JPH09508018A

JPH09508018A - Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害するための方法および試薬

Info

Publication number: JPH09508018A
Application number: JP7519142A
Authority: JP
Inventors: ドレイパー，ケネス・ジー
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 1997-08-19
Also published as: MX9602770A; US6132966A; WO1995019429A3; WO1995019429A2; US5869253A; CA2180740A1; AU1566595A; EP0737247A1; US5610054A

Abstract

(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡを特異的に切断する酵素的ＲＮＡ分子。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害するための方法および試薬発明の背景本出願は、ドレーパー（Draper）の、”Method and Reagent for Inhibiting Hepatitis C Virus Replication”と題する、１９９２年５月１４日に出願された米国特許出願第０７／８８２，８８８号の一部継続出願である。この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製および遺伝子発現の阻害剤として有用な試薬に関する。以下は、関連する技術の議論である。これらのいずれも、本発明に対する従来技術であると認めるものではない。Ｃ型肝炎ウイルス群は非Ａ非Ｂ型肝炎の大部分の症例に関与する。非Ａ非Ｂ型肝炎は多数の異なるウイルスにより引き起こされるが、主因はＨＣＶである。感染は輸血（血友病患者の２５−５０％は慢性肝炎を伴う）、違法薬物の使用による皮下注射（すべての薬物使用者の２５−５０％は非Ａ非Ｂ型肝炎を伴う）、腎臓器官の移植（この場合、後期死亡率の大部分は非Ａ非Ｂ型肝炎による）、および母体−新生児転移により伝搬する。肝炎の散在性出現のうち最高２０％はＨＣＶにより引き起こされる。輸血後肝炎におけるＣ型肝炎ウイルスの関与（症例の＞９５％）および、このウイルスによる感染がＢ型肝炎ウイルスによる感染よりも、肝細胞カルシノーマおよび肝硬変の発生に強く関連しているという後の知見により、ウイルス遺伝子の分子生物学は熱心に研究されてきている。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、正鎖のエンベロープを有するウイルスであり、進化的にはフラビウイルスおよびペスチウイルスと関連している。ＨＣＶゲノムは、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、９０３０と９０９９ヌクレオチドの間のロングオープンリーディングフレーム、および３’−ＵＴＲからなる。ゲノムの３’末端は、タイプＩ株ではポリ（Ａ）の短いストレッチを含むことが報告されているが、タイプII、IIIまたはIV株ではこれは確認されていない。５’− ＵＴＲ中の配列は、ウイルス遺伝子の発現に負の翻訳制御を示すが、ＨＣＶ遺伝子発現の主要な制御はポリ蛋白質の蛋白質分解性開裂から生ずることが報告されている。ポリ蛋白質の種々の蛋白質分解性開裂は、翻訳後の複製関連ウイルス蛋白質の効率的な発現に必須である。生じるレプリカーゼ蛋白質は、３’−ＵＴＲ中の、ウイルスゲノム複製の開始のための構造的なきっかけとして機能する２７から４５ヌクレオチドの間の領域と相互作用する。ＨＣＶのポリ蛋白質の開裂は、細胞性プロテアーゼおよびウイルスにコードされるプロテアーゼの両方を使用し、少なくとも９つの蛋白質を生成する。１０番目のウイルス蛋白質（第２のプロテアーゼ）は、ポリ蛋白質の別の開裂により生じることが報告されているが、確認されていない。ウイルスにコードされる確認されている蛋白質は、構造蛋白質と非構造蛋白質とに分類することができる。ウイルスの構造蛋白質は、Ｃ蛋白質（２２ｋＤ）、Ｅ糖蛋白質（３５ｋＤ）およびＥ２／ＮＳ１糖蛋白質（５８ｋＤ）である。非構造蛋白質には、ＮＳ２（５３ｋＤ）、ＮＳ３（７０ｋＤ）、ＮＳ４ａ（８ｋＤ）、ＮＳ４ｂ（２７ｋＤ）、ＮＳ５ａ（５８ｋＤ）およびＮＳ５ｂ（６８ｋＤ）が含まれる。Ｃ蛋白質は、疎水的蛋白質であり、ウイルス粒子のコア構造成分を構成し、ウイルス粒子を細胞膜に局在化させる役割を果たしているであろう。コア蛋白質が遺伝子発現のトランスアクチベータとして機能するであろうという、過渡的アッセイからの証拠もある。この蛋白質は、ウイルス複製に必須であり、既知のタイプのＨＣＶの間でヌクレオチドのレベルでのホモロジーにおいて高度に保存されているようである。エンベロープ蛋白質は、ウイルス複製に必須であるが、そのヌクレオチド（およびアミノ酸）配列は、ＨＣＶのタイプにより著しく相違する。ＮＳ３蛋白質は、主要なウイルスプロテアーゼとして機能し、この蛋白質中の突然変異は、ポリ蛋白質のプロセシングの阻害によるウイルス複製の不活性化をもたらす。ＮＳ３領域のヌクレオチド配列は、ウイルス単離物の間で高度に保存されている。ＨＣＶＲＮＡレプリカーゼにより示される不正確さのレベルは、同一の患者から得たＨＣＶ標本のゲノム中におけるヌクレオチド置換の継続的な出現を評価することにより間接的に定量化されている。これらの研究は、ヌクレオチドの相違は最小であることを示唆するが、実際には回復した標本が患者での増殖によりあらかじめ選択されるため、これはレプリカーゼの実際の不正確さの過小評価であろう。許容できない置換は、ウイルスの成長の間に消失したであろう。肝炎におけるＨＣＶの複製は、他の肝炎ウイルスの複製と一体に絡み合っている。デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）はＨＣＶと全く異なっているが、これら２ウイルスの生活環は相互依存性である。普通はＨＤＶは、キャプシド蛋白質その他の感染性ＨＤＶ粒子の組み立てに必要な機能を供給するために、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製に依存する。ＨＣＶは同時感染した細胞においてＨＢＶおよびＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の増殖を阻害するので、ＨＣＶの複製はＨＤＶの成熟をも阻害する可能性がある。ＨＣＶ感染の治療のための遺伝子ベクターとしてＨＤＶを使用することは、この干渉により影響されないであろう。ＨＤＶゲノムの遺伝子発現はＨＣＶにより明らかに阻害されないからである。発明の概要本発明は、新規な酵素的ＲＮＡ分子、すなわちリボザイム、およびそれらをＨＣＶの複製の阻害に用いる方法を特徴とする。それらのリボザイムは、ヒトおよび他の動物（他の霊長類を含む）においてこれらの関連するウイルスにより引き起こされる疾病の治療法に用いることができる。リボザイムは、他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的な様式で反復開裂しうる、酵素的活性を有するＲＮＡ分子である。これらの酵素的ＲＮＡ分子は実質的にいかなるＲＮＡ転写産物をも標的とすることができ、ｉｎｖｉｔｒｏで効果的な開裂が達成されている。キム（Kim）ら，84 Proc.Natl.Acad.S ci.USA 8788,1987；ヘイゼロフおよびゲルラッハ（Haseloff,Gerlach）,334 Na ture 585,1988；セク(Cech),260 JAMA 3030,1988；ならびにジェフェリーズ（J efferies）ら，17 Nucleic Acids Research 1371,1989。リボザイムは、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は、標的ＲＮＡを開裂させる作用をするＲＮＡの酵素的部分に近接して保持された、リボザイムの標的ＲＮＡ結合部分により行われる。従ってリボザイムは、まず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的開裂により、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊する。リボザイムはそのＲＮＡ標的に結合して開裂させたのち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復的に結合して開裂させることができる。リボザイムの酵素的性質は他の手法、例えばアンチセンス法（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して、その翻訳を阻止するだけである）より有利である。療法処置を行うのに必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。