JPH09509064A

JPH09509064A - イソ酵素キャリブレーター／コントロール製品

Info

Publication number: JPH09509064A
Application number: JP7521896A
Authority: JP
Inventors: マグネソン，ジェラルド・アール; ナグ，スマトラ
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 1997-09-16
Also published as: WO1995022602A1; AU700666B2; AU1844895A; EP0751989A4; EP0751989A1; CA2183573A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、乾燥し、次いで復元すると本質的にすべてのイソ酵素の活性および免疫学的量を回収する処方を伴ったイソ酵素を安定化するために用いられるバッファーであって、サブユニットの解離および再配列を受けずに長期シェルフライフ（shelf-life）貯蔵をするためのバッファーに関する。長期のイソ酵素の乾燥貯蔵に用いるバッファーは無血清かつ塩不含の水性バッファーであり、該バッフアーは以下のものからなる：１）ガラス状物質形成糖；２）抗酸化剤混合物；３）ｐＨバッファー；および４）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチン。無血清で塩不含のイソ酵素試料の復元に用いるバッファーは塩を含有する水性バッファーからなる。さらに、血清−イソ酵素も開示され、それは以下のものからなる：１）ｐＨバッファー；２）塩；３）抗酸化剤混合物；および４）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチン。図は、温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数のアレニウスプロットにより決定された、血清をベースにした水性バッファーおよび無血清水性バッファー中でのイソ酵素の量についての促進された安定性を示し、５℃におけるシェルフライフを外挿してある。

Description

【発明の詳細な説明】イソ酵素キャリブレーター／コントロール製品発明の背景イソ酵素、すなわち、ある酵素の異なる分子形態は、血中の正常イソ酵素の濃度変化を引き起こす可能性のある、ある種の疾病における病理学的因子の評価の際に、臨床化学および免疫化学において重要な役割を果たしている。酵素の異なる分子形態は異なる組織で形成されるので、イソ酵素の血流中への放出速度ならびに組織におけるその生産と蓄積の速度に疾病状態が及ぼし得る影響のために特定のイソ酵素の血清レベルが上昇または低下しうる。イソ酵素の血清レベルが特定の疾病により特異的に影響を受ける程度はその臨床的重要性を決定する。血清中に存在するイソ酵素を標準的な物理化学的手段により容易に同定することができることが必須である。これらの物理化学的手段は、例えば、ゲル電気泳動による決定、および酵素阻害剤の存在下での酵素活性の不活性化、または熱処理を包含する。より高感度で特異性のある検出手段は、アミノ酸組成の相違のために存在する特異的イソ酵素エピトープの認識および／または免疫化学的方法を用いるサブユニット−サブユニット相互作用を包含する。さらにそのうえ、診断分析対象としてのその価値を高めるためには、十分量のかかるイソ酵素が高度に精製され、リファレンス物質として用いるための安定な状態で市販されていることが重要である。２〜８℃での保存のために配給されうるフリーズドライ凍結乾燥された基本リファレンス物質を有することは、世界的な診断アッセイの標準化のために特に役立つ。臨床的に重要なイソ酵素の例はクレアチンキナーゼ（ＣＫ）であり、それは会合して主要イソ酵素（ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢおよびＣＫ−ＢＢ）を形成するＭまたはＢ型いずれかのサブユニットからなる二量体酵素である。ＭＢイソ酵素は心臓における心筋組織で優勢に生産され、ヒト・血清中に存在しており、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断のための有用なインジケーターである。抗原グレードのＣＫ−ＭＢは、非免疫原性安定化剤の存在下で処方される高度に精製されたイソ酵素であり、ヒト・心臓または組み換えＤＮＡ由来のソースから得ることができる。抗原グレードのＣＫ−ＭＢは２〜８℃における酸化により容易に不活性化され、長期の貯蔵により、または凍結／融解を行った後において、そのサブユニットは解離傾向にあり、再配列すると有意な量のＭＭおよびＢＢイソ酵素を生じる。ヒト・ＣＫ−ＭＢを安定化するためのこれまでの方法は、それを５０％グリセロール存在下、−７０℃で貯蔵することであった（ラント（Landt）ら、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）、第３５巻：９８５〜９８９頁、１９８９年）。