DE69432152T2

DE69432152T2 - Mikrobielle stämme zur produktion von sphingolipidbasen

Info

Publication number: DE69432152T2
Application number: DE69432152T
Authority: DE
Inventors: Lex De Boer; Francisca Ingrid VAN DER WILDT
Original assignee: Cosmoferm BV
Current assignee: Evonik Goldschmidt GmbH
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2009-09-10
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: JPH09504434A; JP3471020B2; US6204006B1; AU8140794A; US5910425A; ATE232909T1; DE69432152D1; EP0726960A1; EP0726960B1; ES2193183T3; WO1995012683A1; DK0726960T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verbesserung von mikrobiellen Stämmen zur Produktion von Sphingolipidbasen mittels Mutagenese- und Selektionstechniken.
Hintergrund der Erfindung
Der Ausdruck „Sphingolipide” bezieht sich auf eine Gruppe von Lipiden, die sich von Sphingosin ableiten. Sphingolipide kommen häufig in den Zellmembranen von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen vor. Obwohl die genaue Funktion der Sphingolipide beim Menschen nach wie vor ungeklärt ist, ist klar, daß diese Verbindungsgruppe an der Übertragung elektrischer Signale im Nervensystem und an der Stabilisierung der Zellmembranen beteiligt ist. Es wurde auch vorgeschlagen, daß die Glycosphingosine eine Funktion im Immunsystem ausüben: bestimmte Glycosphingosine agieren als Rezeptoren für bakterielle Toxine und möglicherweise auch als Rezeptoren für Bakterien und Viren.
Die Sphingolipide enthalten Sphingosin, Dihydrosphingosin oder Phytosphingosin als Base in Amidbindung mit einer Fettsäure. Sphingosin- oder Phytosphingosinbasen können als Ausgangsmaterialien bei der Synthese einer bestimmten Gruppe von Sphingolipiden, nämlich der Ceramide, verwendet werden. Bei den Ceramiden handelt es sich um die wichtigste Lipidkomponente des Stratum corneum, der obersten Hautschicht. Das Stratum corneum hat eine wichtige Barrierefunktion; äußerlich vorliegende Verbindungen werden im allgemeinen außerhalb der Barriere gehalten, und der Feuchtigkeitsverlust wird eingeschränkt. Der Zusatz von Sphingolipiden wie Ceramiden zu Hautkosmetika verbessert die Barrierefunktion und die Feuchthalteeigenschaften der Haut (Curatolo, 1987; Kerscher et al., 1991).
Heterogene Sphingolipidpräparate für Kosmetika werden derzeit hauptsächlich aus tierischen Quellen gewonnen. Im Industriemaßstab ist dies offenbar ziemlich kostspielig. Außerdem wurde gefunden, daß diese Substanzen möglicherweise gefährlich sind, und zwar aufgrund des möglichen Vorhandenseins von „Bovine Spongiform Encephalomyelitis” (BSE) in Gewebe aus dem Rind. Es besteht daher ein steigendes Interesse in der Kosmetikindustrie an neuen Quellen für reine, gut definierte Sphingolipide, die aus Quellen, bei denen es sich nicht um tierisches Gewebe handelt, stammen.
Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen wie die Hefen Pichia ciferrii, mit der früheren Bezeichnung Hansenula ciferrii und Endomycopsis ciferrii (Barnett et al., 1990; Stodola und Wickerham, 1960; Wickerham und Stodola 1960; Wickerham et al., 1954; Wickerham, 1951) Sphingolipide als solche sowie auch Sphingosin, Phytosphingosin und/oder deren Derivate produzieren. Aufgrund dieser Entdeckung sind Quellen für Sphingolipide selbst sowie für Ausgangsmaterialien für die Herstellung von anderen ökonomisch wichtigen Verbindungen, die eine akzeptable Alternative zur Verwendung tierischer Quellen für diese Verbindungen darstellen könnten, verfügbar.
So können zum Beispiel acetylierte Derivate von Sphingosin, Dihydrosphingosin und Phytosphingosin desacetyliert werden und das so erhaltene Sphingosin, Dihydrosphingosin oder Phytosphingosin können chemisch in verwandte Verbindungen wie Ceramide, Pseudoceramide und/oder Glycoceramide umgewandelt werden, die wiederum in Kosmetika und Therapeutika verwendet werden können (Smeets und Weber, 1993).
Die Produktion von Phytosphingosin und/oder seinen acetylierten Derivaten wurde auch in den Hefen Candida utilis und Saccharomyces cerevisiae (Wagner und Zofcsik, 1966; Oda und Kamiya, 1958), Hanseniaspora valbyensis (Braun und Snell, 1967) und Torulopsis utilis (Kulmacz und Schroepfer Jr., 1978) nachgewiesen. Über die Produktion von Phytosphingosin in den Pilzen Aspergillus sydowi und Penicillium notatum (Stodola und Wickerham, 1960) wurde ebenfalls berichtet.
