JPH09505894A - 試料中の又は試料から枯死細胞を検出し及び／又は場合により定量し及び／又は分離するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 臨床的診断を支持する、ならびに薬剤及び治療の有効性を監視するために、生理学及び病理学において枯死を測定するための方法。特に、ａ）試料を、ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と接触させ、ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と反応した細胞、好ましくは無損傷の細胞を定性的及び／又は場合により定量的に検出し、該検出段階はｃ）非−枯死細胞から枯死細胞を単離するための任意の段階の前又は後に行われ、その単離は枯死細胞が段階ａ）においてホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬を与えられており、該試薬がそれ自体既知の方法で選択可能でもあるという事実の故に行うことができることを含む試料中の枯死細胞を検出及び／又は場合により定量及び／又は場合により単離するための方法。ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する適した試薬はアネキシンとして分類されるポリペプチド又はタンパク質である。そのような方法を行うためのキット。

Description

【発明の詳細な説明】 試料中の又は試料から枯死細胞を検出し及び／又は場合により定量し 及び／又は分離するための方法 発明の分野 本発明は医学及び薬理学の分野に存する。特に本発明は、臨床的診断を支持し 、薬剤及び治療の有効性を評価し、監視するために生理学及び病理学において枯 死を測定する方法に関する。 発明の背景 生物の細胞の合計数は、一方で新しい細胞の生成（増殖）に導く過程、及び他 方で存在する細胞の破壊（細胞死）に導く過程の結果である。枯死は存在する細 胞の破壊を担う主要な過程である（１）。 枯死は、究極的に細胞死に導く一連の別個の事象を特徴とする過程である、計 画された細胞死又は細胞自殺としても既知である。枯死に入る細胞は、隣接細胞 との連結部があればそれを破壊する。細胞質が濃厚になり、核が凝集し、壊れて 断片となる。枯死の開始時に、染色質は圧縮され、核膜に対して分離する。細胞 質は濃厚になり、核及び細胞膜は渦巻き始める。後期枯死において、核の断片化 が起こり、細胞表面は隆起を現す。枯死体が形成され、それは近隣細胞により捕 食される。枯死の間に原形質膜の性質が変化する。例えば炭水化物組成における 変更及び膜の疎水性及び電荷の変化が起こる。小胞体は小胞に変化し、それは原 形質膜と融合し、細胞内液及びイオンの消失が起こる。最後の段階において、細 胞は複数の小さい枯死体に分解する。 枯死を介した細胞死は非同調的やり方で１つの集団内の単一細胞を襲い、炎症 応答なしで幾分目立たずに起こる（２）。 正常な組織のホメオスタシスは、細胞が１つ加わる毎に１つが死ななければな らないことを必要とする。枯死は生理学の必須の過程であり、その対となる片方 の増殖とのホメオスタシス的均衡において十分に調節されたやり方で進行する（ ３，４）。増殖及び枯死の過程が均衡を失うと、これは発病の結果を生ずる。今 、異常な枯死に関連付けることができる病理学的状態の数が増加しつつあること が明らかになってきている。細胞が死ぬことを拒絶する時、すなわち枯死経路に 欠陥が起こる時に癌が起こるということが仮定されるので、現在、抗−癌治療を 目的とする多数の研究がある。従って抗−癌処置は、自然に起こる自殺経路を誘 導し、バイオテノロジー的な癌の治癒を与えることを含む。さらに枯死は、虚血 、発作、心疾患及び自己免疫などの多数の疾患におそらく関連していると考えら れる。実際にそれが含まれない過程を見いだすのが挑戦的である程、それは基本 的な生物学的現象であると思われる（１３）。例えば嚢胞性線維症に冒された患 者の肺において死亡するマクロファージは、枯死を経ている。ＤＮＡの肺−閉塞 粘度は枯死的死の特徴である（１２）。枯死は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）な どの自己免疫疾患における徴候としても用いられてきた（１３）。Ｂ−細胞白血 病リンパ腫などのＢ−細胞悪性疾患は、増殖速度の増加の故でなく、欠陥的枯死 のための腫瘍細胞の成長を示す。移動する腫瘍細胞の枯死が抑制されると、腫瘍 細胞の転移が成功する。腫瘍細胞の増殖の速度及び枯死の速度の間の比率が腫瘍 細胞の成長の速度を、従ってその生命を脅かす性質を決定する。 これらの考えから、薬剤による生体内における枯死の調節が将来の抗−癌治療 のための有望な戦術であることが明らかである。組織及び特に腫瘍における増殖 ：枯死の比率を診断し、治療を開発して導くために、迅速で感度の高い方法で枯 死を測定する手段を持たなければならない。 今日まで、文献に記載されている方法は手がかかり、時間がかかるか、又は不 十分な特異性を有するので、この目的に役立たない。 Ｄｕｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．（７）は、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配を用いた平衡 遠心分離法により、枯死又は非−枯死集団を分離できる方法を記載している。こ れらの勾配は合計細胞の最高６０％を含む有意な細胞損失を伴い、そしてそれら は枯死集団からすべてのトリパンブルー陽性細胞を除去はしないので、これは日 常的に用いられない方法である（トリパンブルー排除はどれだけの細胞が生存性 であるかを決定するために用いられる）。 Ｆａｄｏｋ ｅｔ ａｌ．（１４）はリンパ球集団における枯死細胞のパーセ ンテージが、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃ ｏｒｐ．Ｍｃ．Ｇａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色された細胞遠心分離細胞（ｃｙ ｔｏ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ ｃｅｌｌｓ）の形態学的検査により決定された と記載している。