JPH09508377A - ヒルジンを含んでなる医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒルジン、リン酸カリウムおよび糖を含んでなる凍結乾燥医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジンを含んでなる医薬組成物 本発明は、ヒルジン含有の組成物に関し、特に安定な粉末製剤に関する。 ヒルジン、ヒル（Hirudo medicinalis）において天然に産生する抗凝固剤は、 単一のポリペプチド種ではなく、ヒルジン変異体１（HV１）、ヒルジン変異体２ （注、ヨーロッパ特許出願第158564号）、ヒルジン変異体３（PA）〔注、PCT出 願第86／03493号〕および“デス−(Val)₂−ヒルジン”（注、ヨーロッパ特許出 願第158986号）と命名された少なくとも４つの代表例から成る、同等に作用する ポリペプチドのクラスである。変異体は、アミノ酸の数により互いに構造が異な る（特に、HV１のＮ末端配列は Val-Val-Tyrであり、HV２およびHV３のそれは I le-Thr-Tyrでありそして“des−(Val)₂−ヒルジン”のそれは Thr-Thr-Thrであ る）が、しかしＮ末端に疎水性アミノ酸およびＣ末端に極性アミノ酸の蓄積、ス ルファトモノエステルとして存在するチロシン残基(Tyr⁶³)、３つのジスルフィ ドブリッジおよび一般に抗凝血作用を有する。 過去２年にわたって、ヒルジン変異体をクローニングするcDNAおよび合成遺伝 子がクローン化されそして微生物宿主中で発現された。発現生産物は、Tyr⁶³で スルファトモノエステル基を欠いている（そして従って“デスルファトヒルジン (desulphatohirudins)”と命名された）けれども、それらは天然のスルファトヒ ルジンとほゞ同じ生物学的活性を示すことが判明した。デスルファトヒルジン変 異体HV１は、エシェリキア・コリ中で発現され（ヨーロッパ特許出願第158564号 および第168342号）そしてサッカロミセス セレビジ エ（Saccharomyces cerevisiae） 中で発現され（ヨーロッパ特許出願第200655号 、PCT出願第86／01224 号）そしてデス−(Val)₂−デスルファトヒルジンは、エ シェリキア・コリ中で発現された（ヨーロッパ特許出願第158986号）。 本発明によれば、語句「ヒルジン」は、それぞれ文献で示されるヒルジン、デ スルファトヒルジン、ヒルジン変異体又はデスルファトヒルジン変異体又はその 突然変異体を包含することを意図しそして特にデスルファトヒルジン化合物又は デスルファトヒルジン又はその突然変異体をコードする DNAを含有する形質転換 微生物菌株から得ることのできるその突然変異体を包含することを意図する。そ のようなデスルファトヒルジンは、例えばデスルファトヒルジン変異体HV１，HV １修飾（ａ，ｂ）、HV２修飾（ａ，ｂ，ｃ）、HV３、HV３の変異体およびデス(V al)₂−デスルファトヒルジンである。 好ましいデスルファトヒルジンは、次の式（配列番号：１） （ここで ａ）27，36そして47の Xaaは各々 Lysであり、51の Xaaは Hisでありそして62の Xaaはペプチド残基 Glu-Tyr-Leu-Glnである（HV１） 、又は ｂ）27の Xaaは、 Ile又は Gluでありそして36，47，51および62の Xaaはａ）で 定義されたものである（HV１修飾ａ）、又は ｃ）36の Xaaは Ile又は Gluでありそして27，47，51および62の Xaaはａ）で定 義されたものである（HV１修飾ａ）、又は ｄ）47の Xaaは Ile又は Gluでありそして27，36，51および62の Xaaはａ）で定 義されたものである（HV１修飾ａ）、又は ｅ）51の Xaaは Leu又は Aspでありそして27，36，47および62の Xaaはａ）で定 義されたものである（HV１修飾ａ）、又は ｆ）62の Xaaは、 Glu-Tyr， Glu-Tyr-Leu， Glu-Asp-Leu-Gln， Glu-Glu-Leu-G ln， Glu-Tyr-Lys-Arg， Glu-Asp-Lys-Arg， Glu-Lys-Leu-Gln， Ser-Phe-Arg-T yr， Trp-Glu-Leu-Arg， Glu-Tyr-Leu-Gln-Proおよび Glu-Tyr-Leu-Gln-Argから 成る群から選ばれそして27，36，47および51の Xaaはａ）で定義されたものであ る（HV１修飾ｂ）） を有するものであるか、又は次の式（配列番号：２） を有するものであるか、又は次式（配列番号：３） （ここで、 ａ）は47の Xaaは Asnでありそして63の Xaaは Tyrであり（HV２）、又は ｂ）47の XaaはLys， Arg又は Hisでありそして63の Xaaは Tyrであり（HV２修 飾ａ）、又は ｃ）63の Xaaは Glu又は Aspでありそして47の Xaaは Asnである（HV２修飾ｂ） ） を有するものであるか、又は次の式（配列番号：４） を有するものであるか、又は次の式（配列番号：５） を有するものである。 