JPH09505058A - 心機能不全の治療方法およびそのために有用な医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、心臓組織においてイノシトール（１，４，５）トリスリン酸の作用または放出を遮断または阻害することのできる薬剤を有効量投与することにより、哺乳動物において、心機能不全を予防および／または治療するための方法、ならびにそれに有用な医薬組成物に主として関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 心機能不全の治療方法 およびそのために有用な医薬組成物 本発明は一般に、心組織におけるイノシトール（１，４，５）トリスリン酸の 放出または作用を阻害または遮断することができる薬剤を有効量投与することに よって哺乳動物における心機能不全を予防および／または治療するための方法、 およびそれに有用な医薬組成物に関する。 本明細書中において番号で参照される参考文献の詳細は、発明の詳細な説明の 終りに収録されている。 この明細書を通して、文脈により他の意味を必要としない限りは、「含む」と いう文言または「含み」等のその変形は、記述される要素もしくは整数または要 素もしくは整数の群を包含することを意味し、他の要素もしくは整数または要素 もしくは整数の他の群を排除するものではないことが理解されるであろう。 ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）代謝回転経路は、さまざまな種 類の細胞において広範囲の神経伝達物質およびホルモン誘導反応を仲介する複合 的なシグナル変換系である（１）。経路は通常、２つのよく説明されている第２ の伝達物質ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および以下Ｉｎｓ（ １，４，５）Ｐ₃として示すイノシトール（１，４，５）トリスリン酸の放出を 引き起こす特定のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）による膜リン脂質ホスファチジル イノシトール（４，５）ビスリン酸（Ｐ ｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂）の受容体により仲介された加水分解を伴なう。ＤＡ ＧはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化し、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃は 特定の細胞内貯蔵所からカルシウムを放出する。経路の２つの枝は、収縮、分泌 および分裂促進を含むさまざまな細胞反応を別々にまたはともに制御する（２） 。Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃は、Ｉｎｓ（１，４）Ｐ₂を経てＩｎｓ（４）Ｐ₁へ の脱リン酸化およびＩｎｓ（１，３，４，５）Ｐ₄へのリン酸化によって細胞内 で急速に代謝され、これはさらに代謝されてさまざまなイノシトールリン酸異性 体を生成する（図１）。Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ₄自体は、カルシウム封鎖 における役割を有することが示唆されており（３）、他のイノシトールリン酸に 対する役割も示唆されている（４）。 心臓におけるＰｔｄＩｎｓ経路は、α₁−アドレナリンおよびムスカリン受容 体、エンドテリン、およびストレッチによって活性化される（５）。筋肉でない 組織と比較して、心臓はカルシウム放出の点でＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃に対し て敏感ではなく （６）、濃度の高いＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃を添加するとほ とんどの細胞で見られるようにカルシウムの急速な放出ではなくゆっくりとした 漏れが起こる（７）。さらに、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃は、不整脈の発生と関 連するカルシウム振動を高めるが（８，９）、カルシウムに誘起されるカルシウ ム放出を高めるも のではなく、この機構は興奮収縮連関に関連する。 本発明者らは、心臓におけるＰｔｄＩｎｓ代謝回転経路が筋肉でない細胞にお いて説明されるのとは異なることを以前に報告した。心臓においては、［³Ｈ］ Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のリン酸化生成物はかろうじて検出可能であり、より 小さいＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃キナーゼ活性を示す（１０）。より最近の研究 によって、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃はリン酸化によっても脱リン酸化によって もほとんど放出も代謝もされないこと、および蓄積されたイノシトールリン酸の ほとんどがＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃からではなくＩｎｓ（１，４）Ｐ₂から由来 することがわかっている（１１）。これらの発見は、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ が健康な心臓では大きな役割を果たさないことを示唆している。 しかしながら、心筋の虚血および再灌流等の病理学的状態の下ではＰｔｄＩｎ ｓ経路およびＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃がより重要であり得る証拠が存在する。 イノシトールリン酸の放出に関連するα₁−アドレナリン受容体の刺激は、虚血 の際にも再灌流の際にも不整脈すなわち心室頻拍（ＶＴ）および心室細動（ＶＦ ）の双方を誘起することができる。これらの反応は酸素正常状態下では観察され ない。虚血は、多くの心筋調製物におけるα₁−アドレナリン受容体の密度を上 昇させ（１２）、ノルアドレナリン刺激に対する反応性を高める（１３）ことが 報告されている。虚 血性心筋層の再灌流は、多量のカルシウム蓄積と関連し、明らかにα₁−アドレ ナリン受容体の刺激と関連している（１４）。これらのカルシウムの蓄積は、再 灌流により誘発される損傷と関連がある。さらに、多くのアンタゴニストによる α₁−アドレナリン受容体の遮断は、虚血および再灌流の状態のいずれの下でも 抗不整脈性を示している（１５）。 本発明に至る研究において、分離され灌流されたラットの心臓においてＰｔｄ Ｉｎｓ代謝回転経路に対する虚血および再灌流の作用を測定し、これを特徴付け 、これらの病理学的状態の下での第２の伝達物質Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃に対 する可能な機能的役割を調べるために詳細な研究を行なった。 驚くことに、全体的な虚血の後の酸素化媒質との再灌流は、Ｉｎｓ（１，４， ５）Ｐ₃の急速で定量的に大きな上昇を起こし、これは観察される不整脈の発生 と経時的に相関し得ることがわかった。さらに、アミノグリコシド類であるネオ マイシン、ゲンタマイシンまたはストレプトマイシン（これらはＩｎｓ（１，４ ，５）Ｐ₃の形成を阻害することで知られた薬剤である）を用いて心臓における Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成を遮断することによって、虚血性の心臓の再灌 流の後に起こる不整脈を完全に排除するか、または著しく低減することが可能で あることが観察された。 したがって、本発明の一局面は、哺乳動物における心機能不全の予防または治 療のための方法を意図するものであり、この方法は心組織におけるＩｎｓ（１， ４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断することができる薬剤を有効量、上記哺乳 動物に投与することを含む。 本発明の別の局面は、１つ以上の製薬的に許容される担体および／または希釈 剤とともに、心組織においてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断 することができる薬剤を含む、心機能不全の予防および／または治療において有 用な医薬組成物に向けられる。 