DD298412A5

DD298412A5 - Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele

Info

Publication number: DD298412A5
Application number: DD89343270A
Authority: DD
Inventors: Nicholas A Saccomano; Robert A Volkmann
Original assignee: ��@��Kk��; ��@��@��k��Kk��
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1989-04-27
Publication date: 1992-02-20
Also published as: JPH0774187B2; FI902139A0; IE69848B1; IL94147A; NZ244480A; NO300128B1; ATE131813T1; IL94147A0; EP0395357A2; JPH09132596A; AU615144B2; EP0395357A3; JPH07165793A; NZ233469A; CN1038931C; CA2015505A1; HU223593B1; IL112522A; EP0696578A3; HU902610D0

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung bestimmter Polypeptide, die in dem Gift der Agelenopsis aperta Spinne gefunden wurden. Die Polypeptide der Erfindung und eines der Polyamine und deren Salze blockieren Calciumkanaele in Zellen verschiedener Organismen und sind geeignet zum Blockieren der Calciumkanaele in Zellen an sich, in der Behandlung von mit Calciumkanaelen in Verbindung stehenden Krankheiten und Zustaende und zur Kontrolle von wirbellosen Schaedlingen. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, enthaltend die Polyamine, Polypeptide und deren Salze.{Polyamine; Polypeptide; Agelenopsis; Spinne; Neurotransmitter, exzitatorisch; Calciumkanaele; Schaedlinge; Gift}

Description

als Psychotherapeutika, unter anderen, finden. Siehe Excitatory Amino Acids in Health and Disease, Ed. D. Lodge, John Wiley and

Sons Ltd., New York, NY1988, deren Lehren hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Weiterhin sind solche Verbindungen nützlich beim Studium der Physiologie von Zellen wie Nervenzellen und für die Kontrolle von wirbellosen Schädlingen. Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Anwendbarkeiten. Calcium-Antagonisten finden

klinische Anwendung bei der Behandlung solcher Zustände wie Angina, Bluthochdruck, Cardiomyopathien, supraventrikuläre

Arrythmien, Oesophagus-Achalasie, vorzeitige Wehen und Raynauds Krankheit unter anderem. Siehe W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, N. Y. 1988, deren Lehren durch Bezugnahme

aufgenommen werden. Weiterhin t.!.id solche Verbindungen nützlich für das Studium der Physiologie von Zellen wie Nerven-und Muskelzellen und zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Polyamine und Polypeptide, die im Gift der Agelenopsis aperta Spinne

gefunden wurden.

Die Polypeptide der Erfindung und die Fraktionen, in denen sie erfindungsgemäß vorhanden sind, sind folgende:

Fraktion G:

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: HjN-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-

pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-dsp-proasn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-; Molekulargewicht für das ganze Polypeptid gemäß FAB MS: 7267.

Fraktion H₂:

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: HjN-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-se.-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-tys-trp-his-lys-cys-arg-cys-

pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-i.ly-pro-cys-thr-i'iys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-proasn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-; I lolekulargewicht für das gesamte Polypeptid nach lonenzarstäubungs-MS: 7 793.

Fraktion I:

HjN-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CON^; FAB MS: 4158.

Fraktion J:

HjN-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tvr-fvs-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-glyarg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONHj; Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid rjemäß FAB MS: 5506.

Fraktion Li: Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-; Ungefähres Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid etwa 20000.

Fraktion L₂:

Polypeptid, erhalten wie in Beispiel 9 beschrieben.

Fraktion M:

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend:

H₂N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-ldu-asp-glu-thr-val-asp-pro-, ungefähres Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid von etwa 80000.

Die Polypeptide dieser Erfindung blockieren Calciumkanäle in Zeilen. Daher sind die Polypeptide geeignet zürn Blockieren von Calciumkanälen in Zellen an sich. Die Polypeptide sind auch geeignet zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier, die durch Calciumkanalfunktionen in Zellen vermittelt werden. Im Bereich der Erfindung liegen auch Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz haben und im wesentlichen die gleiche Calciumkanal-Blockierungs-Aktivität wie die oben beschriebenen Polypeptide. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Polyamine und Polypeptide umfassen und Verfahren zum Verabreichen dieser Polyamine und Polypeptide.

Gift wird erhalten aus der Agelenopsis aperta Spinne durch das Verfahren des Melkens durch elektrische Stimulation gemäß den auf diesem Gebiet wohlbekannten Standard-Methoden. Es ist bevorzugt, daß das angewendete Verfahren eines ist, das gegen die Kontamination des gesamten Giftes durch abdominalen Reflux oder Hämolymphe gesichert ist. Solche Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Das gesamte so erhaltene Gift wird in gefrorenem Zustand bei etwa -78⁰C gelagert, bis es zur unten beschriebenen Reinigung verwendet wird.

Die Reinigung der Konstituenten aus dem gesamten Gift wird bewirkt durch reverse-phase Hochleistungs-Flüssigchromatopiaphie (HPLC) auf einer Vielzahl von präparativen und halbpräparativen Säulen wie C-4 und C-18 Vydac*- Säulen (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801). Die Peakdetektion wird monochromatisch bei 220 bis 230nm ausgeführt. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann z.B. mit polychromen UV-Daten, die mit einem Waters 990-Dioden-relddetektor (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) gesammelt wurden, durchgeführt werden. Die Fraktionen aus den Säulen werden durch bekannte Verfahren wie durch die Verwendung eines ISCO/„FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO 2159 Peakdetektors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504) gesammelt werden. Die Fraktionen werden in Gefäßen geeigneter Größe wie sterilen Polyethylenlaborgeräten

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gesammelt. Die Konzentrierung der Fraktionen wird dann durch Lyophilisation von dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation von Wasser, bewirkt. Die Reinheit der erhaltenen Konstituenten-Fraktionen kann dann durch chromatographische Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule mit einem Gradientensystem bestimmt werden, das isokratischer ist als das System, das bei der Endreinigung der Fraktionen verwendet wird.