In einer Untersuchung, in der dreißig Hefearten der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Debaromyces, Pichia, Hansenula, Lipomyces, Sporobolomyces, Cryptococcus, Torulopsis, Candida, Trichosporon und Rhodotorula untersucht wurden, wurde gefunden, daß alle mindestens eine Form von Sphingolipiden enthielten (Ceramidmonohexosid) und daher möglicherweise für die Sphingolipidproduktion eingesetzt werden können (Kaneko et al., 1977).
Die Akkumulation von Phytosphingosin wurde in einer ethanolaminproduzierenden Mutante von Saccharomyces cerevisiae gezeigt, wodurch diese Hefe mit einer Ethanolaminquelle versehen wurde (Ishida-Schick und Atkinson, 1983).
Eine Sphingolipidproduktion wurde auch in Stämmen von Bakteriengattungen wie Sphingobacterium (Yano et al.; 1983), Acetobacter, Bacteroides, Bdellovibrio, Xanthomonas und Flavobacterium (Tahara et al., 1986) nachgewiesen.
Stoffel et al. (1968) fanden, daß die Hefe Hansenula (Pichia) ciferrii alle langkettigen Basen, die in der Untersuchung als Vorstufen verwendet wurden, acetyliert. Sphingosin wurde in Triacetylsphingosin und Dihydrosphingosin in Triacetyl-, Diacetyl- und N-Acetyldihydrosphingosin umgewandelt. Außerdem wurden drei Acetylderivate von Phytosphingosin isoliert, und zwar Tetraacetyl-, Triacetyl- und N-Acetylphytosphingosin. Zusätzlich zu diesen Acetylderivaten produzierte Hansenula ciferrii in einem Medium, das langkettige Basen enthielt, langkettige Ceramide.
Der Biosyntheseweg der Tetraacetylphytosphingosin(TAPS)-Synthese in Pichia ciferrii wurde von Barenholz et al. (1973) beschrieben. Der Biosyntheseweg für Sphingosin und Dihydrosphingosin wird von Dimari et al. (1971) vorgeschlagen.
Barenholz et al. (1971 & 1973) befaßten sich mit der Erfassung des Stoffwechsels der als Hintergrund für die Produktion von TAPS und anderen Sphingolipidbasen in vier Stämmen von Hansenula (Pichia) ciferrii dient. In der letztgenannten Untersuchung wurden die Profile von vier Mikrosomenenzymen, die für die Biosynthese von acetylierten Sphingosinbasen eines niedrigen Produzenten (Hansenula ciferrii NRRL Y-1031, E-11, sex b, 8-20-57) und eines hohen Produzenten (Hansenula ciferrii NRRL Y-1031, F-60-10) spezifisch waren, verglichen. Es wurde gefunden, daß die spezifische Aktivität der 3-Ketodihydrosphingosinsynthetase und der Langkettenbase Acetyl-CoA-acetyltransferase im Vergleich mit dem niedrigen Produzenten um das 5–10fache bzw. 30fache erhöht waren, während die Aktivität der Palmitythiokinase und der 3-Ketodihydrosphingosinreduktase ähnlich waren. Dies zeigt, daß bei der Synthese von acetylierten Sphingosinen die Aktivität der 3-Ketodihydrosphingosinsynthetase und die Langkettenbase Acetyl-CoA-acetyltransferase bei dem niedrigen Produzenten die begrenzenden Stufen waren. Es wurde gefunden, daß Hansenula ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 unter definierten Wachstumsbedingungen 300 μMol/1 Sphingosinbasen (ungefähr 0,15 g/l) produziert, von denen mindestens 250 μMol/1 extrazellulär vorlagen. Auch bei Optimierung der Kulturbedingungen für die TAPS-Produktion erhielt man nur 0,485 g/l TAPS (0,024 g TAPS/g Trockenhefe) (Maister et al., 1962).
