JPH09507741A - ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト血清による不活性化に耐性のあるレトロウイルスベクター粒子。ベクター粒子は望ましくはｐ１５Ｅタンパク質を含み、ここでベクター粒子がヒト血清による不活性化に対し耐性のあるように、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも一部は突然変異される。ベクター粒子は更にヒト標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域を含有する一つのタンパク質を含み、これにより生体内に望ましい非相同遺伝子を直接導入することを可能にし、またこれにより非相同遺伝子を含むベクター粒子は標的細胞あるいは標的組織に直接移動する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子 この発明は「注射可能」ベクター粒子に関する。より詳細には、この発明はレ トロウイルスベクター粒子などのベクター粒子に関し、ここでこのようなベクタ ー粒子は、ヒト血清による不活性化に耐性である。 ベクター粒子は、真核細胞などのような細胞内に遺伝子あるいはＤＮＡ（ＲＮ Ａ）を導入するのに有用な作用物質である。遺伝子は適切なプロモーターにより 制御される。ベクター粒子を発生させるのに使用されるベクターの例は、細菌ベ クターなどの原核ベクター、酵母菌ベクターなどの真菌ベクターを含む真核ベク ター、およびＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクターなどのウイルス ベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。細胞に遺伝子あるいはＤＮＡ （ＲＮＡ）を導入するためのベクター粒子を発生させるのに使用されてきたレト ロウイルスベクターは、モロニー・ネズミ白血病ウイルス、脾臓・壊死ウイルス 、ニワトリ肉種ウイルス、およびハーヴェイ肉腫ウイルスを含む。ここで使用さ れる「導入」という用語は、遺伝子を細胞に転移する各種の方法を包含する。こ のような方法は形質転換、形質導入、形質移入、および感染を含む。 ベクター粒子は遺伝子治療目的のために、ＤＮＡを細胞に導入することで使用 されてきた。一般にこのような方法は、患者から細胞を手に入れ、望ましいＤＮ Ａ（ＲＮＡ）を細胞に導入 するためベクター粒子を使用し、次いで治療目的のために工学的に処理された細 胞を患者に提供することを含む。遺伝子治療の代替方法を提供することは望まし い。このような代替手法は、生体内での遺伝子工学処理細胞を含むことになろう 。このような方法では、望ましいＤＮＡ（ＲＮＡ）を含むベクター粒子は患者の 細胞への生体内受け渡しで患者に投与される。 従ってこの発明の目的は、例えばレトロウイルスベクター粒子などのようなベ クター粒子を導入し、ここでベクター粒子がヒト血清による不活性化に対し耐性 となるように遺伝子治療を提供することである。 この発明の一局面に従って、ヒト血清による不活性化に耐性であるベクター粒 子が提供される。望ましくはベクター粒子はウイルスベクター粒子であり、より 望ましくはウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子である。 レトロウイルスの包膜部はｐ１５Ｅとして知られるタンパク質を含み、出願人 は、レトロウィルスのｐ１５Ｅタンパク質部の血清に存在する補体タンパク質の 作用の結果として、レトロウイルスがヒト血清による不活性化を受け易いことを 発見した。更に出願人はこのようなレトロウィルスがそのｐ１５Ｅタンパク質に 突然変異を起こすことでヒト血清による不活性化に耐性にさせ得ることを発見し た。 一つの実施例において、（後記配列リストで示される）ｐ１５Ｅタンパク質を コード化するＤＮＡの一部がベクター粒子にヒト血清による不活性化に耐性にな るように突然変異を起 こしているレトロウィルスベクターが提供される。ここで使用される「突然変異 を起こす」および「突然変異」という用語は、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化す る遺伝子が、ｐ１５Ｅタンパク質の全部ではなくて少なくとも１個のタンパク質 が変化するような形で変化したことを意味する（このような変化は点突然変異、 欠失変異およびもしくは挿入変異を含むことができる）。 