本発明のさらに別の局面は、心組織におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成 または放出を遮断するのに用いられる薬剤に関する。 本発明のさらに別の局面は、心臓不整脈の治療または予防のための医薬の製造 における心組織内のＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断する薬剤 の使用に向けられる。 任意に選択可能に、抗不整脈性薬剤等の別の抗心機能不全薬剤が、Ｉｎｓ（１ ，４，５）Ｐ₃の放出または作用を阻害または遮断する薬剤と組合せて投与され る。このような薬剤は、これに限られるわけではないが、ストレプトキナーゼお よび組織プラスミノーゲン活性化物質等の血栓溶解を誘発する薬剤、またはアミ オダロン（amiodorone）、ソトロール（sotolol）、リグノカイン（lignocaine ）等 の他の抗不整脈性薬剤を含む。 好ましい具体例において、哺乳動物はヒト、たとえばヒツジ、ウシ、ウマ、ロ バまたはブタ等の家畜、またはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコまた はイヌ等の実験用動物である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。 「心機能不全」という語は最も一般的な意味で用いられており、心臓の効果的 なポンプ動作の低下を引き起こし、組織が不十分に灌流されるようないかなる状 態にも関する。より特定的には、これは以下の状態を包含するか、またはこれら の結果として起こり得るものである。それらはすなわち、心臓不整脈、心筋症、 同種異系移植片拒絶（心臓）、冠動脈血管形成、心肺バイパス手術、および電気 生理学的研究である。本発明は特に心臓不整脈の予防および／または治療に向け られる。以下、心臓不整脈に対する言及は、上述のすべての状態を包含するもの と意図される。 以下、ラットの心組織におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃阻害の効果に関して 本発明を詳細に説明する。しかしながら、これはあらゆる哺乳動物、および特に ヒトおよび家畜におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃阻害剤の効果にも及ぶことを 理解されたい。したがって、ラットにおけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃阻害の効 果に対するいかなる言及も、あらゆる哺乳動物、および特にヒトおよび家畜にお けるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃阻害の効果に適用できることを意味する。 「心臓不整脈」という表現は、ここでは、心悸動または心臓の伝導組織を介し てのその伝達における生理学的または病理学的障害によって起こる不規則な心臓 の動きが存在する哺乳動物の状態を示し、かつ、これに限られるわけではないが 、心房、本態性、結節性、発作性心房、発作性結節性、発作性心室、多形性心室 、反射性および洞および心室細動を含む特定の心臓の部位の頻拍および細動を含 む。したがって、心臓不整脈の治療はもっぱら、心臓の規則的な動きを維持する かまたはこれを戻すのに十分な状態および時間をもってＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ の放出または作用を阻害または遮断する薬剤を有効量投与することによって心 臓の規則的な動きを維持するか、またはこれを戻すことである。心臓不整脈は、 疾患状態の後に起こるか、または外傷もしくは治療の結果起こり得るものであり 、本発明は心臓不整脈のいかなる１つまたはそれ以上の原因に限定されるもので はない。典型的には、心臓不整脈は、心筋梗塞形成の後、心肺バイパス手術後の 再灌流の結果として、および不安定なアンギナを有する患者において起こる。 本発明はまた、心臓不整脈が発生する可能性をなくすかこれを少なくするため にＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出または作用を遮断する薬剤を投与する予防的 治療にも及ぶ。 本発明に従って用いられる、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出または作用を阻 害するか、またはその作用を遮断することができる薬剤は、たとえば以下の（ｉ ）および（ ii）を含む。 （ｉ） リン脂質ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂からのＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ の生化学的放出に影響を与え、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃形成の低減を起こす薬 剤。このような薬剤は、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチル マイシン、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンまたはそれら の誘導体等のアミノグリコシド類として知られる化合物のクラス、および、スペ ルミンまたはその誘導体等のポリアミンとして知られる化合物のクラスを含み、 さらにホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）酵素を結合して阻害を生む薬剤を含むもので ある。 （ii） Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の作用を遮断する薬剤、たとえばＩｎｓ（ １，４，５）Ｐ₃受容体を遮断する薬剤、またはＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃に対す るアンタゴニスト化合物。 したがって、好ましい一具体例において、本発明は哺乳動物における心臓不整 脈の治療またはその予防のための方法を提供し、上記方法は、心臓不整脈を調整 するのに十分な条件および時間をもって上記哺乳動物に有効量のアミノグリコシ ドを投与することを含む。 好ましくは、アミノグリコシドは、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカ シン、ネチルマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンまた はそれらの誘導体を含む群の１つである。さらに好ましくは、アミノグ リコシドはネオマイシンまたはその誘導体である。最も好ましい具体例では、ア ミノグリコシドはゲンタマイシンである。 さらに別の好ましい具体例において、本発明は、哺乳動物における心臓不整脈 の治療またはその予防のための方法を提供し、上記方法は、心臓不整脈の調整に 十分な条件および時間をもって上記哺乳動物に有効量のポリアミン化合物を投与 することを含む。 好ましくは、本発明のこの局面において、ポリアミンはスペルミンまたはその 誘導体である。さらに好ましい局面においては、ポリアミンはスペルミンである 。 さらに、ポリアミンまたはアミノグリコシドまたはＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ の放出または作用を阻害または遮断する他の薬剤の投与経路は、好ましくは、経 口、非経口または頬からの投与であるが、ここで意図される方法にわずかな変形 を加えるだけで別の経路も同様に応用可能である。薬剤の有効量は、治療される べき症状および哺乳動物に依存するが、哺乳動物に投与されるべき量は害を及ぼ さないものでなくてはならない。一般に、薬剤の有効量は、１日当たりの投与量 で、０．１→１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは１−１００ｍｇ／ ｋｇであり、さらに好ましくは５−６０ｍｇ／ｋｇである。 本発明の組成物において用いられる製薬的に許容される担体または希釈剤は当 業者には周知であり、たとえば、Re mington's Pharmaceutical Sciences，第１８版，Mack Publishing Company，Ea ston、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国、に記載されている。 