Allerdings produziert keiner der bis jetzt untersuchten Hefestämme, nicht einmal Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F- 60-10, Sphingolipidbasen wie Sphingosin, Phytosphingosin oder deren Derivate in ausreichenden Mengen, daß er als nützliche, ökonomisch interessante Quelle für solche Verbindungen gelten kann. So würde zum Beispiel die Verfügbarkeit von Hefestämmen, die zur Produktion erhöhter TAPS-Mengen fähig sind, die wirtschaftliche Machbarkeit und Attraktion für die Produktion dieses wichtigen Ausgangsmaterials, das wiederum in wirtschaftlich wertvolle Endprodukte wie Ceramide, Pseudoceramide und Glycoceramide umgewandelt werden kann, wesentlich verbessern.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht die Produktion von Pichia-Stämmen, die nach Anspruch 1 zur Produktion von erhöhten TAPS-Mengen fähig sind, mittels Mutagenese- und Selektionstechniken vor. Die so produzierten Mutantenstämme produzieren im Vergleich zu den Produktionsmengen ihrer Elfernstämme, die unter gleichen Bedingungen gezüchtet werden, erhöhte Mengen des gewünschten Produkts. Diese erhöhten Produktionsmengen stellen eine wirtschaftlich attraktive Quelle dieser Verbindung zur Verwendung per se oder als Ausgangsmaterialien für die Umwandlung in wirtschaftlich wertvolle Endprodukte dar.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die Produktion von TAPS durch aufeinanderfolgende Mutagenese- und Selektionsschritte an Mikrobenstämmen, von denen festgestellt wurde, daß sie diese Verbindungen produzieren, erhöht werden kann. Auf diese Weise können Engpässe bei der Biosynthese Schritt für Schritt eliminiert werden, was zur verstärkten Produktion dieser Produkte führt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung eines Pichia-Stammes bereit, der nach Anspruch 1 zur Produktion erhöhter TAPS-Mengen im Vergleich zu seinem Elternstamm bereit ist, wobei der Elternstamm mindestens einer Mutagenesebehandlung unterworfen wird, bei der dieser Elternstamm mit einem geeigneten Mutagen in solch einer Menge behandelt wird, daß man zu einem mutierten Stamm gelangt, der fähig ist, im Vergleich zu dem Elternstamm bei Kultivierung unter gleichen Bedingungen erhöhte Mengen des gewünschten Produkts zu produzieren, wobei anschließend aufgrund der erhöhten Produktion des gewünschten Produkts ein mutierter Stamm selektiert wird.
Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mutierten Stämme, die wie in den Beispielen (unten) gezüchtet werden, können 0,030 g TAPS/g Hefetrockengewicht, vorzugsweise 0,050 g TAPS/g Hefetrockengewicht, vorzugsweise 0,060 g TAPS/g Hefetrockengewicht, vorzugsweise 0,075 g TAPS/g Hefetrockengewicht, vorzugsweise 0,10 g TAPS/g Hefetrockengewicht, vorzugsweise mindestens 0,15 g TAPS/g Hefetrockengewicht, am stärksten bevorzugt mindestens 0,20 g TAPS/g Hefetrockengewicht produzieren.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Hefestämme können von Arten der Gattungen Pichia, insbesondere der Art Pichia ciferrii (früher als Hansenula ciferrii bezeichnet) ausgewählt werden. Am stärksten bevorzugt sind Hefestämme, die zur Gattung Pichia, am stärksten bevorzugt zur Art Pichia ciferrii (insbesondere Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10) zählen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Mutagenese dadurch durchgeführt werden, daß man ein beliebiges geeignetes Mutagen, das zur verstärkten Produktion von Sphingosin, Dihydrosphingosin, Phytosphingosin und/oder deren Derivaten führt, verwendet. Zu bevorzugten Mutagenen zählen zum Beispiel UV-Bestrahlung, Ethylmethansulfonat sowie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (Stanbury, 1988; Shay, 1987; Masanari et al., 1985).
Die Mutagenese kann in Form einer Einzelmutagenese durchgeführt werden, es wird jedoch gefunden, daß die zwei- oder mehrmalige Durchführung der Mutagenese von Vorteil ist. Die Fähigkeit der Stämme, das erwünschte Produkt, wie TAPS, in erhöhten Mengen zu produzieren, steigt nach jedem Mutagenisierungsschritt.
Nach Beendigung der Mutagenesefunktion(en) kann eine erhaltene Mutante selektiert werden, die, wenn sie unter Bedingungen gezüchtet wird, die der Produktion des gewünschten Sphingosins, Dihydrosphingosins, Phytosphingosins und/oder deren Derivate zuträglich ist, die höchsten Produktionsmengen am erwünschten Produkt zeigt.
Dem Fachmann ist allgemein bekannt, daß die Abtrennung von erwünschten Mutanten von den zahlreichen minderwertigen Typen bei Stämmen, die primäre Stoffwechselprodukte, z. B. Aminosäuren, produzieren, wesentlich einfacher als bei Stämmen, die sekundäre Stoffwechselprodukte produzieren, ist (Stanbury, 1988).
Die Vorselektion von hochproduzierenden Mutantenzellen erfolgt auf Agarplatten durch visuelle Beobachtung der Kristallzone von Einzelkolonien und deren anschließende Isolation. Kolonien mit dem größten Kristalldurchmesser im Vergleich zur Koloniegröße werden selektiert. Andere Vorselektionsverfahren, zum Beispiel die Resistenz gegen Aminosäureanaloge oder Proteinsynthesehemmstoffe können ebenfalls verwendet werden.