Die Strukturen, die in den jeweiligen Fraktionen enthalten sind, werden mit bekannten analytischen Verfahren wie Massenspektrometrie und kernmagnotische Resonanz bestimmt. Die Polypeptide der Erfindung werden sequenziert gemäß bekannten Methoden. Zum Beispiel kann eine S-Pyridylethylierung von Cystinresten des zu untersuchenden Polypeptide in Lösung durchgeführt werden, gefolgt von einer Aminosäureseque ^;irung des Polypeptide. Ein solches Verfahren zur S-Pyridylethylierung ist wie folgt. Etwa 1 bis 40μg Polypeptid werden aufgelöst oder verdünnt in bis zu 50 μΙ eines Puffers, der hergestellt wurde durch Mischen von einem Teil 1M Tris-HCI, pH 8,5, enthaltend 4 mM EDTA und 3 Teile 8 M Guanidin x HCI. Dann werden 2,5μΙ 10%iges wäßriges 2-Mercaptoethanol zugegeben und die Mischung wird bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden 2 μΙ 4-Vinylpyridin (frisches Reagenz, gelagert unter Argon bei -20°C) zugegeben und die Mischung wird für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon inkubiert. Die Mischung wird dann entsalzt, vorzugsweise durch Chromatographie auf einer kurven reverse phase Säule. Das gewonnene alkylierte Polypeptid wird dann nach bekannten Methoden sequenziert.

Bei Durchführung dieser Erfindung und Anwendung der oben erläuterten allgemeinen Methode wurde gefunden, daß eine geeignete Säule fürdie anfängliche Fraktionierung des Gifteseine C-18 Vydac*-Säule, 22mm χ 250mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße ist. Diese Säule wird eluiert mit einer Durchflußrate von 15ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten- :rogrammsvonlE(->80%A, 5%-> 20% B[0-> 30min) dann 80%-» 30% A, 20%-»70% B (30-> 55 min], worin A0,1%ige wäßrige Trif luoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist. Die Fraktionen werden wie oben beschrieben gesammelt. 10 so erhaltene Fraktionen, benannt A, B, E, G, H, I, J, K, L und M, wurden für die weitere Analyse und/oder Reinigung ausgewählt. Zusätzlich wurde gefunden, daß die Fraktionierung des gesamten Giftes unter Verwendung einer C-18 Vydac*-Säule, 22 mm χ 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße, die mit einer Durchflußrate von 15ml/min eluiert wird unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-» 10% B, 95%->90% A (0-»30minl worin A und B wie oben beschrieben sind, unter anderem eine Fraktion liefert, die hier mit A' bezeichnet wird. Die Elutionszeiten der Fraktionen sind unten in den Beispielen 1 und 2 angegeben.

Die Fraktionen A, B, G, H, I, J und L werden einer weiteren Reinigung unterzogen unter Verwendung einer Vielzahl von Säulen und Gradienten-Programmen. Die Einzelheiten für jede Subfraktionierung und deren Ergebnisse sind in den Beispielen 3,4,6, 7, 8 und 10 unten angegeben.

Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, umfassen die Fraktionen A', A₁, A₂, B₁, B₂ und E Polyamin-Verbindungen. Diese Verbindungen und die Fraktionen, in denen sie gefunden werden, sind die folgenden. Fraktion A'(AGEL 452):

Fraktion A₁ (AGEL 468):

Fraktion A, (AGEL 448): OH HO

Fraktion B₂ (AGEL 504): FABMS: Hochauflösung: 505,3861 berechnet für C]₇H₄₈N₆O₃. Fraktion E (AGEL 489):

Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, enthalten die Fraktionen G, H;, I, J₁ L^, L₂ und M Polypeptide. Diese Polypeptide und die Fraktionen, in denen sie gefunden werden, sind die folgenden:

Fraktion G:

Eine aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-

pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-proasn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;

Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid gemäß FAB MS: 7267.

Fraktion H₂

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-

pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pio-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-proasn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-;

Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid gemäß lonenzerstäubungs-MS: 7793.

Fraktion I:

HiN-asp-Hsys-va^ly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-€ys-val-asn-asn-asn-CONH₂; FAB MS: 4158.

Fraktion J:

H₂N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-glyarg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONH]; FAB MS: 5506.

Fraktion L₁:

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend: H₂N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;

und ein ungefähres Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid von etwa 20000.

Fraktion L₂:

Polypeptid, erhalten wie in Beispiel 9 beschrieben.

Fraktion M:

Aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend:

H₂N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val~leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro und ein ungefähres Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid von etwa 80000.

Mit dem Vorteil der Offenbarung im Hinblick auf die Verbindungen, die in den Fraktionen des Giftes von Agelenopsis aperta vorhanden sind, ist es nun möglich, die Verbindungen durch andere Verfahren als durch Isolierung/Reinigung aus dem gesamten Gift zu erhalten. Alle diese Verfahren liegen im Bereich der Erfindung. Die Polypeptide, die in den Fraktionen G, H₂,1, J, L₁, L₂ und M enthalten sind und für die die gesamte Aminosäuresequenz beschrieben ist, können synthetisch durch in vitro Proteinsynthese nach wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung eines ABI 430A Solid Phase Peptide Synthesizers (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) unter Anwendung der Standard-Merrifield-Chemie oder anderer Festphasen-Chemie, die dem Fachmann wohlbekannt ist, synthetisiert werden. Die Polypeptide können auch unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken durch das Klonieren