ｐ１５Ｅタンパク質は１９６個のアミノ酸残基を持つウイルスタンパク質であ る。ウイルスにおいては、しばしば１９６個すべてのアミノ酸残基が存在し、時 には（「ｒ」ペプチドとして知られる１８１から１９６までのアミノ酸残基が存 在せず、生成したタンパク質はｐ１２Ｅとして知られるｐ１５Ｅの「成熟」形態 である。かくしてウィルスはｐ１５Ｅおよびｐ１２Ｅタンパク質の両方を含むこ とが出来る。ｐ１５Ｅタンパク質は、１から１３４までのアミノ酸残基がウイル スの外側に存在するように、ウイルス膜につながれる。この発明は以下に述べる 推論のいずれにも限定されないが、補体タンパク質がこの領域に結合し、そのよ うな結合がレトロウイルスの不活性化およびもしくは溶解に導くことを出願人は 確信する。とりわけｐ１５Ｅタンパク質は２個の領域、３９から６１までのアミ ノ酸残基（以下領域１として引用される）、および１０１から１２３までのアミ ノ酸残基（以下領域２として引用される）を含み、これらはｐ１５Ｅタンパク質 の３次元構造に外部立地を持つものと出願人は考える。すなわちこのような領域 は直接ヒト血清にさらされる。領域２は、たとえこの領域のアミノ酸配 列がすべてのレトロウィルス内で同一でなくても、多くのレトロウイルス内で高 度に保護された領域である。このような領域は補体結合領域である。補体結合領 域に結合する補体タンパク質の例は、領域１および２に結合するＣ１ＳおよびＣ １Ｑである。 レトロウイルスを不活性化するために、補体タンパク質は領域１および領域２ の両方に結合する。かくして、望ましい実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質の 補体結合領域をコード化するＤＮＡの少なくとも一部が突然変異した。このよう な突然変異は、ｐ１５Ｅタンパク質の補体結合領域の少なくとも１個のアミノ酸 残基の変化に帰着する。ｐ１５Ｅタンパク質の補体結合領域の少なくとも１個の アミノ酸残基における変化は、補体タンパク質が補体結合領域に結合することを 妨げ、その結果レトロウイルスの補体不活性化を妨げる。１実施例において、ｐ １５Ｅのタンパク質の補体結合領域両方における少なくとも１個のアミノ酸残基 が変化し、またも一つの実施例において、補体結合領域の一つにおいて少なくと も１個のアミノ酸残基が変化する。 とはいっても、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化する全ＤＮＡ配列は、そのよう な変化がベクターに生体内使用には不適切にならしめるために突然変異できない ということは理解されねばならない。 １実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも一 部は、少なくとも１個の正に電荷されたアミノ酸残基あるいは負に電荷されたア ミノ酸残基が反対の電 荷を持つアミノ酸残基に変化するように突然変異する。 正に電荷されたアミノ酸はＨｉｓ，ＬｙｓおよびＡｒｇである。 負に電荷されたアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕである。 も一つの実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なく とも一部は、少なくとも１個の正に電荷されたアミノ酸あるいは負に電荷された アミノ酸が電荷を持たないアミノ酸に変化するように突然変異する。 １実施例において、突然変異するｐ１５Ｅタンパク質の補体結合領域をコード 化するＤＮＡの少なくとも一部は、ｐ１５Ｅタンパク質の１０１から１２３まで のアミノ酸残基の１個もしくはそれ以上の残基をコード化する。１実施例におい て、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも一部は１２２アミノ 酸残基が変化するように突然変異する。 １実施例においては、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも 一部は、１１７から１２２までのアミノ酸残基の少なくとも１個が変化するよう に突然変異する。望ましくは、１１７アミノ酸残基がＡｒｇからＧｌｕに変化し 、また１２２アミノ酸残基がＧｌｕからＧｌｎに変化する。 も一つの実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質の少なくとも一部は、アミノ酸 残基１０４，１０５，１０９および１１１が変化するように突然変異する。