JPH09508024A

JPH09508024A - 細菌からの異種の不溶性タンパク質の抽出

Info

Publication number: JPH09508024A
Application number: JP8502295A
Authority: JP
Inventors: ヤーアルロイ，; ジンドンズウ，; ラッセルコンドン，
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1994-06-22
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1997-08-19
Anticipated expiration: 2013-12-02
Also published as: JP2831473B2; FI965109L; WO1995035368A1; KR19980057993A; FI965109A0; HU9603539D0; EP0759982A1; CA2192184A1; KR100212770B1; BR9508096A; AU2817595A; NZ288825A; FI965109A7; US5437986A; AU690709B2; CA2192184C; MX9606318A; HUT76377A

Abstract

(57)【要約】発酵ブロスをホモジナイズ処理する工程、ホモジナイズ処理したブロスを遠心分離する工程、そして封入体含有ペレットから上清液を除去する工程により、細菌宿主タンパク質の不可逆的な不溶化を回避して、不溶性の哺乳動物タンパク質か、哺乳動物タンパク質を発現する形質転換細菌から抽出される。他の実施態様では、ホモジナイズ処理したブロスのpHは、遠心分離前に2.0に調整される。次いで、酸性にしたブロスを遠心分離し、そしてペレットを緩衝液中に再懸濁し、再びホモジナイズ処理し、そして封入体を遠心分離によって単離する。

Description

【発明の詳細な説明】細菌からの異種の不溶性タンパク質の抽出発明の背景哺乳動物タンパク質をコードするDNA配列を含有するベクターでの細菌の形質転換は一般的である。細菌による哺乳動物タンパク質の発現の結果、細菌中の封入体内に含まれるタンパク質を高産生し得る。このタンパク質を得、そして精製するために、タンパク質含有封入体を細菌から抽出しなければならない。従来、封入体は発酵ブロスを遠心分離する工程、上清液を除去する工程、緩衝液中に細菌ペレットを再懸濁する工程、およびホモジナイズ処理または超音波処理のような機械的技術によって、あるいはリゾチーム添加界面活性剤の使用によって細菌細胞を破砕する工程により単離されてきた。次いで、破砕細胞を含む混合物を遠心分離することで、上清液およびペレット化した封入体を生じる。封入体ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の遠心分離の後に得られる封入体を含有するペレットである。次いで、破砕した細菌を含有する混合物を遠心分離し、上清液およびペレット化した封入体を得る。封入体ペレットは、細菌細胞破砕およびその後の遠心分離の後に得られる封入体を含有するペレットである。しかし、この手順は生存細菌を含有する発酵ブロスを遠心分離する工程を初期工程として包含する。しばしば、大規模な遠心分離の間、生存細菌は遠心分離によって流出されるエアロゾール中で周囲の大気中へ流出し得る。米国特許第4,958,007号は、発酵ブロスにトルエンまたは酸のいずれかを加えることによって細胞を最初に不活性化することによりこの問題を解決する。次いでこのブロスを遠心分離し、上清液を除去し、そして細菌ペレットを緩衝液中に再懸濁させる。そしてこの懸濁液のpHを最終pHが６〜９の間になるように調整する。あるいは、この酸性にした発酵ブロスのpHを６〜９に調整する。次いで、この細菌細胞をホモジナイズ処理により破砕して、細胞から封入体を遊離させる。このプロセスは遠心分離の間の、生存細菌の大気中への流出を排除する；しかしトルエンを用いて細菌を不活性化する場合、トルエンは可燃性であり、そしてその蒸気は引火性であるので、このプロセスは耐爆発室内で行わなければならない。さらに、酸を細菌を不活性化するために用い、そして細菌ペレットを緩衝液中に再懸濁し、そしてこの懸濁液のpHを最終pHが６〜９の間になるように調整する場合、以前は可溶性であった細菌タンパク質が不溶化され、受容し得ない高レベルの細菌宿主タンパク質を含む封入体ペレットを生じる。従って、改良プロセスについては不溶性の組換えタンパク質を抽出することが必要である。このプロセスでは、全てのまたはほとんどの細菌が遠心分離の前に死滅され、ほとんどの宿主細菌タンパク質は溶液中に残存し、そして優勢な不溶性タンパク質は細菌で発現された異種タンパク質である。発明の要旨本発明は、細菌が発酵ブロス中にいまだ存在する間に異種タンパク質を発現する細菌を破砕し、続いて酸処理によって細菌を必要に応じて不活性化することによりこの必要性を満たす。