JPH09504960A - ナタマイシン回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ナタマイシン含有発酵ブロスから高純度のナタマイシンを回収する新しい方法であって、上記ブロスのｐＨを約１０以上に調節し、上記ブロスにナタマイシンを溶解させるに十分な量の実質的に水混和性の溶媒、例えばイソプロパノールを加え、ｐＨ調節されたブロスから不溶性固体を除去し、該ブロスのｐＨをナタマイシンを該ブロスから沈殿させるに十分なレベルに低下させ、ナタマイシンを上記ブロスから取り出す諸段階からなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ナタマイシン回収方法 発明の背景 ナタマイシンはピマリシンとしても知られ、最初は１９５５年に、南アフリカ のナタールのピーターマリツバーグの町の近くで採取された土壌から得られたス トレプトマイセス・ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎａｔａｌｅｎ ｓｉｓ ）の培養物の発酵ブロスから単離された。（Ａ．Ｐ．Ｓｔｒｕｙｋら，Ａ ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ａｎｎｕａｌ ，８７８（１９５７−１９５８））ＷＨＯ によってナタマイシンを示す名称であるピマリシンは、ストレプトマイセス・ナ タレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）あるいはスト レプトマイセス・ギルボスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｉｌｖｏｓ ｐｏｒｅｕｓ ）のいずれかによって産生される。 初期の特許には多数回の精製工程を必要とし比較的高価なユニット操作を含む 回収方法が記載されている。英国特許第８４６，９３３号はメタノール、ブタノ ールおよびアセトンのような水混和性溶媒を使用した発酵ブロスからのナタマイ シンの吸着／溶出回収を開示している。米国特許第３，８９２，８５０号は限ら れた水混和性を有する有機溶媒への抽出、次いで該溶媒からの回収による発酵ブ ロスからの回収を開示している。米国特許第３，３７８，４４１号は発酵ブロス の塩析、ついで溶媒溶解および蒸発による沈殿によるナタマイシンの回収をクレ ームしている。その後の特許である英国特許第２，１０６，４９８号は濾過され た発酵ブロスを真空濃縮またはブタノール抽出して原材料である抗菌複合体を得 、ここからナタマイシンを単離できる。ＷＯ９２／１０５８０はナタマイシンを メタノールで低ｐＨで溶解し、ブロス固形物を除去することを開示している。こ れらの条件下にナタマイシンは酸分解に感受性であって、収量の低下および生成 物純度の低下に有効である。このように、先行技術は高い品質のナタマイシンの 効率的な回収方法を教示していない。 発明の総括 本発明は、実質的に水混和性溶媒をアルカリ性ｐＨで使用する発酵ブロスから 高品質のナタマイシンを回収する新しい単純な効率的方法に関する。詳細には、 ナタマイシンは発酵ブロスから以下の方法で回収される： ａ）上記ブロスのｐＨを約１０より上に調節し、上記ブロスにナタマイシンを溶 解させるに十分な量の実質的に水混和性の溶媒を加え； ｂ）ｐＨ調節されたブロスから不溶性固体を除去し； ｃ）該ブロスのｐＨをナタマイシンを該ブロスから沈殿させるに十分なレベルに 低下させ； ｄ）ナタマイシンを上記ブロスから取り出す。 好適具体例においては、ブロスのｐＨは段階ａ）では１０ないし１１に、段階 ｃ）においては５．５ないし７．５に調節される。段階ｂ）およびｄ）において はいくつかの方法、たとえば、遠心分離、深部濾過および交差流濾過を使用でき るが、好ましい方法は交差流濾過である。回収段階の前に発酵ブロスをたとえば 重量／容量にもとづいて１０ないし５０％固体に濃縮するのが好ましい。回収工 程の間のナタマイシンの大きな安定性のため、ＢＨＡ、ＢＨＴ、アスコルビン酸 またはエリスロビン酸ナトリウムのような抗酸化剤を添加できる。 発明の詳細な説明 発酵によるナタマイシンの生産は周知である。上述の英国特許、ＧＢ８４６， ９３３は代表的であり、ストレプトマイセス・ギルボスポレウス（Ｓｔｏｒｅｐ ｔｏｍｕｃｅｓ ｇｉｌｂｏｓｐｏｒｅｕｓ）を使用した発酵によってナタマイ シンを製造することを開示している。 ナタマイシンを含む発酵ブロスは、所望なら、蒸発、深部濾過、交差流濾過お よび遠心分離のような適当な方法によって濃縮できるが、好ましい方法は交差流 濾過である。重量／容量にもとづいて約１０ないし５０％固体の範囲に濃縮する のが好ましい。濃縮の間ブロスは５０ないし７０℃の範囲に加熱して蒸発または 濾過速度を改善する。 上記ブロスを適当な塩基性化剤、たとえばＮａ₂ＣＯ₃，Ｋ₂ＣＯ₃，ＫＯＨ，Ｎ ａＯＨまたはその組み合わせを使用して約１０を越えるｐＨ、好ましくは約１０ ないし約１１に調節した。