この処方の限界は、長期保存のために活性酵素を維持することにおける困難性および配給および貯蔵目的についての非現実性を包含している。さらにそのうえ、ある種の臨床化学アッセイまたは免疫アッセイにおける妨害を減少させるために、液体キャリブレーターの調製においてそれを使用する前にＣＫ−ＭＢからグリセロールを除去しなければならず、これによりイソ酵素活性および量の部分的な損失を生じる。さらに、グリセロールは凍結せず、その存在は、グリセロールをベースにしたＣＫ−ＭＢ処方を補足したキャリブレーターまたはコントロールのフリーズドライ凍結乾燥を妨害するであろう。血清をベースにしたキャリブレーター＼コントロール物質中に処方されたイソ酵素は、安定化剤の存在下において溶液中および凍結乾燥形態で安定化できることが以前報告された（ホスキンス（Hoskins）、米国特許第４,６８４,６１５号ならびに第４,８８３,７６２号、およびり・ムッティ（Li Mutti）ら、米国特許第４,１２７,５０２号）。しかしながら、血清をベースにしたイソ酵素リファレンス物質は、血清中の多くの成分のために種々の問題があり、外来成分による妨害；ロット間のばらつき；免疫原性の問題；およびバイオハザードの危険性（すなわち、ウイルス混入）が包含される。一般的には、液状および／または乾燥状態の両方における長期保存のためにイソ酵素を安定化することのできる成分を伴った無血清バッファー処方に対する必要性がある。かかる処方が２〜８℃での長期乾燥貯蔵のためにイソ酵素の酵素活性および蛋白構造を維持し、さらにそのサブユニットの解離および再配列を防止することが望ましい目的である。さらにそのうえ、血清をベースとしたキャリブレーター＼コントロール物質に関連したバイオハザード、アッセイ人工物、およびバッチ間のばらつきを除去する一方で、２〜８℃での長期乾燥貯蔵のためにイソ酵素を安定化する無血清水性バッファーを開発することも望ましい目的である。発明の概要本発明は、乾燥し、次いで復元することにより、本質的にすべてのイソ酵素の活性および免疫学的量を回復する処方を伴ったイソ酵素を安定化するために用いられるバッファーであって、サブユニットの解離および再配列を受けずに長期のシェルフライフ（shelf-life）貯蔵をするためのバッファーに関する。長期のイソ酵素の乾燥貯蔵に用いるバッファーは無血清かつ塩不含の水性バッファーであり、該バッファーは以下のものからなる：１）ガラス状物質形成糖；２）抗酸化剤混合物；３）ｐＨバッファー；および４）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチン。無血清で塩不含のイソ酵素試料の復元に用いるバッファーは塩を含有する水性バッファーからなる。さらに、イソ酵素の長期の液状貯蔵用の無血清水性安定化バッファーが開示され、該バッファーは以下のものからなる：１）ｐＨバッファー；２）塩；３）抗酸化剤混合物；および４）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチン。乾燥貯蔵のためのイソ酵素安定化方法は：１）イソ酵素含有水溶液を脱塩し；２）ガラス状物質形成糖、抗酸化剤混合物、ｐＨバッファーおよび非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンを脱塩した溶液に添加し；次いで、３）工程２）の生成物の本質的にすべての水分を除去することからなる。さらに本発明は、上記復元バッファーを用いる方法に関する。長期液状貯蔵のためのイソ酵素の安定化方法は、ｐＨバッファー、塩、抗酸化剤混合物、および非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなる水溶液にイソ酵素を添加することからなる。図面の簡単な説明図１は、温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数のアレニウスプロットにより決定された、ツイン２０含有バッファー処方に関するイソ酵素の活性および量についての促進された安定性を示すグラフであり、５℃におけるシェルフライフを外挿してある。図２は、温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数のアレニウスプロットにより決定された、ゼラチンおよびツイン２０含有バッファー処方に関するイソ酵素の活性および量についての促進された安定性を示すグラフであり、５℃におけるシェルフライフを外挿してある。図３は、温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数のアレニウスプロットにより決定された、血清をベースにした水性バッファーおよび無血清水性バッファー中でのイソ酵素の量についての促進された安定性を示すグラフであり、５ ℃におけるシェルフライフを外挿してある。発明の詳細な説明１の態様において、本発明は、グリセロール中で貯蔵された物質と比較すると、乾燥し復元した場合に、長期乾燥貯蔵を行っていても酵素の活性、量および／またはサブユニット均質性について優れた回収率を示す、無血清かつ塩不含の水性イソ酵素安定化バッファーであって（すなわち、体積あたり５重量％（ｗ／ｖ）の残存水分を有するイソ酵素について約２〜８℃において５カ月以上のシェルフライフ）、免疫原性蛋白または血清をベースにした水性バッファーの存在下での安定化に関連した精製抗原グレードのイソ酵素のコンタミネーションを解消するバッファーに関する。