von für dia Polypeptide oder Teile davon kodie^renden Sequenzen hergestellt werden. Die Polypeptide, für die nur ein Teil der Aminosäuresequenz bekannt ist, können z. B. unter Verwendung von Hybridisierungssonden kloniert werden, die die nun bekannte Information über die Aminosäuresequenz ausnutzen. Eine Kombination von rekombinanten DNA-Techniken und in vitro Proteinsynthese kann ebenso verwendet werden, um die Polypeptide der Erfindung herzustellen. Es ist wohlbekannt, daß bestimmte Aminosäure-Substitutionen in Polypeptiden gemacht werden können, die nicht oder nicht wesentlich die Funktion dieser Polypeptide beeinflussen. Die exakten Substitutionen, die möglich sind, variieren von Polypeptid zu Polypeptid. Die Bestimmung zugelassener Substitutionen wird gemäß den dem Fachmann wohlbekannten Verfahren ausgeführt. Daher liegen alle Polypeptide, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz und im wesentlichen dieselbe Calciumkanal blockierende Aktivität haben, im Bereich dieser Erfindung.

Die Polypeptide der Erfindung blockieren irreversibel Calciumkanäle, die in einer Vielzahl von Zellen wie Zellen im Nerven- und Muskelsystem von Wirbellosen und Wirbeltieren vorhanden sind.

Die Fähigkeit des Polyamine der Fraktion B, und der Polypeptide der Fraktionen G, H₁, H₂,1, J, K, L₁, L₂ und M, Calciumkanäle zu blockieren, wird durch das folgende Verfahren dargestellt. Dissoziierte Ratten-Neocortical-Neurone werden in Krebs-Bicarbonatpuffer, pH 7,4, enthaltend 2mM CaCI₂ und 1 % Rinderserumalburnin (BSA), suspendiert. Die Nouronen werden durch Zentrifugation sedimentiert und im selben Puffer, der zusätzlich 1 Mm Fura 2/AM (Sigma l em. Co., P. O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178) enthält, resuspendiert. Die Zellen werden 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert, gewaschen und dann für weitere 15 Minuten im selben Puffer ohne Fura 2/AM inkubiert. Die Zellen werden dann im obigen Puffer, der jetzt 1,5mM CaCI₂ enthält, gewaschen und bei Raumtemperatur etwa 5 bis 10 Minuten äquilibriert als konzentrierte Zeilsuspension. In eine Quarzküvette werden 1,2ml des vorgewärmten (37⁰C) BSA-freien Puffers, enthaltend 1,5mM CaCI₂ und 1OmM Glucose gegeben, dann 0,3ml der oben hergestellten konzentrierten Zellsuspension. Die Küvette wird in einen thermostatisch geregelten (37⁰C) Halter gestellt, der mit einem magnetischen Rührer ausgestattet ist und die Fluoreszenz wird mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer, wie Perkin Eimer 650-40 (Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06897) gemessen. Das Fluoreszenzsignal läßt man etwa eine Minute sich stabilisieren. Dann werden 1 bis 4μΙ einer Stammlösung der zu untersuchenden Verbindung in Krebs-Bicarbonatpuffer in geeigneten Konzentrationen zu der Küvette zugegeben. Die Kalibrierung der Fluoreszenzsignale und der Fura-2-Streulichtkorrektur wird unter Verwendung der eingeführten Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262: 5188 (1987) durchgeführt. Nach Vervollständigung jeden Tests wird der maximale Fluoreszenzwert (Fmax) bestimmt durch Zugabe von lonomycin und der minimale Fluoreszenzwert (FmIn) wird bestimmt durch anschließende Zugabe von 5mM EGTA, um Calcium zu komplexieren. Unter Anwendung des vorhergehenden Verfahrens wird das Auftreten einer Calciumkanal-Blockade durch eine bestimmte Verbindung gezeigt durch einen Abfall der Fluoreszenz bei Zugabe der bestimmten Verbindung. Ebenso im Bereich der Erfindung liegen Polypeptide, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Polypeptide der Fraktionen G, H₁,1, J, L₍, L₂ und M haben und die im wesentlichen dieselbe Calciumkanal-Blockierungs-Aktivität wi<, diese Polypeptide haben.

Die Polyamine der Erfindung sind nützlich, um exzitatorischen Aminosäure-Neurotransmittern an sich entgegenzuwirken. Die Polyamine sind als solche auch nützlich zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von durch exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter übermittelten Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier wie Krampf, Schlaganfall, zerebrale Ischämie, neuronal degenerative Störungen wie Alzheimer Krankheit und Epilepsie. Die Polyamine sind auch nützlich als Psychotherapeutika in einem Säugetier. Weiterhin sind die Polyamine nützlich für die Untersuchung der Physiologie von Zellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellen des Nervensystems.

Das Polyamin der Fraktion B₁ und die Polypeptide der Erfindung sind nützlich als Calciumkanal-Blocker in Zellen an sich. Als solche sind diese Verbindung ^n auch nützlich für die Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die durch Calciumkanal-Funktionen in Zellen in einem Säugetier vermittelt werden wie Angina, Hochdruck, Cardiomyopathien, supraventrikuläre Arrythmien, Oesophagus Achalasie, vorzeitige Wehen und Raynauds Krankheit. Weiterhin sind diese Verbindungen nützlich bei der Untersuchung der Physiologie von Zellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellen des Nerven- und Muskelsystems.

Auch im Bereich der Erfindung liegen die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Polyamine und Polypeptide der Erfindung. Diese Salze werden nach dem Fachmann wohlbekannten Verfahren gebildet. Zum Beispiel können Säureanlagerungssalze der Polyamine und Basensalze der Polypeptide gemäß üblichen Methoden hergestellt werden.