So isolierte Zellen können in Schüttelflaschen oder Röhrchenkulturen gezüchtet werden und entsprechende Mutanten werden durch Bestimmung der Produktionsmengen des erwünschten Produkts durch Analyse geeigneter Verdünnungen der Fermentationsbrühe selektiert. Die Beschreibungen der Wachstumsbedingungen, wie sie in den Beispielen angeführt sind, werden als Bezug für die Bestimmung der Produktionsmengen der erwünschten Produkte durch die erfindungsgemäßen Stämme bereitgestellt. Andere Kulturbedingungen, die der Produktion des erwünschten Produkts zuträglich und dem Fachmann bekannt sind, können jedoch ebenfalls verwendet werden, ohne vom Gedanken der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Eine quantitative Analyse kann mit verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel durch wiederholte Desacetylierung von TAPS und verwandten Verbindungen mittels Oxidation mit Periodat. Es werden in stöchiometrischer Menge Aldehyde gebildet, bei denen es sich um Abbauprodukte der Oxidation von TAPS und verwandten Verbindungen handelt.
Außerdem kann zusätzlich oder stattdessen eine Selektion aufgrund der TAPS-Produktion in Schüttelflaschen, die mit CDCl₃ extrahiert und mittels NMR analysiert werden, durchgeführt werden. Für die NMR-Analyse wird vorzugsweise TAPS als Standard verwendet.
Andere erwünschte Produkte wie Sphingosin, Phytosphingosin und Dihydrosphingosin, Triacetyl-, Diacetyl- und N-Acetyl-Derivate von Sphingosin, Phytosphingosin und Dihydrosphingosin, glycosylierte Derivate von Sphingosin, Phytosphingosin und Dihydrosphingosin, 3-Ketodihydrosphingosin und/oder 3-Ketosphingosin können auf diese Weise ebenfalls quantitativ bestimmt werden, wobei der TAPS-Standard als Referenz verwendet wird.
Nach Gewinnung des erwünschten Produkts kann dieses direkt verwendet werden oder für die endgültige Verwendung weiter verarbeitet werden. So können zum Beispiel acetylierte Derivate von Sphingosin, Dihydrosphingosin und Phytosphingosin entweder enzymatisch oder chemisch desacetyliert und anschließend als Ausgangsmaterialien für die Synthese von wirtschaftlich wertvollen Sphingolipidprodukten, wie Ceramiden, Glycoceramiden und Pseudoceramiden verwendet werden (Smeets und Weber, 1993).
In den folgenden Beispielen wurde versucht, in bezug auf die Zahlenangaben (z. B. Mengen, Temperatur, pH-Wert usw.) genaue Angaben zu machen, ein gewisses Ausmaß an Versuchsfehlern und Abweichung ist jedoch in Betracht zu ziehen. Falls nicht anders erwähnt, wird die Temperatur in Grad Celsius angegeben und bei dem Druck handelt es sich um Atmosphärendruck oder beinahe Atmosphärendruck.
Herstellungsbeispiel A Herstellung eines Tetraacetylphytosphingosinstandards
Eine Mischung aus 1,0 g (2,8 mmol) Phytosphingosinhydrochlorid (Sigma), 2,7 ml (28 mmol) Essigsäureanhydrid, 2,1 ml (15 mmol) Triethylamin und 10 ml reinem Chloroform wird 8 Stunden lang unter Rühren am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, bis ein pH-Wert von 7 erreicht ist. Die organische Schicht wird anschließend über MgSO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum bei 50°C eingedampft. Der Rückstand wird säulenchromatographisch mit einer Lobor Fertich Säule Große C (440-37) Lichroprep Si60 (40–60 μm) Säule von Merck gereinigt. Als Elutionsmittel wird eine Mischung von Dichlormethan und Methanol (25:1) verwendet (Durchflußgeschwindigkeit 10 ml/min). Als Produkt erhält man einen weißen Feststoff, der in 80prozentiger Ausbeute gebildet wird und einen Schmelzpunkt im Bereich von 41–43°C aufweist. Die Reinheit des so gebildeten TAPS wird mittels NMR-Techniken (Protonen-NMR, 360 MHz) in CDCl₃ bestimmt (unter Verwendung von p-Nitrotoluol als innerem Standard) und wird auf 96% geschätzt.
Eine Konzentration von 15 mg TAPS/ml CDCl₃, das wie oben angegeben erhalten wurde, wird in allen Beispielen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, als Standard verwendet.