望ま しは、１０４アミノ酸残基はＡｒｇからＨｉｓに変化し、１０５アミノ酸残基は ＡｓｐからＡｓｎに変化し、１０９アミノ酸残基はＬｙｓからＧｌｎに変化し、 また、１１１アミノ酸残基はＡｒｇからＧｌｎに変化 する。 も一つの実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの少なく とも一部は、アミノ酸残基１０４，１０５，１０９，１１１，１１７および１２ ２が変化するように突然変異する。望ましくは、１０４アミノ酸残基はＡｒｇか らＨｉｓに変化し、１０５アミノ酸残基はＡｓｐからＡｓｎに変化し、１０９ア ミノ酸残基はＬｙｓからＧｌｎに変化し、１１１アミノ酸残基はＡｒｇからＧｌ ｎに変化し、１１７アミノ酸残基はＡｒｇからＧｌｕに変化し、また１２２アミ ノ酸残基はＧｌｕからＧｌｎに変化するようにＤＮＡの少なくとも一部が突然変 異する。 更にも一つの実施例においては、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡの 突然変異は、ｐ１５Ｅ遺伝子の一部を欠失させ、そのｐ１５Ｅ遺伝子の欠失部分 を他のウイルスタンパク質をコード化する遺伝子の断片あるいは部分で置換され ることにより実行される。１実施例において、ｐ１５Ｅタンパク質をコード化す るＤＮＡの一部は、ｐ２１タンパク質をコード化する遺伝子の断片で置換される が、後者はＨＴＬＶ−Ｉ貫膜タンパク質である。ＨＴＬＶ−Ｉウイルスは補体タ ンパク質による結合に耐性であることが発見されており、かくしてＨＴＬＶ−Ｉ はヒト血清による不活性化に耐性である（星野他「ネイチャー」３１０巻、３２ ４−３２５ページ（１９８４））。かくして１実施例において、一つのレトロウ イルスベクター粒子が提供され、ここではｐ１５Ｅタンパク質の一部が欠失され 、ｐ２１タンパク質の一部などのような他のウイルスタンパク質 の一部により置換されている。 添付配列リストで示されるｐ２１タンパク質は１７６個のアミノ酸残基を持つ タンパク質であり、これはｐ１５Ｅに関して著しいアミノ酸配列相同性を持つ。 １実施例において、少なくとも３９から６１までおよび１０１から１２３までの アミノ酸残基はｐ１５Ｅタンパク質から欠失され、ｐ２１タンパク質の３４から ５６までおよび９６から１１８までのアミノ酸残基で置換される。１実施例にお いては、少なくともｐ１５Ｅタンパク質の３９から１２３までのアミノ酸残基が 欠失され、ｐ２１タンパク質の３４から１１８までのアミノ酸残基で置換される 。 も一つの実施においては、ｐ１５Ｅタンパク質の３９から６９までのアミノ酸 残基が欠失され、ｐ２１タンパク質の３４から６４までのアミノ酸残基で置換さ れ、またｐ１５Ｅタンパク質の９６から１２３までのアミノ酸残基は欠失されて ｐ２１タンパク質の９１から１１８までのアミノ残基で置換される。 このように生成され、ヒト血清による不活性化に耐性であるベクター粒子は、 それが患者に導入された時に標的細胞あるいは組織に直接移動するように工学処 理される。かくして望ましい実施例において、例えば必ずしもそれに限定されな いが、両種性細胞受容体のようなヒト標的細胞の受容体に結合する受容体結合領 域を含有するタンパク質をもベクター粒子は含む。 前記記載のレトロウイルスベクターは、当業者にとって既知 の遺伝子工学手法により構築することができる。 １実施例において、ベンダー他「ウイルス学ジャーナル」６１巻、１６３９− １６４９ページ（１９８７）、およびミラー他「バイオテクニク」７巻、９８０ −９９０ページ（１９８９）で記述されているように、レトロウイルスベクター はＬＮシリーズのベクターであることができる。 も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、多重制限酵素部位、あ るいは多重クローニング部位を含む。この多重クローニング部位は、少なくとも ４個のクローニング、もしくは制限酵素部位を含み、ここでは少なくとも２個の 部位が１０，０００塩基対に１度以下の真核遺伝子の平均出現頻度を持つ。すな わち制限生成物は少なくとも１０，０００個の塩基対の平均サイズを持つ。 一般に、またこれから「希有」部位としてしばしば引用され、また１０，００ ０個の塩基対に１度以下の真核遺伝子の平均出現頻度を持つこのような制限部位 は、その制限配列内にＣＧダブレットを含有し、このダブレットは特に哺乳動物 ゲノムには殆ど現れない。