JPS60188085A - Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ樹肪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるＬ　（＋）−β−ヒドロキシ脂肪
酸の製造法に関する。更に詳しくは、サツカロマイコピ
シス属、エンドマイセス属、あるいはピキャ属に属し、
醋酸をＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を
有する微生物から誘導されたしく→−β−ヒドロキシ酪
酸を単一炭素源とする栄養培地に生育し得ないか、もし
くは生育の弱い変異株を、炭素数４あるいは５の飽和脂
肪酸あるいはα、β−不飽和脂肪酸あるいはアルコール
に作用させ、生成する炭素数４あるいは５のＬ（＋）−
β−ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特徴とするしく
→−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造法に関するものである
。

光学活性Ｌ（ト）−β−ヒドロキシ脂肪酸は２種の異な
る官能基をもち、医薬、農薬等の合成原料として有用な
物質群である。

炭素数４個のＬ（→−β−ヒドロキシ酪酸の製造法に関
しては、アセト酢酸エステルをパン酵母による不斉還元
法によりＬ（＋）−β−ヒドロキシ醋酸エチルとして得
る方法が知られているが（森ら：日本化学会誌部９最、
１３１５頁、１９８３年）、多量の酵母を必要とするた
め経済的な方法とは考え難い。また炭素数４個の分岐状
Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸であるＬ（＋）−β−
ヒドロキシイソ酪酸に関しては、シュードモナス・′プ
チダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）を用
い、イソ醋酸より生産する方法（Ｃ，Ｔ、　Ｇｏｏｄｈ
ｕｅ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｒ。

５ｃｈａｅｆｆｅｒ　：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第１３巻、２０
３頁、　１９７４年）や、本発明者らにより、デバリオ
マイセス属、ピキャ属を始めとする多くの微生物によっ
てイソ醋酸より生産する方法が知られている（特開昭５
７−６５１９２）。一方法素数５個のＬ（＋）−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸のＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸の製
法に関しては、β−ケト吉草酸エチルをパン酵は還元に
よりＤ（→−β−ヒドロキシ吉草酸エチルが得られる（
　Ｇ、　Ｆｉａｔｅｒ　：ｉ（ｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉ
ｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　６２巻、２８２９頁、１９７９
年）ことが知られているが、これは立体配置が逆である
とともに、光学純度が極めて低い。

Ｌ（＋）−ρ−ヒドロキシ吉草酸に関しては、先に本発
明者らがキャンデイダ・ルゴーザＩＦＯ１５４２により
吉草酸からＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉［有］酸を生産
しうろことを見い出している（特開昭５７−６５１８８
）。これは微生物によってＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉
草酸を生産しうろことを見い出したものであるが、通常
の微生物は直鎖状のＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸を
極めて容易に代謝分解するために収率が極めて低く、大
量生産にはむかない。

そこで本発明者らは、安価で、かつ効率的なＬ　（＋）
−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造法を開発すべく研究の結
果、サツカロマイコピシス属、エンドマイセス属、ある
いはピキャ属に属し、酪酸をＬ（ト）−β−ヒドロキシ
醋酸に変換する能力を有する微生物を変異改良し、Ｌ（
＋）−β−ヒドロキシ酪酸を単一炭素源とする栄養培地
に生育しない変異株に誘導することにより、醋酸、クロ
トン　酸あるいはｎ−ブチルアルコールからＬ（＋）−
β−ヒドロキシ醋酸を、吉草酸、２−ペンテン酸あるい
はｎ−アミルアルコールからＬ　（＋）−β−ヒドロキ
シ吉草酸を高収率に生産しつることを見い出した。

本発明を実施するに当り、変異株取得のために用いられ
る親株として、サツカロマイコピシス・リポリテイ力（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｉｓｉｓｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ　）　Ｉ　ＦＯｌ　５４５　、　ｘ　ンドマイセス
・テトラｙ、べ）ｖマ（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｔｒ
ａｓｐｅｒｍａ　）ＣＢＳ　７６５．７０、あるいはピ
キャ、プルトーニ（Ｐｉｃｈｉａ　ｂｕｒｔｏｎｉｉ　
）　Ｉ　Ｆ　ＯＱ　８４４等があるが、醋酸をＬ（＋）
−β−ヒドロキシ醋酸に、吉慴酸をＬ（→−β−ヒドロ
キシ吉草酸に変換する能力を有する微生物であれば、い
ずれも用いることができる。

微生物と基質とを作用させＬ（ト）−β−ヒドロキシ脂
肪酸に変換させる方法としては、微生物を栄養培地で培
養し、得られた培養液に、あるいは培養液から微生物を
分離して菌体懸局液を調整し、それに基質を反応させる
方法、あるいは基質を添加した培地で微生物を培養する
ことにより微生物と基質を反応させる方法等がある。ま
た分離菌体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー等で
固定化した状態でも使用しうる。

