JPH09508532A - 生物試薬固定化媒質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、バイオ試薬を支持物質に固定化でき、乾燥すると耐水性層またはフィルムになる固定化媒質を提供する。本発明の固定化媒質は、（ｉ）液体または流体の結合試薬と（ii）結合試薬中に均一に分散された、固相に固定化されたバイオ試薬複合体とを含む。懸濁液にはさらに、媒質中に均一に分散された補助成分を含んでおり、これらの補助成分は媒質に、電気化学的特性を付与し、固定化したバイオ試薬の安定性を高め、および／または媒質が実質的に耐水性または非水溶性の層になる能力を改善できる。本発明が提供する固定化媒質は均質な液体懸濁液の形である。本発明の固定化媒質は、固定化したバイオ試薬を使用するほぼすべての検定様式に使用できる。例えば、固定化媒質を使用して酵素電極を製造することができ、補助電極および参照電極と共に使用して、酵素の基質の生物学的変換を電気化学的に検出でき、非電気化学的手段を用いて酵素基質の生物学的変換を検出できるバイオセンサを製造することができ、当業界で公知の不均質免疫検定様式に使用できる固相を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 生物試薬固定化媒質 発明の分野 本発明はバイオ試薬の固定化に係る。具体的には、本発明はバイオ試薬を固定 化するための均質に分配できる懸濁液に係る。 発明の背景 特異的結合対の固定化された、または固定化可能な構成要素を使用し、結合型 および遊離型の標識試薬の分離を行なう、種々の結合検定が提唱されている。特 に、検出すべき抗原に対する抗体を、試験管の内壁またはプラスチックビーズの ような固定化物質に結合させる、この種の結合検定が多数記載されている。例え ば、米国特許第４，２４３，７４９号明細書は、試験管の内壁に測定すべきハプ テンに対する特異抗体を不溶化または固定化させた試験管内で反応を実施する、 競合結合検定を開示している。この反応には標識したハプテン接合体を含み、試 験管壁に結合する標識ハプテン接合体の量は測定対象のハプテンの量に反比例す る。同様に、米国特許第４，２３０，６８３号明細書は、抗原または抗体が結合 したポリスチレンビーズを 使用する方法を開示しており、この方法では、抗原または抗体がハプテンと接合 したその抗原に対する抗体または抗体と反応する。結合したハプテン接合抗体は さらに標識した抗ハプテン抗体と反応し、テストサンプル中の抗原または抗体の 量を測定する。 固定化した触媒活性分子、例えば酵素を結合参与体として使用して、テストサ ンプル中に存在する可能性のある固定化した酵素の基質の存在または量を測定す る。市販の化学的分析器では多孔性表面に結合させた酵素を使用して、酵素基質 を光学的または電気化学的に検出できる物質に変換する。管の内壁に酵素を固定 化した管状のナイロン製フローセルを有する光学分析器が記載されている。酵素 を固定化したクロマトグラフ用粒子、例えば微孔性ガラスを含むフローセルを有 する光学分析器も記載されている。 固定化した酵素がその基質に作用して、電気化学的活性分子を形成する能力を 利用した電気化学的センサが記載されている。このようなセンサには、酵素電極 、参照電極、対電極およびポテンシオスタット等の電流電極が含まれる。酵素電 極は一般に白金でできており、その上にオキシダーゼ酵素層が載っている。 この電極を酸化可能な基質および分子状酸素を含むサンプルに浸漬すると、両方 の分子が酵素層に拡散し、基質が酵素と反応し、その結果、酵素が還元される。 還元された酵素は酸素分子で酸化され、酸素分子は還元されて過酸化物になる。 （参照電極によって測定した）電極電位が十分高い場合は、酵素電極の白金部分 がこの過酸化物を酸化して、酸素を再生し、二つの遊離電子を産生する。この遊 離電子は酵素電極から、三つの電極で構成された回路の最後の対電極に向かって 流れる。回路に接続されたポテンシオスタットは電子により生成された電流を測 定することができ、測定された電流はサンプル中に含まれる酸化可能な基質の量 に比例する。従って、サンプル中の酸化可能な基質の存在および／または量が測 定できる。 現在利用できる酵素電極を有する電流電極には、その製造面での制約がある。 これらは、このような電極を製造するために使用する部品が高価であることおよ び／またはその製造に使用する工程が複雑であることに起因する。 例えば、米国特許第４，９８７，０７５号明細書は、イソシアネートモノマー およびポリウレタンポリマーを含むセルロースと結合した酵素の層を付着させた 白金電極を含む酵素電極を 開示している。しかし、電流電極を完成するためには、酵素電極は別の白金電極 を必要とする。 電極表面上に酵素を直接固定化することも記載されている。例えば、合成ポリ マーを使用して白金表面に酵素を固定化させることが記載されており（英国特許 第２，２３０，８６５号明細書）、グルコースオキシダーゼを封入したスルホン 酸化ポリエステルポリマーも白金表面の被覆に使用されており（Analytic Chimi ca Acta ，245 ，139-143(1991)）、白金担持黒鉛電極上のガンマ線照射したポ リビニルアルコール基材中に物理的に封入した酵素が記載されており（Biosenso rs and Bioelectronics，5，47-61(1990)）、シリコーンウェファ上のエラスト マーに酵素を混合したグルコースバイオセンサ電極が記載されており（米国特許 第４，９３８，８６０号明細書）、酵素電極をシリコンウェファ上に製造できる 多層マイクロ製法が記載されている（米国特許第５，２００，０５１号明細書） 。しかし、上記のように、このような電極は高価であり、大量生産に適していな い。 酵素電極を製造する別な方法では、電極物質と酵素の両方を含有するマトリッ クスに酵素を混合する（Anal．Chem.，62， 318-320(1990)）。しかし、そこに記載された方法で製造した電極は、電極を研 磨して新鮮な酵素に露出することにより、定期的に再生する必要がある。 酵素電極を製造する別の方法が米国特許第５，１６０，４１８号明細書に記載 されている。そこに記載された電極は、ゼラチンまたはヒドロキシエチルセルロ ースのような低温結合剤に添加された微細に分割された白金担持炭素に吸着され た酵素を含む懸濁液でできている。次に、この懸濁液を導電性炭素紙上に載せ、 乾燥させる。しかし、結合剤は水溶性であり、その結果、水性サンプルに浸漬す ると懸濁液が溶解する。従って、電極は再使用できない。 発明の概要 本発明によると、バイオ試薬を固定化でき、乾燥すると耐水性の層またはフィ ルムになる固定化媒質が提供される。具体的には、本発明の固定化媒質は、分配 可能な均質な懸濁液の形であり、（ｉ）液体または流体の結合試薬と（ii）固層 に固定化したバイオ試薬の複合体とを含み、この複合体が結合試薬内に均一に分 散されている。懸濁液はさらに媒質中に均一に分散された補助成分を含んでもよ く、これらの補助成分は媒質に電気 化学特性を与え、固定化したバイオ試薬の安定性を高め、および／または乾燥し て、実質的に耐水性または非水溶性の層となる媒質の能力を改善できるものであ る。 本発明の固定化媒質は、固定化したバイオ試薬を使用する本質的にすべての検 定フォーマットに使用できる。本発明の一つの実施態様によると、本発明で提供 される固定化媒質を支持物質に塗布して、支持物質上に非水溶性層を形成するこ とにより酵素電極を製造できる。次に、酵素電極を対電極と参照電極と共に使用 して、その酵素の基質の生物学的変換を電気化学的に検出できる。 本発明の別の実施態様によると、結合試薬および固定化した酵素を含む固定化 媒質を表面に塗布して、非電気化学的手段によりその酵素の基質の生物学的変換 を検出しうるバイオセンサを形成することもできる。 本発明の別の実施態様によると、固定化試薬を、当業界で公知の不均質免疫検 定フォーマットに使用するための固体支持体に塗布することができる。 図面の簡単な説明 第１図は、柔軟性のあるバイオセンサ電極プラットフォーム を示している。 第２図は、電流電極のフローセルアセンブリの拡大図である。 発明の詳細な説明 本明細書には下記の定義を使用できる。定義 本明細書で使用する「分析物」とは、エピトープまたは結合部位を少なくとも 一つ有する、検出または測定すべき化合物または組成物を意味する。分析物は、 それに対する天然の結合相手がある、または結合相手を製造できる物質であれば よい。分析物には、毒素、有機化合物、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、 炭水化物、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤（治療目的および不法 な目的で投与される薬剤を含む）、ウィルス粒子、ならびに上記物質全ての代謝 物および上記物質全てに対する抗体を含むが、これらに限定されるものではない 。例えば、このような分析物には、フェリチン、クレアチニンキナーゼＭＢ（Ｃ Ｋ−ＭＢ）、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン 、バンコマイシン、ゲンタマイシン、テオフィリン、バルプロン酸、キニジン、 黄体ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、エストラジオール、 プロゲステロン、ＩｇＥ抗体、ビタミンＢ２マイクログロブリン、糖化ヘモグロ ビン（Ｇｌｙ．Ｈｂ）、コルチゾール、ジギトキシン、Ｎ−アセチルプロカイン アミド（ＮＡＰＡ）、プロカインアミド、風疹に対する抗体、例えば風疹ＩｇＧ および風疹ＩｇＭ、トキソプラズマ症に対する抗体、例えばトキソプラズマ症Ｉ ｇＧ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ）およびトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ） 、テストステロン、サリチレート、アセトアミノフェン、Ｂ型肝炎ウィルス表面 抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎核抗原に対する抗体、例えば抗Ｂ型肝炎核抗原Ｉ ｇＧおよびＩｇＭ（抗ＨＢＣ）、１型および２型ヒト免疫不全ウィルス（ＨＴＬ Ｖ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体（抗ＨＢｅ ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン（Ｔ４）、総トリヨードチロニ ン（総Ｔ３）、遊離トリヨードチロニン（遊離Ｔ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ） およびアルファ胎児性蛋白質（ＡＦＰ）、およびアンフェタミン、メタアンフェ タミン、バルビツール酸類、例えばアモバルビタール、セコバルビタール、ペン トバルビタール、フェノバルビタールおよびバルビタール、ベンゾジアゼピン類 、例えばリブリウムおよびバリウム、 カンナビノイド類、例えばハシシュおよびマリファナ、コカイン、フェンタニル 、ＬＳＤ、メタプアロン、アヘン類、例えばヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒ ドロモルホン、ヒドロコドン、メタドン、オキシコドン、オキシモルホンおよび オピウム、フェンサイクリジンおよびプロポキシヘンを含むが、これらに限定さ れない依存性薬剤および規制物質を含むが、これらに限定されない。