哺乳動物における制限酵素部位のも一つの希少度ある いは希有の度合は、ＳＶ４０などような哺乳動物ウイルスにおいて表される。一 般に認識部位がＳＶ４０に存在しない酵素は、「希有」哺乳動物カッタである候 補になることが出来る。 １０，０００個の塩基対で１個以下の真核遺伝子の平均出現頻度を持つ制限酵 素部位の例は、必ずしもそれに限定されないが、ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，Ｓａｌ Ｉ，ＸｈｏＩ，ＣｌａＩ， ＳａｃＩ，ＥａｇＩおよびＳｍａＩ部位である。望ましいクローニング部位はＮ ｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩおよびＸｈｏＩよりなるグループから選択される 。 望ましくは、多重クローニング部位は約７０塩基対以下の長さであり、望まし くは約６０塩基対以下である。一般に、多重制限酵素部位、あるいは多重クロー ニング部位は、レトロウイルスベクターの５′ＬＴＲ（長末端反復）および３′ ＬＴＲの間に位置する。多重クローニング部位の５′末端は、５′ＬＴＲの３′ 末端から約８９５塩基対以下であり、望ましくは５′ＬＴＲの３′末端から少な くとも約３７５塩基対である。多重クローニング部位の３′末端は３′ＬＴＲの ５′末端から約４０塩基対以下であり、また望ましくは３′ＬＴＲの５′末端か ら少なくとも１１塩基対である。 生成するレトロウイルスベクターが少なくとも４個のクローニング部位を含み 、ここで少なくとも２個のクローニング部位がＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩ およびＸｈｏＩクローニング部位よりなるグループから選択されるような既知の 技術で知られる遺伝工学手法を通じてこのようなベクターは既存のレトロウイル スベクターから工学的に処理される。望ましい実施例において、レトロウイルス ベクターはＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を 含む。 このレトロウイルスベクターは、遺伝子を真核細胞に転移させるクローニング システムの一部として役立つ。かくして前記記載の型の多重クローニング部位を 含むレトロウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターにある遺伝子操作の ための クローニングシステム、およびレトロウイルスベクターに位置するＮｏｔＩ，Ｓ ｎａＢＩ，ＳａｌＩおよびＸｈｏＩよりなるグループから選択される少なくとも ２個のクローニング部位で和合性のある少なくとも２個のクローニング部位を含 むシャトルクローニングベクターが提供される。シャトルクローニングベクター は、更に前記シャトルクローニングベクターから前記レトロウイルスベクターへ 転移することの出来る少なくとも１個の望ましい遺伝子を含む。 シャトルクローニングベクターは、クローニングあるいは制限酵素認識部位を 含む１個もしくは２個以上のリンカーに連結される塩基性「バックボーン」ベク ターあるいは断片から構築することが出来る。前記記載の和合性あるいは補体ク ローニング部位は、クローニング部位に含まれる。シャトルベクターの制限部位 に対応する末端を有する遺伝子およびもしくはプロモーターは、既知の手法を通 してシャトルベクターに連結される。 シャトルクローニング部位は、原核システムにあるＤＮＡ配列を増幅するのに 使用することが出来る。シャトルクローニングベクターは、一般に原核システム 、とりわけ細胞内で使用されるプラスミドから調製される。かくして、例えばシ ャトルクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８等などのようなプラ スミドから誘導される。 ヒト血清による不活性化にベクター粒子が耐性を持つように突然変異されたｐ １５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡは、レトロウイルスベクター以外の発現 ベクターに含有される ということがこの発明の範囲内にあることも考察されるべきである。この発現ベ クターは、例えばレトロウイルスベクター以外のウイルスベクターあるいは突然 変異ｐ１５Ｅタンパク質を含むベクター粒子を生産することが出来る細胞系に転 移することが出来るいずれかの発現プラスミドを含む。 前記記載の突然変異ｐ１５Ｅタンパク質などのような突然変異ｅｎｖタンパク 質をコード化するＤＮＡを含むベクターあるいは発現ベクターは、ベクター粒子 を生成するためのプレパッケージング細胞系に転移する。