より詳細には、ネイティブ（native）または組み換えイソ酵素を添加し、さらに／または内在する塩分をｐＨバッファーに関係なく残留レベルにまで、好ましくは１０ミリ当量未満にまで（すなわち、塩不含にまで）低下させるために透析濾過するための無血清処方が提供され、凍結乾燥の間に処方の本質的にすべての水分を除去するような凍結、次いで乾燥を行ってもイソ酵素の構造上の完全性および／またはサブユニットの均質性が保護される。再使用および２〜８℃での貯蔵のための最大安定性を得るためには凍結乾燥したヒト・ＣＫ−ＭＢを塩含有バッファーを用いて復元する必要があることに注意すべきである。本発明の無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーは、還元性単糖もしくは二糖、または非還元性単糖もしくは二糖のごときガラス状物質形成糖を含有する。用語「ガラス状物質形成糖」は、上記の糖、またはそれらの混合物を包含する。本発明において、還元性および非還元性単糖のグループは、１ないし３０％（ｗ／ｖ）の濃度のアラビノース、キシロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、およびマンノースを包含する。還元性および非還元性二糖のグループは、１ないし３０％（ｗ／ｖ）の濃度のラクトース、マルトース、セロビオース、ラフィノース、シュクロース、およびトレハロースを包含する。さらに本発明の無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーは、還元剤、金属キレーター、および／または連鎖反応停止剤を包含してもよい抗酸化剤混合物を含有する。還元剤は、１０ないし３０ｍＭの間の濃度のグルタチオン、Ｎ−アセチル−システイン、またはチオ尿素のごとき剤を包含する。金属キレーターは、０ .１ないし１ｍＭの間の濃度のＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、およびＥＧＴＡのごとき剤を包含する。連鎖反応停止剤は、０.００１ないし０.０１％（ｗ／ｖ）の濃度のアスコルビチルパルミタート、ノルジヒドログアイアレチックアシッド、および没食子酸プロピルのごとき剤を包含する。さらに本発明の無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーは、イソ酵素を安定化するための６ないし９のｐＨ範囲に溶液を維持するための、５０ないし２００ｍＭの濃度のＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、およびＴｒｉｓのごとき剤（またはそれらの混合物）を包含するｐＨバッファーを包含する。ヒト・ＣＫ−ＭＢ酵素の活性および免疫学的量を安定化するに好ましいｐＨは、液状および乾燥状態の両方についてｐＨ７.１ないし７.３の間であり、本発明における好ましい具体例はｐＨ７.２の５０ｍＭＨＥＰＥＳである。さらに本発明の無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーは、非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンを含有する。本発明において有用な非イオン性界面活性剤は、体積あたり０.００５％ないし０.１％（ｖ／ｖ）の間の濃度範囲のドデシルポリ（オキシエチレングリコールエーテル）_n（ブリジ３５（Brij35））、ポリ（オキシエチレン）_n−ソルビタン−モノラウラート（ツイン２０（Tween20））ならびにポリ（オキシエチレン）_n−ソルビタン−モノオレアート（ツイン８０（Tween80））のごときポリ（オキシエチレン）_n−ソルビタン−脂肪酸誘導体を包含する。本発明における好ましい具体例は、０.０１％（ｗ／ｖ）の濃度のツイン２０である。合成ポリマーは、０.０１ないし１０％（ｗ／ｖ）の間の濃度のポリビニルスルファート、ポリビニルピロリドン（分子量範囲１００００ないし３６００００）、およびヒドロキシエチル澱粉のごとき剤を包含する。ゼラチンは、０.０１ないし１０％（ｗ／ｖ）の範囲の哺乳動物および魚類の皮膚由来のもの、および植物ゼラチンのごとき剤（またはそれらの混合物）を包含する。また本発明は、塩含有バッファーを用いて無血清かつ塩不含のイソ酵素試料を復元するためのバッファー、およびかかる安定化バッファーでの復元方法に関する。このバッファーは、塩、すなわち、１０ないし２００ｍＭの濃度のＫＣｌおよびＮａＣｌのごときカリウムおよびナトリウム塩（またはそれらの混合物）を包含する剤を含有する。さらに、このバッファーは上記抗酸化剤および／または非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。本発明バッファー中でのヒト・ＣＫ−ＭＢの長期貯蔵安定性の例は、アレニウスプロット形式を用いて説明される（実施例１、２、および５における図１、２、および３を参照）。