すなわち１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を開裂しうる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の特異性は結合の塩基対合メカニズムのみでなく、その分子がそれの結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する。すなわち阻害はＲＮＡ標的の開裂により引き起こされ、従って特異性は非標的ＲＮＡの開裂速度に対する標的ＲＮＡの開裂速度の比率として定義される。この開裂メカニズムは、塩基対合に関与するもの以外の因子に依存する。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きいと考えられる。この一群の化学的開裂剤は感染細胞内のウイルスｍＲＮＡのみに対して高度の特異性を示す。高度に保存された配列領域を標的とするリボザイム分子により、単一化合物でヒトＨＣＶの多数の株を処置することができる。ＨＣＶのウイルス遺伝子の発現を特異的に攻撃する治療法は存在しない。現在の治療プロトコル（インターフェロンおよびリバビリン）は、ウイルスの複製ではなく疾病の症状を治療することからなる。現在の治療プロトコルを停止すると、続いて疾病の反動が起こる。その治療法はウイルスの潜在性またはウイルス複製に衝撃を与えるものではないからである。ウイルスＲＮＡの開裂は、ウイルスの複製および新たに感染した細胞における潜伏性の確立を低下させる新規な処置法を提供する。本発明方法を利用して、急性および慢性ウイルス感染ならびにＨＣＶ誘発性肝細胞トランスフォーメーションの双方を含めたヒトＣ型肝炎ウイルス感染を処置することができる。この有用性はこのような感染が獣医学的に重要であるヒト以外の動物に感染する他のＨＣＶ種にまで拡大することができる。さらにこの有用性は、ペスチウイルスおよびフラビウイルスのファミリーのメンバーにまで拡大することができる。処置は活性ウイルス感染の時点で行われ、感染細胞におけるウイルス負荷を低下させ、かつウイルス複製を不能にする。リボザイム処置はワクチン中で使用しうる欠損ゲノムを作成する手段としても利用しうる。したがって、第１の観点においては、本発明はＨＣＶＲＮＡを特異的に開裂する酵素的ＲＮＡ分子（またはリボザイム）を提供する。好ましい開裂部位はウイルスの複製、例えば蛋白質合成に必要な領域、例えばＨＣＶゲノムの５’側非翻訳領域内にある。この領域は、ピコルナウイルスのキャップ非依存性（ｃａｐｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）翻訳制御を連想させる様式でウイルス蛋白質の翻訳を制御すると考えられる。ＲＮＡのこの領域を破壊すると、欠損蛋白質の合成および不完全なＤＮＡ合成（および欠損ゲノムからの転写の阻害）が生じる。５’側非翻訳領域外の他の領域もＨＣＶ複製のリボザイム仲介による阻害の適切な標的となる。このような標的には、ウイルスの構造蛋白質Ｅ２／ＮＳ１をコードするｍＲＮＡのゲノム領域および非構造蛋白質、特にＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ２／ＮＳ３ハイブリッドプロテアーゼをコードする領域が含まれる。特定の標的領域の選択は、ゲノムの二次構造に依存するであろう。ウイルスが、ゲノムＲＮＡ中のランダム塩基変化によりリボザイム療法から逃れる可能性を回避するために、５’−ＵＴＲまたはＣおよびＮＳ３遺伝子中の多数の領域を標的とすることが予測される。多重標的化はまた、ウイルスが免疫監視から逃れるために点突然変異を用いる能力を最小限にするであろう。表面蛋白質におけるアミノ酸置換を伴うフェーズ変異（およびＨＣＶのゲノムにおける点突然変異の結果）が、ＨＣＶ感染に典型的なウイルスの耐久性の原因であることが提案されている。したがって、本発明において治療処置のために２つまたはそれ以上の異なるリボザイムを用いることができる。 “遺伝子”は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの蛋白質コード領域、または蛋白質合成もしくはそのｍＲＮＡの安定性を制御する、ＲＮＡ中のいずれかの制御領域を表すものとする。 “酵素的ＲＮＡ分子”とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有し、かつその標的内のＲＮＡを特異的に開裂する作用をする酵素的活性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡを分子間開裂し、これにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は、開裂を起こさせるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブリダイゼーションさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが、５０− ７５％程度の低い相補性も本発明に有用である。ＨＣＶに“均等な”ＲＮＡは、ヒトおよび他の霊長類を含めた種々の動物においてウイルスにより引き起こされる疾患に関連する天然に生ずるＲＮＡ分子を包含するものとする。これらのウイルスＲＮＡは互いに類似の構造および均等な遺伝子を有する。好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドのモチーフで形成されるが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連する）のモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例はロッシ（Rossi）ら（8 AIDS RE SEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES 183,1992）に記載され；ヘアピンモチーフの例はハンペル（Hampel）ら（RNA CATALYST FOR CLEAVING SPECIFIC RNA SEQUENCES （１９８９年９月２０日出願、１９８８年９月２０日出願の米国特許出願第０７／２４７，１００の一部継続出願）、ハンペルおよびトリツ（Hampel，Tritz），28 Biochemistry 4929，1989およびハンペル（Hampel）ら、18 Nucleic Acids Research 299，1990）に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例はペロッタおよびビーン（Perrotta,Been），31 Biochemistry 16,1992；ＲＮａｓｅＰモチーフの例はゲリエル−タケダ（Guerrier-Takeda）ら，35 Cell 849,1983；グループＩイントロンはセク（Cech）ら，米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。これらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的ＲＮＡ分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ開裂活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることは、当業者には認識されるであろう。特に好ましい態様においては、リボザイムにより切断されるＲＮＡは、ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲまたはＣ蛋白質もしくはＮＳ３オープンリーディングフレーム中にある。ＨＣＶゲノムのヌクレオチド番号は、標的領域の５’末端の輪郭を描くように与えられている。一次配列データは、タナカ（Tanaka）ら、23 Virus Res. 39，1992から取得した。比較のために、チョー（Choo）ら、88 Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 2451，1991のＨＣＶ配列データを用いた。本発明において有用なリボザイムを製造する方法は、ドレーパー（Draper）の ”Method and Reagent For Treatmemt of Arthritic Conditions”と題する米国特許出願（１９９３年１１月１２日出願、米国特許出願第０８／１５２，４８７号）に一般に記載されており、この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する。第２の関連する観点においては、本発明は上記の酵素的ＲＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞を特徴とする。好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞、または他の霊長類の細胞である。第３の関連する観点においては、本発明は、例えば哺乳動物細胞内でその酵素的ＲＮＡ分子の発現を可能にする様式でベクター内に位置する、上記の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含有する発現ベクターを特徴とする。