微生物と基質との接触反応時に該微生物が利用しうるエ
ネルギー源を補給することによりＬ　（＋）　−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸の生産性は向上する。この際に好ましい
エネルギー源としては、グルコース、グリセロール等が
ある。

通常の微生物はＬ（→−β−ヒドロキシ脂肪酸の代謝速
度が早いため、Ｌ（→−β−ヒドロキシ脂肪酸の蓄積址
は極めて少なく、生産しようとする場合、経済的に不利
である。そこで効率的に多量蓄積させるには、Ｌ（ト）
−β−ヒドロキシ脂肪酸の代謝速度が遅いか、もしくは
代謝しない変異株、換言すればＬ（＋）−β−ヒドロキ
シ脂肪酸を単一炭素源とする栄養培地に生育しないか、
もしくは生育の弱い変異株を使用することが有利である
。このような変異株を得るには人工変異あるいは自然変
異を利用するが、効率的に行なうには通常人工変異が用
いられる。人工変異方法としては、Ｘ線照射、紫外線照
射、γ線処理、およびＮ−メチル−Ｎ−二トローＮ−二
トロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異銹起剤による処
理が用いられる。具体的な例として本発明者らがＬ（＋
）−β−ヒドロキシ脂肪酸を代謝しない変異株をつるた
めに行なったＮＴＧによる変異方法の１例について示す
と、次のとおりである。ただし、目的とする変異株が得
られれば良いのであってこの方法に限定されるものでは
ない。

保存用スラント（サツカロマイコピシス・リボリテイカ
ＩＦＯ１５４５）から１白金耳をグルコース４０ダ、（
ＮＨ４）２■ＰＯ４１３ｆ、ＫＨ２ＰＯ４７ｆ　、　Ｍ
ｇＳＯ４・７ＬＩ２００．８　ｇ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２
０６０〃４、Ｆ　ｅ　８０４　・７Ｈ２０９０Ｑ、０ｕ
ＳＯ４・５Ｉ（２０５１）１ｇ、　Ｋｎ　８０４　−　
４　Ｌｉ２Ｏ１０１１Ｉｇ　、　ＮａＣｌ　０．１ｆ、
　ビ、１−　ｆ、：／　ｌ　ｍｌ、ｆ７　ミン−Ｈ０１
２ｔｑ、水ｔ　ｇ　、　ｐｌ：Ｉ７．２の組成から成る
Ｓ培地８０　ｍｌを５００耐容フラスコに入れ接種し、
３０°Ｃｌ２Ｏ時間振とり培養した。その培養液１．５
ｍｌを０．５　Ｍ　！Ｊン酸緩新液（１）Ｉ（７，０）
で洗浄後、０．５　ｔｑ　／＠ｔＮ　Ｔ　Ｇ溶液８　ｍ
ｌに懸濁し、４ａＣ，６０分間放置した。その後、同じ
緩鋲液で３回洗浄し、次の組成から成る固形平板培地、
Ｃ培地（グルコース２０ｇ、イーストエキス５ｇ、肉エ
キス１０ｇ、ペプトン１Ｏｆ１寒天２０ｇ、水Ｉ　Ｌ　
ｌ）Ｈ７，０）Ｋ塗布し、コロニーを出現させた。この
コロニーをＳ培地のグルコースの代りに醋酸１０ｇ、寒
天２０ｇを加えた１７．０のＳ培地にレプリカし、３０
°Ｃで２日間培養した。このＳ培地上で生育不良の菌（
醋酸非資化性株）を選んだ。この様にして得た酪酸非資
化性株をＳ培地に酪酸１０ｇを添加した培地（ｐｌ（７
，０）に植え、３０°Ｃ１４８時間培養し、Ｌ（１）−
β−ヒドロキシ醋酸の生産量をガスクロマトグラフィー
法（長谷用ら：ジャーナル・オブ・ファーメンティジョ
ン・テクノロジー誌　５９巻。

２５７頁、１９８１年）で分析し、Ｌ（ト）−β−ヒド
ロキシ酪酸生産株を選んだ。この様にして選んだ変異株
はＬ（＋）−β−ヒドロキシ醋酸を単一炭素源とする栄
養培地（例えばＳ培地のグルコースの代りに、Ｌ（ト）
−β−ヒドロキシ酪酸を添加した培地）での生育が著し
く低下しており、本発明に使用できる。他の属の微生物
の変異も同様な手法を用いて行なうことができ、本発明
を実施するために上記方法で得た変異株の例としてサツ
カロマイコピシス・リボリテイカＫＴ　８４０１１．エ
ンドマイセス・テトラスペルマＫＴ　８４０１２．　ピ
キャ・プル）−二ＫＴ　８４０１３等がある。この変異
株の性質としては、親株と殆んど差が認められないが、
表１に示すとおりＬ（ト）−β−ヒドロキシ脂肪酸の資
化性において著しい差が認められた。