Wenn ein Polyamin oder Polypeptid dieser Erfindung an ein Säugetier verabreicht wird, kann es allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der üblichen pharmazeutischen Praxis verabreicht werden. Die Polyamine und Polypeptide können oral oder parenteral verabreicht werden, wobei der parenteral Weg der Verabreichung bevorzugt ist für die Polypeptide. Parenterale Verabreichung schließt intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische Verabreichung ein.

Für die orale Verwendung eines Polyamins oder Polypeptids der Erfindung kann die Verbindung z. B. in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden oder als wäßrige Lösung oder Suspension. Im Fall von Tabletten für orale Verwendung schließen Träger, die üblicherweise verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein und Gleitmittel wie Magnesiumstearat, können üblicherweise zugegeben werden. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der aktive Inhaltsstoff mit emulgierenden und suspendierenden Mitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können bestimmte Süßungs- und/oder Aromatisierungsmittel zugegeben werden.

Für intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Verwendung werden üblicherweise sterile Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes hergestellt und der pH der Lösungen sollte in geeigneter Weise eingestellt und gepuffert werden. Für intravenöse Verwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um die Zubereitung isotonisch zu machen.

Wenn ein Polyamin oder Polypeptid oder Salz davon dieser Erfindung für einen Menschen verwendet wird, wird die tägliche Dosierung normalerweise durch den verschreibenden Arzt bestimmt. Darüber hinaus wird die Dosierung mit Alter, Gewicht und Ansprechvermögen des jeweiligen Patienten ebenso wie mit der Schwere der Symptome des Patienten und der Wirkung der jeweiligen zu verarbeitenden Verbindung variieren.

Wenn ein Polyamin oder Polypeptid oder deren Salz gemäß dieser Erfind.mg verwendet wird zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen, wird diese Verbindung dem Wirbellosen direkt verabreicht oder die Umgebung des Wirbellosen damit versorgt. Zum Beispiel kann eine Verbindung dieser Erfindung als Lösung auf den Wirbellosen gesprüht werden. Die Menge der für die Kontrolle des Wirbellosen notwendigen Verbindungen variiert mit dem Wirbellosen und den Umweltbedingungen und wird von der Person, die die Verbindung anwendet, bestimmt.

Wenn ein Polyamin oder Polypeptid oder deren Salz gemäß dieser Erfindung verwendet wird zur physiologischen Untersuchung von Zellen, wird die Verbindung gemäß dem Fachmann wohlbekannten Verfahren den Zellen zugeführt. Zum Beispiel kann die Verbindung den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer zugeführt werden. Eine geeignete Konzentration der Verbindungen dieser Erfindung zur Verwendung in solchen Untersuchungen ist 100 μΜ. Jedoch kann die Konzentration der Verbindungen in diesen Untersuchungen größer oder viel geringer als 100pm sein. Die Menge de/ verabreichten Verbindung wird vom Fachmann gemäß wohlbekannten Methoden bestimmt.

Ausföhrungsbelsplele Beispiel 1 Anfangsfraktionierung des Gesamtgiftes von Agelenopsis aperta Das gesamte Gift von Agelenopsis aperta, das erhalten wurde von Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 84108 und

das im gefrorenen Zustand bei etwa -78⁰C gelagert wurde, wurde aufgetaut und 10 bis 60 μΙ Mengen davon wurden verdünntauf 200μΙ und auf eine C18 Vydac«-Säule (22mm x 250mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und eluiert unter

V jrwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-» 20% B,95%-> 80% A [0-> 30 Minuten] dann 20%-> 70% B, 80%-> 30% A [SO-> 55 Minuten],

worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde monochromatisch bei 220 bis 230 nm durchgeführt unddie Fraktionen wurden mit einem Isco/„FOXY" Fraktionssammler und einem Isco 2159 Peakdetektor gesammelt. Die Fraktionenwurden gesammelt von 20 Minuten bis 60 Minuten. Basierend auf der Peakdetektion wurden die folgenden Fraktionen gesammelt:

Fraktion	Elutlonszelt
A	etwa 21 Minuten
B	etwa 22,75 Minuten
E	etwa 27,5 Minuten
G	etwa 38 Minuten
H	etwa 39 Minuten
I	etwa 40 Minuten
J	etwa 40 Minuten
L	etwa 43 Minuten
M	etwa 46,3 Minuten

Beispiel 2 Fraktionierung des gesamten Gifts von Agelenopsis aperta, um Fraktion A' zu erhalten. Das gesamte Gift von Agelenopsis aperta wurde erhalten und eine C18 Vydac*-Säule, wie in Beispiel 1 beschrieben, damit

beladen. Die Säule wurde unter Verwendung einer Di rch lußrate von 15ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter

Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-> 10% B, 95%-* 90% A (0-* 30 Minuten], worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist, eluiert. Die Peakdetektion und Fr? ktionssammlung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Es wurde Fraktion A', die bei etwa 12,5 Minuten eluiert wurde, erhalten. Fraktion A' wurde dann behandelt für die Spektralanalyse durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation aus destilliertem Wasser gemäß Standardmethoden. Die Struktur der Verbindung, die in Fraktion A' enthalten ist, wurde dann unter Verwendung von FAB MS bestimmt. Die so

erhaltenen Daten und die davon abgeleitete Struktur sind wie folgt:

A': FAB MS: M/Z 453 (M + 1)

Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-4-hydroxy-benzamid, Beispiel 3 Subfraktionlerung der Fraktion A und Bestimmung von darin enthaltenen Strukturen Fraktion A, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde auf eine C-4Vydac*-Säule (10mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße) geladen und davon eluiert unter Verwendung einer Durchflußrate von 4,0ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 0-> 10% B, 100%-» 90% A [0-»

30 Minuten], worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde erreicht unter Verwendung eines

Waters 990 Diodenfelddektors und die Fraktionssammlung wurde durchgeführt wie im Beispiel 1 beschrieben. Es wurden zwei Fraktionen erhalten wie folgt: Fraktion Elutlonszelt A₁ etwa 7 Minuten A₂ etwa 9 Minuten

Die Fraktionen A, und A₂ wurden dann vorbereitet für die Spektralanalyse durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation aus Wasser gemäß Standardmethoden.