第４の関連する観点においては、本発明は、ＨＣＶＲＮＡを上述の領域で開裂する酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与することによる、ＨＣＶにより引き起こされる疾患を治療する方法を特徴とする。本発明は、ＨＣＶタイプのウイルス感染細胞のウイルスＲＮＡに対して高度の特異性を示す、一群の化学的開裂剤を提供する。リボザイム分子は、好ましくはこのウイルスのすべてのタイプおよび株を単一のリボザイムで処置しうるように、ＨＣＶの高度に保存された配列領域を標的とする。これらの酵素的ＲＮＡ分子は、感染細胞に対し外的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフにおいては、分子が小型（４０ヌクレオチド未満、好ましくは３２−３６ヌクレオチドの長さ）であるため他のリボザイムモチーフと比較して治療の経費を低下させることができる。１００ヌクレオチドを越える長さのリボザイムの合成は自動化された方法によっては極めて困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。発現ベクターによるリボザイムの送達は、原則としてｅｘｖｉｖｏ処置のみによって可能である。これがこの方法の有用性を制限している。本発明においては、小型のリボザイムモチーフ（例えば一般的に図１に示すハンマーヘッド構造のもの）を外的送達に用いる。これらの分子の構造が簡単であることも、リボザイムがｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。従ってハンマーヘッド構造体がより長い転写産物に含有される状況と異なり、リボザイム構造体の適正な折りたたみまたはｍＲＮＡ標的領域へのリボザイムの相補的結合を妨害する非リボザイム−フランキング配列がない。本発明の酵素的ＲＮＡ分子は、ＨＣＶ感染症の治療に用いることができる。感染動物を増殖性感染の時期に治療することができる。この治療のタイミングは感染細胞におけるウイルス負荷を低下させ、かつ増殖性感染のその後のいずれかのラウンドにおけるウイルスの複製を不可能にする。これが可能なのは、好ましいリボザイムはウイルス蛋白質合成の開始が成功するのに必要な構造を不能にするからである。トランスフォームした肝細胞の処置に関しては、本発明の方法は細胞のトランスフォーメーションを引き起こすと考えられるウイルス遺伝子の発現を阻害することができる。本発明の好ましい標的は、従来の標的より有利である。これは感染に際してウイルス吸着または逆転写の時点で作用するだけではないからである。さらにそれらのリボザイムの存在下で感染の第１ラウンドの間に放出されるウイルス粒子は、それらのキャプシドが無傷であるため、なお免疫原性であろう。従って本発明の１方法によれば、欠損性ではあるが、免疫原性であるウイルス粒子を形成し、従って、処置された動物において免疫反応を開始する可能性を維持することができる。さらに本発明の酵素的ＲＮＡ分子は、ＨＣＶウイルスに感染した細胞培養物にｉｎｖｉｔｒｏで使用して、無傷のキャプシドおよび欠損ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子を産生することができる。次いでこれらの粒子を、予防的に免疫応答を誘因するために、または感染動物の治療に用いることができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載まず、図面を簡単に説明する。図面図１は、ハンマーヘッドモチーフのリボザイムを図示したものであり、ＨＣＶ −１標的領域と相互作用するステムＩ、IIおよびIII（それぞれ（Ｉ）、（II）および（III）と符号を付けてある）を示す。リボザイムおよび標的双方の５’ および３’末端を示す。ダッシュは塩基対合したヌクレオチドを示す。標的部位ＨＣＶのゲノムは、そのＲＮＡ含有物およびゲノム複製のエラーの性質のため、急激な遺伝的浮動を受ける。しかしウイルスの複製に必須であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株のＨＣＶウイルス間で比較的保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発明において好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いて、すべてのＨＣＶウイルスを標的とすることができる。本発明者らはこれらのウイルスのゲノム中でこのような領域を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列を、これらの領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる領域の存在につき調べた。詳細に分析された１つの領域は、５’側非翻訳領域である。他の領域、例えばＣまたはＮＳ１蛋白質のオープンリーディングフレームは、以下に記載する方法と同様の方法により分析することができる。好ましくは、ＨＣＶゲノムの選択された領域を標的とするリボザイムを、ＲＮＡの翻訳を阻害する様式で標的ＲＮＡを開裂するように選ぶ。翻訳の阻害が例えば蛋白質合成を阻害することによりウイルス複製を阻害するように遺伝子を選択する。ウイルスＲＮＡのこれらの重要な領域内の有効な標的部位の選択は、その標的ＲＮＡの種々のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに対するアクセス可能性を試験することにより行われる。これらの試験は、ＲＮＡプローブを使用し、ハイブリッド分子をＲＮａｓｅＨで開裂させることによりアクセス可能性をアッセイすることによって実施しうる（下記を参照されたい）。あるいはこの試験は、ＲＮＡの二次構造の予想から設計されたリボザイムプローブを使用し、開裂生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりアッセイし、開裂分子および非開裂分子の存在を検出することができる。以下は適切な標的部位を同定しうる方法の例であり、本発明を限定するものではない。一般にこれらの方法は、ハンマーヘッドリボザイムに対する潜在的な開裂部位を同定し、次いで二次構造の形成が最小となることを確実にすることにより、これらの部位それぞれにつき標的としてのそれらの適性を判定する試験を行うことを含む。ウイルスのｍＲＮＡ配列をＲＮＡｆｏｌｄコンピューター分析により折りたたむ。弱く塩基対合した、または塩基対合していないヌクレオチドを含むと予想されるｍＲＮＡ領域、この場合はＨＣＶの５’側ヌクレオチドを、推定リボザイム認識モチーフにつき探査する。これらの部位はこれらの標的ＲＮＡ内のハンマーヘッド型または他のリボザイムによる開裂に対する好ましい部位である。遺伝子の各部位に対応する短いＲＮＡ基質を設計した。各基質は、対応するリボザイム認識領域と塩基対合しない、５’および３’末端における２−３ヌクレオチドからなるものである。これらの非対合領域は、１２−１４ヌクレオチドの中央領域をフランキングし、リボザイム中の相補的アームをこれに対して設計する。各基質配列の構造は、ＰＣｆｏｌｄコンピュータープログラムを用いて推定する。結合の正の自由エネルギーを生じる配列を受容する。負の自由エネルギーを生じる配列は、各末端から１または２個の塩基をトリミングすることにより修飾する。修飾された配列がなお強固な二次構造をもつと予想される場合は、それらを排除する。基質を選択したのち、ＲＮＡ基質それぞれに対するリボザイムを設計する。リボザイムの折りたたみもＰＣｆｏｌｄにより分析する。ハンマーヘッドモチーフのステムII（図１参照）領域を形成し、かつ分子内塩基対合が避けられるフランキングアームを含むリボザイム分子を探索する。リボザイムはしばしば、リボザイム末端から塩基をトリミングすることにより、またはステムIIに追加の塩基対を導入して目的とする折りたたみを達成することにより修飾する。不適性な折りたたみを伴うリボザイムは排除する。基質／リボザイム対が適性な分子内構造を含むことを見いだしたのち、それらの分子を共に折りたたんで分子間相互作用を予想する。リボザイムとその同族標的配列への配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）塩基対合の模式図を図１に示す。このような分析を用いて、コンピュータによるＲＮＡ構造分析に基づいて、以下のようなＨＣＶゲノムＲＮＡ中の有効な標的部位の予測が得られた（表１を参照のこと）。標的ヌクレオチドは、配列の左に示されるゲノムヌクレオチド番号（ＨＣＶゲノムにおける）とともに示される。参考のためにフランキングヌクレオチドが示されている。リボザイム標的として有用であると考えられる標的を、リボヌクレアーゼＨアッセイ法（下記を参照されたい）により核酸プローブへのアクセス可能性につき試験することができる。このアッセイは、リボザイムを合成する必要なしに、標的部位の使用を迅速に試験することができる。それを利用して、リボザイム攻撃に最適な部位をスクリーニングすることができる。