表１ ※Ｓ培地において、それぞれの化合物を唯一の炭素源と
して１％添加して培養（８０°Ｃ，４日間）した。

→什ヒ：生育良好、□：生育不良 なお、これらの変異株は工業技術院微生物工業研究所に
下記番号で寄託しである。

表２ 本発明に使用する培地はグルコース、グリセリン等の炭
素源、アンモニア、硫安、ペプトン、カザミノ酸等の無
機、有機の含窒素化合物の窒素源、リン酸カリウム、硫
酸マグネ、シウム等生育に必要す無機塩類、更にビオチ
ン等のビタミン類、その他必要に応じて通常の微生物の
培養に用いられる種々の栄養源を適宜配合して用いるこ
とができる。

培養には殺菌した培地に菌を接種し、２０〜４５°Ｃの
温度でｐ１１６〜９に保ちつつ１〜１０日間通気攪拌、
振とり培養等好気的に行なう。培養初期に菌体生産があ
シ、その後Ｌ（ト）−β−ヒドロキシ脂肪酸の生産が行
なわれる。またＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の生産
時にエネルギー源としてグルコースまたはグリセロール
等を補給することにより、より効率的にＬ（→−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸の生産が行なわれる。基質は培養初期か
ら培地に加えても画体生育後、添加してもいずれでもよ
い。

培養液、あるいは菌体反応液から生成したＬ（＋）−β
−ヒドロキシ脂肪酸を回収するには、通常のβ−ヒドロ
キシ脂肪酸の回収に用いる手段によって行なうことがで
きる。例えば菌体除去後、Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ脂
肪酸含有液を濃縮後、硫酸等でｐＨ２，５以下にし、こ
れよりエーテル、酢酸エチル等で抽出し、溶剤を除去後
、減圧蒸留すれば、容易にＬ（＋）−β−ヒドロキシ脂
肪酸をうろことができる。Ｌ（ト）−β−ヒドロキシ脂
肪酸は余９安定な物質でないので、前記の溶剤抽出等で
得たＬ（ト）−β−ヒドロキシ脂肪酸をメタルールやエ
タノール等のアルコールに溶解し、硫酸等の触媒存在下
で加熱し、エステル化することにより、Ｌ（＋）−β−
ヒドロキシ脂肪酸のアルキルエステルに容易に変換しう
る。このものを蒸留すれば晶収率に高純度のＬ（＋）−
β−ヒドロキシ脂肪酸エステルを得ることができ、この
エステル体は比較的安定である。

以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース４０ｇ１イーストエキス５ｆ。

（ＮＨ４）２Ｉ（１’０４　Ｌ　８　ｆ　、　ＫＨｚＰ
０４７　ｇ、ＭｇＳＯ４・７１（２００，Ｂ　ｙ、　Ｚ
ｎＳＯ４−７１（２０Ｂａｙ、ＦｅＳＯ４゜７　［２０
９Ｑ　ｒＪｑ　、　ＣｕＳＯ４Ｈ５Ｊ（２０５１１１１
７、’ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１０１Ｖ、ＮａＣ４０，１
ｇ、酪酸１０　ｍｌ　ｔたは吉草酸１０ｍｌ　（１（Ｊ
当り）の組成からなる培地をＮ　ａ　０１−ＩでｐＨｒ
、２となし、この３１を５４容ミニジャーファーメンタ
−に入れ殺菌後、サツカロマイコピシス・リボリテイカ
ＫＴ８４０１１、あるいはエンドマイセス・テトラスペ
ルマＫＴ８４０１２、あるいはピキャ・プルトーニＫＴ
８４０１Ｂ、を植え、通気１ｖｖｍ、纜拌５００ｒｐｍ
、３０°Ｃで４日間培養した。培養中ｐＨは７．０に保
ち、かつ毎日グルコースを６０ｇずつ添加した。培養終
了後、生成したＬ←）−β−ヒドロキシ酪酸あるいはＬ
（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸を測定した結果、表３の
如くしくト）−β−ヒドロキシ脂肪酸の蓄積がみとめら
れた。

表３ ※Ｌ（ト）−β−ＬＩ　Ｂ　Ａ　：　Ｌ（＋）−β−ヒ
ドロキシ醋酸Ｌ（→−β−１−ＩＶＡ：Ｌ（ト）−β−
ヒドロキシ吉草酸尚、基質無添加の場合、いずれの株の
親株、変異株ともにＬ（ト）−β−ヒドロキシ酪酸ある
いはＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸の蓄積は認められ
なかった。

