JPH09509135A - 免疫寛容の誘導における利用のためのクリプティックペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト等の患者において、抗原から誘導したクリプティックペプチド及び製薬上許容し得るキャリアーを含む組成物の寛容化量を投与することにより免疫寛容を誘導する方法を記載する。アレルゲン又は自己抗原等の蛋白質抗原から誘導したクリプティックペプチドを含む組成物を投与して、未感作の又は予備感作された個人における寛容を誘導することが出来る。好ましくは、この組成物を経口投与する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫寛容の誘導における利用のための クリプティックペプチド発明の背景 抗原を供給することは、免疫不応答又は経口寛容を誘導するための古典的方法 である（Asherson，G.L.等(1977)、Cell Immunol.,33:145; Asherson，G.L. 等( 1979)、Immunology,36:449; Challacombe，S.J. 及びTomasi, T.J.(1980),J.Exp .Med.,152：1459; Bruce,M.G.及びFerguson,A.(1986),Immunology,57: 627; Mow at, A.(1982),Immunology,45:105; 及びStrobel,S.等(1983)、Immunology,49:45 1）。食餌抗原に対する重要な生理学的応答であること（Mowat,A.M.(1987),Immu nology Today,8:93）を考慮しても、経口寛容を利用して、自己免疫病において 見出されるような異所性免疫応答（Thompson,H.S.G. 及びStaines,A.(1990),Imm unol.Today,11:396）及びアレルギーを制御することが出来ることが示唆された 。 最も広く研究された自己免疫疾患のモデル系は、実験用アレルギー性脳脊髄炎 （ＥＡＥ）のモデル系である。感作前に寛容化量のミエリン塩基性蛋白質（ＭＢ Ｐ）を与えられたラットはＭＢＰでの脳脊髄炎チャレンジから保護され得ること が示された（Miller，A.等(1991)、J. Immunol.,147:2155 及びMiller，A.等(1992)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:421 ）。しかしながら、経口寛容の誘導に関与する機構に関して相容れない見解が出 されている。例えば、Whitacre等 (1991)、J.Immunol.,147:2155は、それらが寛 容化した動物からのＴ細胞を用いて抑制をトランスファーすることが出来ないこ とを見出したが、クローン化アネルギーがＣＤ４⁺ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のエフェ クター機能を下方制御するための重要な機構であり得ることを示した。或は、Mi ller，A.等(1991)J.Exp.Med.,174:791は、抑制が寛容化した動物からＣＤ８⁺Ｔ 細胞を受けた天然レシピエントにトランスファーされ得ることを示した。これら のサプレッサー（Ｔ）細胞は、可溶性サイトカインの放出により、ＭＢＰ特異的 ＣＤ⁺Ｔ細胞株のイン・ビトロ応答を阻止することが出来ると報告され、無関係 のＴ細胞の傍観者抑制（by-stander suppression）を引き起こすことも可能であ ろう（Miller,A.(1991)前出）。Ｔ細胞により放出される免疫調節サイトカイン は、後に、ＴＧＦ−β１と定義された（Miller,A．等(1992) Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 89：421）。 細菌及びウイルス性病原体、自己抗体、アレルゲン及び他の実験的抗原例えば ニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）、オバルブミン（ＯＶＡ）及びラムダリプレッ サー（ｃ１）を含む種々の蛋白質抗原から導かれたペプチドが、抗原特異的Ｔ細 胞を刺激する能力について試験され た。広範囲のサイズスペクトルの蛋白質がＴ細胞エピトープとして働くことが報 告されている。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原から導かれたペプチド（ＨＢｓＡｇア ミノ酸残基１９〜３３）は、最近、組換えＢ型肝炎ワクチンで免疫化したヒト患 者の大部分においてＴ細胞応答を刺激することが示された（Schad,V.C.等(1991) Seminars in Immunol.,3:217-224）。主要ミコバクテリア抗原の６５ｋＤ蛋白 質も又、エピトープマップされた（Lamb，J.R.等(1987)EMBO J.,6(5):1245-1249 ）。この６５ｋＤ蛋白質の１１２〜１３２及び４３７〜４５９アミノ酸残基から なるペプチドにおいてＴ細胞エピトープが同定されている。ＭＢＰも又、ヒト（ Ota,K.等(1990) Nature,346:183-187）及び篭歯類（Zamvil等(1986) Nature,324 :258-260）の両方においてエピトープマップされた。 アレルゲン性蛋白質中に存在するＴ細胞エピトープが極最近記載された（O'He hir,R.等(1991)Ann.Rev.Immunol.,9:67-95）。室内塵ダニアレルゲンDerpＩから 誘導された幾つかのペプチドがＴ細胞反応性であることが示された（Thomas，W. R.等、アレルギー及び臨床免疫学の欧州学術会議 Ｘ IV（1989年９月、Berlin） からのEpitopes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop中の 77-82頁； O'Hehir,R.E.(1991)Annual Review Immunology 9:67-95; Stewart,G.A．等、ア レルギー及び臨床免疫学の欧州学術会議ＸIV（1989年９月、Berlin）からの Epi topes of Atopic Allergens Proceedings of Workshop 中の 41-47頁；及び Yessel,H.等、免疫と寛容の区別 の会議22-26（1990年９月、英国、Oxford在、Trinity College）T Cell Activat ion in Health and Disease 中）。短ブタクサアレルゲンAmb ａＩから導いたＴ 細胞刺激性ペプチド（アミノ酸残基５４〜６５）も又報告された（Rothbard,J.B . 等(1988)Cell，52:515-523）。ライグラスアレルギーの個人から導いたＴ細胞 クローンのパネルを用いて、Perez等は、Ｔ細胞エピトープが蛋白質アレルゲンL olpＩのアミノ酸残基１９１〜２１０内に含まれることを示した（Perez,M.等 (1 990) J.Biol.Chem.265(27):16210-16215）。発明の要約 この発明は、患者例えばヒト患者中の蛋白質抗原に対する免疫寛容を、その抗 原から導いた少なくとも１種のクリプティックペプチド及び製薬上許容し得るキ ャリアーを含む組成物の寛容化量を投与することによって誘導する方法に関係す る。