枯死の重要な特徴は核凝縮及び細胞質濃縮である。細胞の生存 性はトリパンブルー排除により決定された。Ｆａｄｏｋ ｅｔ ａｌ．（１４） は、マクロファージが食作用により枯死リンパ球を除去する方法を見いだすこと を目的として行われた試験を記載している。それらは枯死リンパ球の食作用が、 ホスファチジルセリンに構造的に関連する化合物のＬ−イソ型により阻害される こと、及び正常細胞と比較して枯死リンパ球の膜がより多くの量 のメロシアニン５４０色素と結合しており、それらの膜脂質の充填がよりゆるく 、膜のリン脂質非対称の喪失と一致することを示していることを例示した。その 観察は、枯死リンパ球が膜リン脂質非対称を喪失し、原形質膜の外側のリーフレ ット上でホスファチジルセリンを露出していることを示唆している。次いでマク ロファージが、露出されたホスファチジルセリンの認識の後に枯死リンパ球を捕 食する。文献の著者等は、枯死細胞の特異的検出又は単離にかかわらなかった。 彼らは膜枯死細胞のゆるい充填の決定のために非特異的色素を用いた。彼らは平 衡遠心分離法又は形態学的分析を用いることにより枯死及び非−枯死細胞の間の 相違を識別し、ゆるく充填された膜に大部分が結合する非特異的メロシアニン５ ４０色素で細胞を着色することによりこれを追跡した。枯死及び非−枯死細胞を 特異的に識別する新規な方法に関する示唆は与えられていない。 枯死細胞の存在の決定のための現在までにおけるすばらしい標準は、細胞ＤＮ Ａの分析である。この方法の場合、細胞を破壊し、ＤＮＡを抽出し、分析する。 証拠となる約１８０塩基対のＤＮＡラダーが枯死細胞のゲル上に現れる。ＤＮＡ アッセイにおけるそのようなラダーの存在は、例えば全身姓紅斑姓狼瘡などの自 己免疫疾患の診断のための信号となってきた。ＤＮＡ断片の分析はＳｅｌｌｅｎ ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１６）（６）により修正されたＢｕｒｔｏｎ（１５） のジフェニルアミン反応を用いて行うことができる。ＤＮＡラダーにより証明さ れる通り２本鎖ＤＮＡ切断が、枯死細胞に最後の一撃を与える機構であるという 長年の観点が最近、異議を唱えられた。研究者等は、細胞がヌクレオソーム内切 断なしで枯死を経ることができ、その意味するものは、枯死が現 在の多くの診断手段が示唆するより広範囲であり得ることであることを示唆して いる（１７）。 枯死の分野における他の大問題の１つは、あなたは枯死細胞を検出せずにライ シスされた細胞を検出するので、最初に細胞を殺してしまった場合に枯死を阻害 したと考える過ちを犯し易いことである。枯死を阻害することができる化合物又 は処置を探す場合、その方法が実際に枯死を阻害するべきであり、これらが枯死 状態に達する前に他の手段で細胞を単に殺したのではないことが必須である。 発明の記述 枯死細胞の特徴の１つは、改変された原形質膜の性質である（７、８）。驚く べきことに、枯死のプログラムに入った無損傷の細胞はそれらの膜の性質を変化 させ、ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有するより多量の試薬に結合 できるようにすることが見いだされた。これに関連し、高い親和性は１０^-6Ｍよ り小さいホスファチジルセリンに関する解離定数Ｋｄ、好ましくは１０^-10より 小さいＫｄを有することを意味する。アネキシンの範疇に属するポリペプチド又 はタンパク質を用いて驚く程良い結果を得ることができる。因子Ｖａの軽鎖は、 ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬の他の適した例である。 アネキシンは十分に記載された両親媒性タンパク質の群を構成し、それはカチ オンの存在下で細胞膜に可逆的に結合することができる（９）。アネキシンの一 次構造は４倍又は８倍の反復ドメインを含み、それは共通配列を含む。非−保存 的及びそのままのアネキシン特異的Ｎ−末端尾部が第１のドメインに先行する。 ドメインは短い可変リンカーペプチドを介して相互連結されている。アネキシン タンパク質は胎盤組織のよう な組織から精製することができ（１０）、又は組み換え法により得ることができ る（１１）。 ＰＣＴ／ＥＰ９０／０２２５７において、プロトロンビン活性化状態に入った 血小板上のホスファチジルセリンへの結合のためのアネキシンが記載されている 。他の目的のためのアネキシンの利用に関しては何も記載又は示唆されておらず 、本発明の方法における利用に関する示唆は与えられていない。 枯死細胞が有するアネキシンに対する結合部位が増加しているという観察は、 細胞を破壊せずに個々に基づいて（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｂａｓｉｓ）非−枯 死及び枯死細胞を迅速に識別するアッセイの開発に導いた。その方法は以下の原 理に基づく。懸濁細胞又は組織断片をホスファチジルセリンに特異的な試薬と混 合することができ、細胞表面結合試薬の量を試薬に共役させた標識により直接、 あるいは試薬に特異的な抗体を介して間接的に測定することができる。細胞−結 合試薬のパラメーターは、細胞が枯死性であるか又はそうでないかを明らかにす る。決定は定性的又は定量的性質のものであることができる。 枯死細胞を非−枯死細胞から、分離法に適した試薬に共役させたマーカーの選 択を介して分離することもできる。特異的集団の選択、及び異なる集団からのそ の単離に適した複数のマーカーが当該技術の現状において既知である。 一般に本発明は、試料中の枯死細胞を検出し及び／又は場合により定量するた めの方法を目的としており、その方法は ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と 接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と反応し た無損傷の細胞を定性的に及び／又は場合により定量的に検出する ことを含む。この方法は試料中の枯死細胞を分離するための一部としても用いる ことができる。