本発明に従って説明される方法および医薬組成物は、種々の外科的処置の結果 として起こるかまたは心臓病が根底にある心臓不整脈の治療または予防に特に有 用である。 Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出または形成を遮断することができる薬剤は、 一般に、まず分離され灌流されたラットの心臓等の灌流される心組織においてイ ン・ビトロで試験される。有用であると思われる薬剤が次に、ラット、マウス、 モルモット、またはウサギ等の小型動物のモデルにおいてイン・ビボで試験され る。この最初のイン・ビボでのスクリーニングの後でも依然として有用な可能性 のある薬剤は、次にイヌ、ウマ、ブタまたはミニブタ等のより大型の動物モデル で試験することができる。次に、有用な活性の徴候をなおも示す薬剤を用いてヒ トの被験者で臨床試験が行なわれてもよい。抗不整脈性薬剤の臨床試験のための 適切なプロトコルは、ハイドビューシェル（Heidbuchel）らにより記述されてい る（３６）。 本発明はさらに、以下の非制限的な図および例によって説明される。 図面において、 図１は、ホスファチジルイノシトール代謝回転経路を図式的に表わすものであ る。心臓において支配的な経路は箱 の中に示される。 図２は、分離され灌流されたラットの心臓からＴＣＡ抽出されたイノシトール リン酸のＨＰＬＣプロファイルを示す。 Ａ：コントロール心臓、Ｂ：３０分間の全体的な心筋虚血を施された心臓。長 い矢印は、ヌクレオチド標品の溶出位置を示す。 図３は、期間を増加させて全体的な心筋虚血を施していった、分離され灌流さ れたラットの心臓における１ｍｇタンパク質当たりのｃｐｍでの³Ｈ標識イノシ トールリン酸の蓄積を示すグラフである。 図４は、虚血および２０分間の虚血期間の後に再灌流を施された、分離され灌 流されたラットの心臓における³Ｈ標識イノシトールリン酸の蓄積を示すグラフ である。 図５は、ノルアドレナリン刺激（Ａ）、虚血および再灌流（Ｂ）およびレセル ピンの存在下で虚血および再灌流（Ｃ）を施された、分離され灌流されたラット の心臓における個々の³Ｈ標識イノシトールリン酸の蓄積を示すグラフである。 図６は、無処理２分間の再灌流反応の百分率として、２０分間の全体的な虚血 後２分以内の再灌流での³Ｈ標識イノシトールリン酸蓄積に対する種々のネオマ イシン濃度の作用を示すグラフである。 図７は、新生児の筋細胞における³Ｈ標識イノシトール リン酸の蓄積をｃｐｍで示すグラフである。Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のレベル が低いことに注目されたい。 図８は、副腎糸球体細胞における³Ｈ標識イノシトールリン酸の蓄積ｃｐｍを 示すグラフである。Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のレベルが低いことに注目された い。 例１ イノシトールリン酸の実験 心臓におけるイノシトールリン酸反応 発明者らの実験室でのこれまでの研究によって、心組織におけるイノシトール リン酸放出および代謝の経路は、Ｃａ²⁺放出伝達物質Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ の脱リン酸化の生成物は認められるがリン酸化生成物は認められない点で、他の 細胞におけるものとは異なることがわかっていた（１０）。関連する代謝経路は 図１に示される。その後の研究によって、心臓におけるホスファチジルイノシト ール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の一次放出生成物は、Ｉｎｓ（１，４， ５）Ｐ₃ではなくＩｎｓ（１，４）Ｐ₂であることを証明することによって、これ らの発見の説明がついた。このことは、心組織がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の生 成を回避したことを示しており、本研究の基礎となっている。より最近の研究に よって、「心臓の」経路がＧｈと称する非定型性のＧＴＰ結合タンパク質の存在 と相関することを示すことで、この通常とは異なる経路の機構的な根拠が与えら れた（１６）。Ｇｈは、受容体を定型性の ＧＴＰ結合タンパク質に結合するＰＬＣ−βとは異なるホスホリパーゼＣに結合 する（１７）。心臓イノシトールリン酸経路とＧｈの関連をさらに調べるために 、ＰＬＣ−βの阻害剤の作用が研究された（１８）。この化合物Ｕ−７３１２２ は、ノルアドレナリン刺激の下での心組織におけるイノシトールリン酸の蓄積を 阻害しなかったが、Ｇｈを欠き筋肉ではない細胞と区別できないイノシトールリ ン酸代謝経路を有する分離された新生児の筋細胞において十分に効果的な阻害剤 であった。したがって、心組織におけるホスファチジルイノシトール代謝回転経 路は、多くの重要な局面において他の細胞タイプにおけるものとは異なる。 発明者らは、経路における何らかの変化が心筋虚血および灌流の状態の下でα₁ −アドレナリンアゴニストの不整脈の作用の原因であるかどうかの可能性につ いて研究した。 Ａ）方法 分離され灌流されたラットの心臓におけるイノシトールリン酸反応 成長したオスのスプレイジ・ドーレイ（sprague dawley）ラット２５０−３０ ０ｇが用いられた。示されている場合には、ラットはレセルピンで処理され（殺 生前１８時間で５ｍｇ／ｋｇ Ｉ．Ｐ．）、内在するノルアドレナリン貯蔵物を 排除した。ラットは、断頭によって殺生するのに先立ち、１Ｕ／ｇ Ｉ．Ｐ．３ ０分ヘパリンで凝血防止処理された。心臓が迅速に切除され、直ちに氷冷生理食 塩 水において冷蔵された。氷冷溶液において、ランゲンドルフ（Langendorff）に よって説明されているように上行大動脈を介して心臓にカニューレが挿入され、 ３７℃において５％ＣＯ₂−９５％Ｏ₂で平衡させられたＨＥＰＥＳ−緩衝クレブ ス(Krebs)溶液で５ｍｌ／分の速度で逆行的に再灌流された。初期灌流は再循環 的でない態様で行なわれ、内部の血液を除去した。心臓が徐々に暖まるようにし 、内部の血液がなくなると、炭酸クレブス培地を含む３７℃の水でジャケットさ れた器官浴に移され、再循環する態様で灌流が続けられた。１５分の平衡期間の 後、心臓は、２時間にわたって［³Ｈ］−イノシトール、２μＣｉ／ｍｌで標識 された。心臓は、強いリズミカルな拍動に対して標識期間を通してモニタされた 。これらの要件を満たさないいかなる心臓も排棄された。 標識付けのあと、［³Ｈ］−イノシトール含有培地が除去され、β−アドレナ リン受容体を遮断しかつＩｎｓＰ１′−ホスファターゼによるＩｎｓＰ代謝を阻 害するため、プロプラノロール（１０^-6Ｍ）および塩化リチウム（５０ｍＭ）を 含有するクレブス培地と取換えられた（２０）。心臓は、虚血前に１０分間プロ プラノロール、ＬｉＣｌ溶液で灌流された。投与される際にアンタゴニストがこ の１０分間のプレインキュベーションにおいて含まれた。３０分までの種々の時 間にわたって灌流を終了することによって正常体温の全体的な虚血が誘起された 。２０分間の虚血 期間の後、灌流を５ｍｌ／分で再開することによって、再灌流が調べられた。反 応は、房室性の接合部での切除の後、液体₂で心臓を凍結することによって終了 された。凍結された心室の重量が測定され、イノシトールリン酸が以下に説明す るように抽出された。 イノシトールリン酸の抽出 イノシトールリン酸は、すでに記述されているように（２１）、３．５ｍｌ氷 冷５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭフィチン酸溶 液において心室試料から抽出された。簡単に、心室は、氷上１５秒間隔で１０秒 間にわたって２回「ポリトロン」（“Polytron”）ホモジナイザーによってホモ ジナイズされた。試料は、ポッターエルベハイム（Potter-Elvejheim）ホモジナ イザーを用いてさらにホモジナイズされ、その後簡単に音波破砕された。ホモジ ナイズされた試料は遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）され、ＴＣＡ 不溶材料を除去した。上澄みが収集され、残りのペレットが１．５ｍｌ ＴＣＡ ，ＥＤＴＡフィチン酸中で再抽出された。上澄みはプールされ、フレオン、トリ −ｎ−オシルアミン（ocylamine）（１：１ ｖ／v ０．７５ｍｌ：１ｍｌ Ｔ ＣＡ溶液）が加えられ、十分に混合され、低速遠心分離（２０００ｒｐｍ，１０ 分，４℃）によって相分離された。