「分析物」 には、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、高分子およびそれらの混合物も含む 。 本明細書に使用する「分析物アナローグ」とは、分析物に特異的な結合相手と 交差反応する物質を意味するが、分析物自体とその程度の大小は問わない。分析 物アナローグには、分析物アナローグが対象の分析物と共通したエピトープ部位 を少なくとも一つ有している限り、修飾した分析物および分析物の断片部分また は合成部分も含むことができる。分析物アナローグの１例は、分析物アナローグ が分析物に特異的な結合相手と結合できるように、分析物分子全体の少なくとも 一つのエピトープを複製する合成ペプチド配列である。 本明細書で使用する「生物学的変換」とは、一つのものから他のものへの物質 の変換を意味する。酵素がその基質に作用し て、変換された基質を生成することがこの生物学的変換の１例である。 本明細書で使用する「検出可能部分」とは、検出可能な物理特性または化学特 性を有し、結合相手を標識するために使用して、結合相手と接合体を形成できる 化合物または従来の検出可能な化学的グループを意味する。このような検出可能 な化学的グループには、酵素活性のあるグループ、例えば酵素、酵素基質、補欠 分子族基または補酵素、スピンラベル、蛍光分子、例えば蛍光剤および蛍光源、 発色団および色原体、発光分子、例えば発光体、化学発光体および生物発光体、 燐光性分子、特異的結合可能なリガンド、例えばビオチンおよびアビジン、電気 活性な種、放射性同位元素、毒素、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、 ポリペプチド、リポソーム、着色粒子、着色微粒子等でありうるが、これらに限 定されるものではない。本明細書で使用する「特異的結合相手」とは、特異的結 合対、すなわち、二つの分子の一方が化学的または物理的手段を介してもう一方 の分子と特異的に結合する二つの異なる分子の一つを意味する。抗原と抗体の特 異的結合対の他に、他の特異的結合対には、アビジンとビオチン、炭水化物とレ クチン、相補的 ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクタ分子と受容体分子、酵素の コファクタまたは基質と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とその配列また は全蛋白質に特異的な抗体、ポリマー酸と塩基、染料と蛋白質結合剤、ペプチド と特異的な蛋白質結合剤（例えば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボ ヌクレアーゼＳ−蛋白質）等を含むが、これらに限定されない。さらに、結合対 には、元の結合相手のアナローグである結合相手、例えば分析物アナローグまた は遺伝子組み換え手法または分子工学により作製した結合相手がある。結合相手 が免疫反応体であった場合、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル 抗体、組み換え蛋白質または組み換え抗体、キメラ抗体、上記物質の混合物また は断片、および結合相手として使用することの好適性が当業者によく知られてい るこのような抗体、ペプチドおよびヌクレオチドの製剤であってよい。 本明細書で使用する「テストサンプル」とは、分析物を含有することが疑われ る物質を意味する。テストサンプルはその供給源から得られたものを直接使用す ることができ、または予備処理してサンプルの特性を変化させた後に使用するこ ともできる。テストサンプルは、任意の生物学的供給源、例えば、血液、 唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、胸水、粘膜、髄液、腹腔液、羊水等 のような生理学的な流体、発酵ブロス、細胞培養、化学反応混合物等から得たも のであってよい。テストサンプルは使用前に予備処理することができ、例えば、 血液から血漿を調製し、粘性流体等を希釈することができる。処理法には、濾過 、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の添加を含むことができる。生物学的流 体または生理学的流体の他に、他の液体サンプル、例えば、水、食品等を使用し て、環境または食品製造検定を実施することができる。さらに、分析物を含有す ることが疑われる固体物質もテストサンプルとして使用できる。場合によっては 、固体のテストサンプルを修飾して、液体媒質を形成する、または分析物を放出 させることが好都合なこともある。 Ｉ．固定化媒質 本発明の固定化媒質は、（ａ）固相に固定化したバイオ試薬と（ｂ）固定化し たバイオ試薬が均一に分散されているラテックス樹脂を含む結合試薬とを含む、 分配可能な均質な懸濁液の形である。固定化媒質は、媒質の特性を増強し、所望 の性能を得るための補助成分も含んでいてよい。混合物の成分は全体と してペンキ様の流体を形成するため、ペンキと同様の物性を有し、支持物質表面 に容易に塗布できる。さらに、混合物は乾燥すると、非水溶性のフィルムを形成 し、混合物を塗布した表面にその成分を固定化する。本発明の固定化媒質は支持 物質にバイオ試薬を永久的に固定化できると理解される。 本発明の媒質は非水溶性のフィルムを形成でき、従って支持物質にバイオ試薬 を永久的に固定化できるため、例えば再使用可能なバイオセンサ酵素電極を提供 するのに有利に使用できる。もちろん、本発明で提供される固定化媒質で製造し たすべての物品は再使用可能であると理解される。 Ａ．固相 本発明によると、固相は、例えば、バイオ試薬を固定化でき、固定化混合物中 に実質的に均一に分散できる、炭水化物、無機物質、有機物質、合成有機物質、 または上記物質の組み合わせからなる固体物質であってよく、好ましくは、微細 に分割した固体物質である。このような固相を選択できる有機物質には、アガロ ース、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基またはヒドラジド官能基を含むア ガロース誘導体、ポリアクリルアミド、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基 またはヒドラジド官能 基を含むポリアクリルアミド等を含むが、これらに限定されない。無機固相物質 には、シリカ、アルミノシリケート（例えば、ゼオライト）、酸化アルミニウム 、炭素または黒鉛粒子、白金族の金属、例えば白金、パラジウムまたはロジウム が吸着している炭素または黒鉛粒子、白金族金属の酸化物が吸着している炭素ま たは黒鉛粒子、一級、二級または三級アミン官能性ポリマーが吸着している無機 物質、四級アンモニウムポリマー、例 含むことができる。さらに、固相を選択できる無機物質および有機物質の組み合 わせには、金属ポルフィリン、例えばコバルトプロトポルフィリンを吸着させた 炭素粒子または黒鉛粒子を含むことができるが、これらに限定されない。好まし くは、固相は直径約２５ミクロン未満で、表面積が少なくとも約２００ｍ²／ｇ である微細に分割された粒子を含んでいる。粒径約０．１ミクロン未満の固相が 特に好ましい。当業者には理解されるように、固相を結合試薬に分散させると、 粒状の固相の大きさが非常に小さくなることがある。従って、固相の元の大きさ は本発明を限定するものではないことはもちろん理解されよう。 微細に分割された固相を使用することの利点は、このような固相はバイオポリ マー固定化能が高いことである。その結果、いくつかのバイオ試薬を一つの固相 粒子に結合することができる。この方法で、結合試薬中に分散させた固相の量を 減少させながら、生物活性を上昇させることが可能である。さらに、微細分割し た固相を使用すると、本発明で提供される媒質が乾燥した後に形成される層また はフィルムのテクスチャが増強される。 Ｂ．バイオ試薬 本発明のバイオ試薬には、分析物、分析物アナローグ、特異的結合対の構成要 素、検出可能部分等を含むが、これらに限定されるものではない。バイオ試薬は もちろん、固定化試薬を使用する目的によって異なると理解される。例えば、酵 素電極の場合、バイオ試薬は酵素であり、上記のような固定化媒質を支持物質に 塗布する。このような酵素には、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシ ダーゼ、乳酸オキシダーゼ、グリセロールリン酸オキシダーゼ、コレステロール オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、リパーゼ、グリセロールキナーゼ 、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クレアチニンデアミナーゼま たは乳酸オキシダーゼを含むが、これらに限定されるものではない。免疫検定の 場合、バイオ試薬は特異的結合対の構成要素である。 II．バイオ試薬の固相への固定化 バイオ試薬は当業界でよく知られている方法で固相に結合することができる。 このような方法には、吸着、イオン結合、共有結合等を含むが、これらに限定さ れない。 Ａ．バイオ試薬の固相への吸着 バイオ試薬は、バイオ試薬を固相に吸着させることにより、固相に固定化し、 固相／バイオ試薬複合体を形成することができる。一般に、バイオ試薬の固相へ の吸着は当業界でよく知られている方法で実施できる。もちろん、バイオ試薬の 固相への吸着能は、この二つの物質を含むバッファのｐＨおよびイオン強度の関 数であることは理解されよう。従って、もちろん、適切な吸着を達成するために 、バイオ試薬と固相を含有するバッファのｐＨおよびイオン強度を、使用してい る具体的なバイオ試薬および／または具体的な固相に応じて変化させうることは 理解されよう。