枯死細胞の分離を目的とする方法は、 ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と 接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と反応し た無損傷の細胞を定性的に及び／又は場合により定量的に検出し、該検出が非− 枯死細胞から枯死細胞を分離するための段階ｃ）の前又は後に起こることにより 行われ、その分離は、枯死細胞が段階ａ）においてホスファチジルセリンに対す る高い親和性を有する検出可能な試薬を備えており、該検出可能な試薬はそれ自 体既知の方法によって選択可能でもあるという事実の故に行うことができる。ラ イシス（ｌｙｓｉｓ）を受けた細胞と反対の無損傷である細胞の検出は、それ自 体既知の方法で行うことができる。例えばプロピジウムヨーダイドは、ライシス を受けた細胞を認識するが、無損傷の細胞を認識しないマーカーであることが既 知である。プロピジウムヨーダイドを用いた処理の後、無損傷の細胞をそれ自体 既知の方法で、例えばフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ） によりライシスを受けた細胞から分離することもできる。一般に無損傷の細胞に 結合しないがライシスを受けた細胞に結合するマーカーを、ライシスされない細 胞からライシスされた細胞を識別するために、それ自体既知の方法で用いること ができる。ライシスされた細胞に関するマーカーはホスファチジルセリンに対す る高い親 和性を有する試薬に関するマーカーと識別可能でもあるのが好ましく、無損傷で ある細胞からライシスされた細胞の集団を実際に分離するためにも用いることが できるのが好ましい。 ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬はアネキシンとして分 類されるポリペプチド又はタンパク質であることができる。一般的アネキシンの 、及び特にアネキシンＶの特異的リン脂質−結合性は、共役体がまだリン脂質− 結合性を保有しているような方法で広範囲の化合物とアネキシンを共役させる能 力と組み合わされて、本発明の方法の別の実施態様として、自然に起こるか又は いずれかの種類の環境的因子により誘導される細胞枯死を定性的及び／又は定量 的に決定するために用いることができる。まだホスファチジルセリンに対する高 い親和性を示すアネキシンの誘導体も本発明の方法で用いることができる。アネ キシン又はそれらの誘導体を本発明の方法においてホスファチジルセリンに対す る高い親和性を有する試薬として用いる場合、試薬がホスファチジルセリンとの 結合能力を示すために、カチオンの存在下で、好ましくは２価のカチオンの存在 下で試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬と接触させる のも好ましい。２価のカチオンは例えばＣｄ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及び好 ましくはＣａ²⁺から成る群より選ばれることができる。ある量のＣａ²⁺の存在下 で、例えばアネキシンＶはリン脂質膜に外部的（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）やり方で 吸着する。Ｃａ²⁺イオンはアネキシンＶの部位に結合し、特異的アミノ酸の６個 のカルボニル酸素に連結することによりタンパク質とリン脂質膜の間に架橋する と思われる。しかしかくしてキレート化されたＣａ²⁺イオンは配位及び電荷にお いて不飽和である。そこで７番目の配位部位はホスファ チジルセリンのリン部分を受容することができる。架橋は生理学的イオン強度及 びｐＨ条件下、及びＣａ²⁺閾量以上において非常に安定であると思われるが、Ｃ ａ²⁺濃度が閾量以下に減少すると急速に、及び完全に離れる。興味深いことに、 これらのＣａ²⁺の閾量は膜のホスファチジルセリン含有量と逆比例していると思 われる。特にアネキシンＶはホスファチジルセリン含有膜に対する高い親和性を 示す。しかしＫｄなどの客観的（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）パラメーターを用いて親 和性を表すのは困難であると思われ、１０^-10Ｍより小さいという見積もりとし て与えられる。実際これは、ビタミンＫ依存性凝固因子、ならびに補因子ＶＩＩ （ａ）及びＶ（ａ）などの他のリン脂質−結合タンパク質が、膜への結合に関し てアネキシンＶと重大に競合しないという事実により反映される。 本発明の方法を、２種又はそれ以上のカチオンの組み合わせを用いて行うこと もできる。特にＣａ²⁺とＺｎ²⁺の組み合わせは良い結果を与える。Ｔｂ³⁺などの ３価のカチオンを用いることもできる。 用いられる試薬はホスファチジルセリンに対する高い親和性を有していなけれ ばならない。非−枯死細胞の細胞膜の外側のリーフレット上で利用できる他の膜 成分に対してそのような高い親和性を有していないのも好ましい。特にそれはホ スファチジルコリン又はスフィンゴミエリンにあまり結合してはならず、非枯死 細胞の他の外膜成分にあまり結合しないのが好ましい。本発明の方法が単に定性 的効果の決定のための比較目的で用いられる場合、多量の試薬が結合した細胞と 少量の試薬が結合した細胞を区別しなければならないだけなので、この後者の要 求は厳密ではない。しかし当然ホスファチジルセリンに対する試薬の親和性が高 い方がより良い。非−枯死細胞及び枯死細胞の外膜に含まれる種々のリン脂質の 識別は、アネキシンを非−枯死細胞から枯死細胞を分離するための理想的試薬と しているものである。ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの間でホ スファチジルセリンを優先して特異的に決定することができるいずれの試薬も本 発明の方法で用いることができる。ホスファチジルセリンに対する高い親和性を 有する試薬の追加の性質は、それが検出及び／又は選択のために用いられる標識 に共役させられた時にまだホスファチジリセリンに結合できることである。 ここで本方法は枯死細胞及びまた枯死細胞の生成へのある種の処置及び／又は 化合物が与える結果を分析するための手段を提供する。今回、枯死細胞に導く経 路の活性化又は不活性化への処置及び／又は化合物の効果を追跡することが可能 になった。それは細胞を破壊する必要なく、ある集団における非−枯死細胞から の枯死細胞の簡単な分離を可能にもする。