表４ ル ） 実施例２ 実施例１に示した培地から脂肪酸を除去した培地３１を
５１容ミニジャーファーメンタ−に入れ殺菌後、サツカ
ロマイコピシス・リポリテイカに’ｒ８４０１１．　エ
ンドマイセス・テトラスペルマ−’−Ｔ８４０１２、あ
るいはピキャ・ブルトシトＫＴ８４０’１３　を植菌し
、通気１　ｖＶｍ　、ｇ拌５００ｒｌ）ｍ、８０°Ｃで
２４時間培養した。

この培養液各々に、クロトン酸、ｎ−ブチルアルコール
、２−ペンテン酸あるいはｎ−アミルアルコールを１５
ｇずつ添加し、ｐ１■を７．０に保ちつつグルコースま
たはグリセロールを毎日６０７ずつ添加しつつ、更に３
日間培養した。培養終了後、生成したＬ（＋）−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸をガスクロマトグラフィーで／１１１１
定した結果、表５の如くの各Ｌ（＋）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の蓄積が認めら表　５ 実施例３ 実施例１と同様にザツカロマイコピシス・リポｌＪ、ｒ
イカＫＴ８４０１１、エンドマイセス・テトラスペルマ
１１８４０１２、あるいはピキャ・プルトー二ＫＴ８４
０１８を培養し、培養開始後、２４．４８．７２時間口
にグルコース６０ｇ、またはグリセロール６０ｇずつ添
加し、かつｐ■を７．０に保ちつつ９６時間培養した。

比較のため、エネルギー源無添加でも培養した。培養終
了後の培養液中のＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸、ある
いはＬ（＋）−β−ヒドロキシ吉草酸の生成量は表６０
如表６ 手続袖正書（ｈ第う 昭和！Ｚ年７月Ｉと日 特許庁長官　志・）　学殿 す １、事件の表示 昭和５９年　才奇　Ｌ干　階部４４．７５３号２　発明
の名称　Ｌ（ナラ−ρ−じＬＯキ：／腫ハ炊麩の幣隨Ｊ
瓜３、　補正をする者 事イ４二との関係　特許出願人 ７．１　ｆｆ、、；；ｉ　太阪市北区中之島三丁目２番
４号；ｖ″ｇ、（名称）　（０’／り鐘淵化学工業株式
会社代表者　高１）敞 ４、代理人

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）　サツカロマイコピシス属、エンドマイセス属、
   あるいはピキア属に属し、酪酸をＬ（→−β−ヒドロキ
   シ醋酸に変換する能力を有する微生物から誘導されたＬ
   （ト）−β−ヒドロキシ酪酸を単一炭素源とする栄養培
   地に生育しないか、もしくは生育の弱い変異株を炭素数
   ４あるいは５の飽和脂肪酸、あるいはα、β−不飽和脂
   肪酸あるいはアルコールに作用させ、生成する炭素数４
   あるいは５のＬ（ト）−β−ヒドロキシ脂肪酸を採取す
   ることを特徴とするしく＋）−β−ヒドロキシ脂肪酸の
   製造法。
2. （２）微生物が、サツカロマイコピシス・リポリチカあ
   るいはエンドマイセス・テトラスペルマあるいはピキャ
   ・プルシト一二から誘導された変異株でおる特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。
3. （３）基質として用いる飽和脂肪酸が醋酸あるいは吉草
   酸、α、β−不飽和脂肪酸がクロトン酸アルいは２−ペ
   ンテン酸、アルコール力ｎ　−ブチルアルコ−／Ｌ／ｆ
   ｔｌるいはｎ−アミルアルコールであり、製造目的物が
   それぞれ対応するＬ（＋）−β−ヒドロキシ酪酸、ある
   いはＬ　（＋）　−β−ヒドロキシ吉草酸である特許請
   求の範囲第１項あるいは第２項記載の製造法。
4. （４）微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に基質を
   作用させる特許請求の範囲第１項、第２項あるいは第３
   項記載の製造法。
5. （５）基質を添加した培地で培養し、基質と微生物を作
   用させる特許請求の範囲第１項、第２項あるいは第３項
   記載の製造法。
6. （６）微生物を栄養培地で培養し、得られた培養液から
   微生物画体を分離して―体幅濁液を調製し、それに基質
   を作用させる特許請求の範囲第１項、第２項あるいは第
   ３項記載の製造法。
7. （７）微生物と基質を作用させる際に、該微生物が利用
   しうるエネルギー源を補給する特許請求の範囲第１項乃
   至第６項の何れかの項記載のΔａ法。
8. （８）２生物が利用しうるエネルギー源がグルコースま
   たはグリセロールである特許請求の範囲第７項記幀の製
   造法。