濃縮段階での水除去の程度に依って、この濃縮物の水 または水混和性による希釈を行ってｐＨ調節の間の撹拌を促す必要があるかも知 れない。さらに、上記ｐＨ調節濃縮物にナタマイシンを溶解させるに十分量の実 質的に水混和性の溶媒を加える。適当な水混和性溶媒は、たとえば、エタノール 、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフランおよびそれ らの組み合わせである。これらのうち、イソプロパノールが好適である。典型的 には、濃縮物１容量部当たり１ないし２容量部のイソプロパノールが必要である 。 ナタマイシンの溶解度は水あるいはイソプロパノールのいずれでも低いが（” Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｔｗｅｎｔｙ− Ｓｉｘ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａ ｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ ，ｖｏｌ．５０，ｎｏ．２，１９６７），高いｐＨでは溶媒混合物において４０ ないし１２０ｇ／ｌ以上で可溶性である。文献ではナタマイシンはあるかりせい ｐＨでは不安定であると報告されているが（Ｈ．Ｂｒｉｋ”Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”）、実際は本 発明の条件下には適当に安定である。所望なら、安定性はアスコルビン酸、エリ ソルビン酸、ＢＨＡおよびＢＨＴのような抗酸化剤をナタマイシン活性の約０． ２重量％までの量を添加することによってさらに改善される。ＷＯ９２／１０５ ８０に開示されているような低いｐＨの回収工程の条件下には、ナタマイシンは 急速な失活およびナタマイシンから容易には分離されないナタマイシン類似物の 形成に感受性である。 不活性なブロス固体は、深部濾過、交差流濾過および遠心分離のようないくつ かの方法のいずれかによってナタマイシン溶液から取り出される。所望なら、上 記固体は、たとえば、４０−６０％イソプロパノール水溶液で洗って残留ナタマ イシン活性を抽出し、回収量を改善できる。交差流濾過はブロスの固体を除去す るのに好適な方法である。交差流濾過はＪ．Ｍ．ＷａｌｋｅｒおよびＭ．Ｃｏｘ ｇａ”Ｔｈｅ Ｌａｎｇｕａｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ ．Ｃ．，１９８８）で定義されているように、”主液体流はフィルターと平行し ていて該液体が主液体流に対して垂直に通過するようにした濾過装置のための操 作レジメである。このレジメはフィルターケーキの形成を最小にし、したがっ て濾過速度も低下する。フィルター助剤または凝集剤の必要なしに急速な濾過が できる。”特許請求された方法においては、濾過助剤の添加なしに交差流濾過に より急速濾過速度および高い最終固体濃度が可能になる。使用されるセラミック フィルターにより高い交差流速度が可能となり濾過表面を効果的に掃くことがで きる。これらは高温で使用でき、さらにフラックス強化できる。苛酷なｐＨおよ び温度条件に対するこれらの安定性により滑らかな洗浄が促進され、栓塞を最小 にする操作の間にバックパルスされ得る。 次いで生成物に富んだ溶液のｐＨを塩酸のような適当な酸で調節してナタマイ シンを沈殿させる。酸の選択は重要ではなく、経済と簡便のため塩酸が好ましい 。沈殿されたナタマイシン結晶は適当な方法、たとえば、深部濾過、交差流濾過 および遠心分離で単離される。さらに公知の精製工程、たとえば、水−イソプパ ノール混合物で洗い乾燥することによって行われる。遠心分離または交差流濾過 によりナタマイシンを単離するには、濾過母液を同様の溶媒組成の洗浄液で置き 換えて水不溶性不純物が沈殿するのを避けることが必要である。乾燥生成物は典 型的には無水状態で少なくとも９４％の純度を有する。４０−７０％の回収率が 典型的である。交差流濾過は上述のようにナタマイシンの好適単離方法であって 、母液および洗浄液を急速に除去する。この場合の生成物は濃縮結晶スラリーで あり、これは種々の方法、たとえば蒸発または噴霧乾燥によって乾燥固体に転換 できる。 ナタマイシンは結晶の形では温度安定性である（Ｈ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓら、Ｃ ｕｌｔｕｒｅｄ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐ２３，（ １９７８年８月））。生成物水分が約６％以下で運転されない限り７０℃に維持 された乾燥温度が受容できる。ナタマイシンは通常三水和物として存在する。無 水ナタマイシンは水和物より不安定であるが、あまり過剰に乾燥すると生成物の 純度に悪影響を及ぼす。 