一般に、プレパッケー ジング細胞系は、ウイルスのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質、および構造ｇａｇ ，ｐｏｌ，ｅｎｖタンパク質を欠除するレトロウイルスベクターを含有する。こ のようなプレパッケージング細胞系の１例は、ＭｏＭｕＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌタ ンパク質の発現プラスミドおよびＬＮＬ６レトロウイルスベクターを含むＮＩＨ ３Ｔ３ マウス繊維芽細胞細胞系よりなるＧＰＬプレパッケージング細胞系で ある（ミラー他「バイオテクニク」７巻、９８０−９９０ページ（１９８９）） 。しかしこの発明の範囲はいずれの特定のプレパッケージング細胞系に限定され るものではない。 突然変異ｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡを含有する発現ベクターでプ レパッケージング細胞系を形質移入する際に、プレパッケージング細胞系はベク ター粒子を生成する。ベクター粒子は次いで補体耐性をテストされる。補体耐性 を示す（すなわちヒト血清により不活性化しない）ベクター粒子は、従って特定 の包膜（エンベロープ）発現ベクターによりコード 化される補体耐性包膜タンパク質を含有する。このような発現ベクターは当業者 にとって既知の技術により、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコ ード化する発現ベクター、および突然変異ｅｎｖタンパク質をコード化する遺伝 子を含有する発現ベクター（例えば前記記載のような突然変異ｐ１５Ｅタンパク 質を含有する発現ベクターあるいは発現プラスミドなど）を含むパッケージング 細胞系を次いで生産することが出来、ここでこのパッケージング細胞系はヒト血 清による不活性化に耐性のあるベクター粒子を生成するために使用することが出 来る。とりわけ構造ｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を欠いているが対象と なる望ましい遺伝子を含むレトロウイルスベクターは、このようなパッケージン グ細胞系に転移することが出来る。かくしてパッケージング細胞系は対象となる 望ましい遺伝子を含み、ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子を生 成することが出来る。 パッケージング細胞系から生成されたベクター粒子は、ヒト細胞と接触した時 には不活性化されない。また加えてヒト受容体の受容体結合領域を含むタンパク 質で工学的処理を行われた時には、このベクター粒子は標的化され、これにより 、ヒト受容体の受容体結合領域はベクター粒子を標的細胞に結合することを可能 にする。かくして、このレトロウイルスベクター粒子は、（例えば静脈内、筋肉 内、あるいは皮下注射、鼻腔内、口腔内、直腸内、あるいは腟内で）、身体に直 接導入され望ましい標的細胞に移動する。従ってこのようなベクター粒子は、遺 伝子治療方法として生体内での標的細胞に望ましい非相同遺伝 子を導入するのに役立つ。 かくして、望ましくは、この発明のベクターは、更に少なくとも一つの非相同 遺伝子を含む。ベクターあるいはベクター粒子内に位置する非相同あるいは外部 遺伝子は必ずしもそれに限定されないが、サイトカイン、あるいはリンパ球の生 長因子であるリンフォカインのような細胞生長因子をコード化する遺伝子である 。外部遺伝子の他の例は必ずしもそれに限定されないが、因子VIII（抗血友病性 因子）、因子IX（クリスマス因子）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ’ｓ），ＡＤＡ，Ａ ｐｏＥ，ＡｐｏＣおよびＣタンパク質（因子XIV）である。 この発明のベクターは１個もしくは２個以上のプロモーターを含む。使用され る適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ ，ＳＶ４０プロモーター、ミラー他「バイオテクニク」７巻、９号，９８０−９ ９０ページ（１９８９）に記述されるヒトサイトメガロウイル（ＣＭＶ）プロモ ーター、あるいはその他のプロモーター（例えば、必ずしもそれに限定されない が、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ，およびβアクチンプロモーターなどを含む真核 細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）である。