次いで、生存細菌が流出することなく遠心分離を行い得る。この細菌破砕は、生存細菌数を有意に低減し、そして同時に、生存細菌を含有するブロスの流出を最小にするかまたは防止するために閉鎖系で行い得る。本発明の方法は、精製度が増加した異種タンパク質を含む封入体(すなわち先行技術分野の抽出手順によって産生されるよりも低レベルの不溶性の細菌タンパク質を有する封入体)を産生する。本発明は、異種タンパク質を発現する細菌から異種タンパク質を含有する封入体を抽出する３つの方法を提供する。第一の実施態様は以下の工程を包含する： (a)発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現する細菌を発酵させる工程； (b)発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； (c)発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよび上清液を得る工程；および、 (d)上清液を除去して、封入体ペレットを得る工程。本発明の第二の実施態様は以下の工程を包含する： (a)発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現する細菌を発酵させる工程； (b)発酵ブロス内に含まれる該細菌を破砕する工程； (c)発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持する工程； (d)ホモジナイズ処理した発酵ブロスに酸を加えて、発酵ブロスが約2.0のpHを得る工程； (e)該酸性にした発酵ブロスを、０〜15℃の間の温度でインキュベートして、あらゆる残存する未破砕細菌を死滅させる工程； (f)発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよび上清液を得る工程； (g)上清液を封入体ペレットから除去する工程； (h)緩衝液中に封入体ペレットを懸濁して、懸濁液を得る工程； (i)懸濁液にpH調整液を加えて、懸濁液が６〜９の間のpHを得る工程； (j)工程(i)の懸濁液中に含まれる懸濁固形物を破砕する工程； (k)懸濁液を遠心分離して、異種タンパク質を含有する封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；および、 (l)上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る工程。本発明の第三の実施態様は以下の工程を包含する： (a)発酵ブロス中で異種の不溶性タンパク質を発現する細菌を発酵させる工程； (b)発酵ブロス内に含まれる細菌を破砕する工程； (c)発酵ブロスを０〜15℃の温度に冷却または維持する工程； (d)発酵ブロスに硝酸を加えて、ブロスが約2.0のpHを得る工程； (e)該酸性にした発酵ブロスを、約０〜15℃の間の温度でインキュベートして、細菌を死滅させる工程； (f)約8.5にブロスのpHを上昇させる工程； (g)ブロスを破砕する工程； (h)破砕したブロスを遠心分離して、封入体の封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；および、 (i)上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る工程。図面の簡単な説明図は、本発明の方法により産生された封入体および本発明以外の方法により産生された封入体のSDS-PAGEゲルである。発明の詳細な説明本明細書中に引用された全ての米国特許は参考としてその全体が本明細書中に援用される。本発明は、不溶性の非細菌タンパク質(特に、遺伝子形質転換された細菌(特に E.coli.)により産生される哺乳動物タンパク質)を抽出するための方法を提供する。細菌中に発現される非細菌タンパク質は異種タンパク質と称される。本明細書に用いられるように、用語「形質転換細菌」は異種タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌を意味する。このような遺伝子操作は、通常、細菌への発現ベクターの導入を伴う。発現ベクターは、細菌ゲノム中の遺伝子に関して自律的な複製およびタンパク質発現をし得る。細菌発現ベクターの構築は、当該分野で周知であり、所望のタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列を提供することは公知であるか、そうでなければ入手可能である。例えば、米国特許第4,55 1,433号においてDeBoerは細菌発現ベクターに用いるためのプロモーターを開示している；米国特許第4,601,980号においてGoeddelらは、ならびに米国特許第4, 431,739号においてRiggsは、E.coli.発現系による哺乳動物タンパク質の産生を開示している；ならびに、Riggs、前出、Ferrettiら、Proc.Natl.Acad.Sci．