HV３および該HV３の変異体は、Ｎ末端で１又は２個のアミノ酸又はＣ末端で18 ，10，９，６，４又は２個のアミノ酸だけ一次構造を短かくすることによって特 徴づけられる。 特に好ましいデスルファトヒルジン化合物は、式Ｉ（式中、 Xaa基はａ）のも とで定義されたものである）の化合物であるか又は式III（式中、47の Xaaは Ly sでありそして63の Xaaは Tyrである）の化合物である。 最も好ましいヒルジンは、式Ｉ（式中、27，36および47の Xaaは各々 Lysであ り、51の Xaaは Hisでありそして62の Xaaはペプチド残基である）を有するデス ルファトヒルジンHV１である。 本発明で用いられるヒルジンは、合成的に、例えば化学的に製造できるか又は 組換え技術により、又はヒルから単離することにより製造できる。 本発明によれば、語句“突然変異体”は、簡単な又は多重の変異により天然の ヒルジン又はデスルファトヒルジンとは異なる抗凝血作用を示すタンパク質（ム テイン(mutein)）を意味する（注、ヨーロッパ特許出願第352227号および第3522 28号）。当業者に公知の方法、例えば部位特異的変異誘発により生産される該突 然変異体をコードする DNAをクローン化し次いでエシェリキア・コリ（Escheric hia coli）およびサッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の 如き微生物宿主中で発現する。 本発明で用いられるヒルジン化合物は、遊離形をとり得るがしかしそれらの塩 の形であってもよい。該化合物は幾つかのアミノ酸残基中に遊離アミノ基を含有 しているので、化合物は酸付加塩の形をとることができる。適当な酸付加塩は、 通常の治療的に許容し得る酸と特に薬理学的に許容し得る塩である。代表的無機 酸はハロゲン化水素酸（例えば塩素）、および硫酸、リン酸およびポリリン酸で ある。代表的有機酸はアレーンスルホン酸（例えばベンゼンスルホン酸又はｐ− トルエンスルホン酸）、又は低級アルカンスルホン酸（例えば、メタンスルホン 酸）、並びにカルボン酸例えば酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リン ゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸およびクエン酸である。しかし、本発明で用いら れる化合物は幾つかのアミノ酸残基中に遊離カルボキシル基（このカルボキシル 基はペプチド全体に酸性特性を付与する）を含有しているので、それらは無機も しくは有機塩基との塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシ ウム塩、又はアンモニア又は薬理的に許容し得る有機窒素含有塩基から誘導され るアンモニウム塩の形をと り得る。しかし、それらは遊離カルボキシル基と遊離アミノ基を同時に含有する ので、それらはまた分子内塩の形をとり得る。薬理的に許容し得る塩は好ましい 。 ヒルジンを含有する剤形を開発する際の１つの問題は、水性溶液および粉末形 においてその溶解性が劣っていることである。 劣った溶解性は、ヒルジンをクロマトグラフィー法例えば逆相HPLC(RP-HPLC) により分析するとき見られ得る。RP-HPLC法 ：LiChroCART 125-4カラムを用いる（Merck LiChrospheｒ100 RP-18 5 μｍ）。溶剤Ａはアセトニトリル／水（10：90）、（ｖ：ｖ）中 0.5％酢酸アン モニウムであり；溶剤Ｂはアセトニトリル／水（25：75）中 0.5％酢酸アンモニ ウムである。溶出は 0.5ml／分の流速を用い45℃で行なわれる。二つの溶出は、 23％溶剤Ｂを用い零時から出発しそして24分後46％溶剤に達する線状グラジエン トである。２分後70％溶剤Ｂで、カラムは23％溶剤Ｂで７分間平衡化される。 RP-HPLC(１mg／mlヒルジン）を用い水中での組換えヒルジンHV１（CGP39393） の典型的クロマトグラムを図１に示す。 図１において主ピークの相対的ピークは 95.15％である。室温で水中でヒルジ ンを保存すると、時間と共に生成物が増加する。このことはそれ自身主ピークの 領域の減少および複数の小ピークの領域の増加により示される。生起する変化は 、温度ストレス実験を用いることにより、すなわち高温での保存により加促でき る。 今や、本発明者等はリン酸カリウムがヒルジンの安定性を増加するために使用 できることを見出した。 従って、本発明は、ヒルジン、リン酸カリウムおよび糖を含んでなる凍結乾燥 医薬組成物を提供する。 本発明の組成物は、成分の水性溶液を形成し次いでそれを常法で 凍結乾燥することにより製造できる。 リン酸カリウムは好ましくはリン酸水素二カリウムである。それは、凍結乾燥 前、溶液中、 0.1〜0.5 のモル濃度、好ましくは 0.1〜0.3 のモル濃度で使用で きる。 適当な糖には、マニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、フル クトース、グルコース、マルトース、ラクトースおよびデキストランが含まれる 。