使用される他のウイルスプ ロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター、 ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターである。適切なプ ロモーターの選択はここに含まれる内容から当業者にとって明らかであろう。 この発明のベクターは、必要とあれば、望ましい非相同遺伝 子の組織に特異的な発現を行うため、およびもしくは細胞あるいは代謝シグナル に応答する非相同遺伝子の発現を調節するために、調節要素を含むことができる 。 この発明はレトロウイルスベクターとの関連で記述されてきたが、（例えばア デノウイルスおよびアデノ関連性ウイルス粒子などの）他のウイルス粒子、ある いは合成粒子は、ベクター粒子がヒト血清による不活性化に耐性となり、これに よりベクター粒子が生体内投与に適切なベクター粒子になるようにベクター粒子 にある包膜タンパク質の１領域が突然変異するよう構築される。 この発明はここで下記の実施例に関連して記述される。しかしこの発明の範囲 はそれにより限定されるものではない。 実施例． 生成するプラスミドｐＣＥ２が包膜タンパク質ｇｐ７０およびｐ１５Ｅをコー ド化する遺伝子を含むように、プラスミドｐＣＥ２はｐＢＲ３２２から構築され た。ｐＢＲ３２２（図１）はＥｃｏＲＩでカットされ、ＥｃｏＲＩ部位を破壊し てｐＢＲ３２２ ＲＩにするように充填された。ｐＢＲ３２２ ＲＩは次いでＮ ｄｅＩでカットされ、ＮｄｅＩ部位を破壊してｐＢＲ３２２ Ｒ Ｎにするよう に充填された。ｐＢＲ３２２ Ｒ ＮはＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化 され、またＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ断片内にクローンされたのは、プラスミ ドｐＣＥＥ（図３）からのＳＶ４０（図２）からのｐｏｌｙＡ（アデニン）尾部 とともにサイトメガロウイ ルス（ＣＭＶ）中間体初期プロモーターの制御の下でｇｐ７０およびｐ１５Ｅの 遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＦｓｐＩカセットであった。プラスミドｐＣＥＥ から得られたＨｉｎｄＩＩＩ／ＦｓｐＩカセットはＣＭＶ中環体初期プロモータ ーを含み、ここでＢａｌＩ／ＳａｃＩＩ（２１塩基対から７６６塩基対）はリン カー付加によりＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片に変換された。エコトロピック包 膜ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ断片（ｇｐ７０およびｐ１５Ｅをコード化するＭｏＭｕ ＬＶの５４０８塩基対から７８４７塩基対）は充填され、ＥｃｏＲＩリンカーが 付加された。またＢｃｌＩからＢａｍＨＩまでのＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａシグナ ル（２７７０塩基対から２５３３塩基対）はＢａｍＨＩ部位にクローンされた（ 従ってＢｃｌＩ部位を破壊した）。ＢｇｌＩＩ部位はｇｐ７０遺伝子の３′末端 に付加された（この付加はいずれのアミノ産も変化させない）。生成するプラス ミドはｐＣＥ２（図４）である。 ｐ１５Ｅ遺伝子に突然変異を創出するために、ｐＵＣ−Ｅ２と呼ばれる異なっ たプラスミド（図６）内でサブクローニングが実施された。このプラスミドはＰ ｖｕＩＩ断片が除去されＥｃｏＲＩリンカーで置換されたｐＵＣ１８（図５）で ある。これは３２２塩基対ＰｖｕＩＩ断片を除去するためにＰｖｕＩＩでｐＵＣ １８を消化することで実行され、次いでＥｃｏＲＩが付加された。ＥｃｏＲＩ部 位内にＢｇｌＩＩ部位（５４０８）からＮｈｅＩ部位（７８４７）までＭｏＭｕ ＬＶエコトロピック包膜遺伝子（すなわちｐＣＥ２からの ｇｐ７０およびｐ１５Ｅの遺伝子）がクローンされ、これは平滑化され、またＥ ｃｏＲＩリンカーが付加された。生成したｐＵＣ−Ｅ２プラスミド（図６）は、 従って、ｐ１５Ｅ遺伝子内および周辺にユニークＢｇｌＩＩ，ＳｅｐＩ，Ｃｌａ ＩおよびＰｖｕＩＩ部位を持つことになる。 