従って、続いて分離される枯死及び非 −枯死細胞の集団を、次いでさらなる試験及び／又は臨床的適用、例えば同原（ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）幹細胞あるいは 骨髄細胞の移植に用いることもできる。個々の細胞に基づいて分析及び単離する こともできる。本発明の方法は懸濁細胞又は組織切片の試料について用いること ができる。 細胞当たりに結合するホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬 の量は、直接又は間接的に測定することができる。直接測定の場合、分析される べき細胞を、標識を有するホスファチジルセリンに対する高い親和性の試薬と接 触させる。そのような標識は、蛍光マーカー、放射性マーカー、酵素、金属、色 素、検出可能な免疫グロブリン又はタ ンパク質部分のようないずれの一般的に許容され得る検出可能なマーカーである こともできる。適した例は¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、³²Ｐ、³⁵Ｓ及び⁹⁹Ｔｅから 成る群より選ばれる放射性マーカーである。適した蛍光マーカーはフルオレセイ ン、フィコエリスリン及びローダミンから成る群より選ばれることができる。適 した酵素マーカーはアルコールデヒドロゲナーゼ、パーオキシダーゼ及びアルカ リ性ホスファターゼから成る群より選ばれることができる。タンパク質部分はフ ェリチン、ビオチン、アビジン及びストレプタビジン、ならびにこれらの誘導体 から成る群より選ばれることができる。適した色素はエバンスブルー（Ｅｖａｎ ｓ Ｂｌｕｅ）及びクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）から成る群より選ばれることができる。標識法は 標識の型に特異的であり、文献に記載されているか、又は標識の商業的供給者に より与えられる。上記の標識の例は単に例示であり、商業的に入手可能ないずれ の一般的に許容され得る標識も用いることができる。 間接的測定の場合、調べられるべき試料をホスファチジルセリンに対する高い 親和性を有する非標識試薬と接触させ、それ自体既知の方法で試薬特異的抗体に より結合試薬の量を決定することができる。 枯死の測定は、試料を例えばカチオン及びアネキシンタンパク質と接触させた 後に行うことができる。枯死の測定は、標識の存在及び／又は量の決定のための 標準的方法を用いて行うことができる。分析に用いることができる方法の例はフ ロー−及びイメージサイトメトリー（ｆｌｏｗ−ａｎｄ ｉｍａｇｅｃｙｔｏｍ ｅｔｒｙ）、ならびに画像分析（ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）である。抗体 を用いる間接的測定の場合、 当該技術の現状において記載されているいずれの抗体検出イムノアッセイも用い ることができる。 特に試料からの枯死細胞の分離は、蛍光標識に共役させたホスファチジルセリ ンに対する高い親和性を有する試薬を用い、続いて多量の蛍光を有する細胞を蛍 光の低い、又は蛍光を持たない細胞から分離するように設定されるＦａｃｓ細胞 選別機を用いて行うことができる。分離はホスファチジルセリンに対する高い親 和性を有する試薬、又は用いられる試薬の共役形態に関して高い親和性を示す固 相の使用を介しても行うことができる。例えば固定化ビオチンを用い、ホスファ チジルセリンに対する高い親和性を有する試薬に共役させたストレプタビジンに 結合することができる。 本発明の方法は個々の、又は特定の試料における枯死の量に対する化合物又は 特定の処置の効果を決定するために用いることができる。この効果の決定は、調 べられるべき化合物の存在に供された、又は調べられるべき処置に供された試料 を用いて本発明を行い、この結果を、標準試料、あるいは調べられるべき化合物 の存在の前に、及び／又は調べられるべき処置に試料を供する前に採取された試 料を用いて同じ条件下で本発明の方法を行って得る結果と比較することにより確 定することができる。この比較は定性的又は定量的な性質のものであることがで きる。 本発明の方法を行うのに適したキットも本発明の範囲内に含まれる。そのよう なキットは、試薬がホスファチジルセリンに共役させられた場合にも検出可能な 、又は検出可能とされ得る、ホスファチジルセリンに関して特異的な試薬を含ま なければならない。試薬はすでにキットにおいて標識が与えられていることがで き、又はキットを用いて標識を与え ることもできる。キットは無損傷の細胞及びライシスを受けた細胞を識別するこ とができる検出可能な、及び好ましくは選択可能な標識も含まなければならない 。そのような標識の適した例はプロピジウムヨーダイドである。キットがホスフ ァチジルセリンに関して特異的な試薬としてアネキシンを含む場合、場合により ホスファチジルセリンに関して特異的な試薬の細胞膜への結合に必要なカチオン が含まれることができる。キットはさらに本発明の方法を行うのに適した媒体を 含むことができる。キットは比較アッセイで用いることができる特定の細胞集団 の標準試料も含むことができる。キットは分析されるべき特定の細胞に適した媒 体及び／又は標識が存在することにより、これらの細胞の型又は組織の型に関し て特異的であることができる。癌の処置のための薬剤の効果の分析の場合、特定 の癌がある種の組織又は細胞の型に特異的である場合が非常に多く、そのような 場合にはそのような細胞に適した特定の媒体又はマーカーを用いるのが興味深い 。 実施例１ 標準的方法により血液から好中球を単離する。好中球をサイトカインの不在下 又は存在下の培地中に終夜保つ。サイトカインは好中球が枯死に入るのを防ぐこ とが知られている。 好中球集団における枯死を測定するために、細胞を緩衝食塩水中の３ｍＭのＣ ａ²⁺、及びフルオレセインと共役させた１０μｇ／ｍｌの最終的濃度のアネキシ ンＶ、及び１０μｇ／ｍｌのプロピジウムヨーダイドと混合する。混合細胞をフ ローサイトメトリーにより分析する。サイトカインを添加しない試験の結果を示 す図１及びサイトカインを用いた試験の結果を示す図２は、プロピジウムヨーダ イド陰性細胞が２つの集団 を含み、それはこの方法により区別され得ることを示している。少量の結合アネ キシンＶを有する無損傷細胞の集団及び多量の結合アネキシンＶを有する無損傷 細胞の集団である。