83: 599(1986)、Sproatら、Nucleic Acid Research 13:2959(1985)、およびMullenba chら、J.Biol.Chem．261:719(1986)は、細菌における発現用の合成遺伝子の構築法を開示している。多くの細菌発現ベクターは、市販されており、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)，Rockville，Marylandを通して入手可能である。次いで、発現ベクターで形質転換された細菌は、発現される異種タンパク質を刺激する条件下で、細菌培地中で増殖される。形質転換細菌を含有するこの細菌培地を発酵ブロスと呼ぶ。本発明の第一の実施態様では、異種タンパク質を発現する形質転換細菌(好ましくは形質転換E.coli株)は、０℃から25℃の間の温度で標準的な技術により発酵ブロスを超音波処理またはホモジナイズ処理することによって破砕する。一般に、全発酵ブロスの超音波処理またはホモジナイズ処理は、本質的に全ての細胞が死滅されるまで続行するべきである。これは、続く遠心分離による封入体からの可溶性タンパク質および小さな細胞フラグメントの効果的な除去を可能にする；従って、それはタンパク質の最終の純度を最大にする。超音波処理は一般に、分析スケール容量(10〜20ml)の発酵ブロス中に含まれる細菌の破砕のために用いられる。より大規模なスケールでは、高圧のホモジナイズ処理を用いるべきである。1/8インチ(3.2mm)の先細のマイクロチップを有する Heat-Systems-Ultrasonic社のUltrasonic Processor モデル番号W-85を用いる分析容量(10〜20ml)の発酵ブロスについては、50%のサイクル(duty cycle)で18分間の全超音波処理時間、10mlの全ブロスの１秒パルス(正味の超音波処理は９分間)が好ましい。ホモジナイズ処理を細菌を破砕するために用いる場合、発酵ブロスの多数の通 uidics M-110)に発酵ブロスを３回通過させることで十分であることが観察され菌の流出を防止するように系を閉鎖することが好ましい。大規模なホモジナイザーは、しばしば、閉鎖系で設定される。次いで、超音波処理またはホモジナイズ処理した発酵ブロスを遠心分離して、ペレットおよび上清液を含有する封入体を産生する。遠心分離の速度はほとんどの封入体を沈降するのに十分であるべきであるが、懸濁液中のほとんどの細胞フラグメントを上清液中に維持するのに十分な低速度であるべきである。一般に、 1/2インチのコニカルマイクロ遠心チューブを用いて、約5000rpmから10,000rpm 、好ましくは7000〜10,000rpmで、約10分程度であるべきである。次いで、上清液を除去して異種タンパク質を含有する封入体を得る。本発明の第二の実施態様では、発酵ブロス中の細菌を破砕した後、ブロスの温度を０〜15℃に低下させる。次いで、発酵ブロスのpHを、硫酸、リン酸、硝酸、または塩酸を用いて約０〜15℃の温度で約2.0に低下させ、次いでブロスをあらゆる残存細菌を死滅させるために、代表的には約１時間、その温度でインキュベートする。簡単なホモジナイズ処理では全ての細菌が死滅させないためこれは重要である。好ましくは、pHを低下させるために用いる酸はリン酸または硝酸のいずれかである。次いで、発酵ブロスを上記のように遠心分離し、そして上清液を除去して封入体ペレットを単離する。次いで、該封入体ペレットを緩衝液中に再懸濁する。該ペレットを再懸濁するのに用い得る緩衝液の例は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸(TRIS)である。好ましい緩衝液は、50mM TRIS、５mM EDTAおよび50mM NaCl pH8.5(TEN緩衝液)から構成される。得られた懸濁液の最終pHを、適切な塩基で約6.0から約9. 0の間、好ましくは8.5のpHに調整する。pH調整工程で用いられ得る適切な塩基の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどである。pHを上昇させる好ましい塩基溶液は、NaOHの25% w/v溶液である。次いで、pH調整した懸濁液を再び破砕して、超音波処理またはホモジナイズ処理により懸濁液中に存在する固形物を分散させ、続いてそれを遠心分離する。最後に、可溶性の宿主細菌タンパク質および細胞片を含む上清液を除去し、不溶性の咄乳動物タンパク質を含むペレットを回収する。必要であれば、ペレットを１度または２度、好ましくは約8.5のpH緩衝液中で洗浄し得る。酸添加は０℃と15 ℃との間で行うことが重要である。全ての他の抽出操作は、０℃と32℃との間で行い得る。本発明の第三の実施態様では、異種の不溶性タンパク質を発現する細菌は発酵ブロス中で発酵させる。発酵ブロス中の細菌を上記のように超音波処理またはホモジナイズ処理により破砕する。次いで発酵ブロスの温度を０〜15℃に低下させ、そして硝酸を発酵ブロスに加えて該ブロスのpHを約2.0に低下させる。