時間のプロットは、アンダーソン,ジー（Anderson,G.）およびスコット,エム（Scott,M.）（クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第３７巻：３９８〜４０２頁、１９９１年）により記載されたように線形回帰線の勾配を測定することにより各インキュベーション時間におけるイソ酵素活性または量の消失についての１次反応速度定数を決定するように構成された。ｙ切片の９０％と、イソ酵素の活性または量の消失に関する反応速度定数で割った回帰線のｙ切片との間の差として、安定性消失に至るまでの推定時間が決定される（すなわち、ｙ＝ｍｘ＋ｂまたはｘ＝ｙ−ｂ／ｍ）。よって、異なる温度におけるこれらの安定性の消失時点を用いて、インキュベーション温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数の対数を用いるアレニウスプロットを構築する。５℃と一致する回帰線上の時点を測定することにより５℃における貯蔵のシェルフライフの評価を決定する。図１は、ツイン２０を含有するバッファー中で凍結乾燥された組み換えヒト・ＣＫ−ＭＢ（クローン化されたイー・コリ（E.coli）細胞系由来）に関する安定性消失（すなわち、酵素活性および蛋白免疫学的量の消失）に至るまでの時間のアレニウスプロット示す。バイアルを４５、３７、および３０℃の温度に異なる時間置き、塩含有バッファーで復元し、次いで、ＣＫ−ＭＢの酵素活性および量の値の回復を決定するためにアッセイを行った。図１は、５℃におけるＣＫ−ＭＢの量および酵素活性について製品消失に至る時間を、それぞれ、３.９年および４１.１年と推定する破線を示す。さらに、図２は、ゼラチンおよびツイン２０含有バッファー処方について、５℃におけるＣＫ−ＭＢの量および酵素活性について安定性消失に至る時間を、それぞれ、０.５年および３０.７年と推定する破線を示す。本発明バッファーを用いる凍結乾燥ヒト・ＣＫ−ＭＢに関する貯蔵シェルフライフのこれらの評価は、２〜８℃で貯蔵されたグリセロール含有ＣＫ −ＭＢ処方の貯蔵安定性（６８日未満）と比較して、５℃におけるこの酵素の長期安定性を示す（実施例３の表１参照）。本発明の塩含有バッファーで復元されたイソ酵素の液体での安定性を実施例４の表２に示す。これらの結果は、ツイン２０を含有する復元されたＣＫ−ＭＢ処方は、グリセロール含有処方のそれぞれ３２および６８日と比較すると、２〜８ ℃において少なくとも８４日間は元の量および酵素活性の９０％以上を回復することを示す（実施例３および４の表１および２参照）。よって、本発明は、キャリブレーター＼コントロール物質の調製に使用する復元イソ酵素を、例えば、２〜８℃において３カ月まで安定化する。さらに本発明は、上記の無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーの使用方法に関する。本発明方法において、実質的にすべての塩成分を液体イソ酵素試料から除去するための標準的脱塩方法は本発明方法に適するであろう。例えば、当業者に知られた標準的な透析または透析濾過法は本発明方法に適する。さらに、実質的にすべての水分を液体イソ酵素試料から除去するための標準的な乾燥方法は本発明方法に適するであろう。例えば、当業者に知られた標準的なフリーズドライ凍結乾燥法は本発明方法に適する。一般的には、凍結乾燥法はフリーズドライ法を包含する。もう１つの態様において、さらに本発明は、２〜８℃における長期液状貯蔵のためにイソ酵素を安定化するための無血清水性安定化バッファーであって、血清をベースにした水性バッファーに関連した種々の問題（アッセイ人工物、ロット間のばらつき、免疫原性の問題、およびバイオハザードの危険性）のないバッファーに関する。該無血清水性安定化バッファーは、上記ｐＨバッファー、抗酸化剤混合物、および非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンを含有し、好ましい具体例は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２、１０ｍＭＮ−アセチル−システイン、０.２ｍＭＨＥＤＴＡ、０.０１％（ｖ／ｖ）ツイン２０、および３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（分子量１００００）である。さらにそのうえ、この水性安定化バッファーは、１０ないし２００ｍＭの範囲の上記塩を含有し、好ましい具体例は１４０ｍＭＫＣｌである。典型的には、長期液状貯蔵は、微生物の増殖によるコンタミネーションを防止するための保存料および／または滅菌手順を必要とすることに注意すべきである。典型的な保存料は、０.０５ないし５％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の範囲のＮａＮ₃、オキサバンＡ、およびプロクリン３００を包含し、好ましい具体例は０.１％ＮａＮ₃（ｗ／ｖ）である。本発明の無血清水性安定化バッファー中のイソ酵素の熱安定性の比較を図３に示す。