リボザイムの合成本発明に有用なリボザイムは、セク（Cech）（前掲）が述べた遺伝子転写法により、または化学的合成法により調製することができる。ＲＮＡの化学合成はＤＮＡ合成の場合と類似する。しかしＲＮＡ中の追加の２’−ＯＨ基は、選択的３ '−５'ヌクレオチド間結合の形成に、および塩基の存在下でのＲＮＡの分解されやすさに対処するために、異なる保護基対策を必要とする。最近開発された、２ ’−ヒドロキシル基の保護のためにｔ−ブチルジメチルシリル基を用いるＲＮＡ合成法が、リボザイムの合成のための最も信頼性のある方法である。この方法によれば、適正な３’−５’ヌクレオチド間結合を有するＲＮＡが平均カップリング収率９９％以上で再現性をもって得られ、ポリマーの２工程脱保護を必要とするにすぎない。Ｈ−ホスホネート化学に基づく方法は、ホスホルアミダイト化学に基づく方法より相対的に低いカップリング効率を示す。これはＤＮＡ合成についても問題である。自動オリゴヌクレオチド合成のスケールアップのための有望な方法が、Ｈ −ホスホネートにつき最近報告された。適切なカップリング時間と“欠陥（ｆａｉｌｕｒｅ）”配列の追加キャッピングとの併用により、カップリング工程で２当量程度の少量のモノマーを用いて、１４μｍｏｌｅの範囲のスケールでのオリゴヌクレオチドの合成において高い収率が得られた。他の別法は、通常の固体支持体の代わりに可溶性高分子支持体（例えばポリエチレングリコール）を用いるものである。この方法によれば、カップリング工程で約３当量のモノマーを用いて、バッチ当たり１００ｍｇ規模の量の短いオリゴヌクレオチドが得られる。リボザイムの有用性を高めるために、リボザイム構造に対する種々の修飾を行うことができる。このような修飾は保存寿命、ｉｎｖｉｔｒｏでの半減期、安定性、および標的部位へのこれらのリボザイムの導入の容易さを高め（例えば細胞膜貫通を高める）、また標的細胞を認識し、かつ結合する能力を付与する。リボザイムの外的送達は主鎖の化学的修飾によって、例えばリボザイム分子の全体的な負の電荷を減少させて細胞膜を通る拡散を容易にすることによって、有利になる。オリゴヌクレオチドの電荷を減少させるための本発明の対策には下記のものが含まれる：メチルホスホネートによるヌクレオチド間結合の修飾、ホスホルアミダイトの使用、正に帯電した分子へのオリゴヌクレオチドの結合、ならびにオリゴヌクレオチド、脂質および標的細胞に対する特異的レセプターまたはエフェクターから構成されるコンプレックスパッケージの形成。これらの修飾の例には、ＲＮＡ内のヌクレオチド間結合としてホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートを含むイオウ含有リボザイムが含まれる。このようなイオウ修飾リボザイムの合成は、イオウ伝達試薬、³Ｈ−１，２−ベンゼンジチオール−３ −オン１，１−ジオキシドを用いて達成される。リボザイムはリボース修飾されたリボヌクレオチドをも含有しうる。ピリミジン類似体はウリジンから、出発物質としてジエチルアミノイオウトリフルオリド（ＤＡＳＴ）を用いる方法で調製される。リボザイムは電荷を減少させるためにポリマーカチオンに静電的に、または共有結合により付着してもよい。このポリマーは、３’末端をリボヌクレオシドジアルデヒドに変換するだけで、リボザイムに結合させることができる。ジアルデヒドは末端２’，３’−シスジオール系を過ヨウ素酸開裂することにより得られる。送達系に対する個々の要件に応じた他の可能な修飾には、カルボキシ、アミノまたはチオール官能基を含む異なるリンカーアームが含まれる。さらに他の例には、メチルホスホネートおよび２’−Ｏ−メチルリボース、ならびにｍ₇ ＧｐｐｐＧまたはｍ₃ ^2.2.7ＧｐｐｐＧによる５’または３’キャッピングまたはブロッキングが含まれる。例えばキナーゼ処理したリボザイムをグアノシントリホスフェートおよびグアニルトランスフェラーゼと接触させてリボザイムにｍ³Ｇキャップを付加する。この合成ののち、リボザイムを標準法によりゲル精製することができる。リボザイムが所望の活性を有することを確認するために、５’キャップを含むものおよび含まないものにつき標準法により試験して、その酵素的活性およびその安定性の双方につきアッセイすることができる。種々の修飾を有するものを含めた合成リボザイムは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製しうる。シリカおよびポリマー系支持体上での逆相カラムおよびアニオン交換体を用いる他の液体クロマトグラフィー技術も採用しうる。以下は、１つのリボザイムの合成の例である。固相ホスホルアミダイト化学を用いる。用いるモノマーは、ウリジン、Ｎ−ベンゾイル−シトシン、Ｎ−フェノキシアセチルアデノシン、およびグアノシンの、２’−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリルシアノエチルホスホルアミダイト（Glen Research，Sterling，V A）である。固相合成は、ＡＢＩ３９４または３８０ＢＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で、それぞれの機械に提供される標準的なプロトコールを用いて実施する。唯一の例外は、カップリング工程を１０分から１２分に増加させることである。ホスホルアミダイトの濃度は０．１Ｍである。合成は、１μｍｏｌＲＮＡ反応カラム（Glen Research）を用いて１μｍｏｌのスケールで行った。平均カップリング効率は、放出されたトリチルカチオンの熱量測定により判定して、モデル３９４については９７％と９８％との間であり、モデル３８０Ｂについては９７％と９９％との間である。保護されたリボザイムを固体支持体（例えばＣＰＧ）から切断し、無菌バイアル中で、乾燥エタノール性アンモニア（２ｍＬ）中で５５℃において１６時間、塩基およびジホスホエステル部分を脱保護する。反応混合物をドライアイス上で冷却する。その後、冷液体を無菌スクリューキャップつきバイアル中に移し、凍結乾燥する。リボザイムから２’−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基を除去するため、残渣を乾燥ＴＨＦ中の１Ｍフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）に、各シリル基について２０倍過剰の試薬を用いて、室温（約１５−２５℃）において１６時間懸濁する。等容量の無菌１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ６．５を加えることにより反応を停止させる。試料を冷却し、スピードバックで最初の容量の半分に濃縮する。リボザイムは、Ｃ４３００μ ５ｍｍＤｅｌｔａＰａｋカラム上でアセトニトリル勾配を用いるＨＰＬＣにより、２工程で精製する。第１工程、すなわち”トリチルオン”工程では、５’−ＤＭＴ−保護リボザイムを５’−ＤＭＴ基を欠失している不合格配列から分離する。この工程で用いる溶媒は、Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（アセトニトリル）である。溶出プロフィールは、２０％Ｂ−１０分間、次に、２０％Ｂから５０％Ｂの直線勾配−５０分間、５０％Ｂ−１０分間、５０％Ｂから１００％Ｂの直線勾配−１０分間、および１００％Ｂから０％Ｂの直線勾配−１０分間、である。第２工程では、２％トリフルオロ酢酸で処理することにより完全に脱保護されたリボザイムを、Ｃ４３００μ ５ｍｍＤｅｌｔａＰａｋカラム上でアセトニトリル勾配を用いて精製する。この第２工程で用いる溶媒は、Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（８０％アセトニトリル、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）である。溶出プロフィールは、５％Ｂ−５分間、５％Ｂから１５％Ｂの直線勾配−６０分間、１５％Ｂ−１０分間、および１５％Ｂから０％Ｂの直線勾配−１０分間である。リボザイムを含む画分を冷却し、スピードバックで凍結乾燥する。固体残渣を最少量のエタノールおよびアセトン中の過塩素酸ナトリウムに溶解する。遠心分離によりリボザイムを回収し、アセトンで３回洗浄し、凍結乾燥する。発現ベクター本発明においては合成リボザイムが好ましいが、発現ベクターにより産生されたものも使用しうる。適切なリボザイム発現ベクターを設計する際には、下記の因子を考慮することが重要である。最終リボザイムはリボザイム内の望ましくない二次構造を最小限に抑えるためにできるだけ小さく維持しなければならない。比較的強力なプロモーターであり、かつｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの双方で発現可能であるプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス即時型領域プロモーター）を選ぶべきである。