好ましくは、溶液中のバイオ試薬濃度が粒状の固相の表面の非特 異的結合部位を飽和するように、バイオ試薬 を固相混合物に溶解する。従って、バッファのｐＨおよびイオン強度は、バイオ 試薬が固相に最大限吸着されるようなものであることが好ましい。 Ｂ．バイオ試薬の固相へのイオン性固定化 一般に、荷電されたバイオ試薬と反対に荷電された固相による吸引力を利用し て、バイオ試薬を固相に固定化でき、その結果、固相／バイオ試薬複合体が形成 される。好ましくは、正に荷電された化合物が固相に吸着される、または固相と 共有結合する陽イオン性の固相は陰イオン性のバイオ試薬と反応して、固相／バ イオ試薬複合体が得られる。固相に正の荷電を付与するのに適した化合物には、 四級アンモニウムポリマー、例えば 能性ポリマー、例えばポリエチレンーイミン等があるが、これらに限定されない 。 好適な溶媒に溶解した過剰な化合物を固相に添加することにより、これらの化 合物を固相に容易に吸着できる。十分な時間が経過した後、固相は、例えば濾過 または遠心分離により回収できる。固相を好適な溶媒ですすいだ後、固相を再度 回収することにより、残存する化合物をすべて固相から分離することが できる。次に、すすいだ固相は湿ったまま使用し、あるいは、バイオポリマーを 固相にイオン結合させる前に乾燥させることができる。 陽イオン性固相に本質的にイオン結合するであろう陰イオン性のバイオ試薬（ 例えば、酵素および蛋白質）があるが、酵素または蛋白質と固相との間により多 くのイオン結合を形成できるように、酵素またはその一部を陰イオンを付与する ように修飾するのが好ましい。 例えば、酵素または蛋白質に負の電荷を与える一つの方法は、例えば、脂肪族 または芳香族の無水カルボン酸と反応させることである。このような無水カルボ ン酸には、ピロメリト酸二無水物、無水コハク酸、無水マレイン酸等を含むが、 これらに限定されない。 好ましい実施態様によると、例えば、ピロメリト酸二無水物を正に荷電された アミノ基と反応させることにより、酵素または蛋白質に負の電荷を提供し、酵素 または蛋白質に存在するアミノ基を三つの負に荷電された芳香族トリカルボキシ レートに変換することができる。この変換は、酵素または蛋白質の溶液にピロメ リト酸二無水物の水性懸濁液を加えて実施できる。好 ましくは、ｐＨが約６．５から約８．０、好ましくは約７．０から約７．５の好 適バッファに酵素または蛋白質を溶解させる。ピロメリト酸二無水物の量はバイ オポリマー量の約０．０５から約０．５倍、好ましくは酵素または蛋白質の量の 約０．０５倍から約０．１５倍である。アミノ基の芳香族トリカルボキシレート への変換は一般に約５分で完了するが、反応混合物を周囲温度で約１０分から約 ２０分間インキュベートすることが好ましい。次に、この反応混合物を陽イオン 性の固相に直接加えてもよく、陽イオン性の固相と反応させる前に精製してもよ い。 バイオ試薬と固相は反対の電荷を有しているので、この二つの物質間に容易に イオン結合が形成される。一般に、荷電された固相は、陰に荷電されたバイオ試 薬に対する結合能が高い。好ましくは、バイオ試薬の濃度は、固相の陽イオン結 合部位を飽和するようなものである。陽に荷電した固相の懸濁液を陰に荷電した バイオ試薬に添加して反応混合物を形成する場合、バイオ試薬と固相の比は約１ ：１．５から約１：５の間である。好ましくは、反応をｐＨ約６．５から約７． ５のイオン強度の低いバッファ中で、約１分から約３０分間、約２℃から約２５ ℃の温度で実施する。このように形成されたバイオ試薬／固相 複合体は、当業界でよく知られている方法で未結合のバイオ試薬から分離してか ら、結合試薬に加えてもよく、反応混合物中に維持したまま、結合試薬に直接添 加してもよい。複合体を反応混合物から分離する場合、バイオ試薬／固相複合体 を捕らえるのに十分小さく、未結合のバイオ試薬を通過させるには十分大きな孔 径を有するフィルターを使用して、反応混合物を濾過することができる。また、 複合体を遠心分離して、湿ったペレットを形成することもできる。すべての未結 合バイオ試薬を確実に複合体から除去するために、ｐＨ約６．０から約７．５の イオン強度の低いバッファで、捕えた複合体を洗浄することができる。 また、バイオ試薬と固相を一つのステップでイオン結合させ、溶液から共沈さ せることもできる。一般に、この沈殿は、先ずバイオ試薬と固相の一つの溶液を 作製し、溶液をピロメリト酸二無水物で処理し、次に溶液を上記の正に荷電され たポリマーの一つで処理して実施する。好ましくは、バイオ試薬と固相の比は約 １：１から約１：５であり、溶液中のピロメリト酸二無水物の量は溶液中のバイ オ試薬の量の約０．０５倍から約０．１５倍である。 もちろん、バイオポリマーを固相にイオン結合させうる方法は、本明細書に記 載の方法に限定されるものではなく、当業界で公知の他の方法も同様に使用でき ることが理解される。 Ｃ．バイオ試薬の固相への共有結合による固定化 バイオ試薬と固相との間に形成される共有結合により、バイオ試薬を固相に固 定化して、バイオ試薬／固相複合体を形成することができる。このような共有結 合を形成するために、バイオ試薬と共有結合を形成できるように固相を修飾する ことができる。このような固相の修飾には、固相への官能基、例えばアミン基、 カルボン酸基、エポキシド基等を添加することが含まれるが、これらに限定され ない。例えば、当業界でよく知られた方法を使用し、シリカをアミノプロピルト リエトキシシランまたはポリエチレンイミンで誘導体化できる。このような修飾 が完了した後、当業界でよく知られた方法で、アミノ化した固相をさらに誘導体 化して、他の官能基を導入することができる。次に、当業界でよく知られた方法 で、バイオ試薬を誘導体化した固相に共有結合させることができる。例えば、水 溶性カルボジイミド、例えば３−エチル１−（３−ジメチルアミノプロピル）カ ルボジイミド、または同様のカルボン酸活性化剤を、修 飾した固相とバイオ試薬を含有する適当なバッファに加えて、共有結合したバイ オ試薬／固相複合体を形成することができる。この複合体はカルボン酸とアミノ 基との間のアミド結合を介して形成される。 また、上記のように、修飾した固相を修飾した酵素と反応させることもできる 。このような修飾した酵素には、当業界でよく知られた方法を使用して、上記の ようなピロメリト酸二無水物、または他の一無水物または多無水物、例えばＮ− カルボキシ−α−アミノ酸無水物で修飾したもの等を含むが、これらに限定され ない。 バイオポリマーを固相に共有結合する別の方法では、当業界でよく知られてい るヘテロ二官能性結合化合物を使用できる。このような化合物には、ｍ−マレイ ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホス クシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Ｓ−ＳＭＰＢ）、 ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（Ｓ−ＭＢＳ）、Ｎ− γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スクシン イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレー ト（ＳＭＣＣ）、米国特許第４，９９４，３８５号明細書に記載のもの等を含む が、これらに限定されない。二つの化合物を共有結合させるためにこのような化 合物を使用する方法は当業界でよく知られている。 本発明によると、１種またはそれ以上のバイオ試薬を固相に固定化できると理 解される。例えば、個々の抗原に特異的な異なる抗体を一つの固相に固定化でき る。別の例では、個々の基質に特異的な異なる酵素を一つの固相に固定化できる 。 もちろん、バイオ試薬を固相に共有結合できる方法は本明細書に記載の方法に 限定されるものではなく、当業界で公知の他の方法も使用できると理解される。 III．結合試薬 本明細書に記載のように、バイオ試薬を固相に固定化して、バイオ試薬／固相 複合体を形成した後、バイオ試薬／固相複合体を結合試薬と合わせて、本発明の 固定化媒質を形成する。結合試薬はバイオ試薬／固相複合体がその中に均一に分 散されている液体または流体である。結合試薬は支持物質表面で乾燥すると、バ イオ試薬／固相複合体をその表面に不可逆的に接着させることができる。予期し なかったことに、また、驚くべき ことに、本発明によると、結合試薬は乾燥すると、物理的耐久性のある耐水性層 となり、この層はバイオ試薬の生物学的活性を保持する。さらに、結合試薬は、 滑らかな表面または非多孔性表面ならびに多孔性表面を含むが、これらに限定さ れない、種々の表面に接着する。 結合試薬が流体であるため、本発明の固定化媒質は種々の方法で支持物質に分 配または施工できる。従って、例えば、固定化媒質は、塗布、ポンピング、液体 計量、スクリーン印刷、噴霧、ジェッティングまたは固定化媒質への支持物質の 浸漬により、分配できる。さらに、固定化媒質は周囲温度で乾燥できるので、媒 質中に分散させたバイオ試薬／固相複合体はバイオ試薬成分を変性させる可能性 のある有害な温度になることがない。 さらに、固定化媒質は乾燥して耐水性の接着層になるため、固定化媒質を塗布 するまたは乾燥させる表面は再使用できる。さらに、塗布する表面の種類により 結合試薬が限定されることはない。 本発明の結合試薬はラテックス樹脂である。本発明に適するラテックス樹脂に は、アクリルラテックス、酢酸ビニルラテッ クス、スチレンアクリルラテックス、ポリウレタンラテックス等の一又は二以上 が含まれるが、これらに限定されるものではない。結合試薬は、媒質に電気化学 特性を提供し、固定化されたバイオ試薬の安定性を高め、および／または媒質が 乾燥して、実質的に耐水性または非水溶性層になる能力を改善する補助成分も含 むことができる。このような補助成分には、可塑剤、濃厚剤、フィルム形成剤、 安定剤、分散剤、消泡剤、電気化学的活性物質等を含むが、これらに限定されな い。このような任意成分の例には、可塑剤、例えばフタル酸ジブチルおよびセバ シン酸ジオクチル、濃厚剤、例えばヒドロキシエチルセルロース、シリカおよび Acrysol SCT 200、フィルム形成剤、例えば２−エトキシエタノール、エチレン グリコールモノプロピルエーテルおよび２−（２−ブトキシエトキシ）エタノー ル、安定剤、例えば蔗糖、トレハロース、デキストランおよびポリエチレン 消泡剤、例えば２−オクタノール、および電気化学的活性な薬剤、例えば白金担 持炭素または白金担持黒鉛等を含むが、これらに限定されない。 