Die Struktur der Verbindungen, die in den Fraktionen Ai und A₂ enthalten sind, wurde dann bestimmt unter Verwendung von FAB MS. Die so erhaltenen Daten und die davon abgeleiteten Strukturen sind wie folgt:

A₁: FABMS: M/Z469(M + 1),Hochauflösung: 469,3863berachnet fürC₂₃H₄₆N₈Omit2,0ιπιτιμFehler Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-2,5-dihydroxy-benzamid,

OH

A₂: FABMS: M/Z449 (M + i),433,376,260,203 Struktur: N-lie-Amino^-hydroxy^.e.iS-triazahexadec-i-ylM-hydroxy-IH-indol-S-acetamid Beispiel 4 Subfraktionierung der Fraktion B und Bestimmung der darin enthaltenen Strukturen Fraktion B, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde auf eine C-4 Vydac®-Säule (22 mm χ 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße) geladen und eluiert unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nichtlinearen Gradienten-Programms von 0%->0% B, 100%-> 100% A [0->

5 Minuten],dann 0%-> 10% B, 100%-*90% A |5->20 Minuten] (Waters Kurve 1) dann 10%->20% B,90%->80% A (20-»30 Minuten] (Waters, Kurve 6) dann 20%-* 50% B, 80%-> 50% A (30-»40 Minuten] (Waters Kurve 11), worin A 0,1 % wäßrige

TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde durchgeführt unter Verwendung eines Waters 990 Dioden-Felddetektors und

die Fraktionssammlung wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Zwei Fraktionen wurden erhalten wie folgt:

Fraktion	Elutionszeit
B₁	etwa 18,5 Minuten
B₂	etwa 21,5 Minuten

Die Fraktionen wurden dann vorbereitet für die Spektralanalyse durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation aus Wasser gemäß Standardmethoden. Die Struktur der Verbindung, die in Fraktion B) enthalten ist, wurde unter Verwendung von FAB MS bestimmt und die Ergebnisse

hiervon sind wie folgt:

FAB MS: M/Z 506 (M + 1), 489,461,433,378,333,260,231,215,203,155,119

Hochauflösung: 506,3810 berechnet für C₂₆H₄₈N₇O₃ Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-.4-hydroxy-1H-indol-3-acetamid. Das Molekulargewicht der Verbindung, die in Fraktion B₂ enthalten ist, wurde unter Verwendung von FAB MS bestimmt und das Ergebnis hiervon ist wie folgt: FABMS: Hochauflösung: 505,3861, berechnet für C₂₇H₄₈N₆O₃. Beispiel 5 Struktur der in Fraktion E enthaltenen Verbindung Fraktion E, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde für die Spektralanalyse vorbereitet durch Lyophilisation

vom Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation von Wasser gemäß Standardmethoden. Die Struktur der Verbindung, die in

Fraktion E enthalten ist, wurde unter Verwendung von FAB MS, ¹HNMR und '³CNMR bestimmt. Die so erhaltenen Daten und die

davon abgeleitete Struktur sind wie folgt:

FABMS: M/Z 490 (M + 1), 472,433,362,333,260,215,203,177,155,119.

Hochauflösung: 490,3860 berechnet für C₂₆H₄₈N₇O₂ mit Ο,βπΊΐημ Fehler

¹HNMR (500Mhz, d6-DMSO): 10,89 (s, 1 H), 8,90-7,85 (m, 6H), 7,55 (d, J = 8,0Hz, 1 H), 7,34 (d, J = 8,0Hz, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 7,08(dd, J = 8,0 Hz, J = 8,0 Hz, 1 H), 6,98 (dd, J = 8,0 Hz, J = 8,0 Hz, 1 H), 3,50 (s, 2 H), 3,13 (m, 2 H), 3,03-2,82 (m, 18 H), 1,88 (m, 6 H),1,78 (m, 2H), 1,62 (m, 4 H)

¹³C-NMR (125,76 Mhz, dB-DMSO): 170,94,136,10,127,17,123,75,120,92,118,67,118,26,111,33,108,97,57,39,57,07,46,12,46,12, 44,06,43,89,43,89,36,52,36,22,32,78,26,71,23,79,23,06,22,65,22,65,22,45 Struktur: N-{20-Amino-4hydroxy-4,8,12,17-tetraazaeicos-1-yi)-1H-indol-3-acetamid

Alternativ und bevorzugt wurde das gesamte Gift wie in Beispiel 1 beschrieben fraktioniert mit der Ausnahme, daß als Lösungsmittelsystem und lineares Gradientenprogramm verwendet wurde 0% -> 20% B, 100% -> 80% A [0 -> 30 Minuten] mit der Peakdetektion bei 22Cnm. Die Fraktion, die bei etwa 26,0 Minuten eluierte, wurde auf eine Dynamax Phenylsäule (4,6mm x 250 mm, 60Ä Porengröße, 8μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 1 ml pro Minute und von isokratischen Bedingungen von 10% B, 90% A eluiert, wobei A und B wie in Beispiel 1 beschrieben waren. Die Peakdetektion erfolgte unter Verwendung eines Waters 990 Diodenfeld-Detektors (lambda = 220nm) und die Fraktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gesammelt. Die Fraktion, die bei etwa 55,27 Minuten eluierte, wurde vom Elutionsmittel lyophilisiert und anschließend von Wasser lyophilisiert gemäß den Standardmethoden, um die Verbindung dieses Beispiels zu liefern.