無血清バッファーおよび血清をベースとしたバッファーの両方に関する、温度の逆数に対するＣＫ−ＭＢ量についての安定性消失に至るまでの時間のアレニウスプロットのデータである。バイアルを３７、３０、および２５℃の温度に異なる時間置き、ＣＫ−ＭＢ量の値の回復を調べるためにアッセイを行った。図３は、無血清バッファー中５℃におけるＣＫ−ＭＢ量の貯蔵シェルフライフを１３.１年と評価する破線であり、これに対して血清をベースとしたバッファーについては７.６年である（実施例５）。実施例１精製蛋白から塩を除去するために、ヒト・組み換えＣＫ−ＭＢ（１ｍｇ／ｍｌ）を、分子量１００００カットオフのフィルターを装備したアミコン（Amicon）限界濾過セル（マサチューセッツ州ビバリーのアミコン社製）を用いて、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２、６％マルトース、０.２ｍＭＨＥＤＴＡおよび１０ｍＭＮ−アセチル−システインを含有するバッファーに対して５℃において透析濾過した。透析濾過後、上記試料の一部を、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２、６％マルトース、０.２ｍＭＨＥＤＴＡ、１０ｍＭＮ−アセチル−システインおよび０.０１％（ｖ／ｖ）ツイン２０を含有するバッファー中に添加して最終濃度１００μｇ／ｍｌのヒト・組み換えＣＫ−ＭＢを得た。次いで、処方したＣＫ−ＭＢを滅菌濾過し、ＦＴＳトレイドライヤー（ＴＤＳ−０００６５−Ａ型）を用いてフリーズドライ凍結乾燥した。凍結乾燥バイアルを、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２および１２０ｍＭＫＣｌを含有する水性バッファーのうち１ｍｌを用いて復元した。ＣＯＢＡＳＦＡＲＡ IIオートアナライザー（ロッシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics））により、ロッシュ（Roche）ＣＫ−ＮＡＣアッセイ試薬を用いてＣＫ−ＭＢ活性を測定した。アボット（Abbo t）ＩＭｘ免疫アナライザーにより、アボット・ヒト・ＣＫ−ＭＢ試薬を用いてＣＫ−ＭＢ免疫学的濃度を決定した。上記線形回帰分析によりＣＫ−ＭＢの活性および量の回収率に関する時間プロットデータを評価した（すなわち、安定性の消失に至るまでの時間）。ＣＫ−ＭＢのバイアルを、４５、３７、および３０℃ において異なる時間置いて５℃における貯蔵シェルフライフを推定した。図１は、温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの日数のアレニウスプロットを示す。このプロットは、ＣＫ−ＭＢの量および活性に関する５℃における推定シェルフライフは、それぞれ約３.９年および４１.１年であることを示す。実施例２ツイン２０成分を０.５％ゼラチンならびにツイン２０に置き換えたこと以外は、実施例１記載のごとく組み換えヒト・ＣＫ−ＭＢと同じ透析濾過手順を行った。４５、３７および３０℃に異なる時間置かれたこのＣＫ−ＭＢ処方の凍結乾燥バイアルについて、促進された安定性の研究を行った。図２は、この処方についてのアレニウスプロットであって、５℃における貯蔵シェルフライフを、ＣＫ −ＭＢの集団および活性について、それぞれ０.５年および３０.７年と推定するものである。実施例３比較をする目的で、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０.１％ＮａＮ₃（ｗ／ｖ）を含有する処方中のネイティブなヒト・ＣＫ −ＭＢの貯蔵安定性を、サンプリング目的の単一バイアルを用いて２〜８℃において調べた。表１の結果（下に示す）は、このグリセロールをベースとした水性バッファー中のＣＫ−ＭＢは、３２日目および６８日目において、それぞれ元の量および酵素活性の９０％以上を回復することができないことを示す。実施例１〜３における結果により、ツイン２０またはゼラチンならびにツイン２０のいずれかを含有する水性バッファー中で凍結乾燥されたヒト・ＣＫ−ＭＢは、５０％グリセロールを含有する水性バッファー中に存在するネイティブなＣＫ−ＭＢと比較すると、５℃におけるより大きな推定貯蔵安定性を示すことが示される。実施例４本発明バッファー中の復元されたＣＫ−ＭＢの液状貯蔵安定性を説明するために、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２および１２０ｍＭＫＣｌを含有するバッファーを用いて凍結乾燥したヒト・ＣＫ−ＭＢを復元し、連続サンプリングのために２〜８℃で貯蔵した。表２（下に示す）は、組み換えヒト・ＣＫ−ＭＢは、５℃で８４日以上たってから、はじめの量および酵素活性の少なくとも９０％を回復することを示し、５０％グリセロール含有水性バッファー中のネイティブなＣＫ−ＭＢの安定性と比較すると高い液状貯蔵安定性を示すものである（実施例３の表１参照）。実施例５凍結乾燥した組み換えヒト・ＣＫ−ＭＢを実施例１記載のごとく復元し、無血清水性バッファーおよび血清をベースにした水性バッファーの両方に約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度として添加し、次いで、３７、３０、および２５℃に異なる時間置いた。