後、コロニーを数え、生菌率を計算する。照射処理により生菌率が約10％とな る細胞懸濁液を、高TAPS-生成突然変異種を選択するために使用する。 実施例２ エチル- メタン- スルホン酸塩(EMS)による変異の誘発 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-1031 F-60-10或いはその突然変 異誘導体の半対数培養物(100ml)を実施例１に記載したように培養、洗浄するが 、ペレットの洗浄は、pH7.5のIMトリス- 塩酸50mlを生理食塩培地の代わりに用 いる。その後、細胞はpH7.5の1.0Mトリス- 塩酸緩衝液25mlで最終濃度10⁸cells/ mlまで希釈する。 ６mlの細胞懸濁液に、EMS300μlを添加し、室温下で培養する。0,1,3,6,12分 毎に、サンプル１mlを摂取する。その後、細胞を生理食塩培地９mlで２回洗浄し 、適当な希釈度でYEP-D寒天培地に塗抹する。残っている突然変異細胞を一晩培 養し、実施例１に記載したように生菌率を概算する。10％の生菌率を示したサン プルを高TAPS-生成突然変異種を単離するために選択する。 実施例３ N-メチル-N'-ニトロ-N- ニトロソグアニジン(NTG)による変異の誘発 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-1031 F-60-10或いはその突然変 異誘導体の半対数培地(100ml)を実施例１に記載したように培養、洗浄するが、 ペレットの洗浄は、pH7.5の1Mトリス- 塩酸50mlを生理食塩培地の代わりに用い る。その後、細胞はpH7.5の1.0Mトリス- 塩酸緩衝液25mlで最終濃度10⁸cells/ml まで希釈する。 ６mlの細胞懸濁液に、新しく調製したNTGの貯蔵溶液600μlを添加し、室温下 で培養する。0,1,3,6,12分毎に、サンプル１mlを摂取する。次に、細胞を生理食 塩培地９mlで２回洗浄し、適当な希釈度でYEP-D寒天培地に塗抹する。該突然変 異細胞を一晩培養し、実施例１で行ったように生菌率を概算する。10％の生菌率 を示したサンプルを高TAPS-生成突然変異種を単離するために選択する。 実施例４ 突然変異種の予選択 TAPS-寒天培地の予選択を行う。上記実施例1,2または３に記載したように、細 胞を適度に希釈したもの(25-50コロニー／プレート)を得、4-7日間、24℃におい て培養器で培養する。結晶化を剌激するために、プレートを４℃で一晩培養する 。その後、最も結晶化比（結晶化比= コロニーを取り囲む結晶化領域の直径(mm) / コロニーの直径(mm)）の高いコロニーを選ぶ。 該コロニーを単離し、TAPS- 寒天培地を含む寒天プレートに移す。このプレー トを“マスタープレート”とし、コロニーを“原コロニー”として示す。これら のマスタープレート上の細胞物質を、培養管や、振盪フラスコ中での高TAPS生産 者の選択及び貯蔵の目的で使用する。 実施例５ 培養管生育培地でのTAPS分析（方法１） 実施例４で得られた細胞のさらなる選択は、次に、培養管及び振盪フラスコ内 で準備例Ｆで記載したように行い、分析は下記のように行う。TAPS定量の方法は ３つの工程に別れる（セクション５a-c）。5a テトラアセチルフィトスフィンゴシンの脱アセチル化 0.05-0.3g/lのTAPS貯蔵溶液を基準として用いる。サンプル１mlに、予想され るTAPS量の８倍過剰に水酸化ナトリウムを添加し、該溶液を50℃で２時間培養す る。5b フィトスフィンゴシンの酸化 過ヨウ素酸ナトリウムを添加することによりフィトスフィンゴシンを酸化する 。 CH₃-(CH₂)₁₃-CHOH-CHOH-CHNH₂-CH₂-OH−−−→ CH₃-(CH₂)₁₃-CHO + 2 HCOOH + NH₃ + HCHO 上記工程ａで得られた脱アセチル化反応混合物サンプルに、30mM過ヨウ素酸カ リウムを0.1M酢酸緩衝液pH5.4に溶かした溶液１mlを添加する。続いて、室温下 、暗所で一晩酸化する。その間、反応混合物は、IKA Vibrax VXR 電気振盪器(12 5rpm)で穏やかに振盪する。反応中生成したアルデヒドが蒸発するのを防ぐ為に 、反応管を注意深く閉じる。5c アルデヒドの定量 上記工程ｂで得られたアルデヒドの量はAvigad(1983)が記載した比色法により 定量してもよい。 