このようなプロモーターは、標的ＲＮＡを破壊するのに十分なリボザイムの産生を行うのに適したレベルであるが、他の細胞活性の阻害が起こるほど高すぎないレベルで（細胞の死滅自体を目的としない限り）、リボザイムを発現すべきである。リボザイムの５’末端のヘアピンは、リボザイムを５’−３’エキソヌクレアーゼから保護するために有用である。リボザイム遺伝子の３’末端の選ばれたヘアピンは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性からの保護として作用するため有用である。これらのヘアピンは、標準リボザイムを適切な配向で配置し、かつこれらの配列が結合した状態で発現することができるベクター配列内に挿入することができる。ポリ（Ａ）テイルもリボザイムの３’末端を保護するために有用である。これらはポリ（Ａ）シグナル部位を発現ベクターに含有させる（ｉｎｖｉｖｏでポリ（Ａ）テイルを付加するように細胞に信号を発する）か、またはポリ（Ａ）配列を直接に発現ベクターに導入することにより得られる。第１の方法においては、シグナルはリボザイムの他の部分との望ましくない二次構造を形成するのを阻止する位置になければならない。第２の方法においては、ポリ（Ａ）ストレッチの大きさはｉｎｖｉｖｏで発現された場合に経時的にサイズが縮小する可能性があり、従ってベクターを経時的に検査する必要があろう。リボザイムがそれらの標的配列に作用するのを阻止するポリ（Ａ）結合性蛋白質を結合させるポリ（Ａ）テイルの付加については注意を払うべきである。リボザイムの試験目的リボザイムを選択し、合成し、精製すると、それらを速度論的その他の実験において試験して、それらの有用性を判定する。この方法の例を以下に提示する。リボザイムの調製粗製の合成リボザイム（一般に一度に３５０μｇ）を１５％変性ポリアクリルアミドゲル（厚さ０．７５ｍｍ、長さ４０ｃｍ）上で分離し、ＵＶシャドウイングにより視覚化する。全長リボザイムを含有するゲルを切り取り、ゲル切片を５ｍｌのゲル溶離緩衝液（０．５ＭＮＨ₄ＯＡｃ，１ｍＭＥＤＴＡ）中に一夜、４℃で撹拌しながら浸漬する。溶出液をＣ−１８マトリックス（Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ、ミリポア、マサチュセッツ州ミルフォード）上で脱塩し、真空乾燥させる。乾燥したＲＮＡを５０−１００μｌのＴＥ（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．２）に再懸濁する。この溶液のアリコートを１ｍｌのＴＥ中に１００倍に希釈し、その半量を用いてリボザイム溶液を分光測光法により定量する。この希釈原液の濃度は一般に１５０−８００ｎＭである。変性ポリアクリルアミドゲル上に単一バンドが存在することによりリボザイムの純度が確認される。リボザイムを２以上の部分に分けて合成することが有利であろう。リボザイムの各部分はごく限られた酵素的活性を示すか、または示さず、すべての部分が互いにリゲーション（または他の形で並置）すると、活性は実質的に（少なくとも５−１０倍）高まる。ハンマーヘッドリボザイム合成の具体例を以下に示す。本方法は、２つ（またはそれ以上）の比較的短い“半”リボザイムを合成し、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによりそれらを互いにリゲーションすることを含む。例えば３４ｍｅｒリボザイムを作成するためには、２つの１７ｍｅｒを合成し、１つをリン酸化し、そして両者をゲル精製する。次いでこれらの精製された１７ｍｅｒを、２つの１７ｍｅｒに対して相補的なＤＮＡスプリント鎖にアニーリングする。このＤＮＡスプリントは、２つの１７ｍｅｒをそれぞれの１端が互いに隣接する状態で配置するように設計された配列を有する。次いで並置されたＲＮＡ分子をＡＴＰの存在下でＴ４ＲＮＡリガーゼにより処理する。次いでこうして形成された３４ｍｅｒＲＮＡをＨＰＬＣ精製する。基質の調製約１０−３０ｐｍｏｌｅの未精製基質を、２５ｐｍｏｌｅの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端−放射性標識する。標識混合物全体を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化する。全長バンドを切り取り、１００μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に一夜４℃で浸漬する。速度論的反応短い基質（８−１６塩基）を用いる反応のために、アッセイ用緩衝液（７５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂ ）中に、基質濃度が１ｎＭ未満になるように基質溶液を１×で調製する。リボザイム溶液（典型的には２０ｎＭ）をアッセイ用緩衝液中に１×で調製し、１×アッセイ用緩衝液を用いて４種類の希釈液を調製する。各リボザイム希釈液（すなわち２０、１６、１２、８および４ｎＭ）１５μｌを別個の試験管に装入する。これらの試験管および基質試験管を、３７℃で少なくとも５分間プレインキュベートする。１５μｌの基質を各リボザイム試験管中へ迅速ピペッティングにより混入することにより反応を開始する（最終リボザイム濃度が１０、８、６、４、２ｎＭであることに留意する）。５μｌアリコートを１５秒または３０秒間隔で取り出し、５μｌの停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、キシレンシアノールおよびブロムフェノールブルー染料）で停止する。最終リボザイムの時点で残りの基質のアリコートをゼロリボザイム対照として取り出す。これらの試料を１５％または２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。各ゲルを視覚化し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナー（アンビス・システムズ、カリフォルニア州サイディエゴ）で定量する。大部分の活性リボザイムにつき、Ｋ_mおよびＫ_cat値を測定するために速度論的分析を基質過剰で実施する。長鎖ＲＮＡ基質（長さ１５塩基を越えるもの）を用いる速度論的反応のために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７プロモーター、およびウイルスＲＮＡの適宜なヌクレオチドをコードするＤＮＡを含む特定のテンプレートを用いる転写により、基質を調製する。基質溶液はアッセイ用緩衝液（７５ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂）中に１× で調製され、５８ｎＭ濃度の長鎖ＲＮＡ分子を含有する。ゲル精製リボザイムを１μＭ濃度となるように添加することにより、反応を開始する。アリコートを２０、４０、６０、８０および１００分の時点で取り出し、次いで５μｌの停止液の添加により停止する。変性ＰＡＧＥにより開裂生成物を分離する。バンドを視覚化し、アンビスベータスキャナーで定量する。速度論的分析リボザイム仲介による開裂に関する簡単な反応メカニズムは：［式中、Ｒ＝リボザイム、Ｓ＝基質、およびＰ＝生成物である］である。四角で囲んだ工程は基質過剰の場合にのみ重要である。リボザイム濃度は基質濃度より過剰であるので、リボザイム−基質コンプレックス（［Ｒ：Ｓ］）の濃度はコンプレックスが最初に形成されるごく短期間を除いて、経時的に一定である。すなわち：（ここでｔ＝時間）であり、従って：（Ｒ）（Ｓ）ｋ₁ ＝（ＲＳ）（ｋ₂＋ｋ₁）である。反応速度は基質が経時的に消失する速度である：これらの式を置換すると：または：となる。この式を時間収率につき積分すると：となり、ここでＳ₀＝初期基質である。従って非切断基質画分の負の対数を時間（分）に対してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる：ここでｋ_obs＝実測された速度定数である。勾配（ｋ_obs）をリボザイム濃度に対してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる：これらの方程式を用いると、速度論的実験より得られたデータからいずれの被験リボザイムが最も有用であるか、すなわち活性であるかを判定するために必要な情報が得られる。これらのリボザイムを選択し、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏ系で試験することができる。リポソームの調製脂質分子を揮発性有機溶剤（ＣＨＣｌ₃、メタノール、ジエチルエーテル、エタノールなど）に溶解した。有機溶剤を蒸発により除去した。この脂質を０．１ ×リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で水和懸濁し、次いで液体窒素を用いて３回凍結−融解し、室温でインキュベートした。懸濁液を順次０．４μｍ、０．２ μｍおよび０．１μｍのポリカーボネートフィルターから最大圧力８００ｐｓｉで押出した。押出されたリポソーム懸濁液とリボザイムを混合し、凍結乾燥した。この脂質／リボザイム粉末を水で元の容量の１／１０に再水和した。懸濁液を押出しに必要な最小容量（１．５ｍｌのバレルに対しては０．