Beispiel 6 Subfraktionierung der Fraktion G Fraktion G, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde auf eine C-18Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und eluiert unter Verwendung einer Durchflußrate von 10ml pro Minute und oine* Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20% —> 30% B, 80% —»70% A

[0 -> 40 Minuten] (Waters, Kurve 6) und unter Verwendung eines Waters 990 Dioden-Feld-Detektors, wobei Fraktionen wie im

Beispiel 1 beschrieben gesammelt wurden. Fraktion G wurde nach Subfraktionierung wie oben beschrieben, von dr ' Säule bei

etwa 22 Minuten eluiert. Diese Fraktion, die ein Polypeptid enthält, wurde dann vorbereitet für die Sequenzierung durch

Lyophilisation von Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation des Wassers gemäß wohlbekannten Verfahren. Die Aminosäure-Analyse des alkylierten Polypeptide der Fraktion wurde erhalten unter Verwendung der Waters Pico-Tag- Methode nach den Angaben des Herstellers. Die Sequenzdaten wurden gesammelt von einem Applied Biosystems Modell 470A Protein/Peptid-Sequenzierer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) mit wäßriger TFA-Konversion. Die Analyse der entstehenden Phenylthio-hydantoin-Aminosäuren wurde Online durchgeführt mit einem Applied Biosystems Modell 120A PTH Analyzer oder Offline auf einer DuPont Zorbax PTH Säule (Biomedical Product Department, Chromatographie Produkte, E. I. duPont de Nemours und Co., Inc., 1007 Market Street, Wilmington, Delaware Als Ergebnis der Aminosäureanalyse und des FAB MS des gesamten Polypeptide wurde die aminoterminale Aminosäuresequenz eines Teils des Polypeptids, das in Fraktion G enthalten ist, bestimmt als: HjN-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-

cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asppro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser- und FAB MS: 7267.

Beispiel 7 Subfraktionierung der Fraktion H und Bestimmung der darin enthaltenen Strukturen Fraktion H, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde auf eine C-18 Vydac*-Säule (22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und eluiert unter Verwendung einer Durchflußrate von 10ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradientenprogramms von 20% -> 25% B, 80% -♦ 75% A

[0 -> 30 Minuten] (Waters, Kurve 6), dann 25% -> 50% B, 75% -> 50% A130 -* 45 Minuten] (Waters, Kurve 11), worin AO, 1 %

TFA und B Acetonitril ist und unter Verwendung eines Waters 990 Dioden-Felddetektors, wobei die Fraktionen wie in Beispiel 1

beschrieben gesammelt wurden. Von den gesammelten Fraktionen waren die interessierenden Fraktionen:

Fraktion Elutionszelt H2 etwa 36 Minuten H3 etwa 41 Minuten Die Fraktionen H₂ und H₃, die Polypeptide enthalten, wurden dann für die Sequenzierung vorbereitet und gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren sequenziert. Die aminoterminale Aminosäuresequenz eines Teils des Polypeptids, das in Fraktion H₂ enthalten war, wurde bestimmt als: H2N-ala-lys-ala-lθu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asr^-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-

cys-pro-trp-iys-trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cyspro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-; und das Molekulargewicht des gesamten Polypeptids wurde bestimmt durchlonenzerstäubungs-MS und war gleich 7793.

Beispiel 8 Subfraktionierung der Fraktionen I und J und Bestimmung der darin enthaltenen Strukturen Die Fraktionen I und J, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden und die wegen der ähnlichen Elutionszeiten, wie sie in Beispiel 1 gezeigt sind, nicht ausreichend aufgetrennt werden konnten, wurden zusammen auf eine C-4 Vydac*-Säule

(22mm x 250mm, 300A Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 10ml pro

Minute und eines Lösungsmittelsyeteme unter Verwendung eines nichtlinearen Gradienten-Programms von 20% -> 30% B, 80% -> 70% A [0 -> 30 Minuten] (Waters, Kurve 6), dann 30% -* 50% B, 70% -> 50% A [30 -» 45 Minuten] (Waters, Kurve 11) eluiert, wobei A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Peakdetektion und Fraktionssammlung wurden durchgeführt gemäß den in Beispiel β beschriebenen Verfahren. Von den gesammelten Fraktionen waren die interessierenden Fraktionen:

Fraktion Elutlonszelt

I etwa 22 Minuten

J etwa 27,5 Minuten

Die Fraktionen I und J, die Polypeptide enthalten, wurden für die Sequenzierung vorbereitet und gemäß den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren sequenziert.

Die Aminosäuresequenz und das FAB MS des Polypeptids, das in Fraktion I enthalten ist, wurde bestimmt als:

HiN-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cye-ala-asp-trp-als-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONHi und FAB MS: 4158.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz eines Teils des Polypeptids und das FAB MS des gesamten Polypeptids, das in Fraktion J enthalten ist, wurde bestimmt als:

H2Γ^asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser--cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr--cys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-glv^>arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONHi; und FAB MS: 5506.