本発明の回収方法によっては典型的に９４ないし９９％（無水状態にもとづい て計算）の乾燥生成物純度および４０−７０％の回収率が達成される。 実施例 実施例１ 回転エバポレイターによって、１０．５ｇ／ｌのナタマイシン濃度の１０２７ ｍｌの発酵ブロスを５００ｍｌに濃縮した。ｐＨを１０Ｍ水酸化ナトリウムで１ ０．５に調節し、５００ｍｌのイソプロパノールを加えた。この混合物を約２時 間撹拌し、次いで遠心分離した。透明な暗色ナタマイシンに富んだ溶液を傾瀉し 、１２Ｍ塩酸でｐＨ６．５ないし７．５に調節し数時間かけて結晶化させた。ナ タマイシン結晶を遠心分離により単離し、水：イソプロパノール１：１混合物４ ０ｍｌでフィルター漏斗に移し、濾過し、水：イソプロパノール１：１混合物２ ０ｍｌずつで３回洗い、真空オーブン中３５℃で一定重量まで乾燥し、無水状態 にもとづいて純度９６．２％の８ｇのナタマイシン固体を得た。ブロスからの収 率は６９％であった。実施例２ ナタマイシン濃度１３４ｇ／ｌの発酵ブロス濃縮物の１０．２リットル部分を 炭酸ナトリウム１１００ｇ、１４０ｍｌの５０％水酸化ナトリウム溶液および十 分量の水（１．３リットル）を添加することによりｐＨ１０．６に調節しこのｐ Ｈ調節の間に重い沈殿物を混合させた。得られたスラリーに、６ｇのＢＨＡを含 むイソプロパノール６ｋｇを加え、混合物を撹拌してナタマイシンを溶解させた 。ブロスの固体を２５−３０℃で交差流濾過により取り出した。この操作の間に 保持されたブロスの固体のスラリーは濃厚となったので、水：イソプロパノール １：１混合物１０リットルを加えて残留するナタマイシンを洗い出した。濾液を ５Ｍ塩酸でｐＨ６．６に調節し、ナタマイシンを１−２時間かけて結晶化した。 ナタマイシンをビュッフェナー漏斗で濾過し、約５００ｍｌのイソプロパノール と水４０：６０の混合物で洗い、約５００ｍｌの水で洗い、実験室フードで乾燥 して５５０ｇのナタマイシン固体を得た。これは無水状態での純度９７％を越え ていた。ブロス濃縮物からの収率は約４０％であった。実施例３ １．０６％のナタマイシンを含む９６００ガロンの容量の発酵ブロスを５５− ６０℃での交差流濾過によって５３５ガロンの容量に濃縮した。この操作の間に 保持したスラリーが濃縮されたので９１５ガロンの水を洗浄液として加えた。保 持され洗浄されたブロス濃縮物がもはや濾過できないとき、それを炭酸ナトリウ ムと水酸化ナトリウムでｐＨ１０．６に調節し、８０００ｋｇのイソプロパノー ルを加えてナタマイシンを溶解し１ポンドのエリスロビン酸ナトリウム加えて酸 化から保護した。ブロスの固体を２３−２８℃で交差流濾過により除去した。こ の操作の間に保持されたブロスの固体のスラリーは濃厚となったので、水：イソ プロパノール１：１混合物１６２５ガロンを加えて残留するナタマイシンを洗い 出した。ナタマイシンを含む濾液を塩酸でｐＨ６．５に調節した。ナタマイシン を１−２時間かけて結晶化し、水で洗い、乾燥し、２４０ｋｇのナタマイシンを 得た。これは無水状態での純度９８％であった。収率は約６０％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スクラヴォーノス，コンスタンティン アメリカ合衆国コネチカット州06385，ウ ォーターフォード，イースト・ワーフ・ロ ード ７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ナタマイシンを含む発酵ブロスからナタマイシンを回収する方法であって、 下記段階からなる方法： ａ）上記ブロスのｐＨを約１０より上に調節し、上記ブロスにナタマイシンを溶 解させるに十分な量の実質的に水混和性の溶媒を加え； ｂ）上記ｐＨ調節されたブロスから不溶性固体を除去し； ｃ）該ブロスのｐＨをナタマイシンを沈殿させるに十分なレベルに低下させ； ｄ）ナタマイシンを上記ブロスから取り出す。 ２．水混和性溶媒が、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン 、テトラヒドロフランおよびそれらの組み合わせから選択される請求項１記載の 方法。 ３．水混和性溶媒がイソプロパノールである請求項２記載の方法。 ４．段階ａ）において上記ブロスのｐＨが１０と１１との間に調節される請求項 １記載の方法。 ５．段階ａ）において上記ブロスのｐＨが１０と１１との間に調節される請求項 ３記載の方法。 ６．段階ｃ）において上記ブロスのｐＨを５．５と７．５との間に低下させる請 求項１記載の方法。 ７．段階ｃ）において上記ブロスのｐＨがを．５と７．５との間に低下させる請 求項５記載の方法。 ８．段階ｂ）が交差流濾過を利用する請求項１記載の方法。 ９．段階ｂ）が交差流濾過を利用する請求項７記載の方法。 １０．上記ブロスを濃縮する予備段階を含む請求項１記載の方法。 １１．上記ブロスが１０−５０重量／容量％の固体濃度に濃縮される請求項１０ 記載の方法。 １２．上記予備段階が交差流濾過を利用する請求項１０記載の方法。