Herstellungsbeispiel B TAPS-Schrägagarmedium

122 g Nemoutex (Diastatische Produkten B. V.; Leiden, Niederlande) werden in 1 1 Wasser gelöst und 60 Minuten lang bei 110°C sterilisiert. Die Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und zur Entfernung der festen Teilchen filtriert. Der pH-Wert wird auf 6,4 eingestellt. Man versetzt mit 10 g/l Agar (Bacto) und sterilisiert die Lösung 30 Minuten lang bei 120°C. Herstellungsbeispiel C TAPS-Medium (für Röhrchenkulturen und Schüttelflaschen)

Verbindung	Menge (g/l)
KH-Phtalat	20
NaCl	0,06
MgSO₄·7H₂O	0,88
CaCl₂·2H₂O	0,20
NH₄Cl	4,83
KH₂PO₄	1,0
(NH₄)₂Fe(SO₄)₂	0,027
ZnSO₄	0,005
CuSO₄	0,0075
MnSO₄	0,0006
H₃BO₃	0,0006
Na-Molybdat	0,0006
Verbindung	Menge (g/l)
KI	0,00015
Myo-inosit	0,059
Nikotinsäure	0,003
Ca-D-Panthotenat	0,003
Vitamin B₁	0,003
P-Aminobenzoat	0,002
Vitamin B₆	0,0003
Biotin	0,00001
Hefeextrakt (Difco)	1,0

Bei den Schüttelflaschen und Kulturröhrchen wird Glucose auf eine Endkonzentration von 33 bzw. 7 g/l zugegeben. Nach dem Lösen der Bestandteile wird der pH-Wert auf 5,4 eingestellt.
100-ml-Erlenmeyerkolben (ohne Schikane) werden mit 30 ml Medium gefüllt und 30 Minuten lang bei 110°C sterilisiert. Für die Agarplatten wird. das Medium mit 20 g Agar (Bacto) versetzt und man sterilisiert wie beschrieben. Herstellungsbeispiel D YEP-D-Medium

Bacto-Pepton 20 g

Hefeextrakt 10 g

Glucose 20 g

Bacto-Agar 20 g
Man versetzt mit 1000 ml entmineralisiertem Wasser und stellt den pH-Wert auf 7,0 ein. Das Medium wird 30 Minuten lang bei 110°C sterilisiert.
Herstellungsbeispiel E Physiologisches Salzmedium
In 1 Liter entmineralisiertem Wasser werden 8,5 g NaCl gelöst und die Lösung wird 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert.
Herstellungsbeispiel F Wachstumsbedingungen für die Zellkultur
Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 und Mutanten davon werden bei 24°C im Brutschrank auf Schrägagar oder auf Agarplatten gezüchtet.
Die Züchtung in Röhrchen wird in 40-ml-Glasröhrchen (Durchmesser 2,5 cm), die 3,0 ml TAPS-Medium enthalten, durchgeführt. Die Röhrchen werden 3 Tage lang senkrecht in einem Ständer in einem Gallenkamp-Rundschüttelinkubator (300 U/min, 24°C) inkubiert. Nach Beendigung der Fermentation wird die Konzentration des so gebildeten TAPS um die Verdunstung während der Inkubation variiert. Die Mutanten werden in vierfacher Wiederholung geprüft.
Züchtung in Schüttelflaschen (ohne Schikane) wird in 30 ml TAPS-Medium (siehe oben) in 100-ml-Erlenmeyerkolben bzw. in 100 ml Medium in 500-ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt. Es wird in einem Gallenkamp-Rundschüttelinkubator (250 U/min, 24°C) 3 Tage lang inkubiert. Nach Beendigung der Fermentation wird die Konzentration des so gebildeten TAPS um die Verdunstung während der Inkubation variiert. Die Mutanten werden in vierfacher Wiederholung geprüft.
Beispiel 1
Mutagenese mit Ultraviolettbestrahlung (UV)
Eine halblogarithmische Kultur (100 ml) von Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 oder einer Mutante davon wird auf YEP-D oder TAPS-Medium gezüchtet (24 Stunden, 24°C, 250 U/min). Die Kultur wird zentrifugiert (Zentrifuge: Sepatech-Minifuge RF von Heraeus, 5000 × g, 5 Minuten) und das Pellet wird zweimal mit 25 ml physiologischem Salzmedium gewaschen. Die Zellsuspension wird auf eine Endkonzentration von 108 Zellen/ml verdünnt, und 10 ml der Suspension werden in sterile Petri-Scheiben (Durchmesser 9 cm) pipettiert. Die Platten werden dann im Abstand von 23 cm von der Bestrahlungsquelle (Osram-Lampe HQV, 125 Watt) einer UV-Strahlung ausgesetzt und 0, 15, 30, 60 bzw. 90 Sekunden lang bestrahlt. Die bestrahlten Zellen werden dann im Dunklen aufbewahrt (30 Minuten, 20°C). Zur Bestimmung der Überlebensrate werden Verdünnungen der mutierten Zellsuspensionen auf YEP-D-Agarmedium ausplattiert. Die restlichen Zellsuspensionen werden über Nacht auf TAPS-Medium gezüchtet. Falls erwünscht kann Glycerin auf eine Endkonzentration von 10% zugegeben und die Suspensionen bei –20°C aufbewahrt werden. Nach 3tägiger Inkubation bei 24°C werden die Kolonien ausgezählt und die Überlebensprozente werden berechnet. Die Zellsuspension, bei der die Bestrahlungsbehandlung zu einem Überlebensprozentsatz von ungefähr 10% führt, wird für die Selektion von Mutanten, bei denen es sich um hohe TAPS-Produzenten handelt, verwendet.