後者の集団は他の分析法により明らかにされる通り、枯死性 であると思われる。フローサイトメトリー分析から、サイトカインの不在下で非 −枯死細胞対枯死細胞の比率は１．８２：１であるが、サイトカインの存在下で この比率は７．６２：１であることになる。これは、サイトカインの存在のため に枯死相に入る細胞の量が顕著に少ないという事実を示している。サイトカイン 以外の異なる化合物の効果を類似の方法で比較することができ、かくしてそのよ うな化合物の枯死への効果も迅速に及び高感度で識別することができる。 実施例２ ミクロタイタープレートのウェルに接着性細胞をそれ自体既知の方法で植え付 ける。用いられる接着性細胞の型の選択は、行われる診断に依存するであろう。 複数の種々の適した細胞型が商業的に入手可能であり、用いられるべき型の選択 は当該技術分野における熟練者に明らかであろう。続いて細胞をおそらく枯死の 誘導又は阻害を生ずる方法で処理する。次いで枯死の量をＣａ⁺²イオンを含む緩 衝液中で、例えばフルオレセイン又はビオチンのようなリポーター基と共役させ たアネキシンＶの添加により評価する。インキュベーションの後、非結合アネキ シンＶを洗い流す。次いで結合アネキシンＶの量を直接又は間接的に測定する。 直接測定は、アネキシンＶ−フルオレセインの場合ミクロタイターリーダーにお いて行うことができる。間接的測定はストレプタビジン−ホースラディッシュパ ーオキシダーゼ及びアネキシンＶ−ビオチンと組み合わされた発色性基質を用い て行うことができる。結合アネキシンの量はウェ ル当たりの枯死の量と関連する。 実施例３ 以下の文において、種々の疾患の治療における重要な臨床的疑問に役立つ手段 としての例により本発明を説明する。 ３．Ｉ．白血病患者のための抗−癌治療の有効性の評価 白血球細胞にとって致死でない条件下で患者から血液を採取する。そのような 条件は公共の文献により記載されている。 血液を遠心分離して白血球細胞を含む軟層を形成する。これらを集め、密度勾 配遠心分離法、例えば所望の密度のＦｉｃｏｌｌ又はＰｅｒｃｏｌｌにより遠心 分離にかける。選ばれる密度は白血病の型に依存する。その方法は高度に濃縮さ れた白血病細胞を単離するために構築されている。単離される白血病細胞を培地 、例えばＩｓｃｏｖｅ’ｓ ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０中に懸濁させる。培 地にヒト又はウシ起源の血清を、及びグルタミン酸、成長因子、サイトカイン又 は他の細胞生理学の調節剤などの添加剤を補足することができる。 懸濁細胞を培養皿に入れ、例えば３７℃においてインキュベートする。例えば フルダラビン、メトトレキセート、サイクロスポリンのような可能な抗−癌治療 の主成分を、濃度を変化させて培養中の細胞に加える。成分の存在下で細胞をさ らに培養する。あらかじめ決められた時点に試料を採取し、本発明の方法の原理 により細胞死に関して測定する：細胞試料を０．５〜５ｍＭのＣａ⁺²−イオンを 含むＨｅｐｅｓ−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄し、最後に約１０⁴〜１０⁶細胞を含む４ ４５μｌの緩衝液において懸濁させる。フルオレセインと共役させた５μｌのア ネキシンＶ及び５０μｌのプロピジウムヨーダイドを試料に加え、例えばそれぞ れ ０．０２５〜１０μｇ／ｍｌ及び０．５〜２０μｇ／ｍｌとする。試料をさらに インキュベートし、次いで確立された方法に従ってフローサイトメトリー２色分 析により分析する。 図３はそのような分析の典型的結果を示す。この分析は生存、枯死及び壊死細 胞の集団分布を与える。死細胞（枯死＋壊死細胞）の画分は、この特定の細胞型 への、用いられる薬剤の有効性に関する指標である。従ってこのアッセイは患者 の白血病細胞の薬剤抵抗性を明らかにし、かくして抗−癌治療の選択において医 師を導く。 ３．ＩＩ．ＡＩＤＳの進行の評価 白血球にとって致死でない条件下でＨＩＶ−陽性患者又はＡＩＤＳ患者から血 液を採取する。そのような条件は公共の文献に記載されている。軟層を得るため の遠心分離法及び続く例えば所望の密度のＦｉｃｏｌｌ又はＰｅｒｃｏｌｌのよ うな密度勾配上における軟層の遠心分離法を含む標準的方法により末梢血単核球 （ＰＢＭＣ）を単離する。ＰＢＭＣを培地、例えばＩｓｃｏｖｅ’ｓＤＭＥＭ又 はＲＰＭＩ１６４０中に懸濁させる。培地にヒト又はウシ起源の血清を、及びグ ルタミン酸、成長因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの添加剤 を補足することができる。懸濁細胞を培養皿に入れ、例えば３７℃においてイン キュベートする。あらかじめ決められた時点に試料を採取し、本発明の方法の原 理により細胞死に関して測定する。細胞をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、次いで フィコエリスリン標識ＣＤ４又はＣＤ８抗体と共にインキュベートする。次いで 細胞を０．５〜５ｍＭのＣａ²⁺−イオンを含むＨｅｐｅｓ−ＮａＣｌで洗浄する 。細胞を例えば１０⁴〜１０⁶細胞を含む４４５μｌの緩衝液において懸濁させる 。フルオレセインと共役させた５ μｌのアネキシンＶ及び５０μｌのプロピジウムヨーダイドを試料に加え、それ それ０．０２５〜１０μｇ／ｍｌ及び０．５〜２０μｇ／ｍｌとする。試料をさ らにインキュベートし、次いで確立された方法に従ってフローサイトメトリー３ 色分析により分析する。図３はそのような分析の典型的結果を示す。この分析は 生存、枯死及び壊死細胞の集団分布を与える。３色分析のために、ＰＭＢＣサブ セットＣＤ４＋及びＣＤ８＋における死細胞のパーセンテージを測定することが できる。ＰＭＢＣのこれらの小集団における死細胞のパーセンテージはＡＩＤＳ の進行に関する指標であり、治療の選択において医師を導く。 ３．ＩＩＩ．疾患、全身性紅斑性狼瘡の状態の評価 実施例３．ＩＩ．に記載されている通りにＳＬＥ患者から血液を採取し、処理 し、ＰＭＢＣを得る。単離ＰＭＢＣを培地、例えばＩｓｃｏｖｅ’ｓＤＭＥＭ又 はＲＰＭＩ１６４０中に懸濁させる。培地にヒト又はウシ起源の血清を、及びグ ルタミン酸、成長因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの添加剤 を補足することができる。