次いで、発酵ブロスを０〜15℃であらゆる残存細菌を死滅させるために必要な時間、代表的には約１時間インキュベートする。次いで、該発酵ブロスのpHを約8.5に上昇させ、そしてあらゆる残存細菌を含む懸濁液された固形物をホモジナイズ処理または超音波処理により再び破砕する。この第二の破砕後、ブロスを遠心分離し、上清液および封入体ペレットを生成する。次いで上清液を除去し、不溶性の異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る。大規模な操作では、実施態様２および３の酸によって死滅させる手順を使用することが好ましい。なぜなら酸によって死滅させる手順は本質的に100%の細菌を容易に死滅させるからである。この目的を達成するために、多くのホモジナイズ処理試行が必要とされるので、ホモジナイズ処理のみを用いて100%の細菌を死滅させることは、コスト的に有効ではない。封入体を単離した後、次いで異種タンパク質は標準的な生化学的方法を用いてほどかれ(untolded)得、再び折り畳まれ得、そして精製され得る。例えば、Guid e to Protein Purification,Deutscherら編(Academic Press、San Diego、CA、1 990)を参照のこと。以下の実施例は本発明を詳細に記載する。材料および方法の改変が本開示の目的および意図から逸脱することなく実施され得ることは、当業者に明らかである。本発明は以下の限定されない実施例により例示され得る。特に記載しない限り、以下に示す固体混合物中の固形物、液体中の液体、および液体中の固形物の割合は、それぞれwt/wt、vol/vol、およびwt/volに基づく。実施例１（本発明の実施態様１）本実施例で用いたヒトIL-10発現プラスミドは以下の配列を含む： (a)ヒトIL-10コード領域のヌクレオチド配列、Viera,P.ら、Proc.Natl.Acad.S ci.USA，88:1172(1991)； (b)３'末端がIL-10コード領域のヌクレオチド配列の５'末端に融合された、ta cプロモーター、Zurawskiら、J.Immunol.，137:3554(1986)； (c)rhIL-10コード領域の下流に存在する転写ターミネーターを含むlpp３'コード領域および非コード領域、Ghrayeb,J.ら、EMBO,J.，3:2437(1984)； (d)pBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子、Sutcliff,J.G.，C.S.H．Sypmp .Quant．Biol．135:612(1978)； (e)cop^TS熱誘導性複製起点、Hakkaart,M.J.J.ら、Mol.Gen.Genet．183:326(19 81)およびAndreoli,P.M.ら、J.Bacteriol．135:612(1978)。発酵上記のプラスミドを有する(harboring)E.coli.株K12の培養を、水性発酵培地中で通気下および振盪下で行った。各１リットルの培地は、30gのカザミノ酸(Di fco)、20gの酵母抽出物(Difco)、５gのリン酸二水素カリウム、20gのグリセロール、１gのMgSO₄および10mgのテトラサイクリン(Sigma)を含有する。pHを25%w/v のNaOHで7.0に調節し、そして溶解した酸素を、５psi圧下の空気に関して30〜10 0%飽和の間で維持した。温度を初めに、30℃に調節した。培養物の濁度が、No.5 4グリーンフィルターを有するKlett Summerson比色計で測定して約100Klettユニットに達した場合、温度を約38℃に上昇させ、そして該培養物を、その後12〜14 時間で採取した。抽出 rofludics,Inc.)に３回通過させて、細胞を破砕した。ホモジナイズ処理した懸濁液の温度が０〜15℃の間を保持するようにホモジナイザーおよび生成物用容器を氷上に維持した。次いで、発酵ブロスの温度を４℃に低下させ、約１時間、pH７で振盪した。 C5Cモデル)のGS-3ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上清液をは捨て、抽出したIL-10はペレットに残存した。得られた封入体の純度は、図１のレーン１において、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、 Laemmli,U.K.、Nature、277:680(1970)により示す。この工程に従って、封入体を、１cm光路において、元のブロスの15 OD₅₅₀に等しい濃度で緩衝液中に再懸濁した。緩衝液は2.3%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10%グリセロール、0.062M Tri s-HCl pH6.8、0.001%ブロモフェノールブルー、および５%βメルカプトエタノール(用時添加)から構成された。