Beispiel 2
Mutagenese mit Ethylmethansulfonat (EMS)
Eine halblogarithmische Kultur (100 ml) von Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 oder eine Mutante davon wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet und gewaschen, nur daß das Pellet mit 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 statt physiologischem Salzmedium gewaschen wird. Anschließend werden die Zellen in 25 ml 1,0 M Tris-HCl Puffer, pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 10¹⁸ Zellen/ml verdünnt.
6 ml Zellsuspension werden mit 300 μl EMS versetzt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Zeitabstand von 0, 1, 3, 6 bzw. 12 Minuten werden 1-ml-Proben entnommen. Die Zellen werden anschließend zweimal mit 9 ml physiologischem Salzmedium gewaschen und entsprechende Verdünnungen werden auf YEP-D-Agarmedium ausplattiert. Das Wachstum der verbleibenden mutierten Zellen über Nacht, sowie die Schätzung der Überlebensprozente werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Probe mit einem Überlebensprozentsatz von 10 wird für die Isolation von Mutanten, bei denen es sich um hohe TAPS-Produzenten handelt, ausgewählt.
Beispiel 3
Mutagenese mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG)
Eine halblogarithmische Kultur (100 ml) von Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 oder eine Mutante davon wird wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet und gewaschen, nur daß das Pellet mit 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 statt physiologischem Salzmedium gewaschen wird. Anschließend werden die Zellen in 25 ml 1,0 M Tris-HCl Puffer, pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 10¹⁸ Zellen/ml verdünnt.
6 ml Zellsuspension werden mit 600 μl einer frisch hergestellten NTG-Vorratslösung versetzt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Zeitabstand von 0, 1, 3, 6 bzw. 12 Minuten werden 1-ml-Proben entnommen. Die Zellen werden anschließend zweimal mit 9 ml physiologischem Salzmedium gewaschen und entsprechende Verdünnungen werden auf YEP-D-Agarmedium ausplattiert. Die Züchtung der mutierten Zellen über Nacht sowie die Schätzung der Überlebensprozente werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Probe mit einem Überlebensprozentsatz von 10 wird für die Isolation von Mutanten, bei denen es sich um hohe TAPS-Produzenten handelt, ausgewählt.
Beispiel 4
Vorselektion der Mutanten
Die Vorselektion wird auf TAPS-Agarmedium durchgeführt. Entsprechende Verdünnungen von Zellen (25–50 Kolonien/Platte), die wie in Beispiel 1, 2 oder 3 oben erhalten worden waren, werden 4–7 Tage lang bei 24°C im Brutschrank inkubiert. Um Kristallisation zu stimulieren, werden die Platten bei 4°C über Nacht inkubiert. Anschließend werden die Kolonien mit den höchsten Kristallisationsverhältnissen ausgewählt (Kristallisationsverhältnis = Durchmesser der Kristallisationszone um die Kolonie (mm)/Koloniedurchmesser (mm)).
Diese Kolonien werden isoliert und auf Agarplatten, die TAPS-Agarmedium enthalten, übertragen. Diese Platten werden als „Ausgangsplatten” und die Kolonien als „Originalkolonien” bezeichnet. Das Zellmaterial auf diesen Ausgangsplatten wird für die Selektion der höchsten TAPS-Produzenten in Röhrchen, Schüttelflaschen und für Aufbewahrungszwecke verwendet.
Beispiel 5
TAPS-Analyse an Röhrchenkulturen (Verfahren 1)
Die weitere Selektion der in Beispiel 4 erhaltenen Zellen wird anschließend in Röhrchen und Schüttelflaschen wie im Vorbereitungsbeispiel F beschrieben durchgeführt und die Analyse erfolgt wie unten beschrieben. Die Vorgehensweise bei der TAPS-Bestimmung besteht aus drei Teilen (Abschnitte 5 a–c).
5a Desacetylierung von Tetraacetylphytosphingosin
Als Bezugsmaterial werden Vorratslösungen von 0,05–0,3 g/l TAPS verwendet. 1 ml der Proben wird mit (in bezug auf die erwartete Menge der TAPS) dem achtfachen an Natriumhydroxid versetzt und die Lösung wird zwei Stunden lang bei 50°C inkubiert.