無血清水性バッファーは、５０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.２、１４０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＮ−アセチル−システイン、０.２ｍＭＨＥＤＴＡ、０.０１％（ｖ／ｖ）ツイン２０、３％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃を含有していた。血清をベースにした水性バッファーは、ヒト・血清ならびに０.２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃を含有していた。温度の逆数に対する安定性消失に至るまでの時間のアレニウスプロットは、本発明無血清水性バッファー中５℃におけるＣＫ−ＭＢの量について、血清をベースにしたバッファー中の安定性と比較すると約２倍の貯蔵シェルフライフを示した（７.６年に対して１３.１年−−図３参照）。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】ァー中でのイソ酵素の量についての促進された安定性を示し、５℃におけるシェルフライフを外挿してある。

Claims

【特許請求の範囲】１．イソ酵素の長期乾燥貯蔵のための無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーであって、ａ）ガラス状物質形成糖；ｂ）抗酸化剤混合物；ｃ）ｐＨバッファー；およびｄ）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなるバッファー。２．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項１のバッファー。３．無血清かつ塩不含ののイソ酵素試料の復元のための安定化バッファーであって、塩を含有する水溶液からなるバッファー。４．さらに抗酸化剤および／または非イオン性界面活性剤を含有している請求項３のバッファー。５．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項３のバッファー。６．イソ酵素の長期液状貯蔵のための無血清水性安定化バッファーであって、ａ）ｐＨバッファー；ｂ）塩；ｃ）抗酸化剤混合物；およびｄ）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなるバッファー。７．さらにガラス状物質形成糖を含有している請求項６のバッファー。８．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項６のバッファー。９．サブユニットの解離および再配列に対して乾燥イソ酵素を安定化させるための無血清かつ塩不含の水性安定化バッファーであって、ａ）ガラス状物質形成糖；ｂ）抗酸化剤混合物；ｃ）ｐＨバッファー；およびｄ）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなるバッファー。１０．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項９のバッファー。１１．長期乾燥貯蔵のためにイソ酵素を安定化させる方法であって、ａ）イソ酵素を含有する水性バッファーを脱塩し；ｂ）i）体積あたり約９重量％ないし３０重量％の範囲の非還元性単糖もしくは非還元性二糖または還元性単糖、あるいは体積あたり約９重量％ないし３０重量％の範囲の還元性二糖； ii）抗酸化剤混合物 iii）ｐＨバッファー；および iv）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなる水性組成物を工程ａ）の脱塩されたバッファーに添加し；次いでｃ）工程ｂ）の生成物の本質的にすべてを除去する、ここに、工程ｃ）の生成物を復元する場合には塩含有水性バッファーを添加することからなる方法。１２．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項１１の方法。１３．塩を含有する水性バッファー溶液を添加することからなる無血清かつ塩不含の乾燥イソ酵素試料の復元方法。１４．復元バッファーがさらに抗酸化剤および／または非イオン性界面活性剤を含有している請求項１３の方法。１５．イソ酵素が、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、α−アミラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、コリンエステラーゼ、リパーゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼからなる群より選択される請求項１３の方法。１６．ａ）ｐＨバッファー；ｂ）塩；ｃ）抗酸化剤混合物；およびｄ）非イオン性界面活性剤および／または合成ポリマーおよび／またはゼラチンからなる無血清水性バッファー組成物を添加することからなる、液状貯蔵のためにイソ酵素を安定化させる方法。