イノシトールリン酸を含有する、結果として 得られた水相が収集され、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ，２時間，５０ ℃）で処理された。この処理は、クロマトグラフィカラムを保護するのに必要で あった。処理された試料は、１ｍｌダウエックス（Dowex）−５０カラム（４％ 架橋、４−４００メッシュサイズ）にかけられ、１ｍｌの水で溶出された（２２ ）。尿素（０．０５Ｍ最終濃度）が添加され（２３）、試料は、高性能液体クロ マトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析に先立って凍結乾燥された。この方法を用いての イノシトールリン酸の回収率は、標識されない心臓の抽出物への［³Ｈ］標識標 品の添加によって見積られるように、各異性体について９５％を上回った。 イノシトールリン酸の分離および定量化 イノシトールリン酸は、すでに記述されているように（２４）、ウォーターズ ラジアルコンプレッションユニット（Waters Radial Compression Unit）におい てワットマンパーティシル（Whatman Partisil）１０μ ＳＡＸカラムを用い、 複合リン酸アンモニウムグラジエント、ｐＨ３．８、０−２Ｍを用いてアニオン 交換ＨＰＬＣシステムにより分離された。オンラインβ−カウンタ（モデルＣＲ 、ラジオマティックインスツルメンツ（Radiomatic Instruments））を用いてイ ノシトールリン酸が検出され、定量化された。市販の標品との比較によってすべ てのピークが特定された。ヌクレオチド標品ＡＭＰ、ＡＤＰ、およびＡＴＰが試 料で流され、カラムの性能を評価した。 心臓灌流液におけるノルアドレナリン同定 ノルアドレナリンの見積りのための心臓灌流液のアリコートが、虚血組織から 、２０分間ＭＩの後の再灌流の種々の間隔において収集された。試料はＨＰＬＣ によって分析され、すでに記述されているように（２５）電気化学的検出によっ て定量化された。 Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃定量分析 Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の量が、実質的にすでに記述されているように（２ ６）競合的結合測定法（アマーシャム（Amersham）ＴＲＫ１０００）を用いて測 定された。虚血に先立って２時間の心臓灌流中［³Ｈ］標識を省略したこと、お よび抽出処理においてフィチン酸の代わりに５ｍｍ ＡＴＰを用いたことを除い ては、上述のように心室試料が調製された。５ｍｍフィチン酸は、Ｉｎｓ（１， ４，５）Ｐ₃アッセイにおいて交差反応することがわかった。 タンパク質同定 標品としてウシ血清アルブミンを用いた修飾ローリー（Lowry）法を利用して ＩｎｓＰ抽出の後にＴＣＡペレットのアリコートにおいてタンパク質濃度が定め られた。 統計 ここに示す値は、特に述べられていない場合には平均±ＳＥＭ、ｎ＝４である 。結果の統計学的分析は、すべてのＩｎｓＰデータについて学生による対になっ ていない「ｔ−検定」を伴うものである。 Ｂ） 結果 ［³Ｈ］−標識イノシトールリン酸の蓄積に関する全体的虚血の影響 Ｉｎｓ（１／３）Ｐ₁、Ｉｎｓ（４）Ｐ₁、Ｉｎｓ（１，４）Ｐ₂、およびＩｎ ｓ（１，４，５）Ｐ₃として識別される［³Ｈ］イノシトール標識された心臓に含 まれる化合物のＴＣＡ抽出物。これまでに報告されているように、［³Ｈ］−Ｉ ｎｓ（１，３，４，５）Ｐ₄およびその代謝生成物は、明らかではなかった（図 ２ａ）。酸素化された媒質での３０分の灌流は、結果としてイノシトールリン酸 における［³Ｈ］−標識の時間に依存する増大をもたらした。対照的に、全体的 な虚血は、イノシトールリン酸の分配に変化を生じさせる（図２ｂ）一方、標識 の全体量は変化しないままだった。図３に示されるように、Ｉｎｓ（１，４）Ｐ₂ 、およびＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃における減少が、同時に起こる分解生成物Ｉ ｎｓ（１）Ｐ₁およびＩｎｓ（４）Ｐ₁の増大とともに観察された。［³Ｈ］−標 識イノシトールリン酸における著しい変化は、５分間の虚血後に見られた。虚血 症状の下に観察される再分配プロセスは、これがレセルピン処理によるノルアド レナリン貯蔵所の涸渇またはプラゾシン（prazosin）でのα₁アドレナリン受容 体の遮断のどちらの影響も受けないため、虚血の間に放出される内因性ノルアド レナリンからは独立的なものであった。 正常な酸素灌流とは対照的に、心筋におけるイノシトー ルリン酸の蓄積の合計は、調査された３０分の虚血期間全体にわたって変化のな いままだったので、代謝生成物Ｉｎｓ（１／３）Ｐ₁およびＩｎｓ（４）Ｐ₁の増 大により、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃およびＩｎｓ（１，４）Ｐ₂における［³Ｈ ］−標識の減少を説明することができた。これらのデータは、全体的な虚血によ り、ＰｔｄＩｎｓ−ＰＬＣ活性の阻害が引き起こされるため、局所的に高い濃度 のノルアドレナリンが存在していてもイノシトールリン酸の放出は全く起こらな いということを示している。 虚血症状下におけるイノシトールリン酸放出の制御 より最近のモデル研究は、虚血の間のイノシトールリン酸の代謝の変化が、こ れらの条件下におけるｐＨの減少にも周囲の高い細胞外Ｋ⁺濃度にも関連してい ないということを示している。むしろ、発明者らの研究により、イノシトールリ ン酸プロファイルの変化は、ＡＴＰ含有量の減少のみによって説明され得るであ ろうことが示されている。おだやかな無酸素症は、ＡＴＰ含有量を８．３±１μ モル／ｇ乾燥重量から４．５±０．４（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、ｐ＜．０１）に 減少させ、これは結果としてＩｎｓ（１，４）Ｐ₂の含有量における減少をもた らした。全体的虚血において起こるような、ＡＴＰのより大きい減少（０．７１ ８±０．１４まで）は、結果としてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃およびＩｎｓ（１ ，４）Ｐ₂の減少をもたらした。穏やかな、および深刻な虚血のどちらのプロフ ァイルも、 ＡＴＰ生成の阻害剤を用いてモデル化することができた。 穏やかな虚血症状下では、ノルアドレナリンに反応してＩｎｓ（１，４，５） Ｐ₃の放出が起こり、このノルアドレナリンの周囲レベルはこの症状下では高い ものである。穏やかな虚血に続く再灌流により、この反応はさらに強められる（ 後の部分を参照されたい）。したがって、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃放出が虚血 症状下で起こるかどうかは、組織のＡＴＰ含有量、したがって虚血の深刻さに依 存する。しかしながら、再灌流を伴えば強められた放出が常に見受けられる。 ³Ｈ−標識イノシトールリン酸の蓄積に関する虚血後の再灌流の影響 ２０分の全体的な心筋虚血に続く酸素化された媒質での再灌流により、［³Ｈ ］−標識イノシトールリン酸の蓄積における急速な増大がもたらされた。この活 性化は二相性であって、１分および２分の再灌流の間に起こる急速かつ一過性の 蓄積と、それに続く２０分を過ぎても続くゆっくりとした量的には小さい２次的 な蓄積とを伴う（図４）。 ２分間の虚血後の再灌流によりもたらされるイノシトールリン酸の急速な蓄積 は、先行するレセルピン処理によりそれが回避されていたため、内因性ノルアド レナリンの放出に依存していた（図５ｃ）。［³Ｈ］−標識Ｉｎｓ（１，４，５ ）Ｐ₃の放出は、１０^-4Ｍのノルアドレナリンでの灌流により、レセルピン処理 された動物において回復させ ることができた。プラゾシン（１０μＭ）処理は、２分の再灌流イノシトールリ ン酸反応を阻害し、α₁−アドレナリン受容体を介しての仲介を示した。したが って、即時の再灌流Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃反応にはニューロンで放出された ノルアドレナリンが必要であり、かつこれはａ₁−アドレナリン受容体により仲 介される。 再灌流Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃反応はａ₁−アドレナリン受容体のノルアドレ ナリン刺激によりもたらされるものではあるが、これは酸素正常状態下における ノルアドレナリン反応とはいくつかの点で異なっている。第１に、イノシトール リン酸の放出が量的により大きい。