5b Oxidation von Phytosphingosin
Das Phytosphingosin wird durch Versetzen mit Natriumperiodat oxidiert. CH₃- (CH₂) 13-CHOH-CHOH-CHNH₂-CH₂-OH → CH₃-(CH₂)₁₃-CHO + 2 HCOOH + NH₃ + HCHO
Eine Probe des in Schritt a erhaltenen desacetylierten Ansatzes wird zu 1 ml einer 30 mM Kaliumperiodat in 0,1 M Essigsäurepuffer, pH 5,4 gegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur im Dunklen über Nacht oxidiert, wobei der Ansatz leicht auf einem elektronischen Schüttler Typ IKA Vibrax VXR geschüttelt wird (125 U/min). Um ein Verdunsten des bei der Reaktion gebildeten Aldehyds zu verhindern, werden die Probenröhrchen vorsichtig verschlossen.
5c Aldehydbestimmung
Die in Schritt b oben gebildete Aldehydmenge kann colorimetrisch wie von Avigad (1983) beschrieben bestimmt werden.
Nach der Oxidation im Schritt b werden 0,2 ml Probe mit 0,3 ml 1% (w/v) Purpald (Aldrich) in 1N NaOH versetzt. Das Purpald-Reagenz sollte frisch hergestellt (und nicht älter als 2 Stunden) sein. Diese Mischung wird 30 Minuten auf einem elektronischen Schüttler Typ IKA Vibrax VXR inkubiert (180–200 U/min). Die Reaktion wird anschließend durch Zugabe von 0,5 ml 0,2% NaBH₄ in 1N NaOH (w/v) gestoppt. Die Extinktion der Probe wird bei einer Wellenlänge von 548 nm bestimmt.
Beispiel 6
TAPS-Analyse mittels NMR (Verfahren 2)
Die weitere Selektion der in Beispiel 4 erhaltenen Zellen wird anschließend in Röhrchen und Schüttelflaschen wie im Vorbereitungsbeispiel F beschrieben durchgeführt und die Analyse erfolgt wie unten beschrieben.
6a Extraktion
Die Extraktion des TAPS aus dem Wachstumsmedium in den Schüttelflaschen kann mit verschiedenen hydrophoben organischen Verbindungen erfolgen. Bei der im vorliegenden Beispiel verwendeten organischen Extraktionsverbindung handelt es sich um Deuteriummarkiertes Chloroform (CDCl₃). Das Kulturmedium (25 ml) wird mit 2 ml CDCl₃ extrahiert und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang auf einem elektronischen Schüttler IKA Vibrax VXR kräftig waagerecht geschüttelt (volle Geschwindigkeit). Dann wird zentrifugiert (Zentrifuge: Heraeus Sepatech Minifuge RF, 10.000 × g, 5 Minuten) und das CDCl₃ wird entfernt und mittels NMR analysiert.
6b Analyse mittels kernmagnetischer Resonanz (NMR)
Der TAPS-Gehalt der CDCl₃-Schicht wird in der gleichen Serie wie der TAPS-Standard bestimmt; für diesen Zweck verwendet man ein AMR360 NMR-Gerät (Bruker-Carlsruhe, Deutschland). Man verwendet die folgenden Einstellungen des NMR-Geräts:
Empfänger-Verstärkungswert: fixiert
Relaxationszeit: 5 Sekunden
Anzahl der Scans: fixiert
Puls: 45°
Die Fourier-Transformation der erhaltenen FID-Werte (Free Induction Decay) werden mit absoluter Intensität durchgeführt. Die TAPS-Menge (die in mg pro Gramm Kultur wird) wird nach der folgenden Formel berechnet:
Gewicht und Reinheit des Standards werden in Gramm bzw. Prozent ausgedrückt. Der Standard enthält 15 mg TAPS/ml CDCl₃.
Beispiel 7
Trockengewichtsbestimmung
Getrocknete Zentrifugenröhrchen, deren Gewicht (A) bekannt ist, werden mit ungefähr 10 ml Zellsuspension gefüllt, und das Gewicht wird nochmals bestimmt (B) und zentrifugiert. Die Pellets werden anschließend in einem Inkubator getrocknet (24 Stunden bei 105°C), und das Gewicht wird neuerlich bestimmt (C). Das Trockengewicht wird folgendermaßen berechnet (A, B, C sind in Gramm ausgedrückt): Trockengewicht (g/kg) ·= {(C–A)/(B–A)} × 1000 g Trockenmaterial/kg Zellsuspension.
Bei den Schüttelflaschen wird der TAPS-Gehalt (in Gramm TAPS/Gramm Trockengewicht) folgendermaßen berechnet:
Dementsprechend wird die TAPS-Produktionsmenge in g TAPS/g Hefetrockengewicht ausgedrückt.