次いで、DAIICHIミニ勾配ゲル(全12ウエル)の各ウエルに10μlを載せた。ゲルを、泳動緩衝液中、35mA/ゲルの定電流下で泳動した。ブルーの色素がゲルの底に達したら電流を止め、ゲルをLaemmli、上記に記載されるように呈色させた。結果を図のレーン１に示す。実施例２（本発明の実施態様２） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は実施例１に記載したように調製した。実施例１のように発酵ブロスをホモジナイズ処理した後、ブロスの温度を４ ℃に低下させ、そしてブロスのpHを、85%w/wリン酸を加えることにより2.0に低下させた。次いで、酸性にした懸濁液を約１時間４℃で振盪した。次いで酸性モデル)のGS-3ヘッドにおいて、４℃で遠心分離した。上清液は捨て、封入体ペレットを元の発酵ブロス容量の1/4にTEN緩衝液で再懸濁し、そして緩衝液のpHを３回通過させ、そして上記のようにSORVAL遠心機のGS-3ヘッドにおいて遠心分離した。上清液は捨て、抽出したIL-10はペレット中に残存した。得られた封入体の純度を、図のレーン２にSDS-PAGEにより示す。実施例３（本発明の実施態様２） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例２に記載したように調製した。9N HNO₃溶液をリン酸の代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン３にSDS-PAGEにより示す。実施例４（本発明の実施態様２） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例２に記載したように調製した。9N H₂SO₄溶液をリン酸の代わりに用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン４にSDS-PAGEにより示す。実施例５（本発明の実施態様ではない） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は、ホモジナイズ処理したブロスを酸性にするために85%w/wリン酸を用いて、実施例２に記載したように調製した。酸性にした懸濁液を約１時間振盪した後、懸濁液のpHを25%w/v NaOH溶液で8.5に４℃で遠心分離した。上清液を捨て、抽出したIL-10はペレットに残存した。得られた封入体の純度を、図のレーン５にSDS-PAGEにより示す。実施例６（実施態様３） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は、実施例５に記載したように調製した。9N HNO₃溶液を用いて、発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン６にSDS-PAGEにより示す。実施例７（本発明の実施態様ではない） IL-10含有封入体を以下に示すこと以外は実施例５に記載したように調製した。9N H₂SO₄溶液を用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン７にSDS-PAGEにより示す。実施例８（本発明の実施態様ではない）レーン８は、国際特許出願PCT/US94/01909に記載されたチャイニーズハムスター卵巣から産生され、精製されたIL-10の純度を示す。その純度は、20μlのサンプルをウエルに載せた以外は実施例１に記載されたように図のSDS-PAGEにより決定した。実施例９（本発明の実施態様ではない）レーン９は、図の他のレーンのタンパク質の分子量を評価するために用いられる高分子量標準マーカーを示す。実施例１０（先行技術） IL-10を産生する細菌を、実施例１のように発酵させた。発酵が完了した時、発酵ブロスのpHを9N HNO₃で2.0に低下させ、そして１時間振盪した。ブロスのp 上清液は捨て、抽出したIL-10はペレットに残存した。得られた封入体の純度を、図のレーン１０にSDS-PAGEにより示す。実施例１１（先行技術） IL-10含有封入体を以下に示すこと以外は実施例１０に記載したように調製した。9N H₂SO₄溶液を用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン１１にSDS-PAGEにより示す。実施例１２（先行技術） IL-10含有封入体を、以下に示すこと以外は実施例１０に記載したように調製した。85%W/WH₃PO₄を用いて発酵ブロスのpHを2.0に低下させた。得られた封入体の純度を、図のレーン１２にSDS-PAGEにより示す。結論図１は、低レベルの不純物(すなわち低レベルの不溶性の宿主タンパク質)を有する封入体を産生する本発明の実施態様の驚くべき能力を例示する。第一のレーンは、本発明の第一の実施態様の方法である実施例１で抽出したIL-10を含む封入体のSDS-PAGEゲルである。細菌含有発酵ブロスをホモジナイズ処理および遠心分離をして、単離した純粋な封入体を産生した。