第２に、放出されたイノシトールリン酸のプ ロファイルが、再灌流条件下における１次的な放出生成物はＩｎｓ（１，４，５ ）Ｐ₃であった一方で酸素正常状態下（１１）ではＩｎｓ（１，４）Ｐ₂が優勢で あるということにおいて、異なっている。第３に、再灌流条件下におけるイノシ トールリン酸の放出は、後に詳述する（表１）ように、酸素正常状態下では放出 を阻害しなかったいくつかの化合物により、阻害されている。 Ｏ₂を含まない（Ｎ₂飽和）媒質での再灌流はイノシトールリン酸放出を活性化 しないため、２分の再灌流反応には酸素の再導入が必要である。この発見は、近 年の報告が酸化体はＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃受容体の感度を増大させると示し ている（２７）ため、大変興味深いものである。 したがって、２つの異なるメカニズムすなわち増大される放出と増大される感度 とにより、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃は、虚血および再灌流の条件下においてよ り影響的かつより損傷を与えるものとなり得る。 虚血および再灌流の条件下におけるノルアドレナリン濃度 内因性ノルアドレナリンは、虚血症状下において心筋の細胞外空間内に蓄積さ れることが知られている（２８）。発明者のモデルにおいてそのような蓄積を立 証するため、この研究では組織および周囲の灌流液においてノルアドレナリン濃 度が測定された。虚血の開始に先立ち、プロプラノロールおよびＬｉＣｌを含む クレブス(Krebs)媒質での１０分の再循環灌流に続いて、コントロール値（９． ８７±１．５４×１０^-10Ｍ）がサンプリングされた。２０分の全体的虚血によ り、心筋の細胞外空間内でノルアドレナリンの蓄積が引き起こされた（８．１９ ±２．０３×１０^-7Ｍ）。このノルアドレナリンは再灌流で急速に放出され、１ ０ｍｌの再循環灌流液内に放出されたときには４０倍前後に希釈されるにもかか わらず、２分間の再灌流ではレベルは高いままだった（１．２６±０．２８×１ ０^-8Ｍ）。灌流液のノルアドレナリンレベルは２０分の再灌流の後著しく降下し （１．０６±０．５×１０^-9Ｍ）、コントロールにおけるものと変わらないレベ ルに至った（Ｐ＞０．３）。２分の再灌流後、灌流液内のノルアドレナリン濃度 は平均１．５４±０．５×１０^-8Ｍとなった。そのような濃度は、非虚血性心筋 からのイノシトールリン酸放出を刺激するにあたり効果的でない。これは２分の 虚血後の再灌流の間の、心室のα₁−アドレナリン受容体の感度または利用可能 性の増大を示すものである。発明者らの研究室におけるこれまでの研究では、非 虚血性心筋における神経刺激がもたらすイノシトールリン酸蓄積の増大は僅かで あることが示されている。したがって心臓のα₁−アドレナリン受容体がニュー ロンで放出されたノルアドレナリンに反応するのは、虚血および再灌流の条件下 においてのみである。 再灌流により誘発される［³Ｈ］−標識イノシトールリン酸反応に関するアミ ノグリコシド類の効果 アミノグリコシド系抗生物質ネオマイシンは、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃放出 の阻害剤としてよく特徴づけられているものである（２９）（３０）。２分間の 再灌流で誘発される［³Ｈ］−標識イノシトールリン酸反応に関するネオマイシ ンの効果が調査された。虚血に１０分先立って添加され、この手順全体を通じて 維持されたネオマイシン（０．０５ｍＭ）は、［³Ｈ］−標識イノシトールリン 酸の蓄積を著しく阻害するものではなかった。より高い濃度、すなわち０．５ｍ Ｍおよび５ｍＭでは、それぞれ［³Ｈ］−標識イノシトールリン酸蓄積に対し、 ネオマイシンの不在下における２分間の虚血後の再灌流と比較して平均で４ ５％および５５％の阻害がもたらされた（図６）。これらの結果は、５ｍＭのネ オマイシンが［³Ｈ］Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の蓄積において２０％の減少を引 き起こしたが、イノシトールリン酸₁およびイノシトールリン酸₂の蓄積には効果 がなかったという、健康な心臓組織で見られるものとは異なっている。より低い 濃度は効果がなかった。これらのデータは、虚血後の再灌流の間においては、心 筋組織のネオマイシンに対する感度は１０倍を超えて増大することを示している 。 ネオマイシンのこの阻害効果がアミノグリコシド類のクラス効果であるのかど うか、またもしそうならば他のメンバーがより高い効能を有しているのではない かということを確立するために、続いて実験が行なわれた。イン・ビボでの調査 のために利用可能な血漿アッセイを用いることに鑑み、これらの調査にはストレ プトマイシンおよびゲンタマイシンが選択された。表１に示すように、ゲンタマ イシンおよびストレプトマイシンは双方とも、ネオマイシンよりも強力な再灌流 で誘発されるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃放出の阻害剤であった。したがって再灌 流で誘発されるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃放出の阻害は、アミノグリコシド類の クラス効果である。表１に示すように、ポリアミン、スペルミンもテストされ、 阻害的であることが示された。 より最近の研究は、再灌流不整脈に対するトロンビンの寄与の可能性を調査し ている。上述の研究では媒質により 灌流される心臓を使用した。しかしながら、イン・ビボの心筋虚血および再灌流 は、閉塞の要因とされる血栓の形成と関連づけられるトロンビンの局所的な高い 濃度と関わりがある。他の研究室による最近の研究では、イン・ビボでの血栓の 直接的な前駆的不整脈作用が指摘されている。発明者らの研究室における研究で は、トロンビンは心臓組織内のＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出を直接的に刺激 するものであり、この放出は再灌流条件下におけるノルアドレナリン反応の阻害 に必要とされるものと類似の濃度においてゲンタマイシンにより阻害されるとい うことが示されている。 端的に言えば、全体的な虚血に続く心臓の再灌流はＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ の放出を引き起こすものであり、これはニューロンで放出されるノルアドレナリ ンまたはトロンビンのいずれによってでもなされ得る。これらの物質は双方とも 、イン・ビボでの虚血症状下における心臓内に存在することが予期されるであろ うものである。 例２ イン・ビトロでの心筋機能 Ａ）方法 自然位(in situ)で灌流されるラットの心臓において再灌流で誘発される不整脈 虚血を誘発するための２０分間の冠動脈閉塞とそれに続く再灌流の影響下にお かれた、自然位(in situ)で灌流さ れるラットの心臓のモデルを用いて、再灌流で誘発される不整脈が調査された。 ラット（２５０−３００ｇ）は麻酔（ペントバルビトン６０ｍｇ／ｋｇ，Ｉ． Ｐ．）をかけられ、ヘパリン処理された（１ラット当り２００Ｕ、Ｉ．Ｖ．）。 次に胸郭が開かれ、金属のカニューレ（ＩＤ １ｍｍ）が挿入されて上行大動脈 内へ結びつけられ、自然位でランゲンドルフ灌流が開始された（３１）。開胸か ら心臓の灌流開始までの間隔は５０から７０秒の間であった。灌流液はクレブス 緩衝剤であり、冠動脈の流れは非虚血性の灌流については５ｍｌ／ｇ心臓重量／ 分の速度でイスマタック(Ismatac)蠕動ポンプにより制御された。この流れの速 度では、灌流ラインのサイドアームに接続された圧力変換器（グールド・シュタ ットハム(Gould Statham)モデル、ｐ２３）により測定される冠動脈灌流圧力は 、３２−３８ｍｍＨｇの間であった。大動脈の除去に続き、肺脈管がしばって止 められた。いくつかの調製物において、心室の圧力は先端から左心室腔内へミラ ーマイクロチップ変換器カテーテルを挿入することによって測定された。すべて のパラメータ、すなわち冠動脈灌流圧力、心室圧力、および心外膜ＥＣＧは、グ ラス(Grass)モデル７ポリグラフ上に絶えず記録された。２つの心臓が灌流され 、同時に調査された。 絹の縫合糸（４．０）が、左冠動脈のまわりに、その元の所から２〜３ｍｍの ところで緩く巻き付けられた。その 後の閉塞の開放のために、２つの絹の放出リングが縫合糸のまわりに位置づけら れた。局所的虚血を誘発する、動脈の守備よい閉塞は、冠動脈灌流圧における少 なくとも３０％の増大によって示された。