懸濁細胞を培養皿に入れ、例えば３７℃においてイン キュベートする。あらかじめ決められた時点に試料を採取し、本発明の方法の原 理により細胞死に関して測定する。 次いで細胞を０．５〜５ｍＭのＣａ²⁺−イオンを含むＨｅｐｅｓ−ＮａＣｌで 洗浄する。細胞を例えば１０⁴〜１０⁶細胞を含む４４５μｌの緩衝液において懸 濁させる。フルオレセインと共役させた５μｌのアネキシンＶ及び５０μｌのプ ロピジウムヨーダイドを試料に加え、それぞれ例えば０．０２５〜１０μｇ／ｍ ｌ及び０．５〜２０μｇ／ｍｌとする。試料をさらにインキュベートし、次いで 確立された方法に従ってフ ローサイトメトリー２色分析により分析する。 図３はそのような分析の典型的結果を示す。この分析は生存、枯死及び壊死細 胞の集団分布を与える。死細胞（枯死＋壊死細胞）の画分は疾患の活性の状態に 関する指標であり、従って治療法の選択において医師を導く。 ３．ＩＶ．胚の正常な、又は異常な発生の評価 受胎後１１〜１３日（ｐｌｕｇ＝０日）の妊娠中のマウスをエーテルで麻酔し た後に頸部脱臼により犠牲にする。子宮を取り出し、胚を集め、２つの群に分け る。ビオチンと共役させたアネキシンＶの注入により細胞死を検出するために胚 を一時的に培養する。先端の直径が１５〜２５μｍのガラス針を有するＨａｍｉ ｌｔｏｎ−Ｓｙｒｉｎｇｅピペット系を用いて胚を心臓の心室に注入する。胚を ３７℃の緩衝液中に保って外科用顕微鏡下で或る容量の約３μｍのアネキシンＶ −ビオチン溶液（ａ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ３μ ｍ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ｂｉｏｔｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を注入する。注入 に成功すると、臍静脈の一時的白化（ｂｌａｎｃｈｉｎｇ）が見られるであろう 。心臓活性を調べ、インキュベーションの３０分間で残存する胚をさらに処理す る。インキュベーションの後、胚を光学顕微鏡法（ＬＭ）のために４％Ｆｏｒｍ ａｎ ｈｅａｐｓ緩衝液中で、又は電子顕微鏡法（ＥＭ）のために２％グルタル アルデヒド−２％パラホルムアルデヒドカコジレート緩衝液中で４℃において終 夜固定する。 ＬＭの場合の組織学的分析 固定に続き、胚を脱水し、パラフィン中に埋め込み、３μｍで系列的に切断す る。メタノール／Ｈ₂Ｏ₂（９：１ ｖ／ｖ）中で２０分間イン キュベートすることにより、内因性パーオキシダーゼを遮断する。切片をリン酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する。ホースラディッシュパーオキシダーゼ共 役アビジン（アビジン−ＨＲＰ）（Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット、 Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるアビジン−ビオチン複合体法 を用い、室温で細胞結合アネキシンＶ−ビオチンを検出する。３，３’−ジアミ ノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を用いて染色を発色させ、ヘマト キシリンを用いて対比染色する。 ＥＭの場合の組織学的分析 アネキシンＶ−ビオチンと共にインキュベートした後、前記のガラス針を用い て胚を心臓内注入により固定する。次いで組織断片を取り出し、４℃において終 夜固定する。１００μＭの切片をビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）上で切断 し、ＬＭの場合と同様にしてアネキシンＶ−ビオチンの染色を発色させる。ＤＡ Ｂの後、切片をＯｓＯ₄で後固定し、３％ウラニルアセテートを用いて全体的に 染色し、続いて脱水してプラスチック（Ｄｕｒｃｏｐａｎ）に埋め込む。組織を ミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊｕｎｇ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ）上で超薄 切片に切断し、最後に１％クエン酸鉛で染色する。切片を電子顕微鏡法により調 べる。 アネキシンＶ−ビオチンは死亡しつつある細胞、又は死細胞に結合するが生存 細胞には結合しない。従って処理された胚の切片は、子宮から胚を取り出した時 点における、発生中の胚の細胞死の形態を視覚化しているであろう。細胞死は空 間と時間の座標により胚において計画されている。空間及び時間において異常な 細胞死は生物にとって重大性を有す るであろう。例えば二分脊椎はある時点におけるある場所の細胞死の欠如の結果 である。正常に計画された細胞死の目録は公共の文献に十分に記載されている。 この目録は、この実施例に記載の方法により測定される発生中の胚における細胞 死の正常性（異常性）を判定するための参照としての役目を果す。発生中の胚に おける細胞死の測定は遺伝的欠陥の研究及び化合物の奇形形成性の評価において 重要である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年４月２３日 【補正内容】 請求の範囲 １．ａ）試料を、ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な 試薬と接触させ、これに関連し、高い親和性とはＫｄ＜１０^-6Ｍのホスファチジ ルセリンに関する解離定数を有することを意味し、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と反 応した細胞を定性的及び／又は定量的に検出し、細胞は好ましくは無損傷の細胞 であり、該検出は ｃ）非−枯死細胞から枯死細胞を単離する ための任意の単離段階の前又は後に行われる ことを含む試料中の枯死細胞を検出、及び／又は定量、及び／又は単離するため の方法。 ２．試薬が選択可能な試薬であり、単離法が枯死細胞に結合する該試薬を用いる 請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬がアネキシンとして 分類されるポリペプチド又はタンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．