好ましい糖は、マニトールおよびトレハロースである。 凍結乾燥前の溶液中の糖の量は、５〜50％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜20％（ ｗ／ｖ）の温度をもたらすそのような量であってよい。凍結乾燥前の溶液は、好 ましくは等張である。 凍結乾燥前の溶液のpHは、４〜10、好ましくは６〜９、そして最も好ましくは 6.5〜８であってよい。 所望により、シトラート緩衝剤を、例えばクエン酸を添加することにより、凍 結乾燥前の溶液に添加できる。シトラートのモル濃度は、 0.1〜0.5 、好ましく は 0.1〜0.3 である。 凍結乾燥前の溶液中のヒルジンの濃度は、 0.5〜500 mg／ml、好ましくは20〜 25mg／mlである。 凍結乾燥生成物は、冷凍保存に対する必要性はなく、長期間安定である。加え て、生成物を水に再溶解した後、生成溶液はまた長期間安定であるがしかし溶液 中の安定性は凍結乾燥粉末の安定性程良好でない。 凍結乾燥生成物を再溶解することによって製造される溶液は、標準アンプル、 予備充てん二重チャンバ注射器、又はマルチ投与システムの製造に用いることが できる。溶液は、勿論、投与に対し直ちに使用できる。 本発明を次の実施例により説明する。 例 １ 組換えデスルファトヒルジンHV１（チバガイギーからのCGP39393）の水性溶液 は、それを（ａ）水；（ｂ）５％トレハロース溶液の70容量部およびクエン酸／ K₂HPO₄混合物の30容量部、pH 7.4で 150mM；（ｃ）５％マニトール溶液の30容量 部およびクエン酸／K₂HPO₄混合物70部、pH 7.4で 150mM；および（ｄ）５％マニ トール溶液の30容量部およびK₂HPO₄の70重量部、pH 7.4で 150mM中に溶解するこ とにより製造される。各々の場合、ヒルジンの濃度は30mg／mlである。 溶液を凍結乾燥しそして46℃で保存する。異なる時間、サンプルを水に溶解し １mg／mlヒルジンとし次いで主ピークを RP-HPLCにより測定する。得られた結果 を下記の表１に示す。 安定性は、46℃で拡大された期間保存されたときでさえ高いレベルで維持され ていることがわかる。 例 ２ 組換えデスルファトヒルジンHV１（チバーガイギーからのCGP39393）の水性溶 液を、次の如くそれを種々の糖／シトラート／ホスフェート混合物に溶解するこ とにより製造する。各々の場合、30容量部の糖を、70容量部のシトラート／ホス フェートと混合する。 man 5％：CKP−100mM K₂HPO₄（1.74％）； 7mMクエン酸（0.134％ ）；82mMマニトール（1.5％）； 4mMヒルジン（0.3 ％）． suc 10％：CKP−100mM K₂HPO₄（1.74％）； 7mMクエン酸（0.134％ ）；87.6mMスクロース（３％）； 4mMヒルジン（0 .3％）． tre 10％：CKP−100mM K₂HPO₄（1.74％）； 7mMクエン酸（0.134％ ）；87.6mMトレハロース（３％）； 4mMヒルジン （0.3％）． 溶液を凍結乾燥しそして種々の温度で保存する。一定の保存時間後、サンプル を水に溶解し１mg／mlヒルジンとし次いで主ピークをRP-HPLCにより測定する。 粉末を種々の温度で保存するとき改善された安定性が認められる。通常の周囲 条件よりも恐らくはわずかにより高い26℃で、 132日後に顕著な分解は認められ ない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒルジン、リン酸カリウムおよび糖を含んでなる凍結乾燥医薬組成物。 ２．リン酸カリウムが、燐酸水素二カリウムである、請求の範囲第１項記載の 組成物。 ３．糖が、マニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、フルクト ース、グルコース、マルトース、ラクトース又はデキストランである、請求の範 囲第１又は２項記載の組成物。 ４．ヒルジンが、デスルファトヒルジン（desulphatohirudin）変異体又はそ の突然変異体である、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の組成物。 ５．ヒルジンが、デスルファトヒルジンHV１である、請求の範囲第１〜４項の いずれか１項に記載の組成物。 ６．またシトラートを含有する、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載 の組成物。 ７．成分を水に溶解し次いで溶液を凍結乾燥することによって得られる、請求 の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の組成物。 ８．凍結乾燥前の溶液のpHが４〜10である、請求の範囲第７項記載の組成物。 ９．凍結乾燥前の溶液中のヒルジンの濃度が、0.1〜500 mg／mlである、請求 の範囲第７〜９項のいずれか１項に記載の組成物。 10．凍結乾燥前の溶液が等張である、請求の範囲第７〜11項のいずれか１項に 記載の組成物。