もちろん、固定化試薬に含まれる化合物およびその量は、添 加する特定の固相、使用する分配工程、または乾燥ステップおよび硬化ステップ の特性に依存することは理解されよう。例えば、可塑剤はコーティングのひび割 れを防止するために必要とされる可能性があり、濃厚剤は懸濁した固体の沈殿を 防止するために望ましい可能性があり、フィルム形成剤、一般に有機溶媒は、可 塑剤を安定化し、滑らかなコーティングが得られ乾燥速度を調整するために必要 な可能性があり、安定剤は乾燥工程の間および後にバイオポリマーの安定化を促 進するために必要な可能性があり、分散剤はポリマーの凝集を防止するために必 要な可能性があり、消泡剤は混合の間の気泡形成を減少させるために必要な可能 性があり、電気化学的活性な薬剤は固定化媒質を電気的および／または電気化学 的に活性化するために必要な可能性がある。可塑化、濃厚化、フィルム形成、分 散、消泡および導電性を強化するために使用できる特定の化合物およびその量は 、ラテックス塗料業界でよく知られており、当業者の知識の範囲である。 結合試薬に添加できるバイオ試薬／固相複合体および補助的固体の最適量は、 固定化媒質の臨界的顔料容量濃度（ＣＰＶＣ）の関数である。当業者に理解され るように、ＣＰＶＣは結合試 薬と結合試薬に含まれる顔料（粒子）の量の関係を意味する。ＣＰＶＣ未満の結 合試薬は、粒子が埋め込まれているが、互いに接触してはいない連続的な結合試 薬相を有するコーティングを形成する。反対に、ＣＰＶＣを超える結合試薬は連 続した結合試薬相を有していないが、埋め込まれた粒子は互いに接触している。 ＣＰＶＣを超える試薬で形成されたコーティングの物理特性はＣＰＶＣ以下の 試薬で形成されたコーティングの物理特性と異なる。例えば、電気的輸送および バリア輸送、密度、機械強度等の特性がＣＰＶＣの影響を受ける。本発明による と、予期しなかったことに、また、驚くべきことに、結合試薬中に懸濁した固体 の量が実質的にＣＰＶＣより高い場合、コーティングの導電性および透過性は、 コーティングの物理強度を損なうことなく、最適化されることが判明した。 固相／バイオ試薬複合体懸濁液を結合試薬に直接添加しても、結合試薬に添加 する前に、回収して、洗浄してもよいことは理解される。もちろん、結合試薬に バイオ試薬／固相物質を物理的に分散させる方法が固定化媒質で作製されたフィ ルムの性質に影響を与える可能性があることは理解される。従って、均質 な混合物を形成するために、バイオ試薬／固相複合体を結合試薬に十分分散させ ることが好ましい。複合体を分散させる方法には、高剪断均質化、ボールミル処 理等を含むが、これらに限定されない。 本発明の固定化媒質を形成する場合、一又は二以上の異なる種類のバイオ試薬 ／固相複合体を結合試薬中に分散させることができると理解される。例えば、固 相に固定化した１種の酵素を、固相に固定化した別の種類の酵素を含有する固定 化媒質に加えることができる。同様に、固相に固定化した一つの抗原に特異的な 抗体を、固相に固定化した別の抗原に特異的な抗体を含有する固定化媒質に加え ることができる。もちろん、このような添加は同時にも順次にも実施できること も理解されよう。 IV．支持物質 一般に、本発明の支持物質には、ビーズ、磁気粒子、微粒子またはマクロ粒子 、管、試験管、マイクロタイタプレート、電気化学的物質、膜等を含むが、これ らに限定されない。このような支持物質は合成物質、天然物質、または合成的に 修飾した天然物質から製造でき、セルロース物質、例えば紙、セルロー スおよびセルロース誘導体、例えば酢酸セルロースおよびニトロセルロース、ガ ラス繊維、天然の布、例えば綿、合成の布、例えばナイロン、多孔性ゲル、例え ばシリカ、アガロース、デキストランおよびゼラチン、多孔性繊維マトリックス 、澱粉をベースとする物質、例えば架橋結合したデキストラン鎖、セラミック材 料、オレフィン、またはポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ アミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸ビニルと塩化ビニルのコポリマ ー、ポリ塩化ビニルとシリカの混合物を含む熱可塑性物質を含むが、これらに限 定されない。 もちろん、固定化媒質を塗布する支持物質は固定化媒質を支持できなければな らず、表面は支持の目的に適したものでなければならないことは理解されよう。 例えば、固定化媒質を電流電極または電位差電極として使用しようとする場合、 表面は電気化学的伝導性のある物質であるか、かかる物質と結合していることが 好ましい。このような支持物質には、銅、白金、金、パラジウム、チタン、導電 性の炭素または黒鉛インクで被覆したチタン、導電性プラスチック等を含むが、 これらに限定されない。 本発明によると、一つの表面を複数の固定化媒質のコーティングで被覆するこ とができる。特に、表面を同じ固定化媒質の複数の層で被覆することができ、あ るいは、二つ以上の異なる種類の固定化媒質で順次被覆することもできる。例え ば、コレステロールオキシダーゼ／固相複合体を含む固定化媒質を白金担持炭素 支持物質に塗布し、乾燥させた後、コレステロールエステラーゼ／固相複合体を 含有する第二の固定化媒質を塗布し、乾燥させて、テストサンプル中のコレステ ロール量を測定するための酵素電極を形成することができる。 Ｖ．バイオリアクタおよびバイオセンサ 本発明によると、バイオリアクタは、本発明の固定化媒質を反応生成物の検出 に関与しない表面に塗布することにより製造できる。この実施態様によると、乾 燥させた固定化媒質にサンプルを接触させる間または後に、光学指示物質をサン プルに加えることにより、サンプル中の基質の存在／量を光学的に測定すること ができる。光学的指示物質は、酵素とその基質との反応の副産物と反応して、例 えば、色、蛍光および発光の変化を生じさせるものであってよい。例えば、生じ た色、蛍光、発光を基質が既知量の場合の予期値と比較することにより、サン プル中に存在する基質の量を定量できる。この比較は可視的に、または分光光度 計、蛍光計または発光計のような分析器で実施できる。 本発明の固定化媒質は、バイオセンサデバイスの製造にも使用でき、このデバ イスでは酵素基質の反応を電気化学的センサまたは光学センサで直接モニタする 。電気化学的バイオセンサは、本明細書上記のように、電導性固相および／また は電気化学的活性な固相を含有する本発明の固定化媒質を、導電性指示物質に塗 布または分配し、乾燥させることにより作製できる。もちろん、電導性および／ または電気化学的に活性な固相の上にバイオポリマーを固定化させることができ 、あるいは、このような固相を補助的成分として、バイオポリマー／固相複合体 を含有する固定化媒質に加えることができると理解されよう。また、例えば、酵 素／固相複合体を含有する固定化媒質を電気化学的に活性なセンサデバイスの上 にコーティングとして塗布してバイオセンサを作製できることももちろん理解さ れよう。 次に、その上に固定化媒質を乾燥させたこのような支持物質を電流または電位 差検出デバイスと共に使用して、テストサン プルと接触させたときにこのような支持物質により生じる電流または電圧を測定 することができる。このようなデバイスの構成は当業者には容易に明らかであろ う。光学センサの実施態様では、固定化試薬を光学センサの表面、例えば反射し たまたは化学的に調整された光を測定できる光ファイバデバイスの末端に塗布す ることができる。例えば、本発明で提供される固定化媒質は、米国特許第４，８ １０，６５５号明細書および米国特許第４，９２５，２６８号明細書に記載のよ うな酸素濃度を光学的に検出できる酸素センサに使用することができる。次に、 オキシダーゼ酵素による酸素の消費をこのようなセンサで直接測定することがで き、これは消費されたオキシダーゼの共基質の量と比例する。 VI．結合検定 本発明によると、固定化媒質を、当業界で公知の慣用の特異結合検定フォーマ ットと共に使用する試薬の作製にも使用できる。このような方法には、競合免疫 検定、サンドイッチ免疫検定、イムノメトリック免疫検定等を含むが、これらに 限定されない。 このような検定を実施するための検定試薬は多様な形を取り うるが、一般に、（１）検出すべき分析物、（２）分析物に対する特異的結合相 手および（３）標識した試薬を含む。検定試薬は同時にまたは順次混合すること ができ、結合の程度が存在する分析物の量の関数となるように、標識した試薬は 対応の結合相手と結合する。通常は、結合した種と遊離している種とを互いに物 理的に分離し、使用した特定の標識の活性を測定することにより、各画分中に存 在する標識の量を測定する。このような分離は、これらの種の一つを支持物質に 固定化し、捕獲試薬を形成することにより実施することが多い。このような捕獲 試薬は、本明細書に記載の支持物質に固定化媒質を塗布することにより作製でき る。例えば、競合的不均質免疫検定方式では、特異的な結合相手例えば抗体を支 持物質に固定化し、捕獲試薬を形成することができる。次に、分析物を含有する テストサンプル、捕獲試薬、および検出可能部分で標識した分析物を含む標識し た試薬を含む反応混合物を形成して、上記のような結合型の種および遊離型の種 、すなわち、標識した試薬に結合した分析物と捕獲試薬に結合した標識分析物を 形成する。これらを分離し、分析物に結合した標識試薬の量または捕獲試薬に結 合した標識試薬の量を検出し、テストサンプル中に存在する分析 物の量と相関させることができる。同様に、サンドウィッチ型不均質免疫検定方 式では、分析物を含有するテストサンプルを、支持物質に固定化させた抗体と検 出可能部分で標識した抗体を含む標識試薬とに接触させて、固定化した抗体、分 析物および標識試薬を含む固定化複合体を形成する。これらを分離し、固定化し た複合体中の標識試薬の量、または遊離の標識試薬の量を検出し、テストサンプ ル中に存在する分析物の量と相関させることができる。 従って、このような免疫検定方式に使用するための捕獲試薬は、本発明の固定 化媒質を使用し、本発明の固定化媒質を支持媒質に塗布して製造できるが、この 固定化媒質は、例えば、本発明の教示に従って、固相に固定化した特異的結合相 手を含む。 検定終了時、このような捕獲試薬は、所望に応じて、次の検定に使用するため に再生することができると理解される。捕獲試薬の再生特性は、このような試薬 を作製するために使用する乾燥した固定化試薬の安定性によるものである。当業 界でよく知られた方法により、捕獲試薬から結合した分析物を解離させることに より、捕獲試薬を再生できる。 VII．テスト用キット 本発明のテスト用キットは、本発明の固定化媒質を塗布した支持物質を使用す る、本発明で考慮する種々の検定を実施するために必要な必須な試薬を全て含ん でいる。