蛋白質抗原例えばアレルゲン又は自己抗原から誘導したクリプティックペプ チドを含む組成物を投与して未感作の又は予備感作された個人において寛容を誘 導することが出来る。好ましくは、この組成物を、経口投与して、個人における アレルゲン又は自己抗原に対する感受性を治療する。図面の簡単な説明 図１は、DerpＩで免疫化したマウスから単離して、DerpＩから誘導した選択し たペプチドに対する応答についてトリチウム化チミジンの取り込みにより分析し たＴ細胞の応答のグラフ表示である。 図２ａ及び２ｂは、DerpＩから誘導した選択したペプチドで免疫化したマウス 単離して、DerpＩ蛋白質（パネルａ）又は適当なペプチド（パネルｂ）に対する 応答について分析したＴ細胞の応答のグラフ表示である。 図３は、マウスにより認識されるＴ細胞エピトープのDerpＩ蛋白質配列中の位 置の図式表示であり、ここに、免疫優性エピトープは平行線を引いた四角で表し 、クリプティックエピトープは点を打った四角で表し、エピトープのないことを 黒い四角で表してある。 図４は、緩衝液（パネルａ）、ペプチドＧＥＸｐ５７−１３０（パネルｂ）、 ペプチドＧＥＸｐ１０１−１５４（パネルｃ）、又は組換え蛋白質ＧＥＸDerpＩ （１−２２２）（パネルｄ）を給餌し、その後にDerpＩで免疫化したマウスから 単離し、イン・ビトロでのDerpＩへの応答について、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ（ パネルａ〜ｄ）又はＩＬ−２産生（パネルｅ〜ｈ）により分析したＴ細胞の応答 のグラフ表示である。 図５は、組換え蛋白質ＧＥＸDerpII（１−１２９）、ペプチドＧＥＸｐ１０１ −１５４、又はペプチドＧＥＸｐ１８８−２２２を給餌し、その後にDerpＩで免 疫化し たマウスから単離し、DerpＩ（パネルａ及びｄ）、ペプチドｐ１１０−１３１（ パネルｂ及びｅ）、又はペプチドｐ７８−１００（パネルＣ及びｆ）に対する応 答について、ＩＬ−３／ＣＳＦ（パネルａ〜ｃ）又はＩＬ−２産生（パネルｄ〜 ｆ）により分析したＴ細胞の応答のグラフ表示である。 図６は、緩衝液又は組換え融合ペプチド（ＧＥＸｐ１３１−１８７）の何れか を給餌し、その後にDerpＩで免疫化したマウスから単離し、DerpIIに対する応答 について、ＩＬ−２産生により分析したＴ細胞の応答のグラフ表示である。発明の詳細な説明 この発明は、患者内の蛋白質抗原に対する免疫寛容を、その抗原から誘導した 少なくとも１種のクリプティックペプチドを投与することによって誘導するため の方法に関するものである。蛋白質抗原は、特定のクラスII主要組織適合複合体 （ＭＨＣ）分子と共に提示された場合にその天然蛋白質抗原に対する曝露に際し て患者のＴ細胞を活性化するある種の決定基又はエピトープを含むことが知られ ている。Ｔ細胞応答は抗原上の１又は２の決定基の存在により制限されるのでは なく、Ｔ細胞応答は選択された幾つかの決定基を優先的に利用するようである。 従って、Ｔ細胞決定基利用の階層が、多決定基蛋白質抗原について存在する。従 って、特定の蛋白質抗原 に対するＴ細胞決定基又はエピトープをイン・ビトロＴ細胞増殖アッセイに基づ いてカテゴリーに分けることが出来、該増殖アッセイにおいては、蛋白質抗原プ ライムしたＴ細胞をその蛋白質抗原から誘導した選択した濃度のペプチドと共に 培養し、そのペプチドに応答したＴ細胞による増殖の量を例えばトリチウム化チ ミジンの取り込みにより測定する。 このアッセイにより、もしペプチドが、試験した患者において抗原プライムし たＴ細胞における最高のＴ細胞増殖応答の一つを一貫して誘導するならば、その ペプチドを免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むカテゴリーに類別する。免疫優性エ ピトープと比較して、マイナーＴ細胞エピトープを含むペプチドは、イン・ビト ロで、一層変わり易く且つ低い程度のＴ細胞増殖を再生せしめる。培地だけのバ ックグラウンドレベルの２倍未満のＴ細胞増殖を再生させるペプチドは、Ｔ細胞 エピトープを含まないか又はクリプティックＴ細胞エピトープを含むカテゴリー に類別される。クリプティックエピトープは、天然蛋白質抗原のプロセッシング 及び適当なＭＨＣ分子への提示のために普通は免疫系に示されない蛋白質抗原中 の決定基である。しかしながら、クリプティックエピトープを含むペプチドは、 Ｔ細胞を寛容化することが出来、患者をそのペプチドでプライムするとその患者 から得たＴ細胞はそのペプチドが由来したペプチド又は蛋白質抗原に応答してイ ン・ビトロで増殖する。蛋白質抗原から 誘導した少なくとも１つのクリプティックエピトープを含むペプチドを、ここで は、クリプティックペプチドという。上記のアッセイにより類別したペプチド中 のクリプティックエピトープの存在を確認するために、抗原プライムされたＴ細 胞を、各ペプチドの別々の存在下でイン・ビトロで培養してペプチド反応性Ｔ細 胞株を樹立する。もし所定のペプチドを用いてＴ細胞株を樹立することが出来、 且つＴ細胞がそのペプチド又はそのペプチドが由来した蛋白質抗原でのチャレン ジにおいて増殖し得るならば、そのペプチドは少なくとも１つのクリプティック エピトープを含むと考えられる。 蛋白質抗原中のクリプティックエピトープの存在は、ある種のエピトープの免 疫系への曝露の欠如によるものであり、適当なクラスIIＭＨＣ分子に対してエピ トープを示し得ない蛋白質抗原の正常なプロセッシングから生じ得る。或は、抗 原プロセッシングの最終生成物が、クリプティックエピトープを隠し、ＭＨＣ分 子又はそのエピトープに対して特異的なＴ細胞上のＴ細胞レセプターへのアクセ スを妨げる大型断片であり得る。更に、同じ蛋白質抗原上の他のエピトープは、 クリプティックエピトープと同じ制限要素への結合について競争し得るか、又は 異なる制限要素に対する一層高い親和性及び利用可能性を有することが出来、そ れ故、ＭＨＣとのクリプティックエピトープの相互作用を阻止する。 この発明のクリプティックペプチドは、蛋白質抗原か ら導いた少なくとも１つのクリプティックエピトープを含む（即ち、このペプチ ドは、少なくとも約７アミノ酸残基を含む）。かかるペプチドは、所望するだけ 多くの蛋白質抗原のアミノ酸残基を含むことが出来、好ましくは少なくとも約７ 、一層好ましくは少なくとも約１５、更に一層好ましくは少なくとも約２０及び 最も好ましくは少なくとも約２５アミノ酸残基を含むことが出来る。２０〜４０ アミノ酸残基程のペプチドの長さが好適である。何故なら、ペプチド長の増大は 、ペプチド合成を困難にし、並びに、ペプチドと蛋白質抗原（例えば、それが由 来したアレルゲン）の間のコンホメーション類似性の保持による望ましくない特 性（例えば、免疫グロブリン結合活性又は酵素活性）の保持を生じ得るからであ る。所望であれば、１種以上のペプチドのアミノ酸配列を生成し、リンカーによ り結合して抗原提示細胞によるプロセッシングに対する感受性を増大させること が出来る。かかるリンカーは、任意の非エピトープアミノ酸配列又は他の適当な 接合剤又は結合剤であってよい。