ライシス（ｌｙｓｉｓ）を受けた細胞を検出するためのマーカーの利用によ り、細胞をライシスを受けた細胞と無損傷の細胞に区別することができる請求の 範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５．マーカーがプロピジウムヨーダイドである請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．細胞がフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により検出さ れる請求の範囲第４又は５項に記載の方法。 ７．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬がアネキシ ンＶ又はホスファチジルセリンに対する高い親和性を示すそれらの誘導体である 請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ８．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬を、試薬がホスファ チジルセリンに対する親和性を示すためにカチオンの存在下で試料と接触させる 請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。 ９．カチオンが２価のカチオンである請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．２価のカチオンがＣｄ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及びＣａ²⁺から成る群 より選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．カチオンがＣａ²⁺である請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬を、試薬がホスフ ァチジルセリンに対する高い親和性を示すためにＣａ²⁺及びＺｎ²⁺の両方の存在 下で試料と接触させる請求の範囲第８〜１１項に記載の方法。 １３．カチオンがＴｂ³⁺である請求の範囲第８項に記載の方法。 １４．ホスファチジルセリンに対して特異的な試薬に検出可能なマーカーを設け る請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の方法。 １５．検出可能なマーカーが蛍光マーカー、放射性マーカー、酵素、金属、色素 、検出可能な免疫グロブリン又はタンパク質部分から選ばれる請求の範囲第１４ 項に記載の方法。 １６．放射性マーカーが¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、³²Ｐ、³⁵Ｓ及び⁹⁹Ｔｅから成 る群より選ばれる請求の範囲第１４又は１５項に記載の方法。 １７．蛍光マーカーがフルオレセイン、フィコエリスリン及びローダミンから成 る群より選ばれる請求の範囲第１４又は１５項に記載の方法。 １８．酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、パーオキシダーゼ及びアル カリ性ホスファターゼから成る群より選ばれる請求の範囲第１４又は１５項に記 載の方法。 １９．検出可能なマーカーがフェリチン、ビオチン、アビジン及びストレプタビ ジン、ならびにそれらの誘導体から成る群より選ばれる請求の範囲第１４項に記 載の方法。 ２０．色素がエバンスブルー（Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ）及びクーマシーブリリア ントブルー（Ｃｏｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）から成る 群より選ばれる請求の範囲第１４又は１５項に記載の方法。 ２１．枯死細胞がフローサイトメーター又は抗体検出イムノアッセイの利用によ り単離される請求の範囲第１〜２０項のいずれかに記載の方法。 ２２．ミクロタイタープレートに接着性細胞を設け、枯死がミクロタイタープレ ートにおいて測定される請求の範囲第１〜２０項のいずれかに記載の方法。 ２３．枯死細胞に結合する試薬に対して高い親和性を示す固相の利用により非− 枯死細胞から枯死細胞を分離する請求の範囲第１〜２０項のいずれかに記載の方 法。 ２４．アネキシン又はアネキシンの共役形態に対して高い親和性を示す固相の利 用により非−枯死細胞から枯死細胞を分離する請求の範囲第１〜２０項のいずれ かに記載の方法。 ２５．調べるべき化合物及び／又は処置の存在に供された試料を用いて請求の範 囲第１〜２４項のいずれかに記載の方法を行い、結果を、標準試料を用いて、及 び／又は調べるべき化合物及び／又は処置の存在の前に採取された試料を用いて 同じ条件下で請求の範囲第１〜２４項に記載 の方法を行って得られる結果と比較することを含む、個体及び／又は試料中の枯 死の量に対する化合物又は特定の処置の効果を決定するための方法。 ２６．検出可能な又は検出可能にされることができる、ホスファチジルセリンに 対する高い親和性を有する試薬、 を含む請求の範囲第１〜２５項のいずれかに記載の方法を行うために適したキッ ト。 ２７．無損傷の細胞からライシスを受けた細胞を区別するための検出可能なマー カーをさらに含む請求の範囲第２６項に記載のキット。 ２８．カチオンをさらに含む請求の範囲第２６又は２７項に記載のキット。 ２９．適した媒体をさらに含む請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載のキ ット。 ３０．検出可能なマーカーが、細胞が分離され得るようにする選択可能なマーカ ーである請求の範囲第２６〜２９項のいずれかに記載のキット。 ３１．マーカーがプロピジウムヨーダイドである請求の範囲第２６〜３０項のい ずれかに記載のキット。 ３２．不適切な細胞から移植に適した細胞を分離するための請求の範囲第１〜２ ２項のいずれかに記載の方法及び／又は請求の範囲第２６〜３１項のいずれかに 記載のキットの利用。 ３３．