このようなテスト用キットは、試薬の適合性が許容する組成物または混 合物として、必要な試薬を保持する一つまたは複数の容器の組み合わせとして、 市販のパックの形で提供される。テスト用キットは、もちろん、当業界で公知の 、市販品使用者の観点から望ましい可能性のある他の物質、例えば、バッファ、 希釈剤、予備処理用試薬等を含むことができることを理解されよう。 一つの実施態様によると、テスト用キットは上記のような不均質免疫検定を実 施するために提供され、ここで使用される捕獲試薬は本発明の固定化媒質を含む 。 以下の実施例は本発明を限定するためのものではなく、本発明を説明するため のものである。 実施例１ グルコースオキシダーゼ酵素電極の製造 グルコースオキシダーゼを白金担持炭素に固定化し、次に、吸着された酵素を 、カルボキシル化ポリスチレン／アクリル樹 脂（Ｐｌｉｏｌｉｔｅ樹脂７１０４）および水溶性スルホン化ポリエステルポリ マー（ＡＱ５５）を含有するコーティング溶液に混合する。この処方を均質な混 合物を形成するのに最適化し、この混合物を導電性炭素インク表面上に被覆し、 電気化学的にテストした。ＡＱ５５ポリマーは白金担持炭素を樹脂全体に分散さ せ、樹脂が乾燥したときに接着性コーティングを形成するのに役立つ。材料 １．白金１０％を含有する白金担持Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ ７２（カーボンブラッ ク）（Ｅ−Ｔｅｋ社、米国マサチューセッツ州フラミンガム） ２．グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由 来、グレードＩ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ、米国インディアナ州インディアナポリス） ３．リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ Ｎ ａＣｌ、ｐＨ６．０） ４．ＡＱ５５ポリマー（固体、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国テネ シー州キングスポート） ５．Ｐｌｉｏｌｉｔｅ Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ樹脂７１０４（Ｇｏｏｄｙｅａｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国オハイオ州アクロン）手順 白金担持炭素（５０ｍｇ）をＰＢＳバッファ（０．４ｍｌ）に加え、Ｏｍｎｉ Ｍｉｘｅｒ２０００（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国コネチカッ ト州ウォーターベリーから市販）を使用し、最高速度１分間均質化した。ＧＯＤ 溶液（ＰＢＳ ０．１ｍｌ中６．９ｍｇ）を白金担持炭素に加えて、懸濁液を形 成し、上記のように均質化した。次に、懸濁液を周囲温度で１時間インキュベー トしてから、ＡＱ５５ポリマー（水０．１５ｍｌ中４２ｍｇ）を加え、懸濁液を 上記のように再度均質化した。次に、樹脂（固形分４４％の溶液０．０７５ｍｌ ）を加え、懸濁液を上記のように均質化した。ペンキブラシを使用して、特注の 電流電極の表面に、得られた固定化媒質を２回塗布した。 ここで図面を参照して、第１図は、本発明で使用する電流電極を作製するため に使用する柔軟な電極プラットフォーム１０を示している。導電性部分２０、２ ２、２４、２６および２８ は導電性炭素（Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ、米国インディアナ州フィッ シャーズから市販）であり、ポリエステル製の固体基板１５にスクリーン印刷し た。銀／塩化銀インク（Ｏｌｉｎ Ｈｕｎｔ、米国カリフォルニア州オンタリオ から市販）を直径１．０ｍｍの参照電極１１を導電性部分２０の頂部にスクリー ン印刷し、ポテンシオスタットとの電気的接点のためには導電性銀および炭素部 分（Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販）を使用した。作動電極は、導 電性部分２２、２４、２６および２８の頂部に固定化媒質約０．５μｌを小さな インクブラシで塗布して、直径約１．０ｍｍの円形の媒質付着体３０、３２、３ ４および３６を形成した。 第２図によく示されているように、柔軟な電極プラットフォーム１０に固定し たスクリュー７０、ナット８０、およびガイドピン９０および１００、ならびに 、小型の硬いプラスチック裏打ちプレート４０と大型の硬いプラスチック裏打ち プレート６０の間に柔軟なシラスティックのガスケット５０がある。スクリュー ７０およびピン９０および１００が上記成分全てを通るようにするために、小型 裏打ちプレート４０に開口部７２、７４および７６を設け、柔軟な電極プラット フォーム１０に開口部１２、１４および１６を設け、ガスケット５０に開口部 ５２、５４および５６を設け、大型裏打ちプレート６０に開口部６２、６４およ び６６を設けた。 ガスケット５０は溝５８も具備し、作動電極３０、３２、３４および３６およ び参照電極１１の上に固定すると、４０μｌのフローセルが形成された。大型裏 打ちプレート６０には孔６７および６８があり、孔６７および６８はガスケット ５０に隣接して適切に固定するとフローセルの流入孔および流出孔として機能す る。この電気化学的セル用補助電極は、大型裏打ちプレート６０上に導電性炭素 インク層６５（Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販）を分配して作製し た。 完成した電極フローセルを導電性部分２０、２２、２４、２６および２８を介 してポテンシオスタットデバイスに接続した。蠕動ポンプを使用してＰＢＳバッ ファと３ｍＭのグルコースカリブレータ（ＰＢＳ中）を別々にフローセル内に入 れた場合の各々の電流をポテンシオスタットで測定した。初期負荷電流を散逸さ せた後、作動セル電位３５０ｍＶで、グルコースオキシダーゼの作用によってグ ルコースと酸素から生成された過酸化水素の酸化からの最高電流を測定した。正 味のグルコース信号は、バッファシグナルとグルコースシグナルとの電流の差と して計算した。結果 先ず、グルコース電極はグルコース１ｍＭ当たり１９４８ｎＡの電流を生成し た。シグナルは室温で１週間のテスト期間中に定常的に低下したが、コーティン グは無傷のままであった。従って、電極の製造に使用したコーティングは活性が あり、耐久性を持ち、再使用可能であった。 実施例２ 白金担持炭素に吸着させたグルコースオキシダーゼを使用した酵素電極の製造 実施例１と比較し、このコーティング手順では、異なる樹脂と混合手順を使用 した。速乾性で、接着性を有し、顔料を乳化できるような市販の工業用インク処 方から下記の樹脂を選択した。混合手順は高剪断速度が得られるものであり、従 って、顔料を非常によく分散し、小さな粒径が得られた。この滑らかなエマルジ ョンを得るために、歯科用アマルガム混合用デバイスＷＩＧ−Ｌ−ＢＵＧ（Ｃｒ ｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、米国イリノイ州リ ヨン）中で処方成分を混合した。このミキサーはボールベアリングを持つ２ｍｌ のステンレススチールバイアル中で処方を機械的に撹拌す るので、０．５ｍｌから１ｍｌのコーティング製剤を混合できる。材料 １．白金を１０％含有する白金担持Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ ７２（カーボンブラッ ク） ２．ＧＯＤ ３．ＰＢＳ ４．アクリル樹脂混合物（下記の処方、不揮発性固形分３１．６％）アクリル樹脂混合物の成分 重量％ Joncryl 537アクリルエマルジョン（Johnson Wax、 米国ウィスコンシン州ラシーヌ） ５４ Joncryl 56 アクリル樹脂（Johnson Wax、 ２７ DMAMP 80（Angus Chemical社、米国イリノイ州 ノースブルック） １ Ektasolve EP（Eastman Chemicals） ９ 蒸留水 ９手順 ＰＢＳバッファ中の白金担持炭素の懸濁液にＰＢＳバッファ中のＧＯＤの溶液 を加えることにより、白金担持炭素に酵素を吸着させた。一つの懸濁液はＰＢＳ ０．４４ｍｌと５０ｍｇ／ｍｌのＧＯＤ溶液０．２ｍｌ中に白金担持炭素１０ １ｍｇを含み、もう一方の懸濁液にはＰＢＳ ０．２ｍｌと５０ｍｇ／ｍｌのＧ ＯＤ溶液０．１ｍｌ中に白金担持炭素５１ｍｇを含んでいる。混合物を周囲温度 で約１時間半、静かにインキュベートした後、２０００ｒｐｍで遠心分離した。 上清を捨て、得られた湿ったＧＯＤ／炭素ペレットを樹脂混合物０．８ｇに再懸 濁し、ＷＩＧ−Ｌ−ＢＵＧ中で１０分間混合した。得られたコーティング溶液を ブラシで別々の電極上に塗り、実施例１と同様にテストした。この二つのコーテ ィング溶液の処方は下記表１に示す。 結果 処方１および処方２の両者共で、優れた接着性を有し、ひび割れや亀裂のない コーティングが作製された。処方２は樹脂の割合が高かったため、やや光沢があ った。実施例１と同様に、過酸化水素およびグルコースの反応ならびに残留バッ クグラウンド電流および電気抵抗について電極をテストした。これらのテスト結 果を下記表２に示す。 上記の結果は、処方中の樹脂対固体（炭素）の比は、グルコースおよび過酸化 物に対する電気化学的反応に影響を与えるが、バックグラウンド電流および電気 抵抗に対してはわずかな影響しか与えなかったことを示した。炭素（顔料）が臨 界顔料容量比に近い場合、コーティングの導電性および透過性は最適となるが、 コーティングの物理的強度を損なう程高くはなかった。 実施例３ シリカにイオン結合したグルコースオキシダーゼを使用した酵素電極の製造 本方法では、四級ポリマーで可溶性シリカと酵素を溶液から共沈させた。正に 荷電したポリマー／シリカに対するＧＯＤのイオン的親和性を上昇させるために 、ＧＯＤをピロメリト酸二無水物で修飾した。その結果、ＧＯＤ活性はほとんど またはまったく損失することなく、アルカリ性ｐＨでの失活を防ぐよう、酵素を 安定化させた。材料 １．１０％白金を含有する白金担持Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ ７２（カーボンブラッ ク） ２．ＧＯＤ ３．修飾したリン酸緩衝バッファ（ＭＰＢＳ：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸 および０．