例えば、２種のクリプティックペプチドを結合 することが出来、又はクリプティックペプチドと、蛋白質アレルゲンから導いた 免疫優性又はマイナーエピトープを含むペプチドとを繋ぐことが出来る。 クリプティックペプチドを、かかるペプチドをコードするヌクレオチド配列の 発現を指示する核酸ベクターでトランスフォームした宿主細胞において組換えＤ ＮＡ技 術により、又は化学合成により、或はある限られた状況においてはアレルゲン等 の蛋白質抗原の化学的開裂によって生成することが出来る。組換え技術により生 成した場合には、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指示する核酸 ベクターでトランスフォームした宿主細胞をその細胞に適した培地において培養 する。これらのペプチドは分泌され、細胞及び細胞培養培地の混合物から採取す ることが出来る。或は、このペプチドは細胞質に保持され、それらの細胞を採取 し、溶解させて、ペプチドを単離精製することが出来る。ペプチドを、ペプチド 又は蛋白質を精製するための当分野で公知の技術を用いて単離することが出来、 該技術には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限 外濾過、電気泳動及びこのペプチドが由来したペプチド若しくは蛋白質抗原又は その一部分に対して特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製が含まれる 。ここに記載したクリプティックペプチドを、組換えＤＮＡ技術により生成する 場合には細胞性物質又は培養培地を実質的に含まず、化学合成する場合又は蛋白 質アレルゲン若しくは他の蛋白質抗原の化学的開裂により得る場合には化学的前 駆物質その他の化学物質を実質的に含まないように単離する。 蛋白質抗原のＴ細胞エピトープが未知又は不明確な場合にこの発明のクリプテ ィックペプチドを得るために、その抗原の蛋白質構造を検討し、その配列を所望 の長さ の少なくとも２つのペプチド断片に分割することが出来る。例えば、蛋白質抗原 の蛋白質配列を系統的に少なくとも２つの所望の長さの重複しない断片又は所望 の長さの重複する断片に分割することが出来る。説明のための例として、２２９ 残基のアミノ酸配列（SEQ ID NO:１に示す）を有するDermatophagoides pterony ssinus のDerpＩ主要アレルゲンの公知のアミノ酸配列を、約２２〜３５アミノ酸 残基長であって各断片が他の断片と約１０アミノ酸だけ重複しているペプチド断 片に分割することが出来る。これらのペプチド断片中にＴ細胞エピトープを含む 可能性を最大にするために、アルゴリズムを用いて予想したＴ細胞エピトープの 存在を維持するように重複領域及び各断片の長さをデザインすることが出来る（ Rothbard,J. 及びTaylor,W.R.(1988) EMBO J.7:93-100;及びBerzofsky,J.A.(198 9) Philos.Trans.R.Soc.Lond.323:535-544）。好ましくは、蛋白質抗原中のヒト Ｔ細胞エピトープを、公知のＨＬＡクラスII結合特異的アミノ酸残基を用いて予 想することが出来る。その結果のペプチド断片を組換えＤＮＡ技術又は化学合成 によって生成することが出来る。 蛋白質抗原から誘導したペプチド断片を試験してＴ細胞刺激活性（即ち、増殖 、リンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギー／寛容の誘導）を有する断片を 決定した。例えば、ヒトＴ細胞刺激活性を、蛋白質抗原に感受性のヒト等の患者 （即ち、その蛋白質抗原に対する免疫 応答を有する患者）から得たＴ細胞を、この蛋白質抗原から誘導したペプチド断 片と共に培養し、その蛋白質に応答してＴ細胞による増殖の存在を測定すること により試験することが出来る。Ｔ細胞による増殖の存在は、例えば、トリチウム 化チミジンの取込みにより測定することが出来る。 免疫優性Ｔ細胞エピトープ、マイナーＴ細胞エピトープ及びクリプティックエ ピトープを実施例３に記載のように同定することが出来る。選択したペプチド中 のクリプティックエピトープの存在を確認するために、その蛋白質抗原に感受性 の個人からＴ細胞を得て、各クリプティックペプチドと共に別々に培養してペプ チド反応性Ｔ細胞株を樹立する。ペプチド及びそのペプチドが由来した蛋白質抗 原に応答したＴ細胞増殖又はＴ細胞寛容の誘発の存在は、そのペプチド中の少な くとも１つのクリプティックエピトープの存在を確実にする。 この発明のクリプティックペプチドは、アレルゲン又は自己抗原等の蛋白質抗 原から誘導することが出来る。アレルゲンから導く場合は、クリプティックペプ チドを、例えば、下記の属のアレルゲン等の任意の公知の蛋白質アレルゲンから 誘導することが出来る：Dermatophagoides属、Felis 属、Ambrosia属、Lolium属 、Cryptomeria 属、Alternaria属、Alder 属、Betula属、Quercus 属、Olea属、Artemisia 属、Plantago属、Parietaria属、Canine属、Blattella 属、Apis属、Periplaneta 属、及びSorghum 属。Dermatophagoidespteronyssinus 種の主要ア レルゲン、DerpＩ中のマウスにより認識されるクリプティックペプチドをマウス において測定し、DerpＩ（SEq ID NO:１）の１２０〜１４３アミノ酸残基、Derp Ｉ（SEQ ID NO:１）の１４４〜１６９アミノ酸残基及びDerpＩ（SEQ ID NO:１） のアミノ酸残基１３１〜１８７を含む。 クリプティックペプチドは又、自己抗原に対する免疫寛容が望ましい場合に、 アレルゲン以外の蛋白質抗原から誘導することも出来る。クリプティックペプチ ドが由来し得る自己抗原には、糖尿病治療用のインシュリン、グルタミン酸デカ ルボキシラーゼ（６４Ｋ）、ＰＭ−１及びカルボキシペプチダーゼ、多発性硬化 症治療用のミエリン塩基性蛋白質、胎児赤芽球症治療用のｒｈ因子、重症筋無力 症治療用のアセチルコリンレセプター、グレーブズ病治療用の甲状腺レセプター 、グッドパスチャー症候群治療用の基底膜蛋白質、及び甲状腺炎治療用の甲状腺 蛋白質が含まれる。 この発明の一面により、蛋白質抗原から誘導したクリプティックペプチドを患 者に投与して、その患者においてその蛋白質抗原に対する免疫寛容を誘導する。 この患者という用語には、蛋白質抗原に対する免疫応答を高めることの出来る生 物体例えば哺乳動物が含まれる。患者の例には、ヒト、ラット、マウス、イヌ、 ネコ、ウマ、ウシ及びこれらのトランスジェニック種が含まれる。免 疫寛容とは、患者内の特定のリンパ球の発生、成長又は分化のブロックがこの発 明のクリプティックペプチドの寛容量の投与により生じた患者の状態をいう。寛 容は、リンパ球が活性化されずに削除され又は不応答性にされる条件下での抗原 のリンパ球上の抗原レセプターとの相互作用から生じる。寛容は又、特異的Ｔ若 しくはＢリンパ球の作用又はリンパ球活性化を阻止する他の制御機構によること もあり得る。