４ｍｌ）１０ｍｌのバレルに対しては１．５ｍｌ）に１×ＰＢＳで希釈し、０．４μｍ、０．２μ ｍ、０．１μｍのポリカーボネートフィルターから再度押出した。このリポソームに捕獲されたリボザイムを捕獲されていないリボザイムからゲル濾過クロマトグラフィー（セファロースＣＬ−４Ｂ，バイオゲルＡ５Ｍ）により分離した。リポソーム抽出物をプールし、０．２μｍフィルターで濾過することにより滅菌した。遊離リボザイムをプールし、エタノール沈殿により回収した。リポソーム濃度は放射性脂質の取り込みにより測定された。リボザイム濃度は³²Ｐで標識することにより測定された。ロッシ（Rossi）ら，1992（前掲）（およびそこに引用される参考文献）にリポソームを調製するための他の方法が記載されている。ｉｎｖｉｖｏアッセイ選ばれたリボザイムの作用の有効性をｉｎｖｉｖｏで、ＨＣＶに対して感受性である細胞培養物を用いて、標準法により試験しうる。例えばＨＣＶ感受性のＨｅｐＧ２細胞の単層培養物を、６もしくは９６ウェル組織培養プレート中で増殖させる。ＨＣＶ発現プラスミドを導入する前に、培養物を３−２４時間、リボザイム含有リポソームまたはカチオン性脂質／リボザイム複合体で処理する。次いで細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、ＨＣＶ発現プラスミドを導入またはトランスフェクトする。細胞を、適当なリボザイム調製物とともに、新鮮な培地に交換しながら、３日から５日処理する。グアニジンイソチオシアネート技術により全細胞ＲＮＡを回収し、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いてＨＣＶｍＲＮＡの量を定量化し、リボザイム媒介性開裂を評価する。あるいは、細胞溶解物を調製し、製造元の指示にしたがってプロテインＡ−セファロースに吸着させたポリクローナル抗コア抗血清を用いて、ＨＣＶのコア粒子を免疫沈殿させることもできる。沈殿したコアをリボヌクレアーゼで処理して非カプシド化ＲＮＡを切断し、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出によりコア蛋白質を切断する。通常は、全ＲＮＡの半分および抽出されたＲＮＡの半分を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて分析する。リボヌクレアーゼ保護アッセイ細胞内における標的ｍＲＮＡの蓄積またはリボザイムもしくはＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの開裂（ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ）は、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて定量化することができる。この方法においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ(U.S.Biochemical)を用いて、１×転写緩衝液（製造元より供給される）、０．２ｍＭＡＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、１Ｕ／μｌ膵臓ＲＮａｓｅ阻害剤（Boehringer Mannheim Biochemica ls）および２００μＣｉの³²Ｐ標識ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，New Englan d Nuclear）を含む２０μｌの反応液中で、３７℃において１時間反応させて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスリボプローブを転写させる。鋳型ＤＮＡを１ＵＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)で３７℃において１５分間消化し、取り込まれなかったヌクレオチドをＧ−５０セファデックス・スピンクロマトグラフィーで除去する。アンチセンスプローブの転写と同様の方法で、適当なＤＮＡ鋳型を用いて標的ＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで転写することができる。標準的な方法により転写産物を精製し、以下に記載する方法にしたがって、３７℃においてリボザイムで消化する。あるいは、ウイルス感染細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ）チューブに移し、マイクロ遠心分離機において低速で３０秒間遠心分離してペレット化し、７０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．１％サルコジル、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中で溶解させる。次に、細胞溶解物（４５ μｌ）または規定量のｉｎｖｉｔｒｏ転写産物（これもまたハイブリダイゼーション緩衝液中）を、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、５×１０⁵ｃｐｍのそれぞれのアンチセンスリポプローブを含む５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、２５μｌの鉱油を上層し、５５℃で一夜加熱することによりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション反応を０．５ｍｌのＲＮａｓｅ溶液（０．４ＭＮａＣｌ中、２０Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＡ、２Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＴ１、１０Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ）中に希釈し、３７℃で３０分間加熱し、１０μｌの２０％ＳＤＳおよび１０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、その後３７℃においてさらに３０分間インキュベートする。ハイブリッドは、０．５ｍｌのフェノール／クロロホルム１：１混合物で抽出することにより部分精製し、水相を０．５ｍｌのイソプロパノールと合わせ、ミクロ遠心分離機で室温（約２０℃）において１０分間遠心分離して、ＲＮａｓｅ耐性ハイブリッドをペレット化する。ペレットを１０μｌのローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、１×ＴＢＥ、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール）に溶解し、９５℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで、変性条件下で分析する。リボザイムの安定性選ばれたリボザイムをその安定性、従ってその潜在的有用性を調べるために試験することができる。このような試験は種々の化学的修飾（例えばポリ（Ａ）テイルの付加）がリボザイムの安定性に及ぼす影響を調べるためにも利用することができ、従ってより安定なリボザイムの選択の補助となる。例えば反応混合物は、１−５ｐｍｏｌｅの５’（キナーゼ処理）および／または３’標識リボザイム、１５μｇの細胞質ゾル抽出物、および２．５ｍＭＭｇＣｌ₂を全容量１００ μｌ中に含有する。反応物を３７℃でインキュベートする。８μｌアリコートを一定時間毎に取り出し、８μｌの停止混合物（２０ｍＭＥＤＴＡ，９５％ホルムアミド）と混合する。試料を１５％アクリルアミドシークエンスゲル上で分離し、フィルムに露光し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）で走査する。３’標識リボザイムは、³²Ｐ標識コルジセピンをポリ（Ａ）ポリメラーゼにより３’ＯＨに取り込ませることにより形成しうる。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応物は、４０ｍＭトリス、ｐＨ８，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，２５０ｍＭＮａＣｌ，２．５ｍＭＭｎＣｌ₂；３μｌ ³²Ｐコルジセピン，５００Ｃｉ／ｍＭ；および６単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼを全容量５０μｌ中に含有する。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。塩基置換がリボザイム活性に及ぼす影響いずれの一次構造特性がリボザイムによる基質の開裂を変化させるかを判定するために、特異的リボザイムにより認識される基質開裂領域において塩基をわずかに変化させることができる。例えば、基質配列を中心の“Ｃ”ヌクレオチドで変化させて、開裂部位をＧＵＣからＧＵＡモチーフに変化させることができる。