１％Ｋａｔｈｏｎ ＣＧを保存料として含有する１００ｍＭリン酸ナ トリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４） ４．Ｓｎｏｗｔｅｘ ＵＰ、２０％可溶性コロイド様シリカ溶液（日産化学工業 、日本、東京） ５．ピロメリト酸二無水物（１，２，４，５−テトラカルボン酸二無水物、Ａｌ ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー） ６．Ｍａｇｎｉｆｌｏｃ ５９１Ｃ、２０重量％四級アンモニウムポリマー水溶 液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ社、米国ニュージャージー州ウェイン ） ７．アクリル樹脂混合物（下記の処方、不揮発性固形分８．８５％）アクリル樹脂混合物の成分 重量％ Joncryl 537 アクリルエマルジョン（Johnson Wax） １５．５ フタル酸ジブチル（Fluka Chemical、スイス・ ブックス） １．７ 水酸化ナトリウム（３％溶液） ２．１ ２−エトキシエタノール（Aldrich Chemicals） ５．０ 蒸留水 ７５．７手順 ＧＯＤ（２０ｍｇ）をＭＰＢＳバッファ２ｍｌに溶解し、Ｓｎｏｗｔｅｘ Ｕ Ｐ（可溶性シリカ１００ｍｇ）０．５ｍｌ を加えて、混合物を形成した。次に、調製したばかりのピロメリト酸二無水物の 懸濁液（水１ｍｌ中２０ｍｇ）０．１ｍｌを混合物に加えると、混合物は濁った 。室温に約１０分間置くと、混合物は清澄になり、二無水物のアシル化反応が完 了したことを示した。反応終了後、反応混合物にＭａｇｎｉｆｌｏｃ ５９１Ｃ の２０ｍｇ／ｍｌ水溶液０．４ｍｌ（四級アンモニウムポリマー８ｍｇ）を加え た。Ｍａｇｎｉｆｌｏｃ溶液を加えると、シリカおよび大部分のＧＯＤが沈殿し た。沈殿を遠心分離し、水で３回洗って、可溶性の塩を除去した。最終的なペレ ットを焼結ガラスフィルター上でアセトン１０ｍｌを使用して乾燥させると、シ リカ、四級ポリマーおよびＧＯＤを含有する黄色の粉末８９．５ｍｇが得られた 。 ＧＯＤ／シリカコーティング試薬は、上記のＧＯＤ／シリカ６６．０ｍｇと上 記のアクリル樹脂混合物９３４ｍｇを合わせて調製した。白金担持炭素（Ｖｕｌ ｃａｎ ＸＣ ７２）コーティング試薬は、乾燥した白金担持炭素６６．０ｍｇ とアクリル樹脂混合物９３４．０ｍｇを合わせて調製した。両者をＷＩＧ−Ｌ− ＢＵＧ中で３分間混合した。これらの二つの溶液を使用して、表３に示す試薬を 調製した。各試薬溶液のアリコ ート（０．４μｌ）を、ガラスの毛細管マイクロピペットを使用して、手で作動 電極（実施例１と同様）に載せ、１５時間乾燥させた。得られた電極を、ＰＢＳ バッファ中０．１ｍＭ過酸化水素と５ｍＭのグルコース溶液を使用し、３５０ｍ Ｖでポテンシオスタットでテストした。電流は周囲温度で測定し、下記表４に示 す。電極はＰＢＳバッファ中、周囲温度で保存した。湿潤状態で５日間保存した 後に、再度テストした。保存後に得られた結果も下記表４に示す。 データは、実施例２と比較し、過酸化物反応は１０倍、グルコース反応は２− ３倍となり、電極の安定性も改善されたことを示している。データはまた、許容 できるグルコース反応を維持しながら、白金担持炭素と酵素／シリカ比は変化さ せうることも示している。 実施例４ グルコースオキシダーゼと濃厚化剤を使用した酵素電極の製造 本実施例は、酵素電極の反応に対する濃厚剤の作用を示している。また、電極 の安定性および反応の直線性に対する酵素固定化法の作用も示している。濃厚剤 （Ａｃｒｙｓｏｌ ＳＣＴ ２００）を使用すると、より高い過酸化物反応を有 し、電極ごとのばらつきの少ないコーティングが得られた。この理 由は明らかではないが、疎水性または親水性を持つ濃厚剤はコーティングへの溶 媒の浸透を改善する可能性があると考える。次の三つの方法でＧＯＤを固層に接 着させた。（１）カルボジイミド結合により白金担持炭素をＧＯＤに共有結合さ せること、（２）炭素にイオン結合させること、（３）実施例３に記載のように シリカにイオン結合させること。材料 １．１０％白金を含有する白金担持Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ ７２（カーボンブラッ ク） ２．ＧＯＤ ３．ＭＰＢＳ ４．ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファ（１ｍＭエチレンジアミン四酢酸および０．１％ Ｋａｔｈｏｎ ＣＧを保存料として含有する、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ ００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０） ５．ＭＥＳバッファ（５０ｍＭモルホリノエタンスルホネート、ｐＨ５．０） ６．ＥＤＡＣ（３−エチル１−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国ミ ズーリ州セントルイスから市販） ７．Ｍａｇｎｉｆｌｏｃ ５９１Ｃ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ） ８．ピロメリト酸二無水物（１，２，４，５−テトラカルボキシレート二無水塩 、Ａｌｄｒｉｃｈ）１．共有結合法（ＥＤＣ法） 水４ｍｌ中にＥＤＣ８０ｍｇを含有する溶液を、白金担持炭素の懸濁液（ＭＥ Ｓバッファ４０ｍｌ中１０００ｍｇ）に加えて、混合物を形成した。直ちに、混 合物にＧＯＤ（２００ｍｇ）を加え、混合物を室温で一晩（約１２時間）混合し た。一晩混合した後、過剰な液体を混合物から除去した。炭素／ＧＯＤ混合物は ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファで１回洗ってから、種々の結合試薬に添加した。２．ＰＭＡ−ＧＯＤ炭素／Ｑｕａｔ結合法 ＧＯＤ（２００ｍｇ）をＭＰＢＳバッファ２０ｍｌに溶解し、溶液を形成した 。調製したばかりのピロメリト酸二無水物の懸濁液（水１ｍｌ中２０ｍｇ）１ｍ ｌを混合物に加えて、反応混合物を形成した。室温に約１０分間置くと、混合物 は濁った状態から透明になり、二無水物アシル化反応が完了 したことを示した。反応終了後、反応混合物を、上記のように約３０秒間均質化 してある白金担持炭素（１０００ｍｇ）、Ｍａｇｎｉｆｌｏｃ ５９１Ｃ（１０ ０ｍｇ）および水（１２．５ｍｌ）の懸濁液と合わせた。陰イオン性ＧＯＤを加 えると、陽イオン性炭素が凝集し、これを遠心分離により回収した。次に、炭素 ／ＧＯＤ複合体をＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファで洗い、遠心分離して、洗浄液を除 去した。３．ＰＭＡ−ＧＯＤシリカ／Ｑｕａｔ 上記のようにこのバイオポリマー／固相結合手順に使用する方法は、実施例３ に記載の方法と同じであるが、アセトン乾燥ステップが削除されている点だけが 異なった。樹 脂 １．アクリル樹脂混合物Ａ（濃厚剤なし、不揮発性固体分 ３８．５％） 成 分 重 量 ％ Joncryl 537 アクリルエマルジョン ６８．４ フタル酸ジブチル ７．０ 水酸化ナトリウム（３％溶液） ８．７ ２−エトキシエタノール ２０．６２．アクリル樹脂混合物Ｂ（濃厚剤あり、Ａｃｒｙｓｏｌ） 成 分 重 量 ％ アクリル樹脂混合物Ａ ７６．９ Acrysol SCT2000（Rohm and Hass、米国ペンシル バニア州フィラデルフィア） ２３．１電 極 下記の量で（表５）固相ＧＯＤ調製物を樹脂混合物と合わせ、次に混合し、分 配し、実施例３に記載のようにテストした。 グルコース水溶液（０．５ｍＭおよび１０ｍＭ）を使用し、電極を製造直後お よび４５℃で１１日間、湿潤条件で保存後にテストした。減衰データを下記表６ に示す。 表６に示す結果は、ＧＯＤを炭素またはシリカにイオン結合させたときに、グ ルコース反応が特に高いことを示している。シリカに結合した酵素も、熱処理後 でも、シグナル、直線性および安定性がよく調和していた。 実施例５ 酵素結合剤としての陽イオン性シリカの製造 本実施例は、薫蒸シリカおよび可溶性シリカがある種の市販の四級ポリマーを 吸着して、大量の陰イオン性酵素を吸着する 物質を形成することを示している。陰イオン性酵素として、本明細書ではグルコ ースオキシダーゼおよびピロメリト酸で修飾されたコレステロールオキシダーゼ を例示している。材料 １．ＧＯＤ ２．コレステロールオキシダーゼ（Ｎｏｒｃａｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉ ｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） ３．ＭＰＢＳ ４．ＰＢＳ／ＥＤＴＡ ５．Ｓｎｏｗｔｅｘ ＵＰ、可溶性コロイド様シリカ２０％溶液 ６．薫蒸シリカ（０．００７μ、Ｓｉｇｍａ） ７．Ｇａｆｑｕａｔポリマー（ＧＡＦ社、米国ニュージャージー州ウェイン） ８．Ｍａｇｎｉｆｌｏｃポリマー４９１Ｃ−４９６Ｃシリーズのポリアクリルア ミド四級ポリマー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ） ９．Ｍａｇｎｉｆｌｏｃポリマー５６７Ｃ−５９１Ｃシリーズの四級アミンポリ マー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ 社） １０．Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（Ｃａｌｇｏｎ社、米国ペンシルバニア州ピッツ バーグ） １１．Ｃｏｒｃａｔ Ｐ１８ポリエチレンイミン（Ｃｏｒｄｏｖａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ社、米国ミシガン州） １２．ＵＣａｒｅポリマー、１％ｗ／ｖのヒドロキシエチルセルロース四級ポリ マー（Ａｍｅｒｃｈｏｌ社、米国ニュージャージー州エジソン）手順 表７に示すポリマーの水溶液（濃度１０−４０ｍｇ／ｍｌ）を可溶性シリカま たは薫蒸シリカ（約０．５〜２ｍｇポリマー／ｍｇシリカ）と混合し、得られた 沈殿シリカ懸濁液を水で３回洗い、過剰なポリマーを除去した。シリカ１ｍｇ当 たりＧＯＤを約１ｍｇ加えて、得られたシリカ／ポリマー複合体をバイオポリマ ー結合親和性についてテストした。洗浄ステップ後、複合体へのＧＯＤの吸着を 可視的に測定した。複合体による黄色があれば、結合の結果が陽性であるとする 。種々のポリマーに関する結合の結果を表７に示す。 