免疫応答を阻止するための１つの機構は、サプレッサーＴ細胞と呼 ばれるリンパ球の１つのクラス（その主要な機能は、特定のＴ及びＢリンパ球の 活性化を抑制することである）の刺激である。この状況において、阻止は、抗原 自身によってではなく抗原により誘導された制御細胞によって媒介される。他の 提案された寛容の機構は、リンパ球のユニーク若しくはイソタイプ決定基又は抗 原に特異的な抗体が標的とされる抗原に対する免疫系による応答である。この応 答は、この応答は、相補的イディオタイプのネットワーク及び抗原特異的細胞の 刺激をブロックする抗イディオタイプを生じる。最後に、Ｂ及びＴリンパ球の活 性化の生成物、即ち抗体及びサイトカイン自身は、それぞれ、リンパ球の原理的 エフェクター分子として機能することに加えて特異的免疫を制御して寛容を生じ ることが出来る。 患者において免疫寛容を誘導するために、蛋白質抗原から誘導したクリプティ ックペプチドの寛容化量を患者に投与する。寛容化量を、ヒト等の患者において クリプ ティックペプチドが由来した抗原に対する免疫寛容を誘導するのに必要なクリプ ティックペプチドの投薬量として定義する。患者における免疫寛容は、標準的臨 床手順で測定して、蛋白質抗原に対する非応答性又は症状の減少により示される （例えば、Varney等(1990)British Medical Journal 302:265-269を参照された い）。アレルゲンに対する寛容が求められる場合、かかる非応答性には、アレル ゲン誘導されたアレルギー症状の減少が含まれる。ここでいう場合、アレルゲン に対する症状の減少には、ヒト等の患者の、ここに記載したクリプティックペプ チドでの治療養生法の後のアレルゲンに対するアレルギー応答の如何なる減少も 含まれる。この症状の減少は、ヒトにおいては主観的に測定することが出来（例 えば、患者がアレルゲンにさらされたときに一層快適に感じればよい）、或は、 標準皮膚試験を用いる等臨床的に測定することが出来る。 蛋白質抗原から誘導したクリプティックペプチドを、典型的には、患者に、製 薬上許容し得るキャリアー又は希釈剤を含む組成物の形態で投与する。患者にお いて蛋白質抗原に対する免疫寛容を誘導するための本発明の組成物の投与は、公 知の手順を用いて、患者をその蛋白質抗原に対して寛容にするのに有効な投薬量 及び期間にて行なうことが出来る。この組成物の有効量は、患者の抗原に対する 感受性の程度、年齢、性別、及び体重等の因子、並びにクリプティックペプチド の患者において寛容 を誘導する能力によって変化する。投薬量養生法は、最適治療応答を与えるよう に調節することが出来る。例えば、幾つかに分割した投与量を日々投与し又は治 療状況の緊急度に応じて減らすことが出来る。 クリプティックペプチドは、慣用の方法、例えば注射（皮下、静脈等）、経口 投与、吸入、鼻腔内投与、経皮適用、又は直腸投与によって患者に投与すること が出来る。患者における免疫寛容を誘導するための投与の好適経路は、経口投与 及び鼻腔内投与である。O'Hehir,R.E.等(1993)Eur.J.Clin.Invest.23(12):763-7 72参照。投与経路によって、活性化合物（即ち、クリプティックペプチド）を、 この化合物を不活性化し得る酵素、産その他の天然条件から保護する物質で被覆 することが出来る。 クリプティックペプチドを腸投与によって投与するためには、このペプチドを その不活性化を阻止する物質で被覆するか又はその物質と同時投与する必要があ り得る。例えば、クリプティックペプチドを、適当な希釈剤にて、患者に投与し 、酵素阻害剤と同時投与し、又はリポソーム等の適当なキャリアーにて投与する ことが出来る。製薬上許容し得る希釈剤には、塩溶液及び緩衝剤水溶液が含まれ る。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホ スフェート（ＤＥＰ）及びトラシロールが含まれる。リポソームには、水中油中 水ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソームが 含まれる（Strejan 等(1984) J.Neuroimmunol.7:27）。寛容を誘導する目的のた めには、この組成物を、好ましくは、非免疫原形態、例えばアジュバントを含ま ない形態にて投与する。 活性化合物を、非経口投与することも出来る。グリセロール、液体ポリエチレ ングリコール、及びそれらの混合物並びに油にて分散を調製することも出来る。 通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製物には、微生物の成育を阻止する ための防腐剤を含ませることが出来る。 注射用に適した製薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散及び 無菌の注射用溶液若しくは分散の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。すべ ての場合に、組成物は無菌でなければならず且つ容易に注射出来る程度に流動性 でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下において安定でなければなら ず且つ細菌及びカビ等の微生物の夾雑に対して保護されなければならない。キャ リアーは、溶媒又は分散媒であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオール （例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコー ル等）、これらの適当な混合物及び植物油が含まれる。適当な流動性を、例えば 、レシチン等の被覆を用いることにより、分散の場合に必要な粒子サイズを維持 することにより、及び界面活性剤の利用によって維持することが出来る。微生物 の作用の阻止は、種々の抗細菌及 び抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン 酸、チメロサール等によって達成することが出来る。多くの場合、組成物中に、 等張剤例えば、糖質、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、塩化 ナトリウムを含むことが好ましい。組成物に吸収を遅延させる薬剤例えばアルミ ニウムモノステアレートびゼラチンを含有させることによって、注射可能組成物 の延長された吸収を達成することが出来る。 無菌の注射溶液を、活性化合物を必要な量で適当な溶媒中に上記の成分の１つ 又は組合せと共に混合し（必要ならば）、その後除菌濾過することにより調製す ることが出来る。一般に、分散を、活性化合物を、基本的分散媒及び上記の内の 必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に混合することによって調製する。無菌注 射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好適方法は、活性成分（即ち、こ の発明のペプチド）に上記の除菌濾過した溶液からの任意の所望の成分を加えた 粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。 