次いで各基質を用いた開裂についてのＫ_cat／Ｋ_m値を分析して、その変化がリボザイム開裂速度を高めるか否かを判定する。リボザイム結合アームに対して相補的な塩基を変化させる影響を扱うために、同様な実験を行うことができる。相補的基質に対する強固な結合を維持することが予想される変化が好ましい。ヌクレオチド含量のわずかな変化が、結合強度のみに基づいて予想し得ない様式でリボザイム／基質の相互作用を変化させる可能性がある。リボザイムの触媒コア領域の構造は、基質の構造、またはリボザイム／基質コンプレックスの三次元構造のわずかな変化を認識する。最適なリボザイム設計を始めるために、種々のアーム長さを有するが、同じ長さの短いＲＮＡ基質を標的とするリボザイムの開裂速度を調べることができる。最小のアーム長さが必要であり、有効な開裂はリボザイム／基質の組み合わせに応じて異なる。選ばれたリボザイムの開裂活性は、ＨＣＶ相同性基質またはＨＣＶゲノムＲＮＡを用いて評価することができる。アッセイはリボザイム過剰で実施され、おおまかなＫ_cat／Ｋ_min値が得られる。短い基質または長い基質を用いて得られる数値を比較すると、ｉｎｖｉｖｏでのリボザイムの有用性が示される。リポソーム送達されたリボザイムの細胞内安定性選ばれたリボザイムのｉｎｖｉｖｏ安定性を試験するためには、下記の試験が有用である。リボザイムを³²Ｐ末端標識し、リポソーム内に捕獲し、ＨＣＶ感受性細胞に３時間送達する。細胞を分画し、リボザイムをフェノール／クロロホルム抽出により精製する。あるいは、細胞（１×１０⁷、Ｔ−１７５フラスコ）をフラスコの表面から掻き取り、低温のＰＢＳで２回洗浄する。細胞を４ｍｌのＴＥＳ（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，０．２５Ｍ蔗糖，ｍＭＥＤＴＡ）で３５回ダウンシング（ｄｏｕｎｃｉｎｇ）することによりホモジナイズする。核を１００×ｇで１０分間ペレット化する。細胞下小器官（膜画分）をＳＷ６０ローターにより２００，０００×ｇで２時間ペレット化する。ペレットを１ｍｌのＨ緩衝液（０．２５Ｍ蔗糖，５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。上清液は細胞質画分を含有する（約３．７ｍｌ中に）。核ペレットをＴＭ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂）中の６５％蔗糖１ｍｌに再懸濁し、蔗糖の段階濃度勾配（１ｍｌの６５％蔗糖ＴＭ中の核、１ｍｌの６０％蔗糖ＴＭ、１ｍｌの５５％蔗糖ＴＭ、５０％蔗糖ＴＭ、３００μｌの２５％蔗糖ＴＭ）上でＳＷ６０ローターにより３７，０００×ｇで１時間バンド形成させる。核のバンドを採集し、ＴＭ緩衝液で１０％蔗糖となるように希釈する。核をＳＷ６０ローターにより３７,０００×ｇで１５分間ペレット化し、ペレットを１ｍlのＴＭ緩衝液に再懸濁する。アリコートを変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、細胞内局在を測定する。新規に合成されたリボザイムの移動度を比較することにより、無傷のリボザイムを含有する種々の画分を測定することができる。細胞内でのリボザイム分子の半減期を延長する修飾を調べるために、細胞を上記により分画し、それぞれの画分の純度をその画分に存在することが知られている酵素活性をアッセイすることにより評価することができる。種々の細胞画分を−７０℃で凍結し、修飾されたリボザイム分子の相対的なヌクレアーゼ耐性の判定に利用する。リボザイム分子は５ホスホロチオエート（ｐｓ）により、または分子の各末端における２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾により合成することができる。これらの分子およびホスホジエステル型のリボザイムを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより³²ＰおよびＡＴＰで末端標識する。等濃度を細胞質抽出物に添加し、それぞれのアリコートを１０分間隔で採取する。試料を変性ＰＡＧＥによりサイズ分画し、相対的なヌクレアーゼ耐性度をアンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナーでゲルを走査することにより分析する。それらの結果は、リボザイムが細胞質抽出物で消化されたか否か、またいずれの型が相対的にヌクレアーゼ耐性が高いかを示す。短いＲＮＡ基質を用いた場合、修飾されたリボザイムは一般に天然リボザイムの触媒活性の８０−９０％を保持する。非標識、５’末端標識、または３’末端標識リボザイムをアッセイに使用しうる。これらの実験は、所見を検証するためにヒト細胞抽出物を用いて実施することもできる。リボザイムの投与選ばれたリボザイムを予防的に、またはウイルス感染患者に、適宜な送達ベヒクル、例えばリポソーム、制御放出ベヒクルにより、イオントホレシス、エレクトロポレーションもしくはイオン対合分子、または共有結合付加物、あるいは他の薬理学的に許容される送達法を用いて、感染組織にリボザイムを外的に送達することにより投与しうる。投与経路には、筋肉内、エアゾール、経口（錠剤または丸薬の形）、局所的、全身的、眼内、腹腔内、および／または鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）が含まれる。リボザイムによる免疫感作および／またはリボザイムの送達のための発現ベクターも適切である。ドレーパー（Draper）、米国特許出願第０８／１５２，４８７号（１９９３年１１月１２日出願）を参照のこと。図面を含むすべての内容を本明細書に参考として引用する。選ばれたリボザイムの特定の送達経路はリボザイムの用途に依存するであろう。一般に各リボザイムについての特定の送達プログラムは、細胞内局在に関する非修飾リボザイムの取り込み、次いで効力の証明に注目するであろう。あるいは動物の器官または組織におけるこれらと同じ細胞への送達を追及することができる。取り込み試験には、送達ベヒクルまたは方策にかかわらず、細胞のリボザイム取り込みを評価するための取り込みアッセイが含まれる。これらのアッセイは、取り込み後のリボザイムの細胞内局在をも測定し、最終的には標的配列を含む細胞コンパートメント（核および／または細胞質）内で定常状態濃度を維持するための要件を確立する。次いで効力および細胞毒性を調べる。毒性には細胞の生存性のみでなく、細胞の機能も含まれる。採用しうる送達法には下記のものが含まれる：ａ．リポソーム内に封入ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入ｃ．コレステロールとのコンジュゲーションｄ．大部分のｓｎＲＮＡに見られる抗原結合部位を利用した、核コンパートメントへの局在化ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いた、リボザイムの電荷の中和ｆ．リボザイムを全身に分布させるための血液幹細胞の利用。本発明には、下記を含めた少なくとも３種類の送達方策が有用である：リボザイムの修飾、粒子キャリヤー型薬物送達ベヒクル、およびウイルス発現ベクター。大部分の小分子同様に非修飾リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは徐々にではあるが細胞に取り込まれる。細胞の取り込みを高めるために、リボザイムは本質的にはランダムに、その電荷を減少させるが特異的な官能基を保持する様式で修飾することもできる。これにより、分子は細胞膜を越えて拡散することができ、従って透過バリヤーが除かれる。電荷を減少させるためのリボザイムの修飾は、細胞によるこれらの大型分子の取り込みを高める１つの方法である。しかし、ランダムな方法は推奨できない。リボザイムは小型の薬物より構造的および機能的に複雑だからである。リボザイムの触媒活性を維持するために必要な構造上の要件は当業者に周知である。細胞への送達を高める修飾を設計する際には、これらの要件を考慮する。修飾はヌクレアーゼ分解に対する感受性を低下させるためにも設計される。これらの特性は双方ともリボザイムの効力を大幅に改良するであろう。リボザイム開裂活性に必要なホスホジエステル結合を変化させることなしに、細胞による取り込みを数オーダー増大させることができる。ホスフェート主鎖の化学的修飾は負の電荷を減少させ、これにより膜を越えた自由拡散が可能になるであろう。この原理はアンチセンスＤＮＡ技術につき有効であることが立証された。ＤＮＡとＲＮＡの化学組成の類似性が、これを実現可能な方法にする。体内においては、組織細胞内への修飾リボザイムの拡散を駆動させるために外部濃度の維持が必要であろう。罹患組織を一時的に高い濃度の薬物に暴露し、これが徐々に全身吸着により消費されうる投与経路が好ましい。リボザイムの循環半減期を高めるように設計された薬物キャリヤーを用いる静脈内投与を採用しうる。薬物キャリヤーのサイズおよび組成が、血流からの急速な消失を制限する。感染部位に蓄積するように調製されたキャリヤーは、リボザイムを分解プロセスから保護しうる。薬物送達ベヒクルは全身投与および局所投与の双方に有効であろう。