表７に示す結果に基づき、薫蒸シリカ上のポリマー１、８、１２、１３、１４ 、１５、１６および１７を、ピロメリト酸（ＰＭＡ）で誘導体化したコレステロ ールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）に対する結合親和性についてテストした。ＰＭＡ ／ＣｈＯＤは、グルコースオキシダーゼについて実施例４に述べたように、調製 した。しかし、未反応のＰＭＡを除去するた ｉａ、スウェーデン、ウプサラから市販）でＰＭＡ／ＣｈＯＤを脱塩する手順を 補った。 このように製造したＰＭＡ／ＣｈＯＤ（０．７５ｍｇ）を、ポリマーに結合し てあるシリカ０．７８ｍｇを含有するＰＢＳの溶液に加えた。得られた溶液を常 に撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、固 相を遠心分離し、洗浄して未結合の酵素を除去してから、ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッ ファ１ｍｌに再度懸濁させた。微細に分割した固相の酵素を適当に希釈し、Ｃｈ ＯＤ活性を定量し、可溶性ＰＭＡ／ＣｈＯＤ標準物質と比較した。ポリマー１６ および１７は可視的にＰＭＡ／ＣｈＯＤの結合しているように思われなかったた め、テストしなかった。酵素活性は、Ａｂｂｏｔｔ きる遠心分離器付き分光光度計分析器、本出願人から市販）で過酸化物結合比色 検定で色の変化率として測定した。この実験で得られた結果を表８に示す。 表８は、室温で３日間乾燥させ、再構成し酵素結合固相のアリコートについて 、保持された活性の量を測定した結果も示している。 このデータは、処理したシリカはすべて酵素に対する高い結合能を有し、使用 したポリマーに応じて、結合能および乾燥後の活性の保持に２−３倍の差がある ことを示している。 実施例６ 薫蒸シリカに共有結合したコレステロールオキシダーゼを使用した酵素電極の製 造 本実施例は、アミノ化した薫蒸シリカにコレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯ Ｄ）を共有結合させる方法を示す。固定化したＣｈＯＤをコーティング処方に混 合し、実施例１に示したように電流電極の方式でテストした。材料 １．コレステロールオキシダーゼ ２．ＭＰＢＳ（ｐＨ７．５） ３．ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．０） ４．薫蒸シリカ ５．アミノプロピルトリエトキシシラン（Ａ３６４８、Ｓｉｇｍａ） ６．Ｍａｇｎｉｆｌｏｃ ５９１Ｃ四級アミンポリマー ７．３−エチル １−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド（ＥＤＡＣ） ８．トリニトロベンゼンスルホネート（Ｓｉｇｍａ） ９．ピロメリト酸二無水塩手順 薫蒸シリカ（１．０ｇ）をアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＴＳ）の２ ０％水溶液１０ｍｌと共に撹拌し、６ＮのＨＣｌでｐＨを３．２８に調整し、反 応混合物を形成した。反応混合物を水浴で１時間７０℃に加熱し、水で２回洗い 、ＭＰＢＳバッファに再懸濁し、湿潤スラリーとして保存した。トリニトロベン ゼンスルホネートと反応させたときのオレンジ色の存在によりアミンの存在を実 証した。 ＣｈＯＤのピロメリト酸（ＰＭＡ）誘導体を実施例５に （Ａｍｉｃｏｎ社、米国マサチューセッツ州ベヴァリーから市販）を使用して５ ．０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。次のように酵素をアミノ化シリカに共有結合させ た。アミノ化薫蒸シリカ（湿潤状態で２５０ｍｇの乾燥シリカに相当）をＭＥＳ バッファで洗い、ＰＭＡ ＣｈＯＤ（ＭＥＳバッファ１０ｍｌ中酵素 ５０ｍｇ）の溶液に加えた。ＥＤＡＣ（２０ｍｇ）を溶液に加え、次に溶液を撹 拌しながら一晩（約１２時間）インキュベートした。インキュベートした後、こ のように形成されたシリカ／ＣｈＯＤ複合体をＭＰＢＳバッファで洗い、４℃で バッファ中に保存した。複合体の活性は０．０７５ｍｇ活性酵素／ｍｇシリカで あった。 下記の樹脂処方を使用して実施例１と同様に電極を作製した。アクリル樹脂混合物Ｃ（不揮発性の固体分５５．９％） 成分 重量％ Joncryl 537 アクリルエマルジョン ３６．１ フタル酸ジブチル ３９．３ 水酸化アンモニウム（１．５Ｎ溶液） １．０ ２−エトキシエタノール ２３．６ 本実施例に使用したコーティング処方は以下の成分を含んだ。成分 量 ＰＭＡ−ＣｈＯＤ／シリカ ３８４ｍｇ^* 白金担持炭素 ３０ｍｇ アクリル樹脂混合物Ｃ １３０ｍｇ 蒸留水 ４５６ｍｇ^* この重量は蒸留水で１回洗い、遠心分離した後の複合体の湿潤重量に基づく。 四つの電極を作製し、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウ ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７５％デオキシコール酸含有０．０５％Ｋａｔｈｏ ｎ ＣＧを含むバッファ中５００μＭのコレステロール溶液中で、実施例１に上 記のようにテストした。得られた電流反応は３２３±２８ｎＡ／５００μＭであ った。実施例７ 消泡剤および安定剤を使用したグルタミン酸オキシダーゼ電極 本実施例は、濃厚剤Ａｃｒｙｓｏｌ ２７５との混合中に生じる気泡を減少さ せるための樹脂処方中への消泡剤の使用を示す。下記の処方を使用すると、コー ティング処方の消泡に要する時間が一晩から２時間未満に短縮された。 この処方はコーティング溶液中に可溶性二糖類、トレハロース（Ｓｉｇｍａ） も含んでいる。この物質が存在することにより、安定剤を添加していないコーテ ィングと比較し、電極の乾燥安定性および正味シグナルがいずれも上昇した。材料および手順 実施例５に記載の手順を使用して、グルタミン酸オキシダー ゼ（ヤマサ醤油株式会社、日本、東京から市販）を、無水ピロメリト酸で誘導体 化し、精製した。次に、実施例６に記載のカルボジイミド法を使用して、ＰＭＡ グルタミン酸オキシダーゼをアミノ誘導体化した薫蒸シリカに共有結合させ、湿 潤状態で保存した。この湿潤状態の固定化グルタミン酸オキシダーゼの固形分は １１％であり、シリカ１ｍｇ当たり０．１６ｍｇの活性酵素を含有していた。 白金担持炭素（１０％白金）をＭＰＢＳバッファで均質化し、蒸留水で３回洗 い、遠心分離し、湿潤状態で保存した。湿潤状態の白金担持炭素の固形分は１５ ％であった。 消泡剤を含む樹脂処方は以下のものを含有していた。アクリル樹脂混合物Ｄ 成分 重量％ Joncryl 537アクリルエマルジョン ４６．３ 水酸化アンモニウム（１．５Ｎ） ６．４ フタル酸ジブチル^*（Fluka Chemical） ５．１ ２−エトキシエタノール^* １５．０ Surfynol 104H（Air Products） １．９ Surfynol 695（Air Products） ３．６ Acrysol 275（Rohm & Haas） ２１．８^* フタル酸ジブチルは２−エトキシエタノールに溶解した後、アクリルエマルジ ョンに加えた。 コーティング溶液は以下の処方を使用して、実施例２に記載のように製造した 。成分 ｍｇ ＰＭＡグルタミン酸オキシダーゼーシリカ（湿潤） ２０６ 白金担持炭素（湿潤） １５１ アクリル樹脂混合物Ｄ １４０ トレハロース（水中０．０８５Ｍ） ５０２ コーティング溶液０．８μｌを使用し、乾燥した室温環境で１週間、電極を硬 化させて、実施例１に記載のように電極を作製した。次に、電極を３７℃で７日 間連続的に湿潤状態で使用してテストした。２時間毎に、バッファおよび希釈し たウシ血漿（血漿１部＋ＭＰＢＳバッファ３部、ｐＨ６．５）中のグルタミン酸 反応を実施例１に記載のように測定した。グルタミン酸反応の直線性をこの安定 性試験の前後に測定し、下記表９に示す。この電極は３７℃で７日間使用した後 に最初の反応の４０％を保持し、グルタミン酸に対する反応の直線性は維持され た。 電極を乾燥させ、３７℃で５週間保存して処理した。熱処理後、電極をテスト したところ、電極反応（平均４電極スポット）は１０３３ｎＡ／２５０μＭグル タミン酸で、熱ストレス前の１０８９ｎＡと比較しても５％の損失に過ぎなかっ た。実施例８ 過酸化水素触媒として金属ポルフィリンを使用した電極の製造 本実施例では、過酸化水素酸化触媒としての金属ポルフィリ ンの使用を記述する。コーティング溶液中に白金担持炭素（白金１０％）を使用 する代わりに、金属ポルフィリンで処理した未白金担持活性炭素を使用した。さ らに、固相に結合した酵素の代わりに、薫蒸シリカに共有結合したウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）をコーティングに混合した。 実施例７の手順に従って電極を作製した。材料 １．白金を含まないＶｕｌｃａｎ ＸＣ ７２Ｒ（カーボンブラック）（Ｃａｂ ｏｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）米国マサチューセッツ州ウォールサム） ２．プロトポルフィリンIXジメチルエステル（Ｓｉｇｍａ） ３．塩化コバルト（Ｓｉｇｍａ） ４．ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ） ５．薫蒸シリカ ６．アミノプロピルトリエトキシシラン ７．３−エチル １−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ８．ＭＥＳバッファ（ｐＨ５．５） ９．ＭＰＢＳバッファ（ｐＨ７．５）手順 １００ｍｌの丸底フラスコでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５． ０ｍｌを還流した後、プロトポルフィリンIXジメチルエステル２００ｍｇをフラ スコに加えた。ポルフィリンが溶解するまで、撹拌棒で混合物を撹拌した。次に 、塩化コバルト２１０ｍｇをフラスコに加え、混合物を１０分間還流した後、フ ラスコを熱源から離した。反応混合物から過剰な溶媒を蒸発させ、反応混合物を ２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに移し、氷水１２５ｍｌを加えた。次に 、フラスコを氷浴中に約２０分間置き、得られた固体のコバルトプロトポルフィ リン（ＣｏＰＰ）を濾過して回収し、一晩風乾させた。ＣｏＰＰの溶液（クロロ ホルム０．７５ｍｌ中１５．４ｍｇ）を５００ｍｇの均質化し、ＭＰＢＳで洗浄 した炭素に加えた。反応混合物を３０分間撹拌してから、炭素混合物を遠心分離 し、上清を捨てた。炭素を蒸留水で３回洗った。 実施例６のように薫蒸シリカをアミノプロピルトリエトキシシランでアミノ化 し、ＢＳＡを下記のようにアミノ化シリカに共有結合させた。