ここに記載のクリプティックペプチドを上記のように適当に保護すれば、その ペプチドを、例えば不活性の希釈剤又は同化可能な食べられるキャリアーと共に 経口投与することが出来る。このペプチド及び他の成分を、硬い若しくは柔らか い殻ゼラチンカプセルに封入し、錠剤に圧縮し、又は直接個人の食事に混ぜるこ とも出来る。 経口投与用に、活性化合物を賦形剤と混ぜ、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トロー チ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用する ことが出来る。かかる組成物及び調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を 含むべきである。この組成物及び調製物のパーセンテージは、勿論、変えること が出来、約５〜８０重量％の単位が便利である。かかる組成物中の活性化合物の 量は、最適の投薬量が得られるようにする。本発明による好適組成物又は調製物 は、経口投薬量単位が約１０〜２００ｍｇの活性化合物を含むように調製する。 ここで用いる場合、「製薬上許容し得るキャリアー」には、任意のすべての溶 媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張剤並びに吸収遅延剤等 が含まれる。かかる製薬上活性な物質のための媒質及び薬剤は当分野において周 知である。慣用の媒質又は薬剤が活性化合物と相容れない場合を除いて、それら の組成物における利用は企図される。補足的活性化合物をこれらの組成物に混ぜ ることも出来る。 組成物を、投与しやすい投薬量単位形態及び均一の投薬量で配合するのが有利 であり得る。投薬量単位とは、ここで用いる場合、治療される哺乳動物患者に対 する単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい、各単位は、所望の効果 を生じるように計算された活性化合物の予め決められた量を必要な製薬用キャリ アーと共に含 む。この発明の投薬量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特性及び達 成すべき効果及び（ｂ）患者の治療用のかかる活性化合物を合成する本質的技術 的限界により指示され且つ直接それらに依存する。 この発明の組成物は、ヒト等の患者に投与される１種以上のクリプティックペ プチドを含むことが出来、或はクリプティックペプチド及び免疫優性又はマイナ ーエピトープを含むペプチドを含むことが出来る（該患者は、このペプチドが由 来した蛋白質抗原に未感作又は予備感作されており、投薬量及び期間は、患者に おいてこの抗原に対する寛容を誘導するのに十分なものとする）。例えば、一種 以上の同じ又は異なる組成物の患者における寛容を誘導するのに有効な量を同時 に又は順次的に投与することが出来る。少なくとも２種のペプチドを含む組成物 （例えば、少なくとも２種のペプチドの物理的混合物）も又、寛容化方法におい て用いることが出来る。例えば、クリプティックペプチドと免疫優性エピトープ を含むペプチドを同時投与することが出来る。 この発明のクリプティックペプチド（即ち、完全な蛋白質抗原を患者に与えた 場合に免疫化において認識されるエピトープを含まないペプチド）を投与するこ とによって寛容を誘導することが出来るという事実は、重要である。免疫療法に おいて有効なペプチドは、それ故、単にＴ細胞クローン又は感作された個人のポ リクローナル応答により認識されるものに限らない。クリプティック ペプチドの投与は、免疫優性エピトープを含むペプチドを感作された個人へ投与 することにおける潜在的な本質的限界を回避することが出来る。クリプティック ペプチドの利用は、既にＴ_h１及びＴ_h２又は同等の経路に沿って進行しているＴ 細胞クローンの発生を向け直すことを必要とせずに免疫応答を改変する可能性を も提供する。 溶解度を高め、治療若しくは防護効果又は安定性（例えば、生体外での棚持ち 及び生体内での蛋白質分解に対する抵抗性）を増大させる等の目的のためにこの 発明の方法において有用なクリプティックペプチドの構造を改変することも可能 である。ペプチドの寛容を誘導する能力を改変するためにアミノ酸置換、欠失又 は付加等によりアミノ酸配列を変えた、或は同じ目的のために成分を付加した改 変ペプチドを生成することが出来る。 例えば、ペプチドを、それがＴ細胞アネルギー又は寛容を誘導しＭＨＣ蛋白質 に結合する能力を維持するように改変することが出来る。この例において、Ｔ細 胞レセプターについて重要な結合性残基（即ち、クリプティックエピトープを含 むアミノ酸残基）を、公知技術（例えば、各残基の例えばアラニンでの置換及び Ｔ細胞反応性の有無の測定）を用いて決定することが出来る。必須であることが 示された残基を、その必須アミノ酸を他の好ましくは類似アミノ酸残基（その存 在がＴ細胞反応性を増大させ、減少させるが排除せず又は影響するアミノ酸 残基）で置換する（保存的置換）ことによって改変することが出来る。更に、Ｔ 細胞相互作用に必須でないアミノ酸残基を他のアミノ酸（その取込みがＴ細胞反 応性を増大させ、減少させ又は該反応性に影響しないが、関連ＭＨＣへの結合を 排除しないアミノ酸）で置換することにより改変することが出来る。非必須アミ ノ酸についての好適アミノ酸置換は、限定はしないが、アラニン、グルタミン酸 又はメチルアミノ酸での置換を含む。 ペプチドの改変の他の例は、ジスルフィド結合による２量体形成を最小化する ためのシステイン残基の好ましくはアラニン又はグルタミン酸、或はセリン又は スレオニンでの置換である。 安定性及び／又は反応性を増大させるために、ペプチドを改変して、天然の対 立遺伝子変異から生じる蛋白質抗原のアミノ酸配列における１つ以上の多型を取 込むことも出来る。更に、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸又は非アミノ酸アナロ グを代用とし又は付加してこの発明の範囲内の改変ペプチドを生成することが出 来る。更に、ペプチドを、A.Sehon と共同研究者（Wie 等、前出）のポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）法を用いて改変してＰＥＧと結合したペプチドを生成す ることが出来る。ペプチドの改変は、還元／アルキル化（Tarr:Methods of Prot ein Microcharacterization,J.E.Silver編、ニュージャージー、Clifton 在、Humana Pre ss，155-194頁 (1986)中）、アシル化（Tarr，前出）、エステル化（Tarr，前 出）、適当なキャリアーへの化学的カップリング(Mishell 及び Shiigi 編、Sel ected Methods in Cellular Immunology，カリフォルニア、San Francisco 在、WH Free man (1980);米国特許第４，９３９，２３９号）、又は温和なホルマリン処理（M arsh，(1971)International Archives of Allergy and Applied Immunology 41: 199-215)を含むことも出来る。 