虚血期間の間、灌流圧力は非虚血性灌 流レベルに調整された。 ハーバードモデル(Harvard Model)２２ポンプを介して、灌流に薬剤が加えら れた。灌流液パラメータを確実に一定なものとするため、薬剤の流れは灌流の流 れの１％未満とされた。薬剤は、他の言及がなされていない限りは、虚血および 再灌流期間全体の１０分前およびその最中に存在していた。 心臓調製物は調査の開始に先立ち少なくとも２０分の間安定化された。１０分 の薬剤のインキュベーションに続き、左冠動脈は２０分間、局所的虚血を誘発す るために結紮された。この虚血期間の終わりで、結紮は解放され、心臓は５分間 の間プレ虚血性の流れで灌流された。虚血の最中、または再灌流の最初の２分間 に起こる心室の不整脈は、ランベス(Lambeth)コンベンション（３２）に従い規 定された。 統計 不整脈の発生は、各グループにつきｎ≧８とし、χ²検定を用いて分析された 。 Ｂ）結果 再灌流で誘発される不整脈に関するアミノグリコシド類の 効果 第２の伝達物質Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の、最初の再灌流で誘発される放出 は、再灌流で誘発される不整脈と関連する時点において起こる。上で略述した考 察に基づき、これは不整脈の発生においてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃が役割を持 つかもしれないことを示唆している。したがって、再灌流で誘発される不整脈は 定量化され、これらの条件下におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃反応を阻害する 化合物の効果が調査された。 自然位で灌流されたラットの心臓における冠動脈閉塞およびそれに続く再灌流 の虚血性モデルが用いられ、虚血症状および再灌流された条件下の双方において 非常に高いパーセンテージの心室不整脈がもたらされた。冠動脈閉塞による２０ 分の局所的虚血により、８３％（１０／１２）のＶＴ発生率が生じた。表２に示 されるように、この虚血期間に続く再灌流は、調査された１２匹のラットのうち １０匹においてＶＴおよび退行性のＶＦを生じさせた。すべての場合において、 多数の早発の心室鼓動がみられた。ＶＴおよびその後のＶＦで不整脈になった心 臓のうちで、調査が行なわれた５分の再灌流期間の間に回復したものは１つもな かった。 これらの再灌流で誘発される不整脈に関するネオマイシンの効果が、表２に示 される。０．０５ｍＭにおけるネオマイシンは、再灌流全体にわたって深刻なＶ ＴおよびＶＦ の双方を示す調査された８匹のラットのうちの６匹に関して、誘発された不整脈 に何ら著しい効果を与えなかった。対照的に、かつ［³Ｈ］−標識イノシトール リン酸の研究と並行して、より高い濃度のネオマイシン（０．５ｍＭ）は、再灌 流により誘発される不整脈の発生を抑制し、研究された１０匹のラットのうちい ずれでもＶＴまたはＶＦが見られなかった。同様な効果が５ｍＭのネオマイシン でも観察された。０．５ｍＭのネオマイシンによる再灌流誘発不整脈の阻害は、 心拍数および心室圧力のようないかなる血流力学的効果とも無関係であったが、 薬剤の最初の導入の際にはこれらは降下し、閉塞に先立つ１０分間のインキュベ ーション期間の間でコントロールとそれほど変わらないレベルまで回復した。 表１に示すように、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびスペルミンも また、再灌流で誘発されるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出に関する効果と並行 して、再灌流不整脈を抑制するものである。ゲンタマイシンはテストされた中で 最も強力な薬剤であり、ストレプトマイシンがそれに続く。より高い濃度では、 ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンは虚血的段階の間に起こる不整脈の部 分的な抑制をももたらす。これらのデータはさらに、再灌流不整脈におけるその 明らかに本質的である役割に加えて、これらの不整脈に対するＩｎｓ（１，４， ５）Ｐ₃による寄与の可能性をも示唆している。 したがって、再灌流条件下におけるホスファチジルイノシトール（４，５）ビ スリン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂）の加水分解の阻害により、再灌流不整 脈の発生が回避される。 再灌流で誘発される不整脈に関するスタウロスポリンの(staurosporine)の効 果 Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃に加えて、第２の伝達物質ＤＡＧもまた、ＰｔｄＩ ｎｓ（４，５）Ｐ₂の加水分解の際に生成される。ＤＡＧはさまざまなイソ型の プロテインキナーゼＣを活性化し、これはいくつかの細胞のプロセスを制御する 。したがって、アミノグリコシド類の抗不整脈効果はＤＡＧ生成およびそれに続 くＰＫＣ活性化の阻害によるものである可能性があった。そこで、強力なプロテ インキナーゼＣ阻害剤スタウロスポリン（３３）の再灌流誘発不整脈に対する効 果が調査された。スタウロスポリン（１０^-7Ｍ、これは再灌流条件下で心筋にお けるＰＫＣを阻害するものとして知られている濃度である（３４））は、表１に 示されるように、未処理のコントロールから再灌流誘発不整脈の発生率パーセン トを著しく変えるものではなかった。 ホスホリパーゼＣβの阻害の影響 今日まで、利用可能なホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣの 直接的な阻害剤は僅かであった。しかしながら、１つの化合物、すなわちＵ−７ ３１２２として知られるステロイド誘導体が、ＰＬＣ−βイソ型を阻害するもの として示されている。上で説明したように、この薬剤は無傷の心臓調製物におい てはＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出を阻害せず、抗不整脈作用を伴わなかった 。このデータは表２にまとめられている。 併せて考えると、いくつかの異なる化合物から導き出されたデータは、Ｉｎｓ （１，４，５）Ｐ₃の放出の阻害により再灌流不整脈の抑制がもたらされるとい うことを示している。 再灌流条件下におけるトロンビンの不整脈効果 トロンビンが心臓におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出を直接刺激すると いう発見は、トロンビンがこのメカニズムを介して直接的に不整脈を引き起こす 可能性を示している。ノルアドレナリンにより開始される不整脈的な事象が除外 されるように、レセルピン投与されたラットからの心臓を用いて実験は行なわれ た。レセルピンを投与された動物からの心臓では、再灌流不整脈はみられなかっ た。しかしながら、灌流液にトロンビン（２Ｕ／ｍｌ）が加えられると、高い発 生率の再灌流不整脈がみられた。さらに、これらの不整脈はゲンタマイシンによ って阻害され、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出（表２）との関連性が示された 。 例３ イン・ビボでの研究 Ａ） 方法 イン・ビボでのアミノグリコシドの抗不整脈作用の研究のためにゲンタマイシ ンが選ばれた。これは、イン・ビトロでゲンタマイシンが最も効力の強い薬剤で あり、しかも血漿レベルを測定するためのアッセイ法が最近可能になっているか らである。トロンビンの作用が、観察される不整 脈に寄与するよう、ラットはヘパリンで処理されなかった。 冠動脈の閉塞および再灌流のためのイン・ビボモデル ラットは、ペントバルビトン（６０ｍｇ／ＫｇＩＰ）で麻酔をかけられ、室内 の空気により人工的に酸素を補給された。胸郭部が前方の助骨の間を介して開か れ、その心臓が露出された。４．０縫合糸が、左の冠動脈の周りに配置された後 、ポリエチレンカニューレが誘導され、通された。胸郭は、胸部の外側からカニ ューレを通したまま閉じられた。右の頸動脈には動脈の血圧を記録するためカニ ューレが挿入された。２０〜３０分間の安定化の後、チューブを通る結紮糸の末 端を引張り、かつ縫糸とともにチューブをクランプで締めて糸の末端を固定する ことにより、左の冠動脈が結紮された。虚血の時間は１０分間であり、続いて再 灌流が行なわれた。動脈の血圧およびリードＩＩ ＥＣＧが、虚血の前および間 において３分間記録され、さらに再灌流の最初の５分間記録された。