ＰＣＲプラスマーは次いで（ｐＣＥ２を鋳型として使用して）ｐ１５Ｅタンパ ク質内に下記の突然変異をコード化するように合成された。 １．アミノ酸残基１１７はＡｒｇからＧｌｕに変化され、またアミノ酸残基１ ２２はＧｌｕからＧｌｎに変化される。 ２．アミノ酸残基１０４はＡｒｇからＨｉｓに変化され、アミノ酸残基１０５ はＡｓｐからＡｓｎに変化され、アミノ酸残基１０９はＬｙｓからＧｌｎに変化 され、またアミノ酸残基１１１はＡｒｇからＧｌｎに変化される。また、 ３．アミノ酸残基１０４はＡｒｇからＨｉｓに変化され、アミノ酸残基１０５ はＡｓｐからＡｓｎに変化され、アミノ酸残基１０９はＬｙｓからＧｌｎに変化 され、アミノ酸残基１１１はＡｒｇからＧｌｎに変化され、アミノ酸残基１１７ はＡｒｇからＧｌｕに変化され、またアミノ酸残基１２２はＧｌｕからＧｌｎに 変化される。 各ＰＣＲ製品はＳｐｅＩおよびＰｖｕＩＩで消化され、またユニークＳｐｅＩ およびＰｖｕＩＩ部位でｐＵＣ−Ｅ２にクローンされる。生成するプラスミドは 次いで点突然変異を形成するため配列される。 これらの突然変異を持つＤＮＡ断片は次いで発現プラスミド ｐＣＥ２にサブクローンされる。ｐＣＥ２はＥｃｏＲＩで消化され、包膜ＤＮＡ 断片は除去されｐＵＣ−Ｅ２プラスミドからのＥｃｏＲＩ包膜断片で置換される 。生成するｐＣＥ２プラスミドは次いでＥｃｏＲＩ断片の配向を検査され、新し く創出された突然変異ｐ１５Ｅ遺伝子の存在を確認するために（クローニング部 位結合部および点突然変異を維持する領域においてのみ）再配列される。生成す る発現ベクターは次のように識別される。 ｐＣＲ６８−アミノ酸残基１１７がＡｒｇからＧｌｕに変化し、アミノ酸 残基１２２がＧｌｕからＧｌｎに変化する突然変異を含む。 ｐＣＲ６９−アミノ酸残基１０４がＡｒｇからＨｉｓに変化しアミノ酸残 基１０５がＡｓｐからＡｓｎに変化し、アミノ酸残基１０９がＬｙｓからＧｌｎ に変化し、またアミノ酸残基１１１がＡｒｇからＧｌｎに変化する突然変異を含 む。また、 ｐＣＲ７０−アミノ酸残基１０４がＡｒｇからＨｉｓに変化し、アミノ酸 残基１０５がＡｓｐからＡｓｎに変化し、アミノ酸残基１０９がＬｙｓからＧｌ ｎに変化し、アミノ酸残基１１１がＡｒｇからＧｌｎに変化し、アミノ酸残基１ １７がＡｒｇからＧｌｕに変化し、またアミノ酸残基１２２がＧｌｕからＧｌｎ に変化する突然変異を含む。 プラスミドｐＣＲ６８，ｐＣＲ６９、およびｐＣＲ７０はＧＰＬプレパッケー ジング細胞系に個別に形質移入される。 ＧＰＬプレパッケージング細胞系は、ＭｏＭｕＬＶｇａｇ−ｐｏｌタンパク質の ための発現プラスミドおよびレトロウイルスベクターＬＮＬ６を含むＮＩＨ ３ Ｔ３マウス繊維芽細胞系よりなる（ミラー他、１９８９）。ｐＣＲ６８，ｐＣＲ ６９、あるいはｐＣＲ７０の形質移入によって、ＧＰＬパッケージング細胞系は ベクター粒子を生産する。 過渡的に発現されたベクター粒子は、形質移入後４８−７２時間後に細胞上澄 み液と共に収集される。 前記記載の創出されたベクター粒子は、次いで、当業者にとって既知の手法に よりベクター力価が検定される。ベクター粒子はまた、このベクター粒子を検定 あるは治療法方法に使用するために、当業者に既知の方法に従って必要とあれば ウイルス上澄み液として収集され濃縮される。 この発明の利点は、ヒト患者に直接ベクター粒子を導入し、これによりベクタ ー粒子は、そのような導入に際しヒト血清に溶解せずまた不活性化されない能力 を含む。かくしてこの発明のベクター粒子は望ましい遺伝子を生体患者に受渡す ことを可能にする。このようなベクター粒子はそれらが「標的化」されまた注射 可能に工学処理され、ベクター粒子がヒト血清による溶解あるは不活性化される ことなく標的細胞あるいは組織に直接移動することを可能にする。 しかし、この発明の範囲は前記の特異な実施例に限定されないことは理解され ねばならない。この発明は特に記述されたもの以外にも適用することか出来、し かもそれは後述する請求の範囲内にある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一つのベクター粒子であって、前記ベクター粒子はヒト血清による不活性 化に耐性のあるベクター粒子。 ２．請求の範囲第１項記載のベクター粒子であって、ここで前記ベクター粒子 はｐ１５Ｅタンパク質を含み、またここでｐ１５Ｅタンパク質の全部ではなくて 一部がベクター粒子にヒト血清による不活性化に耐性を与えるように突然変異し ているベクター粒子。 ３．