Beispiel 9

Subfraktionierung der Fraktion L und Bestimmung der darin enthaltenen Strukturen Die Fraktion L, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde auf eine C-18Vydac®-Säule (10mm χ 250mm,300A Porengröße, 5μ Teilchengröße) geladen und mit einer Durchflußrate von 3,5ml/min und einem Lösungsmittelsystem unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 25% -> 40% B, 75% -> 60% A (0 -* 30 Minuten] eluiert, wobei A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Peakdetektion und Fraktionssammlung wurden durchgeführt nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren. Von den gesammelten Fraktionen waren die interessierenden Fraktionen:

Fraktion	Elutlonszelt
L,	etwa 20,25 Minuten
L₂	etwa 22,5 Minuten

Die Fraktionen Li und Lj, die Polypeptide enthalten, wurden vorbereitet füi die Sequenzierung und gemäß den im Beispiel 6 beschriebenen Verfahren sequenziert.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz eines Teils des Polypeptids, das in Fraktion L₁ enthdi.en ist, wurde bestimmt als:

HJN-ilθ-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-ρro-trp-mθt-val-ser-ilθ--gln-gln-lys-asn-lys-lys--gly--gly-phθ-asp- und das Molekulargewicht des gesamten Polypeptids wurde bestimmt durch Gelelektrophorese nach bekannten Verfahren als

Beispiel 10

Bestimmung der Struktur der in Fraktion M enthaltenen Verbindung

Fraktion M, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde und ein Polypeptid enthält, wurde für die Sequenzierung vorbereitet und nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren sequenziert.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz eines Teils des Polypeptids, das in Fraktion M enthalten ist, wurde bestimmt als:

HjN-glu-ala-thr-glu-ala-als-lys-vaWeu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-und das Molekulargewicht des gesamten Polypeptids wurde durch Gelelektrophores nach bekannten Verfahren bestimmt als etwa 80000.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen Polypeptide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid I mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(a) vorhanden in einer Fraktion aus rohem Gift der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -» 20% B, 95% -» 80% A [0 -» 30 Minuten], dann 20% -> 70% B, 80% -» 30% A [30 -> 55 Minuten], worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 38 Minuten eluiertwird;

(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die /on einer C-18 Vydac®- Säule, 22mm x 250mm, 300Ä Porengröße 10μTθilchengrößθ unter Verwendung einer Durchflußrate von 10ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20% -»30% B, 80% -» 70% A [0 -> 40 Minuten] (Waters Kurve 6), worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 22 Minuten eluiert wird;

(c) eine aminoterminale Aminosäuresequenz umfaßt:

H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-aia-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-glygln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-gluarg-giy-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;

(d) FAB MS: 7267;

und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen dergleichen Calcium blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (I), einem Polypeptid (II) der Formel

asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cysthr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CON^ und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen derselben Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (II), einem Polypeptid (III) mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(a) vorhanden in einer Fraktion von rohem Gift der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 22 mm x 250mm 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsrhittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-»20% B, 95%-»80% A[O-»30 Minuten), dann 20%-> 70%B₁80%-»30% A [30->55 Minuten],worin A0,1%wäßrigeTFAund B Acetonitril ist, bei etwa 39 Minuten eluiertwird;

(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®- Säule 22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 10ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystyms unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20%-» 25% B, 80%-»75% A[O-*30 Minuten] (Waters Kurve 6), dann 25%-h» 50% B, 75%-» 50% A [30 -»45 Minuten] (Waters Kurve 11), worin A 0,1 % wäßrigeTFA und B Acetonitril ist, bei etwa 36 Minuten eluiertwird; und

(c) eine aminoterminale Aminosäuresequenz umfaßt:

HaN-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-glylys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glulys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asptrp-; und

(d) lonenzerstäubungs MS: 7793;

und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (111), einem Polypeptid (IV) der Formel

H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-prohis-pro-asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ile-cys-ser- g ly-arg-ly s-ty r-CO N H₂

und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (IV), einem Polypeptid (V) mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(a) vorhanden in einer Fraktion des rohen Gifts der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule 22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-> 20% B, 95% -»80% A (0 -» 30 Minuten], dann 20%-» 70%B,80%-»30%A[30~»55 Minuten],worinA0,1%wäßrigeTFAund B Acetonitril if.t, bei etwa 43 Minuten eluiert wird;

(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®- SäuleiOmm x 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 3,5ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 25%-> 40% B, 75%-* 60% A[0-> 30 Minuten], worin A 0,1% wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 20,25 Minuten eluiert wird;

(c) eine aminoterminale Aminosäuresequenz umfaßt:

HaN-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp- und

(d) Molekulargewicht von etwa 20000;

und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (V), einem Polypeptid (Vl) mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(a) vorhanden in einer Fraktion des rohen Gifts der Agelenopsis apertc Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule 22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-> 20% B, 95%-» 80% A [0-> 30 Minuten], dann 20% -» 70% B,80%-»30% A [30-»55 Minuten], worin A0,1 %wäßrigeTFAund B Acetonitril ist, bei etwa 43 Minuten eluiert wird; und

(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®- SäuleiOmm x 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 3,5 ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 25%-h>40% B, 75%-> 60% A (0-» 30 Minuten], worin A 0,1% wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 22,5 Minuten eluiert wird;

und einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (Vl), einem Polypeptid (VII) mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(a) vorhanden in einer Fraktion des rohen Gifts der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule 22 mm x 250 mm, 300 A Porengröße, 10 μ Teilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-> 20% B, 95%-» 80% A [0-»30 Minuten], dann 20%-» 70% B, 80%->30% A (30-* 55 Minuten], worin A0,1% wäßrigeTFA und B Acetonitril ist, bei etwa 48,3 Minuten eluiert wird;

(b) eine aminoterminale Aminosäuresequenz umfaßt:
H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro; und

(c) Molekulargewicht von etwa 80000 und

einem Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität wie das Polypeptid (VII) und deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (I) gewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta eluiert wird von einer C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-» 20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -» 30 Minuten], dann 20% -> 70% Acetonitril, 80%-* 30% 0,1% wäßrigeTrifluoressigsäure [30-»55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm, die Fraktion, die bei etwa 38 Mir.Jten eluiert, gesammelt und auf eine C-18 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 10 ml pro Minute eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20%-» 30% Acetonitril, 80%-» 70% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -» 40 Minuten] (Waters Kurve 6) und Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 22 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird;