同原又は異種幹細胞あるいは骨髄細胞の移植のための請求の範囲第３２項 に記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ｇ０１Ｎ 33/532 0276−2Ｊ 33/532 33/533 0276−2Ｊ 33/533 33/534 0276−2Ｊ 33/534 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）試料を、ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な 試薬と接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬と反 応した細胞、好ましくは無損傷の細胞を定性的及び／又は場合により定量的に検 出し、 該検出段階は ｃ）非−枯死細胞から枯死細胞を単離する ための段階の前又は後に行われ、その単離は枯死細胞が段階ａ）においてホスフ ァチジルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬を備えており、該試 薬がそれ自体既知の方法で選択可能でもあるという事実の故に行うことができる ことを含む試料中の枯死細胞を検出及び／又は場合により定量及び／又は場合に より単離するための方法。 ２．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬がアネキシンとして 分類されるポリペプチド又はタンパク質である請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．フローサイトメトリーなどのそれ自体既知の方法におけるプロピジウムヨー ダイドの利用によるなどの、それ自体既知の方法でライシスを受けた細胞を検出 するためのマーカーを用いることにより、細胞をライシスを受けた細胞と無損傷 の細胞に区別することができる請求の範囲第１又は２項に記載の方法。 ４．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬がアネキシンＶ又は ホスファチジルセリンに対する高い親和性を示すそれらの誘導 体である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬を、試薬がホスファ チジルセリンに対する親和性を示すためにカチオン、好ましくは２価のカチオン の存在下で試料と接触させる請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６．２価のカチオンがＣｄ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺及び好ましくはＣａ²⁺か ら成る群より選ばれる請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬を、試薬がホスファ チジルセリンに対する高い親和性を示すためにＣａ²⁺及びＺｎ²⁺の両方の存在下 で試料と接触させる請求の範囲第５又は６項に記載の方法。 ８．カチオンがＴｂ³⁺である請求の範囲第５項に記載の方法。 ９．ホスファチジルセリンに対して特異的な試薬に蛍光マーカー、放射性マーカ ー、酵素、金属、色素、検出可能な免疫グロブリン又はタンパク質部分などの検 出可能なマーカーが与えられている請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方 法。 １０．放射性マーカーが¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、³²Ｐ、³⁵Ｓ及び⁹⁹Ｔｅから成 る群より選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．蛍光マーカーがフルオレセイン、フィコエリスリン及びローダミンから成 る群より選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、パーオキシダーゼ及びアルカリ性ホ スファターゼから成る群より選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。 １３．タンパク質部分がフェリチン、ビオチン、アビジン及びストレプ タビジン、ならびにそれらの誘導体から成る群より選ばれる請求の範囲第９項に 記載の方法。 １４．色素がエバンスブルー及びクーマシーブリリアントブルーから成る群より 選ばれる請求の範囲第９項に記載の方法。 １５．枯死細胞がＦＡＣＳなどのフローサイトメーターの利用により単離される 請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。 １６．ミクロタイタープレートに接着性細胞を設け、枯死を多数の細胞試料にお いて測定する請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。 １７．アネキシン又はアネキシンの共役形態に高い親和性を示す固相の利用によ り非−枯死細胞から枯死細胞を分離する請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記 載の方法。 １８．調べられるべき化合物及び／又は処置の存在に供された試料を用いて請求 の範囲第１〜１７項のいずれかに記載の方法を行い、結果を、標準試料を用いて 、及び／又は調べるべき化合物及び／又は処置の存在の前に採取された試料を用 いて同じ条件下で請求の範囲第１〜１７項に記載の方法を行って得られる結果と 比較することを含む、患者及び／又は試料中の枯死の量に対する化合物又は特定 の処置の効果を決定するための方法。 １９．ａ）検出可能な又は検出可能にされることができる、ホスファチジルセリ ンに対する高い親和性を有する試薬、 ｂ）無損傷の細胞からライシスを受けた細胞を区別し、好ましくは分離す るための検出可能な及び好ましくは選択可能な、例えばプロピジウムヨーダイド のようなマーカー、ならびに場合により ｃ）カチオン、及び ｄ）適した媒体 を含む請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の方法を行うために適したキッ ト。 ２０．例えば同原又は異種幹細胞あるいは骨髄細胞の移植のために、不適切な細 胞から移植に適した細胞を分離するための請求の範囲第１〜１６項のいずれかに 記載の方法ならびに／又は請求の範囲第１８項に記載のキットの利用。