ペプチドの精製を容易にし、それらの溶解度を潜在的に増大させるために、レ ポーター基をペプチド主鎖に加えることが出来る。例えば、ポリヒスチジンをペ プチドに加えてそのペプチドを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフ ィー（Hochuli,E.等 (1988) Bio/Technology,6:1321-1235）にて精製することが 出来る。更に、所望であれば、特異的なエンドプロテアーゼ開裂部位をレポータ ー基とペプチド配列との間に導入して、無関係な配列を含まないペプチドの単離 を容易にすることが出来る。上首尾に患者を蛋白質抗原に対して寛容化するため には、ペプチドに官能基を付加し又はペプチド中に疎水性領域を導入しないこと によってペプチドの溶解度を増すことが必要であり得る。 ペプチド内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に助成す るために、標準的プロテアーゼ感受性部位をペプチド内に組換えにより又は合成 によって工作することが出来る。例えば、ＫＫ又はＲＲ等の帯電したアミノ酸対 を、ペプチドの組換え構築中に、ペプ チド内に導入することが出来る。その結果生成するペプチドを、カテプシン及び ／又は他のトリプシン様酵素開裂に感受性にして１つ以上のＴ細胞エピトープを 含むペプチドの部分を生成することが出来る。更に、かかる帯電アミノ酸残基は 、ペプチドの溶解度の増加を生じ得る。 ペプチドをコードするＤＮＡの位置指定突然変異導入法を用いて、ペプチドの 構造を改変することが出来る。かかる方法は、ＰＣＲ（Ho等 (1989) Gene 77:51 -59）又は変異遺伝子の全合成（Hostomsky,Z.等 (1989)Biochem．Biophys．Res ．Comm．161:1056-1063）を含んでよい。細菌の発現を増大させるために、上記 の方法を他の手順と共に用いて、ペプチドをコードするＤＮＡ構築物中の真核生 物用コドンを、大腸菌、酵母、哺乳動物又は他の真核生物細胞において優先的に 用いられるものに変えることが出来る。 この発明を、更に、下記の非制限的実施例により説明する。この出願中で引用 されているすべての参考文献及び公表された特許出願を参考として本明細書中に 援用する。下記の材料及び方法の節に記載した方法を、後述の実施例において用 いた。 材料及び方法動物及び抗原 雌のＢ１０及びＢＡＬＢコンジェニックマウス及び同 系交配のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（６〜８週齢）を、オーストラリア国、ウエスタン、Murdo ch在、Animal Resource Centreから購入した。 室内塵ダニアレルゲンDerpＩを消耗したダニ媒質（ＳＭＭ）から、前に記載さ れた技術（Hoyne,G.F.等(1993)前出；Lombardo等 J.Immunol.144:1353-1360及び Chapman (1989) Advances in Biosciences 74:281-295）を用いて、アフィニテ ィー精製した。結晶オバルブミン（ＯＶＡ）第Ｖ等級を、ミズーリ、St.Louis在 、Sigma Chemical社から購入した。公表されたDerpＩ配列（Chua等（1988）J.Ex p.Med.167:175-182）から誘導した重複合成ペプチドを、標準ｔ−ＢＯＣ化学を 用いて合成し、ペプチドを逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ り精製して、個々のペプチドの配列をチェックして正体を確認した。この研究で 使用したペプチドは、DerpＩ配列（Chua等 (1988) 前出）から誘導した下記のア ミノ酸残基を含んだ：１〜２０、１３〜３９、２１〜４９、４０〜６０、５０〜 ７１、６１〜８４、７８〜１００、８５〜１０９、１０１〜１１９、１１０〜１ ３１、１２０〜１４３、１３２〜１５７、１４４〜１６９、１５８〜１８０、１ ７０〜１９１、１８１〜２０４、１９７〜２２２。組換え蛋白質の調製 全DerpＩ又はDerpII蛋白質をコードするインサート（オーストラリア国、Melb ourne 在、Commonwealth Serum Laboratories，消耗ダニ媒質からのもの）又は組換え構築物（関連ｃＤＮ Ａの制限エンドヌクレアーゼ断片から形成したもの；Chua等(1990) Int.Arch.Al lergy Appl.Immunol.91:118-123参照）をｐＧＥＸベクターにライゲートして大 腸菌中にトランスフォームした（Smith,D.B.及びJohnson,K.S.(1988)Gene,67:31 ）。これらの生成物の分子クローニングの手順は、他所に記載されている（Chua ,K.Y．等(1988) J.Exp.Med.,167:175及びChua,K.Y．等(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,91:124）。ｐＧＥＸベースの蛋白質又はペプチド構築物でトラン スフォームした対数期大腸菌を、０．１ｍＭ イソプロピルチオガラクトシダー セ（ＩＰＴＧ）（Promega）を培養に加えて３７℃で６０分間震盪することによ り、組換え蛋白質の発現を誘導した。多量の融合ペプチドが必要であったので、 それらを可溶化含有物から調製した。細菌ペレットを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有 するトリス緩衝塩溶液中に再懸濁し、０．１ｍｍガラスビーズを含むホモジェナ イズ用ボトルに移して、Braun MSK ホモジェナイザーを用いて５分間ホモジェナ イズした。１０，０００ｇで、４℃で１０分間の超遠心分離の後に溶菌液を取り 出した。ペレットを、１ＭＮａＣｌ及び１％トリトン−Ｘ１００（BDH Chemical s）を含む１．７５Ｍ グアニジンＨＣＬで、ピペットで入念に吸うことにより 、２回洗い、次いで遠心分離した。次いで、ペレットを、５０ｍＭ ＮａＣｌ及 び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む８Ｍ 尿素中で３７℃で２時間イン キュベートすることにより溶解させた。この試料を、３−（シクロヘキシルアミ ノ）−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ10.7）にて透析し、ｐＨを ゆっくりと９．６に調節した。次いで、組換え物質を、１００００ｇの遠心分離 により清澄化し、可溶性物質の濃度をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準量に 対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びクー マシーブルーでの染色を用いて評価した。