(b) wenn im wesentlichen reines Γ ;lypeptid (II) gewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta eluiert wird von einer C-18 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-» 20% Acetonitril, 95%-» 80% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [0-» 30 Minuten], dann 20%-»70% Acetonitril, 80%-h> 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30-» 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 40 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule (22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 10 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20%-» 30% Acetonitril, 80% -» 70% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [0->30 Minuten] (Waters Kurve 6), dann 30%-» 50% Acetonitril, 70%-» 50% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30-> 45 Minuten] (Waters Kurve 11) und Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 22 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiertwird;

(c) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (III) gewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta eluiert wird von einer C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -»20% Acetonitril, 95% -»80% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [0-»30 Minuten], dann 20% -»70% Acetonitril, 80% -» 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 -» 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion. bei 220 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 39 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße) geladen und eluiert wird unter Verwendung einer Duichflußrate von 10 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20%-» 25% Acetonitril, 80%-» 75% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0—> 30 Minutern] (Waters Kurve 6), dann 25%-» 50% Acetonitril, 75%-» 50% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30—»45 Minuten] (Waters Kurve 11) und Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 36 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiertwird;

(d) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (IV) gewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10 μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-* 20% Acetonitril, 95%-» 80% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [0-»30 Minuten], dann 20%-» 70% Acetonitril, 80%-» 30% 0,1 % wäßrigeTrifluoressigsäure [30-» 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 40 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule(22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μTeilchengröße) geladen und unter Verwendung einer On/chflußrate von 10ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 20%-» 30% Acetonitril, 80%-» 70% 0,1%wäßrigeTrifluoressigsäure [0-»30 Minuten] (Waters Kurve 6), dann30%-»50% Acetonitril, 70%-» 50% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [30-»45 Minuten] (Waters Kurve 11) und Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 27,5 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird;

(e) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (V) gewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%-» 20% Acetonitril, 95%-» 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0-» 30 Minuten], dann 20%-> 70% Acetonitril, 80% -» 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30-» 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 43 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-18 Vydac®-Säule(10mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 5μTeilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 3,5ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 25%-» 40% Acetonitril, 75%-» 60% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [0 -» 30 Minuten] und Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 20,25 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiertwird;

(f) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (Vl) gewünscht ist, das gesamte Gift von Ageienopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, ^Teilchengröße) eluiertwird unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5%—»20% Acetonitril, 95%-» 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -»30 Minuten], dann 20% -» 70% Acetonitril, 80% -» 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure (30 -> 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 43 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-18 Vydac®-Säule (10 mm χ 250 mm, 300Ä Porengröße, 5 μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 3,5 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung ,ines linearen Gradienten-Programms von 25%-»40% Acetonitril, 75%-» 60%0,1%wäßrigeTrifluoressigsäure[0-» 30 Minuten] und Peak-Detektionbei 220 bis 230nm eluiertwird, dia Fraktion, die bei etwa 22,5 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird;

(g) wenn im wesentlichen reines Polypeptid (VII) gewünscht ist, das gesamte Gift von Ageienopsis aperta eluiertwird von einer C-18 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -» 20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure (0 -» 30 Minuten], dann 20% -> 70% Acetonitril, 80% —» 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 —»55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm, die Fraktion, die bei etwa 48,3 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird;

oder alternativ eines der Polypeptide durch an sich bekannte Verfahren synthetisiert wird und wenn Polypeptide mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie eines der Polypeptide erwünscht sind, dieses Polypeptid oder die Polypeptide durch an sich bekannte Verfahren synthetisiert und gegebenenfalls die Polypeptide in die pharmazeutisch annehmbaren Salze durch an sich bekannte Verfahren umgewandelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft bestimmte Polypeptide, die im Gift der Ageienopsis aperta Spinne gefunden wurden. Die Polypeptide und deren pharmazeutisch annehmbare Salze blockieren Calciumkanäle in Zellen einschließlich Nerven- und Muskelzellen verschiedener Organismen einschließlich Wirbellosen und Wirbeltieren. Die Erfindung betrifft die Verwendung dieser Polypeptide und ihrer Salze zum Blockieren von Calciumkanälen in Zellen wie Zellen des Nerven- und Muskelsystems eines Organismus an sich, zur Behandlung von Calciumkanal-übermittelten Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier und zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und Zusammensetzungen, wie Polypeptide, Polyamine und deren Salze enthalten.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es wurde berichtet, daß das Gift der Spinne Ageienopsis aperta mindestens zwei Toxine enthält, 'Jie Calciumströme beeinflussen. H.Jackson et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:1078 (1987). Diese Autoren beschreiben ein Toxin, das sie mit AG 2 bezeichnen, das ein Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton hat und Calciumströme in einem breiten Bereich von Geweben zu unterdrückenscheint. Weiter berichten H.Jackson et al., Soc. Neu. Sei. abstr. 12: 730(1986) von einem anderen Toxin von Ageienopsis aperta, das eine Komponente von ungefähr 6000 MG enthält. Von diesem Toxin wird berichtet, daß es die präsynaptische Blockade der Transmission bewirkt und es wurde vorgeschlagen, daß das Toxin Calciumkanäle, die mit der Freisetzung von Neurotransmitter in Zusammenhang stehen, blockiert.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Mittel zur Verfugung zu stellen, die durch exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter vermittelten Krankheiten und Zuständen sowie Calcium-abhängigen Krankheiten oder Zustände entgegenwirken.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter-Antagonisten und Verbindungen die Calciumkanäle blockieren, sie enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen. Verbindungen, die exzitatorische Amiriosäure-Neurotransmitter-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Verwendbarkeiten. Exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter-Antagonisten können klinische Anwendung bei der Behandlung solcher Zustände wie Krampfanfall, Schlaganfall, Hirnischämie, neuronale Degenerations-Störungen wie Alzheimer Krankheit und Epilepsie und