本発明の第二の実施態様により産生された封入体の純度を、図１のレーン２、３および４に例示する。レーン２、３、および４は、それぞれ、実施例２、３および４(ここでは、ホモジナイズ処理した発酵ブロスを酸性にし、０〜15℃の間の温度でインキュベートし、遠心分離して封入体ペレットおよび上清液を産生した)に従って産生された封入体である。ペレットを緩衝液中に再懸濁する；pHを8 .5に上昇させ、そして懸濁液をホモジナイズ処理した。次いで、懸濁液を再び遠心分離し、そして封入体ペレットを単離した。実施例２(レーン２)はリン酸を用い、実施例３(レーン３)は硝酸を用い、および実施例４は硫酸を用いてホモジナイズ処理したブロスを酸性にした。図１に明確に例示するように、本発明の第二の実施態様のプロセスは、高度な純度を有する封入体を産生する。レーン６(実施例６のプロセスにより産生された)は、本発明の第三の実施態様のプロセスに従って産生された封入体のSDS-PAGEゲルを示す。この実施態様では、ホモジナイズ処理された発酵ブロスのpHを硝酸で約2.0に低下させ、そして約１時間０〜15℃の間の温度で振盪した。次いで、ブロスのpHを約8.5に上昇させた。次いで、ブロスを再びホモジナイズ処理し、そして遠心分離して単離された封入体を産生した。本発明の第三の実施態様に従って、硝酸のみが純粋な封入体を産生するのに有効であった。リン酸(実施例５、レーン５)または硫酸(実施例７、レーン７)のいずれかが硝酸に置き換えられる場合、受容し得ない高レベルの不溶性の細菌宿主タンパク質を含有する封入体が産生された。レーン８はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞により産生されたヒトIL-10 のSDS-PAGEである。レーン９は高分子量標準のSDS-PAGEゲルである。レーン１０、１１および１２は、それぞれ実施例１０、１１および１２に記載された先行技術の方法に従って産生された封入体のSDS-PAGEを示し、細菌から異種タンパク質を抽出する先行技術の方法が本発明のプロセスに従って抽出された封入体より実質的に高レベルの宿主タンパク質を有する封入体を産生することを示す。要約すると、本発明の全ての実施態様は、図１のレーン１、２、３、４および６により例示されるように純粋な封入体を産生する。一方、他の方法により産生された封入体は、受容し得ない高レベルの宿主タンパク質を有する封入体を生じる。本発明は上記の特定の実施態様と関連して記載してきたが、それらの多くの代替、修飾および変形は当業者に明かである。全てのこのような、代替、修飾および変形は本発明の主旨および範囲内にあることが意図され、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コンドン，ラッセルアメリカ合衆国ニュージャージー 08901−2828，ニューブランズウィックバルドウィンストリート 33

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を包含する異種タンパク質を発現する細菌から該異種タンパク質を抽出する方法： (a)発酵ブロス中で該細菌を発酵させる工程； (b)該発酵ブロスに含まれる該細菌を破砕する工程； (c)約０〜15℃の間の温度に該発酵ブロスを冷却または維持する工程 (d)該発酵ブロスに酸を加えて、該発酵ブロスが約2.0のpHを得る工程； (e)該酸性にした発酵ブロスを０〜15℃の間の温度でインキュベートして、あらゆる残存する未破砕細菌を死滅させる工程； (f)該発酵ブロスを遠心分離して、封入体ペレットおよび上清液を得る工程； (g)該上清液を該封入体ペレットから除去する工程； (h)緩衝液中に該封入体ペレットを懸濁して、懸濁液を得る工程； (i)該懸濁液にpH調整溶液を加えて、該懸濁液が６〜９の間のpHを得る工程； (j)工程(i)の懸濁液中に含まれる懸濁された固形物を破砕する工程； (k)該懸濁液を遠心分離して、該異種タンパク質を含有する封入体ペレットおよび上清液を産生する工程；および、 (l)上清液を除去して、異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る工程。２．以下の工程を本質的に包含する異種タンパク質を発現する細菌から該異種タンパク質を抽出する方法： (a)発酵ブロス中で該細菌を発酵させる工程； (b)該発酵ブロス内に含まれる該細菌を破砕する工程； (c)該発酵ブロスを約０〜15℃の間の温度に冷却または維持する工程； (e)該発酵ブロスに硝酸を加えて、該発酵ブロスが約2.0のpHを得る工程； (f)該酸性にした発酵ブロスを０〜15℃の間の温度でインキュベートして、該細菌を死滅させる工程； (g)約8.5に該ブロスのpHを上昇させる工程； (h)該ブロス中に含まれる固形物を破砕し、そして分散させる工程； (i)該発酵ブロスを遠心分離して、上清液および封入体を含む封入体ペレットを産生する工程；および、 (j)該上清液を除去して、該異種タンパク質を含有する単離された封入体を得る工程。