工程ｂで酸化した後、パーパルド(Purpald)（アルドリッチ）の１規定NaOH１ ％溶液0.3mlをサンプル0.2mlに添加する。パーパルド試薬は新たに調製するべき である（２時間以上経過していないもの）。この混合物を30分間 IKA Vibrax VX R 電気振盪器(180-200rpm)でインキュベーションする。続いて、NaBH₄の１規定N aOH 0.2％溶液(w/v)0.5mlを添加して反応を終了させる。サンプルの吸着は波長5 48nmで測定する。 実施例６ NMR によるTAPS分析（方法２） 実施例４において得られた細胞をさらに選別するため、続いて、培養管及び振 盪フラスコの中で、製造例Ｆに記載した方法或いは下記のように分析を行う。6a 抽出 振盪フラスコの生育培地からTAPSを抽出するために種々の疎水性有機化合物を 用いてもよい。本発明の実施例において使用した有機抽出化合物は重水素化クロ ロホルム(CDCl₃)である。培地(25ml)をCDCl₃２mlで抽出し、室温下でIKA Vibrax VXR 電気振盪器を用い、５分間水平方向に勢いよく混合する（最高速度）。次 に混合物を遠心分離し（ハラエアス セパテック ミニフュージ RF セントリフ ュージ(Haraeus sepatech minifuge RF centrifuge),10,000×g,５分)、CDCl₃を 除去し、NMRで分析する。6b 核磁気共鳴(NMR)分析 CDCl₃層中のTAPS含有量をTAPS標準と同じ系列で測定し、この目的のために、A MR360 NMR- 装置（ブルーカー- カールスルーエ(Bruker-Carlsruhe)ドイツ）を 用いた。NMR装置は次のように調節した： レシーバーゲインバリュー：固定 緩和時間：５秒 スキャン回数：固定 パルス：45° 得られたFID（自由誘導減衰）のフーリエ変換は絶対強度で行う。TAPSの量（単 位グラム培地当たりのミリグラムで表す）は次式により計算する：積算（サンプル ）×重量標準×純度標準×2/25 積算（標準） 重量及び純度標準はそれぞれ、グラムおよびパーセントで表す。該標準は15mg TAPS/ml CDCl₃を含む。 実施例７ 乾燥重量測定 重量が既知の乾燥した遠心管（Ａ）に約10mlの細胞懸濁液を添加し、再度重量 を測定し（Ｂ）、遠心分離を行う。次に、ペレットを培養器の中で乾燥し（24時 間、105℃）、再び重量を測定する（Ｃ）。乾燥重量は次式に従い計算する（Ａ ，Ｂ，Ｃはグラムで表す）： 乾燥重量（g/kg）＝ ｛（Ｃ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）｝×1000g 乾燥物質／kg 細胞懸濁液 振盪フラスコについて、TAPS含有量（g TAPS/g 乾燥重量）は次式に従い計算 する： TAPS含有量＝TAPS量(g TAPS/kg 培地) 酵母乾燥重量(g/kg 培地) よって、TAPSの製造水準は、g TAPS/g酵母乾燥重量のように表す。 実施例８ ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii) NRRL Y-1031 F-6010の培養により生成 したTAPS及びTAPS培地上で得られた突然変異種の定量 振盪フラスコのTAPS培地上でピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)NRRL Y-10 31 F-60-10は40倍に、CBS III，CBS 1710及びCBS 1910は10倍に、突然変異種は ５倍に増殖し、製造例Ｆに記載したような条件下で培養した。TAPS抽出及びNMR- 分析は実施例６に記載したように行った。乾燥重量測定は実施例７に記載したよ うに行った。 TAPS- 生成酵母菌株の培地を抽出して得られたCDCl₃層のNMRスペクトル共鳴ピ ークは、製造例Ａに記載したように調製したTAPS標準の分析から得られたもの と全く同じ所に位置している。 F-60-10の40個の振盪フラスコ培地の平均生産性は、0.025gTAPS/g酵母乾燥重 量である。CBS 111，CBS 1710及びCBS 1910の生産性は10回の独立した測定の平 均であり、突然変異株の生産性は５回の独立した測定の平均である。突然変異の ５株（5F11，14D11，15G8，20A11及び27D10を指定する）の生産性は下の表に示 す。表に示したように、突然変異株は、親株の生産性よりもかなり高い生産水準 であり、約40-60%高くなっている。 