この研究で使用した組換ペプチドは、 ＧＥＸDerpＩ（アミノ酸残基１〜２２２）、ＧＥＸDerpII（アミノ酸残基１〜１ ２９）、ＧＥＸｐ１−１４（DerpＩのアミノ酸残基１〜１４）、ＧＥＸｐ６０− １１１（DerpＩのアミノ酸残基６０〜１１１）、ＧＥＸｐ９８−１４０（DerpＩ のアミノ酸残基９８〜１４０）、ＧＥＸｐ１０１−１５４（DerpＩのアミノ酸残 基１０１〜１５４）、ＧＥＸｐ５７−１３０（DerpＩのアミノ酸残基５７〜１３ ０）、ＧＥＸｐ１８８−２２２（DerpＩのアミノ酸残基１８８〜２２２）。経口寛容の誘導 マウスをエーテル下で軽く麻酔し、胃内にチューブで３ｍｇの蛋白質又はペプ チドを３日連続で供給した。抗原をＣＡＰＳ緩衝液に溶解させて０．２ｍｌの容 積にて投与した。マウスを、最後の給餌の７日後に、尾の基部に、容積０．２ｍ ｌにて完全フロイントアジュバント （ＣＦＡ）中に乳化した１００ｍｇの天然蛋白質で皮下に免疫化した。培養培地 リンパ節細胞を、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０ｍＭ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び２０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったダルベッコ改変イ ーグル培地（ＤＭＥ）中で培養した。ＦＤＣ−Ｐ１細胞（Kelso,A.(1990),J.Imm unol.,145:2167）をＤＭＥ＋５％ＦＣＳ中に維持し、他方ＣＴＬＬ−２細胞（Kr illis,S.（1978） J.Immunol.120:20）をRosewall Park Memorial Institute（ ＲＰＭＩ）培地＋１０％ＦＣＳ中に維持した。Ｔ細胞アッセイ 大動脈周囲及び鼠径リンパ節を免疫化したマウスから採取し、これらの節をス テンレス鋼ワイヤーメッシュを通すことにより単離細胞浮遊液を調製した。細胞 を洗って、９６ウェル平底組織培養プレートにて、０．２ｍｌの容積のＤＭＥ培 養培地中で４×１０⁵細胞にて培養した。蛋白質又はペプチド抗原を種々の濃度 で加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。上清を集めて必要がある まで−２０℃に保存した。すべてのイン・ビトロアッセイに使用されたDerpＩは 、消耗ダニ媒質（ＳＭＭ）から単離したアレルゲンであった。リンホカインアッセイ ＦＤＣ−Ｐ１細胞は、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦに応 答して最も増殖し、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４に対してそれに次いで増殖する（Ke lso,A.(1990)前出）。２×１０³細胞を、５０μｌＤＭＥ＋５％ＦＣＳにて、９ ６ウェル平底組織培養プレート中の５０μｌの培養上清に加えた。これらの細胞 を、４０時間３７℃でインキュベートし、次いで、１μＣｉの³Ｈ−チミジンで 更に４〜６時間３７℃でパルス標識した。次いで、細胞をガラス繊維フィルター マット上に採取して、試料を、液体シンチレーションスペクトロメトリーを用い て、又は後の実験用にそれを獲得するためにPackardマトリックス9600直接ベー タカウンター（コネチカット、Meriden在、Packard Instruments）にて、³Ｈ− チミジンの取込みについて計数した。 ＣＴＬＬ−２細胞株は、ＩＬ−２で最大に増殖するが、ＩＬ−４の存在下では 僅かしか増殖しない（Kelso,A.(1990)J.Immunol.145:2167）。上清を、ウェル当 り５０００のＣＴＬＬ−２細胞と共に２４時間３７℃で培養し、１μＣｉの³Ｈ −チミジン（³Ｈ−Ｔｄｒ）でパルス標識した。細胞を、ガラス繊維フィルター マット上に採取して、取込まれた放射能の量を上記のように測定した。実施例１ マウスにより認識されるDerpＩ中の 免疫優性、マイナー及びクリプティック Ｔ細胞エピトープの測定 Ｈ２^bマウスはDerpＩに対する高応答動物であるが、Ｈ２^k、Ｈ２^d及びＨ２^qマ ウスは低応答動物であることが以前に示された（Hoyne,G.(1992) Ph.D.Thesis,T cell Recognition During Mucosal and Systemic Responses，Western Austral ia大学）。DerpＩ上のＴ細胞エピトープの位置を決定するために、Ｂ１０マウス を１００μｇのＣＦＡ中のDerpＩで皮下に免疫化し、８日後に大動脈周囲及び鼠 径リンパ節を、重複ペプチドのパネルを用いて、抗原特異的リンホカイン放出（ ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ）について調べた。３つの別々の実験において、最大応 答はペプチドｐ１１０−１３１（DerpＩのアミノ酸残基１１０〜１３１）に対し て見出され、他方、最低応答もペプチドｐ７８−１００（DerpＩのアミノ酸残基 ７８〜１００）及びｐ２１−４９（DerpＩのアミノ酸残基２１〜４９）に対して 見られた。他のペプチドは、応答を刺激することが出来なかった。かかる実験の １つの結果の例を図１に示すが、ここでは次のペプチドを用いた：ペプチドｐ１ １０−１３１（□）、ペプチドｐ７８−１００（△）及びペプチドｐ２１−４９ （●）。 クリプティックエピトープについて試験するために、マウスをすべてのペプチ ドで免疫化し、DerpＩ及び免疫 化ペプチドに対する応答を、脾臓接着細胞の存在下で測定した。ペプチドｐ１２ ０−１４３（DerpＩのアミノ酸残基１２０〜１４３）及びペプチドｐ１４４−１ ６９（DerpＩのアミノ酸残基１４４〜１６９）は、マウスを感作して、それらが 完全なDerpＩ蛋白質（図２ａ）及びペプチド（図２ｂ）の両者に対してそれぞれ 応答を再生するようにすることが出来る。図２の結果は、３重の試料の平均ＩＬ −３／ＧＭ−ＣＳＦ応答を示している。この図には、次のペプチドを示してある ：ペプチドｐ１２０−１４３（□）、ペプチドｐ１４４−１６９（△）、ペプチ ドｐ１３２−１５７（○）及びペプチドｐ１５８−１８０（×）。実施例２ 融合蛋白質の投与によるマウスにおける 経口寛容の誘導 幾つかの組換えペプチドを、DerpＩｃＤＮＡの制限酵素消化により生成した。 これらの断片を上記のようにｐＧＥＸ発現ベクター中にクローン化して大腸菌中 にトランスフォームした。この研究用に選択した組換えペプチドは、Schistosom a japonicum のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ蛋白質に付着した融合体 として発現した。これらの融合蛋白質及びペプチドを細菌細胞ペレットから可溶 化してＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．６）中に透析した。図３に列挙したこれらの組 換えペプチドを、上記の公知のＴ細胞エピトープデータに基づいて選択し た。組換えペプチドを、その配列内の免疫優性（平行線を引いた四角）、クリプ ティックエピトープ（点を打った四角）の存在又はＴ細胞エピトープの不在（黒 い四角）について選択した。従って、対照ペプチドＧＥＸｐ１−２３（DerpＩの アミノ酸残基１〜２３）及びＧＥＸｐ１８８−２２２（DerpＩのアミノ酸残基１ ９７〜２２２）は、如何なるＴ細胞エピトープをも含んでいなかった。