アミノ化薫蒸シリ カ（湿潤状態で乾燥シリカ２５０ｍｇに相当）をＭＥＳバッファで洗い、ＢＳＡ の溶液 （ＭＥＳバッファ１０．０ｍｌ中５１．０ｍｇ）に加えた。ＥＤＡＣ（２０ｍｇ ）を溶液に加え、次に、一晩撹拌した。次に、シリカ／ＢＳＡ複合体をＭＰＢＳ バッファで洗った。 以下の処方を使用し、実施例７に記載のようにコーティング溶液を調製した。 成 分 ｍｇ ＢＳＡ−シラン（湿潤） １０３ コバルトプロトポルフィリン（ＣｏＰＰ）で修飾 した炭素（湿潤） ７６ アクリル樹脂混合物Ｄ ７０ トレハロース（水中０．０８５Ｍ） ２５１ コーティング溶液０．８μｌを使用し、実施例３のように電極を作製した。比 較のために、上記の成分を使用して、ＣｏＰＰで修飾した炭素の代わりに１０％ の白金担持炭素を含有するコーティング溶液を調製し、電極の作製に使用した。 白金担持炭素はＣｏＰＰ修飾炭素と同じ方法で、クロロホルムと共にインキュベ ートした。各型の二つの電極を、種々の電位で、１００ｍＭ過酸化水素溶液を使 用して電気化学的反応について テストした。表１０に示すデータは、炭素上のコバルトプロトポルフィリンは炭 素上の白金と同様の方法で過酸化水素酸化を触媒することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラケツト，ジヨン・エム アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノーシヤ、ワンハンドレツドサーテイシ ツクスス・アベニユー・10011 (72)発明者 ボツジズ，シエイラ・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、グリーンツリー・ロード・ 17836 (72)発明者 シユルツ，ステイーブン・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60096、ウイ ンスロツプ・ハーバー、フアンダーバー ク・ドライブ・2204

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バイオ試薬を支持物質に固定化するための固定化媒質であって、 ａ．固相に固定化したバイオ試薬と ｂ．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されているラテックス樹脂と を含み、実質的に均質に分配可能な混合物である固定化媒質。 ２．前記バイオ試薬が分析物、分析物アナローグ、検出可能部分および特異的結 合相手からなる群から選択される請求項１に記載の媒質。 ３．前記バイオ試薬が酵素である請求項１に記載の媒質。 ４．前記固相が、シリカ粒子、アガロース粒子、セルロース粒子、誘導体化した セルロース粒子、炭素粒子、白金担持炭素粒子、黒鉛粒子、白金担持黒鉛粒子、 酸化アルミニウム粒子、アルミノシリケート粒子、二酸化チタン粒子、白金族金 属酸化物粒子、金属ポルフィリン炭素粒子、金属ポルフィリン黒鉛粒子およびそ れらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の媒質。 ５．前記固相がさらに、四級アンモニウムポリマー、三級アミノポリマー、二級 アミノポリマーおよび一級アミノポリマーからなる群から選択した吸着されたポ リマーを含む請求項４に記載の媒質。 ６．固定化媒質の化学的特性および物理的特性を修飾するための手段をさらに含 み、前記修飾手段が、可塑剤、濃厚剤、フィルム形成剤、安定剤、分散剤、消泡 剤、電気化学的活性物質およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項 １に記載の媒質。 ７．テストサンプル中に含有される分析物の生物学的変換を検出するためのデバ イスであって、前記デバイスが支持物質と前記支持物質上の少なくとも１枚の耐 水性固定化媒質フィルムとを含み、前記フィルムが ａ．固相に固定化したバイオ試薬と ｂ．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されている乾燥ラテックス樹脂 を含むデバイス。 ８．前記バイオ試薬が酵素である請求項７に記載のデバイス。 ９．固定化媒質の化学的特性および物理的特性を修飾するため の手段をさらに含み、前記修飾手段が、可塑剤、濃厚剤、フィルム形成剤、安定 剤、分散剤、消泡剤、電気化学的活性物質およびこれらの混合物からなる群から 選択される請求項７に記載のデバイス。 １０．前記固相が、シリカ粒子、アガロース粒子、セルロース粒子、誘導体化し たセルロース粒子、炭素粒子、白金担持炭素粒子、黒鉛粒子、白金担持黒鉛粒子 、酸化アルミニウム粒子、アルミノシリケート粒子、二酸化チタン粒子、白金族 金属酸化物粒子、金属ポルフィリン炭素粒子、金属ポルフィリン黒鉛粒子および それらの混合物からなる群から選択される請求項７に記載のデバイス。 １１．前記固相がさらに、四級アンモニウムポリマー、三級アミノポリマー、二 級アミノポリマーおよび一級アミノポリマーからなる群から選択した吸着された ポリマーを含む請求項１０に記載のデバイス。 １２．前記支持物質が導電性物質を含む請求項７に記載のデバイス。 １３．前記支持物質が、管、磁気粒子、マイクロタイタープレート、膜、試験管 、微粒子およびビーズからなる群から選択さ れる請求項７に記載のデバイス。 １４．テストサンプル中の分析物の存在または量を測定する方法であって、 ａ．テストサンプルを、前記テストサンプルに含まれる分析物の生物学的変換 を検出できるデバイスと接触させ、前記デバイスが、支持物質と前記支持物質上 の少なくとも１枚の耐水性固定化媒質フィルムとを含み、前記フィルムが １．固相に固定化したバイオ試薬及び ２．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されている乾燥ラテックス樹 脂であるステップと、 ｂ．前記テストサンプル中の前記分析物の量を測定するステップとを含む方法 。 １５．前記バイオ試薬が酵素である請求項１４に記載の方法。 １６．前記固相が粒子であり、前記固相が、シリカ粒子、アガロース粒子、セル ロース粒子、誘導体化したセルロース粒子、炭素粒子、白金担持炭素粒子、黒鉛 粒子、白金担持黒鉛粒子、酸化アルミニウム粒子、アルミノシリケート粒子、二 酸化チタン粒子、白金族金属酸化物粒子、金属ポルフィリン炭素粒子、金属ポル フィリン黒鉛粒子およびそれらの混合物からなる群か ら選択される請求項１４に記載の方法。 １７．前記固相がさらに、四級アンモニウムポリマー、三級アミノポリマー、二 級アミノポリマーおよび一級アミノポリマーからなる群から選択した吸着された ポリマーを含む請求項１６に記載の方法。 １８．支持物質と前記支持物質上の少なくとも１枚の耐水性固定化媒質フィルム を含む捕獲試薬であって、前記フィルムが ａ．固相に固定化したバイオ試薬と ｂ．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されている乾燥ラテックス樹脂 と を含む捕獲試薬。 １９．前記支持物質が、ビーズ、磁気粒子、微粒子、試験管、マイクロタイター プレート、管および膜からなる群から選択される請求項１８に記載の捕獲試薬。 ２０．前記バイオ試薬が、分析物、分析物アナローグ、検出可能部分および特異 的結合相手からなる群から選択される請求項１８に記載の捕獲試薬。 ２１．前記固相が粒子であり、前記固相が、シリカ粒子、アガロース粒子、セル ロース粒子、誘導体化したセルロース粒子、 炭素粒子、白金担持炭素粒子、黒鉛粒子、白金担持黒鉛粒子、酸化アルミニウム 粒子、アルミノシリケート粒子、二酸化チタン粒子、白金族金属酸化物粒子、金 属ポルフィリン炭素粒子、金属ポルフィリン黒鉛粒子およびそれらの混合物から なる群から選択される請求項１８に記載の捕獲試薬。 ２２．前記固相がさらに、四級アンモニウムポリマー、三級アミノポリマー、二 級アミノポリマーおよび一級アミノポリマーからなる群から選択した吸着された ポリマーを含む請求項２１に記載の捕獲試薬。 ２３．特異的結合対の構成要素と前記分析物との間の結合をモニタリングするこ とによりテストサンプル中の分析物の存在または量を測定するための方法であっ て、 ａ．前記テストサンプルを捕獲試薬と接触させて、混合物を形成し、前記捕獲 試薬が支持物質と前記支持物質上の少なくとも１枚の耐水性固定化媒質フィルム とを含み、前記フィルムが １．固相に固定化したバイオ試薬及び ２．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されている乾燥ラテックス樹 脂であるステップと、 ｂ．前記混合物を、分析物／捕獲試薬複合体を形成するのに 十分な時間および条件下でインキュベーションするステップと、 ｃ．前記複合体を指示試薬と接触させるステップと、 ｄ．測定可能なシグナルを検出するステップとを含む方法。 ２４．前記支持物質が、ビーズ、磁気粒子、微粒子、試験管、マイクロタイター プレート、管および膜からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。 ２５．前記バイオ試薬が、分析物、分析物アナローグ、検出可能部分および特異 的結合相手からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。 ２６．前記固相が粒子であり、前記固相が、シリカ粒子、アガロース粒子、セル ロース粒子、誘導体化したセルロース粒子、炭素粒子、白金担持炭素粒子、黒鉛 粒子、白金担持黒鉛粒子、酸化アルミニウム粒子、アルミノシリケート粒子、二 酸化チタン粒子、白金族金属酸化物粒子、金属ポルフィリン炭素粒子、金属ポル フィリン黒鉛粒子およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項２３に 記載の方法。 ２７．テストサンプル中の分析物の存在を評価するためのテスト用キットであっ て、 ａ．支持物質と前記支持物質上の少なくとも１枚の耐水性固 定化媒質フィルムを含み、前記フィルムが １．固相に固定化したバイオ試薬及び ２．前記の固定化したバイオ試薬が均一に分散されている乾燥ラテックス樹 脂である捕獲試薬と、 ｂ．検出可能なシグナルを提供できる指示試薬とを含むテスト用キット。 ２８．前記支持物質が、ビーズ、磁気粒子、微粒子、試験管、マイクロタイター プレート、管および膜からなる群から選択される請求項２７に記載のテスト用キ ット。 ２９．前記バイオ試薬が、分析物、分析物アナローグ、検出可能部分および特異 的結合相手からなる群から選択される請求項２７に記載のテスト用キット。