Beispiel 8
Quantitative Bestimmung des von den Kulturen von Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-6010 und erhaltenen Mutanten auf TAPS-Medium gebildeten TAPS
Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10 wird in vierzigfacher Wiederholung, CBS 111, CBS 1710 und CBS 1910 in 10-facher Wiederholung und Mutantenstämme in fünffacher Wiederholung in Schüttelflaschen auf TAPS-Medium gezüchtet und unter wie in Vorbereitungsbeispiel F beschriebenen Bedingungen kultiviert. Die TAPS-Extraktion und NMR-Analyse erfolgen wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Trockengewichtsbestimmung erfolgt wie in Beispiel 7.
Die Resonanz-Peaks der NMR-Spektren der CDCl₃-Schicht, die durch Extraktion einer Kultur eines TAPS-produzierenden Hefestamms erhalten werden, befinden sich in der gleichen Lage wie diejenigen, die in der Analyse des TAPS-Standards, der wie in Vorbereitungsbeispiel A hergestellt wird, erhalten werden.
Die durchschnittliche Produktivität der 40 Schüttelflaschenkulturen von F-60-10 beträgt 0,025 g TAPS/g Hefetrockengewicht. Die Produktivität von CBS 111, CBS 1710 und CBS 1910 ist der Durchschnitt von 10 unabhängigen Messungen, und die Produktivitätswerte von Mutantenstämmen sind die Durchschnitte von 5 unabhängigen Messungen. Die Produktivitätswerte von fünf Mutantenstämmen (mit der Bezeichnung 5F11, 14D11, 15G8, 20A11 und 27D10) sind in der Tabelle unten dargestellt. Dies zeigt, daß das Produktionsniveau der Mutantenstämme wesentlich höher, nämlich ungefähr 40–60% höher, als die Produktivität des Elternstamms ist.
Die fünf Mutantenstämme sowie der Elternstamm Pichia ciferrii NRRL-Y1031 F-60-10, werden am 6. Juli 1994 unter den Hinterlegungsnummern (siehe auch Tabelle oben) CBS 403.94, CBS 404.94, CBS 405.94, CBS 406.94, CBS 407.94 (Mutantenstämme) sowie CBS 408.94 (Elternstamm) beim „Centraal Bureau voor Schimmelcultures” (CBS), Baarn, Niederlande, hinterlegt.

TAPS-Produktivität der Pichia ciferrii-Stämme CBS 111, CBS 1710 und CBS 1910 sowie NRRL-Y1031 F-60-10 sowie von Mutanten, die vom letztgenannten Stamm stammen, in Schüttelflaschen:

Stamm		Produktivität
		(g TAPS/g Trockengewicht)
	CBS 111	0,0072
	CBS 1710	0,0046
	CBS 1910	NN*
F-60-10	CBS 408.94	0,023
5F11	CBS 405.94	0,033
14D11	CBS 403.94	0,037
15G8	CBS 404.94	0,034
20A11	CBS 406.94	0,036
27D10	CBS 407.94	0,032

*NN = nicht nachweisbar

Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung eines mutierten Pichia-Stamms, der zur Produktion von mindestens 0,030 g Tetraacetylphytosphingosin (TAPS)/g Pichia-Trockengewicht fähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pichia-Elternstamm, der zur natürlichen Produktion von TAPS fähig ist, mindestens einer Mutagenesebehandlung unterworfen wird, bei der dieser Elternstamm mit einem geeigneten Mutagen in solch einer Menge behandelt wird, daß man zu einem mutierten Stamm gelangt, der fähig ist, im Vergleich zu dem Elternstamm bei Kultivierung unter gleichen Bedingungen erhöhte TAPS-Mengen zu produzieren, wobei anschließend ein mutierter Stamm selektiert wird, der bei 3tägiger Kultivierung bei 24°C in TAPS-Flüssigmedium in Erlenmeyerkolben zur Produktion von mindestens 0,030 g TAPS/g Pichia-Trockengewicht fähig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mutierte Pichia-Stamm aus der Gruppe der Stämme der Art Pichia ciferrii stammt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutagen aus der Gruppe UV-Strahlung, Ethylmethansulfonat oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin stammt.
Mutierter Pichia-Stamm, der bei 3tägiger Kultivierung bei 24°C in TAPS-Flüssigmedium in Erlenmeyerkolben zur Produktion von mindestens 0,030 g TAPS/g Pichia-Trockengewicht fähig ist.
Mutierter Pichia-Stamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er aus der Gruppe der Stämme der Art Pichia ciferrii stammt.
Mutierter Pichia-Stamm nach Anspruch 5, wobei dieser Stamm aus der Gruppe CBS 403.94, CBS 404.94, CBS 405.94, CBS 406.94 und CBS 407.94 stammt.
Verfahren zur Produktion einer gewünschten Verbindung aus der Gruppe Phytospingosin bzw. dessen Acetylderivate, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm nach den Ansprüchen 4 bis 6 unter Bedingungen, die die Produktion von TAPS fördern, kultiviert wird und das so produzierte TAPS gegebenenfalls desacetyliert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der gewünschten Verbindung um Phytosphingosin handelt.