イン・ビボ ラットモデルにおいて、再灌流不整脈の最も高い発生率は１０分間の冠動脈閉塞 の後に生じる。虚血領域のサイズは、実験の終わりにおいて染色法により決定さ れた。虚血領域については、コントロール動物からの心臓とゲンタマイシンを摂 取した動物との間に差異はなかった。ゲンタマイシンは虚血の開始に先立って２ ．５〜１０ｍｇ／Ｋｇ／分の投与量で注入され、プロトコルの間中維持された。 このことにより、血圧および心拍数にゆるやかな減少が生じた。 表３に示すように、ゲンタマイシンは、イン・ビボで再灌流不整脈の発生を阻 害した。これらの条件下において発生する不整脈は、ノルアドレナリンおよびト ロンビンにより起こされ、さらにおそらく他の薬剤によっても起こされると予想 された。ゲンタマイシンが虚血条件下で生じる不整脈に対しも効果的であったと いうことは留意すべき重要なことである。上述したように、Ｉｎｓ（１，４，５ ）Ｐ₃の放出もまた、虚血の厳しさに応じて、これらの条件下で生じ得る。 例４ 心臓選択的ＰＬＣ阻害剤 本発明者による研究は、虚血性再灌流の後の条件下におけるＩｎｓ（１，４， ５）Ｐ₃放出の阻害が、再灌流不整脈の発生を阻害することを示している。この ことは、Ｐｔ ｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂をＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃に加水分解するＰＬＣ酵素に 直接結合しかつ阻害すること、またはＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂を拘束しかつ それによりあまり直接的にではなくＰＬＣ活性を阻害することのいずかにより、 達成することができた。ＰｄｔＩｎｓ代謝回転経路がすべての細胞系において生 じるものであるとすれば、阻害剤を効果的な治療上の手段とするには、何らかの 選択性を阻害剤に組込むことが重要である。心臓においてα₁−アドレナリン受 容体に結合するＰＬＣは、直接的な酵素阻害剤に対して１つの可能なターゲット を提供するものである。なぜなら、それは、最近論述されているＰＬＣクラス（ １７）のいずれとも異なる酵素であるからである。しかしながら、ＰｔｄＩｎｓ （４，５）Ｐ₂を拘束するアミノグリコシド類のような薬剤もまた適切であり得 る。本発明者は、これらの化合物の効力が虚血条件下において１桁を上回る大き さで増加することを示してきた。さらに、たとえアミノグリコシド類がＰｔｄＩ ｎｓ（４，５）Ｐ₂を拘束することにより作用するとしても、ＰＬＣ活性の阻害 を生じることにおけるアミノグリコシド類の相対的な効力は、異なるＰＬＣイソ 形に対して異なっており、しかもゲンタマイシンよりもむしろネオマイシンは概 して最も効果的である（表４）。ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂は、ホスファチジ ルコリン特異的ホスホリパーゼＤのための基質であるよりもむしろ活性化物質で ある。この酵素に対して、 アミノグリコシド類はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂による活性化を阻害すること を示してきているが、効力の順位のオーダーは、ＰＬＣの研究において観察され るものと異なっていた。したがって、たとえアミノグリコシド類がＰｔｄＩｎｓ （４，５）Ｐ₂を拘束することにより作用するとしても、この拘束は、明らかに 、異なる態様でＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂に相互作用する異なる酵素類に影響 を及ぼすものである。 したがって、適切に選択的な薬剤の開発は、これらのメカニズムのいずれかに よって可能であるはずである。 例５ 抗不整脈剤 最近入手することができる抗不整脈剤は、効力が全く不十分なものであり、し かもそれらの用途は顕著な副作用のためにしばしば限定される。さらに、これら の薬剤は、虚血の間に生じる不整脈を主としてターゲットにしており、しかも再 灌流の後に生じる不整脈に対して実質的に効果的ではない（３６）。ゲンタマイ シンはイン・ビトロおよびイン・ビボで再灌流不整脈を阻害することにおいて非 常に効果的である。これらの発見は、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出の阻害に 基づく全く新しいクラスの抗不整脈剤を開発するための支えになるものである。 さらに、イン・ビボで発生する不整脈は、イン・ビトロモデル系で見られる不整 脈よりも機構的により複雑であるはずであり、しかも我々のモデル研究およびイ ン・ビボ実験の両方によって示唆されるように、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃は一 般的に言われている「再灌流」不整脈よりもより広い役割を有し得るはずである 。不安定なアンギナのような症状は、冠動脈の一時的な閉塞の繰返しを伴うはず であり、したがって虚血および再灌流の症状の発現の繰返しを伴うはずである。 したがって、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の放出の阻害により作用する薬剤は、一 般的に言われる「再灌流」不整脈よ りも広く臨床上適用することができるものである。 以上具体的に説明してきたもの以外の変更および修飾がここに規定される本発 明について可能であることは当業者において容易に理解できるところである。本 発明がそのような変更および修飾をすべて包含することが理解されるべきである 。本発明はまた、本明細書において個々にまたはまとめて言及されまたは示され る工程、特徴、組成物および化合物のすべてを含むものであり、さらには、それ らの工程または特徴のいずれの２つまたはそれ以上の任意の組合せおよびすべて の組合せを含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/335 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/335 31/34 9454−4Ｃ 31/34 31/40 9454−4Ｃ 31/40 31/44 9454−4Ｃ 31/44 31/70 ＡＢＱ 9051−4Ｃ 31/70 ＡＢＱ 31/71 9051−4Ｃ 31/71 38/43 9051−4Ｃ 37/547 38/45 9051−4Ｃ 37/52 38/48 9051−4Ｃ 37/465 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ダート，アンソニー・マイケル オーストラリア、3145 ビクトリア州、イ ースト・マルバーン、ダグラス・ストリー ト、24 (72)発明者 デュー，シャオ−ジュン オーストラリア、3181 ビクトリア州、ウ インザー、アプトン・ロード、13／40

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 哺乳動物における心機能不全の予防または治療のための方法であって、心 臓組織においてイノシトール（１，４，５）三リン酸（Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ₃ ）の形成または放出を遮断することのできる薬剤の有効量を前記哺乳動物に投 与することを含む、方法。 ２． 前記心機能不全が心臓の不整脈であることを特徴とする、請求項１の方法 。 ３． 前記心臓の不整脈が、心臓部位の頻拍および細動を含むことを特徴とする 、請求項２の方法。 ４． 前記薬剤が、リン脂質ＰｄｔＩｎｓ（４，５）Ｐ₂からのＩｎｓ（１，４ ，５）Ｐ₃の放出を阻害または阻止するものであることを特徴とする、請求項１ 、２または３の方法。 ５． 前記薬剤がアミノグリコシドであることを特徴とする、請求項４の方法。 ６． 前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン 、ネチルマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンまた はそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５の方法 。 ７． 前記薬剤がポリアミンであることを特徴とする、請求項４の方法。 ８． 前記ポリアミンがスペルミンまたはその誘導体であ ることを特徴とする、請求項７の方法。 ９． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の作用を遮断することを特徴とする 、請求項１、２または３の方法。 １０． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃受容体を遮断することを特徴とす る、請求項９の方法。 １１． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のアンタゴニストであることを特 徴とする、請求項９の方法。 １２． 前記薬剤が経口投与、非経口投与または頬からの投与によることを特徴 とする、請求項１、２または３の方法。 １３． 前記有効量が、前記哺乳動物の体重のキログラム当り約０．１から約１ ００ｍｇであることを特徴とする、請求項１、２または３の方法。 １４． 前記有効量が、前記哺乳動物の体重のキログラム当り約５から約６０ｍ ｇであることを特徴とする、請求項１３の方法。 １５． 抗不整脈剤の逐次投与または同時投与をさらに含む、請求項１、２また は３の方法。 １６． 前記抗不整脈剤が、アミオダロン、ソタロールおよびリグノカインから なる群から選択されることを特徴とする、請求項１５の方法。 １７． 血栓溶解をもたらすことのできる薬剤の逐次投与または同時投与をさら に含む、請求項１、２または３の方法。 １８． 該薬剤が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノー ゲン活性化物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７の方法 。 １９． 心収縮および／または心拡張機能を増加させる薬剤の逐次投与または同 時投与をさらに含む、請求項１、２または３の方法。 ２０． 該薬剤が、ジオキシン、ドブタミン、ナイトレート、カプトプリル、ニ フェジピンおよびフルセミドからなる群から選択されることを特徴とする、請求 項１９の方法。 ２１． 前記哺乳動物がヒトであるこを特徴とする、請求項１、２または３の方 法。 ２２． 心臓組織におけるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断す ることに使用するための薬剤。 ２３． 前記薬剤が、リン脂質ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂からのＩｎｓ（１， ４，５）Ｐ₃の放出を阻害または阻止するものであることを特徴とする、請求項 ２２の薬剤。 ２４． 前記薬剤がアミノグリコシドであることを特徴とする、請求項２３の薬 剤。 ２５． 前記薬剤が、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマ イシン、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンまたはそれらの 誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４の薬剤。 ２６． 前記薬剤がポリアミンであることを特徴とする、請求項２３の薬剤。 ２７． 前記薬剤がスペルミンまたはその誘導体であることを特徴とする、請求 項２６の薬剤。 ２８． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の作用を遮断することを特徴とす る、請求項２２の薬剤。 ２９． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃受容体を遮断することを特徴とす る、請求項２８の薬剤。 ３０． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のアンタゴニストであることを特 徴とする、請求項２８の薬剤。 ３１． 前記薬剤が他の抗不整脈剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２２ 、２３または２８の薬剤。 ３２． 前記他の抗不整脈剤が、アミオダロン、ソタロールおよびリグノカイン からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３１の薬剤。 ３３． 前記薬剤が、血栓溶解をもたらすことのできる成分をさらに含むことを 特徴とする、請求項２２、２３または２８の薬剤。 ３４． 前記成分が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノ ーゲン活性化物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３３の薬 剤。 ３５． 前記薬剤が、心収縮および／または心拡張機能を増加させる成分をさら に含むことを特徴とする、請求項２２、２３または２９の薬剤。 ３６． 前記成分が、ジオキシン、ドブタミン、ナイトレート、カプトプリル、 ニフェジピンおよびフルセミドから なる群から選択されることを特徴とする、請求項３５の薬剤。 ３７． １つ以上の製薬的に許容される担体または希釈剤とともに、心臓組織に おいてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断することのできる薬剤 を含む、心機能不全の予防および／または治療に有用な医薬組成物。 ３８． 前記薬剤が、リン脂質ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ₂からのＩｎｓ（１， ４，５）Ｐ₃の放出を阻害または阻止するものであることを特徴とする、請求項 ３７の医薬組成物。 ３９． 前記薬剤がアミノグリコシドであることを特徴とする、請求項３８の医 薬組成物。 ４０． 前記薬剤が、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマ イシン、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンまたはそれらの 誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３９の医薬組成物。 ４１． 前記薬剤がポリアミンであることを特徴とする、請求項３７の医薬組成 物。 ４２． 前記薬剤がスペルミンまたはその誘導体であることを特徴とする、請求 項４１の医薬組成物。 ４３． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の作用を遮断することを特徴とす る、請求項３７の医薬組成物。 ４４． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃受容体を遮 断することを特徴とする、請求項４３の医薬組成物。 ４５． 前記薬剤がＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃のアンタゴニストであることを特 徴とする、請求項４３の医薬組成物。 ４６． 前記薬剤が、他の抗不整脈剤をさらに含むことを特徴とする、請求項３ ７、３８または４３の医薬組成物。 ４７． 前記他の抗不整脈剤が、アミオダロン、ソタロールおよびリグノカイン からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４６の医薬組成物。 ４８． 前記組成物が、血栓溶解をもたらすことのできる薬剤をさらに含むこと を特徴とする、請求項３８、３９または４３の医薬組成物。 ４９． 該薬剤が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノー ゲン活性化物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４８の医薬 組成物。 ５０． 前記組成物が、心収縮および／または心拡張機能を増加させる薬剤をさ らに含むことを特徴とする、請求項３７、３８または４３の医薬組成物。 ５１． 該薬剤が、ジオキシン、ドブタミン、ナイトレート、カプトプリル、ニ フェジピンおよびフルセミドからなる群から選択されることを特徴とする、請求 項５０の医薬組成物。 ５２． 心臓組織においてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ₃の形成または放出を遮断す る薬剤の、心臓不整脈の治療または 予防のための医薬の製造における使用。 ５３． 前記薬剤がアミノグリコシドであることを特徴とする、請求項５２の使 用。 ５４． 前記薬剤がポリアミンであることを特徴とする、請求項５２の使用。