それらは徐放性レザバーとして作用するように、またはそれらの内容物を標的細胞に直接送達するように設計することができる。直接送達薬物ベヒクルを用いることの利点は、１回の取り込み当たり多数の分子が送達されることである。これらのベヒクルは、さもなければ血流から急速に消失するであろう薬物の循環半減期を高めることが示された。このカテゴリーに属する特殊な薬物送達ベヒクルの若干の例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および生物吸着性マイクロスフェアである。このカテゴリーに属する送達システムのうちではリポソームが好ましい。リポソームは細胞内安定性を高め、取り込み効率を高め、かつ生物学的活性を改良する。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式で配列した脂質からなる中空の球状小胞である。それらは水溶性化合物を閉じ込めるための内部水性空間を備え、直径０．０５ミクロンから数ミクロンに及ぶサイズである。幾つかの研究から、リポソームはＲＮＡを細胞へ送達することができ、かつそのＲＮＡは生物学的に活性な状態に維持されることが示された。例えば、最初は研究道具として設計されたリポソーム送達ベヒクルであるリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）が無傷のｍＲＮＡ分子を細胞へ送達し、これにより対応する蛋白質が産生することが示された。リポソームは幾つかの利点をもたらす：それらは無毒性であり、生物分解性の組成である；それらは長い循環半減期を示す；および、組織を標的とするためにそれらの表面に認識分子を容易に結合させることができる。最後に、懸濁液または凍結乾燥製品のいずれにおいてもリポソーム系薬剤が経費的に有効に製造されることは、許容しうる薬物送達システムとしてのこの技術の実施可能性を証明した。他の制御放出薬物送達システム、例えばナノ粒子およびヒドロゲルは、リボザイムの有効な送達ベヒクルであろう。これらのキヤリヤーは化学療法薬および蛋白質系薬剤のために開発されたものであり、従ってリボザイムの送達に適している。リボザイムの局所投与は、最小の全身吸収において投与部位に局在濃縮を可能にするので有利である。これによって罹患部位へのリボザイムの送達方策が簡単になり、毒性の程度が少なくなる。さらに、適用される材料の量が他の投与経路に必要なものよりはるかに少ない。効果的な送達のためには、リボザイムが感染細胞内へ拡散することが必要である。負の電荷を中和するためにリボザイムを修飾することが、透過に必要なすべてであろう。しかし電荷の中和が不十分である場合、修飾されたリボザイムをリポソーム内に透過促進剤、例えばアゾン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸と共に配合することができる。リポソームは修飾リボザイムおよび透過促進剤がリポソームから感染細胞内へ移行する徐放性ベヒクルであってもよく、またはリポソームのリン脂質が修飾リボザイムおよび透過促進剤と共に細胞への送達の促進に直接に関与することもできる。場合により、リボザイムおよび透過促進剤の双方を徐放のための坐剤配合物中に配合することができる。リボザイムは全身的に投与することもできる。全身吸収は、薬物が血流中に蓄積し、次いで全身に分布することを意味する。全身吸収を生じる投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内、鞘内、および眼内投与が含まれる。これらの投与経路はそれぞれリボザイムをアクセス可能な罹患組織に暴露する。皮下投与は局所リンパ節中へ排液し、リンパネットワーク内を通って進み、循環中へ進入する。循環中へ進入する速度は、分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームその他の薬物キャリヤーを用いると、リボザイムはリンパ節に局在する。リボザイムを細胞内へ拡散するように修飾するか、またはリポソームが細胞への非修飾もしくは修飾リボザイムの送達に直接関与することもできる。腹腔内投与も循環系への進入をもたらし、この場合もリボザイム送達ベヒクル複合体の分子量およびサイズが進入速度を制御する。静脈内注射されたリポソームは肝臓、肺臓および脾臓内への蓄積を示す。この蓄積が注射量の３０−４０％となるように組成およびサイズを調整することができる。残りの用量は最高２４時間、血流中で循環する。選ばれた送達法により罹患細胞における細胞質蓄積が起こり、最適投与のためには分子はある程度のヌクレアーゼ耐性をもつべきである。核への送達も採用しうるが、好ましさの程度は比較的低い。極めて好ましい送達法には、リポソーム（１０−４００ｎｍ）、ヒドロゲル、制御放出ポリマー、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーション（ｅｘｖｉｖｏ処置用）、および他の薬剤学的に適用しうるベヒクルが含まれる。用量は適応症および投与経路に依存するが、１００−２００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内であるべきである。処置期間は病的症状の経過期間全体に及び、通常は少なくとも１４−１６日間、恐らく連続的であろう。局所適用、眼内適用および膣内適用のためには、１日多数回の投与が考慮される。投与回数は疾病への送達ベヒクルおよび臨床試験による有効性データに依存するであろう。細胞内における療法レベルのリボザイムの確立は、取り込みおよび分解の速度に依存する。分解度を低下させると、リボザイムの細胞内半減期が延長される。従って化学的に修飾されたリボザイム、例えばホスフェート主鎖の修飾、またはヌクレオチド類似体によるリボザイムの５’および３’末端のキャッピングを有するものは、異なる投与形態を必要とするであろう。有用な系についての記載は前記に引用した先行技術により提供され、それらすべてを本明細書に参考として引用する。本発明のリボザイムは、試料中の標的ＲＮＡの存在を特異的または非特異的に検出するための診断道具としても有用である。すなわち試料中に標的ＲＮＡが存在する場合、それはリボザイムによって特異的に開裂し、従ってより小型のＲＮＡ種として容易にかつ特異的に検出することができる。このような小型のＲＮＡ種の存在は、試料中に標的ＲＮＡが存在することの指標である。他の態様は下記の特許請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/02 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 7/00 9282−4Ｂ 15/00 Ａ 15/09 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＣＶのＲＮＡを特異的に切断する活性を有する酵素的ＲＮＡ分子。２．ＨＣＶのＲＮＡを、５’−非翻訳領域またはコア（Ｃ）領域もしくはプロテアーゼＮＳ３もしくはＮＳ２／ＮＳ３をコードするＲＮＡで切断する、請求項１記載の酵素的ＲＮＡ分子。３．前記ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１記載のＲＮＡ分子。４．前記ＲＮＡ分子がヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループ１イントロンまたはＲＮａｓｅＰＲＮＡモチーフのものである、請求項１記載の酵素的ＲＮＡ分子。５．配列番号１−８のいずれかに示される配列を開裂する酵素的ＲＮＡ分子。６．請求項１−５のいずれかに記載の酵素的ＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞。７．前記細胞がヒト細胞である、請求項６記載の細胞。８．請求項１−５のいずれかに記載の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を、哺乳動物細胞中でその酵素的ＲＮＡ分子を発現させうる様式で含む発現ベクター。９．患者に請求項１−５のいずれかに記載の酵素的ＲＮＡ分子を投与することにより、ＨＣＶまたはＨＣＶ遺伝子もしくはＨＣＶ遺伝子の一部の発現により引き起こされる疾患を治療する方法。１０．前記患者がヒトまたはヒト以外の霊長類である、請求項９記載の方法。１１．欠損ウイルス粒子を提供する方法であって、ＨＣＶに感染した細胞を、ウイルス複製に必要な遺伝子の開裂に活性を有する酵素的ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。１２．前記分子がウイルスの蛋白質合成に必要な核酸の開裂に活性を有する、請求項１１記載の方法。１３．前記核酸がＨＣＶの５’非翻訳領域中にある、請求項１１記載の方法。１４．ＨＣＶに感染した細胞を、ウイルス複製に必要な遺伝子の開裂に活性を有する酵素的ＲＮＡ分子と接触させることにより製造される欠損ウイルス粒子。１５．ヒトにおいて免疫応答を誘導するかまたは抗ＨＣＶ免疫グロブリンの生成を誘導する方法であって、ＨＣＶに感染した細胞をウイルス複製に必要な遺伝子の開裂に活性を有する酵素的ＲＮＡ分子と接触させることにより製造される欠損ウイルス粒子を投与することを含む方法。