突然変異の５株及び親株ピチア シフェーリ(Pichia ciferri)NRRL Y-1031 F- 60-10は“Centraal Bureau voor Schimmelculture”(CBS)、バールン、オランダ に、1994年７月６日、次の寄託番号で寄託した（上記表参照）:CBS 403.94,CBS 404.94,CBS405.94,CBS 406.94,CBS 407.94（突然変異種）及びCBS 408.94(親株) 。 ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)菌株CBS 111，CBS 1710 及びCBS 1910 と、NRRL Y-1031 F-60-10及び後者の菌株から得られた突然変異種の振盪フラス コ内でのTAPS- 生産性： 菌株 生産性 （g TAPS/g 乾燥重量） CBS 111 0.0072 CBS 1710 0.0046 CBS 1910 ND＊ F-60-10 CBS 408.94 0.023 5F1l CBS 405.94 0.033 14D11 CBS 403.94 0.037 15G8 CBS 404.94 0.034 20A11 CBS 406.94 0.036 27D10 CBS 407.94 0.032 ＊ND= 検出不可能

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ファン デル ウィルト イングリート フランシスカ カロリーヌ オランダ エヌエル‐2613デーエム デル フト ラーン ファン オーヴェルヴェス ト 46

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．突然変異微生物菌株の製造方法であって、スフィンゴシン、ジヒドロスフィ ンゴシン、フィトスフィンゴシン或いはそれらの誘導体から選ばれる所望の化合 物を天然に生成可能な親株を、十分な量の適切な変異源で処理して、同一条件下 で培養した場合に、前記親株と比較して、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴ シン、フィトスフィンゴシン或いはそれらの誘導体を高い水準で生成可能な突然 変異菌株を得、次に、所望の化合物の向上した生産性を基礎として、前記変異株 を選択することを含む少なくとも一つの突然変異誘発処理を親株に施すことを特 徴とする、上記製造方法。 ２．変異源が、紫外線照射、エチルメタンスルホネート或いはN-メチル-N'-ニト ロ-N- ニトロソグアニジンから選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法 。 ３．親株が、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン 、或いはそれらの誘導体から選ばれる所望の化合物を天然に生成可能な、酵母、 細菌類菌株及び真菌類菌株から選ばれることを特徴とする請求項１または２に記 載の方法。 ４．スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン或いはそ れらの誘導体から選ばれる所望の化合物を、同一条件下で培養した場合にその親 株と比較して、高い水準で生成可能な微生物突然変異株であって、請求項１−３ のいずれかに記載の方法で得ることができるものであることを特徴とする突然変 異菌株。 ５．酵母菌株であることを特徴とする請求項４に記載の微生物突然変異株。 ６．ピチア（Pichia）属の種から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の微 生物突然変異株。 ７．ピチア シフェーリ(Pichia ciferrii)種の菌株から選ばれることを特徴と する請求項６に記載の微生物菌株。 ８．スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン或いはそ れらの誘導体から選ばれる所望の化合物を生成する方法であって、請求項４から ７のいずれか１項に記載の菌株を、前記所望の化合物の生成を促す条件下で 培養することを特徴とする上記方法。 ９．スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン或いはそ れらの誘導体から選ばれる所望の化合物を生成する、請求項４から７のいずれか １項に記載の菌株の使用。