請求の範囲第２項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパク 質の少くとも１個のアミノ酸が変化するようにｐ１５Ｅタンパク質の一部が突然 変異しているベクター粒子。 ４．請求の範囲第３項記載のベクター粒子であって、ｐ１５Ｅタンパク質の補 体結合領域の少なくとも一部が突然変異しているベクター粒子。 ５．請求の範囲第４項記載のベクター粒子であって、ここで前記補体結合領域 がｐ１５Ｅタンパク質の３９から６１までおよび１０１から１２３までのアミノ 酸残基よりなるグループから選択されるベクター粒子。 ６．請求の範囲第６項記載のベクター粒子であって、ここで前記補体結合領域 がｐ１５Ｅタンパク質の１０１から１２３までのアミノ酸残基であるベクター粒 子。 ７．請求の範囲第６項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパク 質のアミノ酸残基１２２が変化するように突然変異されるベクター粒子。 ８．請求の範囲第６項記載のベクター粒子であって、ここでアミノ酸残基１１ ７および１２２が変化するようにｐ１５Ｅタンパク質が突然変異されるベクター 粒子。 ９．請求の範囲第８項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパク 質が突然変異されて、アミノ酸残基１１７がＡｒｇからＧｌｕに変化し、またア ミノ酸残基１２２がＧｌｕからＧｌｎに変化するベクター粒子。 １０．請求の範囲第６項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパ ク質が突然変異されて、アミノ酸残基１０４，１０５，１０９，および１１１が 変化するベクター粒子。 １１．請求の範囲第１０項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタン パク質が突然変異されて、アミノ酸残基１０４がＡｒｇからＨｉｓに変化し、ア ミノ酸残基１０５がＡｓｐからＡｓｎに変化し、アミノ酸残基１０９がＬｙｓか らＧｌｎに変化し、またアミノ酸残基１１１がＡｒｇからＧｌｎに変化するベク ター粒子。 １２．請求の範囲第６項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパ ク質が突然変異されて、アミノ酸残基１０４，１０５，１０９，１１１，１１７ および１２２が変化するベクター粒子。 １３．請求の範囲第１２項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタン パク質が突然変異されて、アミノ酸残基１０４がＡｒｇからＨｉｓに変化し、ア ミノ酸残基１０５がＡｓｐからＡｓｎに変化し、アミノ酸残基１０９がＬｙｓか ら Ｇｌｎに変化し、アミノ酸残基１１１がＡｒｇからＧｌｎに変化し、アミノ酸残 基１１７がＡｒｇからＧｌｕに変化し、またアミノ残基１２２がＧｌｕからＧｌ ｎに変化するベクター粒子。 １４．請求の範囲第５項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパ ク質が突然変異されて、少なくとも１個の正もしくは負に電荷されたアミノ酸が 反対の電荷を持つアミノ酸に変化するベクター粒子。 １５．請求の範囲第５項記載のベクター粒子であって、ここでｐ１５Ｅタンパ ク質が突然変異されて、少なくとも１個の正もしくは負に電荷されたアミノ酸が 非電荷アミノ酸に変化するベクター粒子。 １６．請求の範囲第１項記載のベクター粒子であって、ここで前記ベクター粒 子は更にヒト標的細胞の受容体に結合する受容体結合領域を含有するタンパク質 を含むベクター粒子。 １７．請求の範囲第１６項記載のベクター粒子であって、更に非相同遺伝子を 含むベクター粒子。 １８．請求の範囲第１７項記載のベクター粒子で形質転換された真核細胞。 １９．ｐ１５Ｅタンパク質をコード化するＤＮＡを含む一つの発現ベクターで あって、ここでｐ１５Ｅタンパク質をコード化する前記ＤＮＡは突然変異されて 、前記ＤＮＡによるコード化される前記突然変異ｐ１５Ｅタンパク質が１個のベ クター粒子に含まれる時には、前記ベクター粒子がヒト血清による不活性化に耐 性のあるようになる発現ベクター。 ２０．請求の範囲第１９項記載の発現ベクターを含む一つのパッケージング細 胞系。 ２１．一つのウイルスベクター粒子であって、前記ウイルスベクター粒子がヒ ト血清による不活性化に耐性のあるウイルスベクター粒子。