ＧＥＸｐ ５７−１３０（DerpＩのアミノ酸残基５７〜１３０）は、２つのエピトープを含 んだが、他方、ＧＥＸｐ１０１−１５４（DerpＩのアミノ酸残基１０１〜１５４ ）及びＧＥＸｐ９８−１４０（DerpＩのアミノ酸残基５７〜１３０）は単一免疫 優性エピトープ（アミノ酸残基１１０〜１３１）を含み、ＧＥＸｐ１３１−１８ ７（DerpＩのアミノ酸残基１３１〜１８７）はクリプティックエピトープを含ん でいる。 以前に特性表示された経口寛容の誘導のための養生法（Hoyne,G.F.(1993),Imm unology 78:534-540）に従って、マウスに、３ｍｇの融合ペプチドを３日連続で 与え、更に７日後に、ＣＦＡ中の天然蛋白質で皮下に免疫化した。次いで、７日 後に、蛋白質又は合成ペプチドの何れかで刺激した大動脈周囲及び鼠径リンパ節 を用いてイン・ビトロリンホカインアッセイを行なった。マウスにＣＡＰＳ緩衝 液又は組換えＧＥＸDerpＩ（１−２２２）融合蛋白質を与えることが、ＣＦＡ中 のＯＶＡの皮下注射に対するマウスのＩＬ−２又はＩＬ−３／Ｇ Ｍ−ＣＳＦ応答に影響を有しないことを示すための実験を行なった。 経口投与したペプチドが寛容を誘導し得るか否かを試験するために、対照用マ ウスにＣＡＰＳ緩衝液を与え（図４、パネルａ及びｅ）、他方、試験用動物には 、３ｍｇのＧＥＸDerpＩ（１−２２２）（図４パネルｄ及びｈ）又は融合ペプチ ドＧＥＸｐ５７−１３０（図４、パネルｂ及びｆ）又はＧＥＸｐ１０１−１５４ （図４、パネルｃ及びｇ）を、３日連続で与えた。１週間後に、ＣＦＡ中の天然Derp Ｉでの免疫化に対する応答を測定した。ＣＡＰＳ緩衝液を与えられたマウス は、DerpＩ蛋白質に対する強い応答、ＴＣＲトリガーリングに応答してＩＬ−３ ／ＧＭ−ＣＳＦ（図４、パネルａ）及びＩＬ−２（図４、パネルｅ）の両者のイ ン・ビトロ分泌を示した。他方において、ＧＥＸDerpＩ（１−２２２）又は２つ のペプチドＧＥＸｐ５７−１３０若しくはＧＥＸｐ１０１−１５４の何れかを与 えられたマウスは、ＩＬ−２応答を低下させた（図４、パネルｆ−ｈ）。ＩＬ− ２応答の一層顕著な阻止は、この性質のすべての実験の一貫した特徴であった。 マウスにＧＥＸｐ９８−１４０を与えたところ、このペプチドにより誘導された 同程度の寛容が見出された。 経口寛容の発達がアレルゲン上のＴ細胞エピトープに対する応答にどの程度影 響したかを調べるために、３ｍｇのＧＥＸｐ１０１−１５４又はＧＥＸｐ１８８ − ２２２及びＧＥＸDerpII（１−１２９）（対照用）を、３日連続でマウスに与え た。１週間後に、マウスをDerpＩで免疫化し、リンパ節細胞を涸渇させる応答を イン・ビトロで蛋白質及びペプチドに対して測定した。データは、次の抗原濃度 での各群における個々のマウスについての応答を示す：DerpＩ、２０μｇ／ｍｌ ；ペプチドｐ１１０−１３１及びペプチドｐ７８−１００、１０μＭ。図５に示 したように、マウスにＧＥＸｐ１８８−２２２又はＧＥＸDerpII（１−１２９） の何れかを与えることは、蛋白質又は免疫原性ペプチドｐ１１０−１３１又はｐ ７８−１００でのイン・ビトロでのチャレンジにおいて、それらのリンパ節細胞 のＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−２を分泌する能力に影響しない。しかしな がら、対照的に、ＧＥＸｐ１０１−１５４を与えられたマウスのリンホカイン応 答は著しく減少し、従って、全蛋白質に対して寛容化されたようである（図５） 。１つのエピトープの給餌により誘導される寛容は、アレルゲン上の他のエピト ープに対して特異的なＴ細胞に影響を与えるようである。引き続く１つのエピト ープを含むＧＥＸｐ６１−１００及び融合ペプチドＧＥＸｐ１−２３（対照用） を用いる実験は、同じ結果を与えた。 クリプティックエピトープを含むペプチドが免疫応答に影響し得るか否かを測 定するために、マウスに、３ｍｇのペプチド１４４〜１６９に見出されたクリプ ティ ックエピトープを含むＧＥＸｐ１３１−１８７（図６（●））を３日連続で与え 、他方、対照用マウスには、ＣＡＰＳ緩衝液（図６（□））を与えた。１週間後 に、マウスを、ＣＦＡ中のDerpＩで免疫化した。リンパ節細胞を、イン・ビトロ でDerpＩと共に培養し、上清をＩＬ−２についてアッセイした。図６の各データ 点は、群当り５匹の動物の平均応答±標準偏差を示す。クリプティックペプチド を与えられたマウスの応答は、統計的に異なった（ｐ＜０．０５ ｔ検定）。図 ６に示したように、対照用マウスからのリンパ節細胞は、ＩＬ−２分泌によりイ ン・ビトロでDerpＩに対する強い応答を示したが、クリプティックエピトープを 与えられたマウスは、ずっと弱いリンホカイン応答をイン・ビトロで示した。 ここに提供したこれらの結果は、優性又はクリプティックＴ細胞エピトープを 含む融合ペプチドを給餌することは、全抗原での皮下免疫化に対するＴ細胞応答 を阻止し得ることを示している。優性エピトープを含む融合ペプチドの場合には 、この阻止は顕著であり、全アレルゲン又は免疫優性ペプチドでイン・ビトロで チャレンジされたリンパ節細胞涸渇からの低下したＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦ放 出により測定される。これは、給餌に用いた融合体上に存在しない残基を含むペ プチドへの応答を含んだ。例えば、融合ペプチドＧＥＸｐ１０１−１５４を給餌 することは、DerpＩ免疫化の、全アレルゲン及び合 成ペプチドｐ１１０−１３１及びｐ７８−１００と反応するＴ細胞を誘導する能 力を阻止した。従って、この効果は、可溶性因子によって媒介され得る。或は、 この阻止は、DerpII融合蛋白質によっては誘導し得ないので特異的である。類似 のデータが、Miller，A.等(1991)J.Exp.Med.,174:791; Whitacre，C.C.等(1990) J.Immunol.147:2155; 及び Miller,A.等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:421 によって得られており、ＭＢＰに対する経口寛容がＴＧＦ−β１により媒介され 、イン・ビトロモデルにて傍観者応答を抑制することを示し得ることが見出され た。 Ｔ細胞エピトープを含まない２種の融合蛋白質を給餌することは、免疫応答を 阻止しなかった。しかしながら、ペプチドｐ１４４−１６９に見出されたクリプ ティックエピトープを含む融合ペプチドＧＥＸｐ１３１−１８７を給餌すること は、有意に阻止した。阻止の程度は、優性エピトープを含む融合体については著 しくなかったが、恐らく給餌養生法を延長し又は投与量を増すことによって増大 させ得るであろう。これらの融合ペプチドを給餌することは又、ＭＬＮにおいて Ｔ細胞を感作して、それらが、ペプチドＧＥＸｐ１３１−１８７を給餌した後にDerp Ｉ又はクリプティックペプチドｐ１４４−１６９を含む合成ペプチドでイン ・ビトロで刺激したときにＧＭ−ＣＳＦを放出するようにすることも見出された 。経口寛容におけるこれらの感作された細胞の存在 は、最近、ＯＶＡについて記載された（Hoyne,G.F.等(1993),Immunology 78:534 -540）。実施例３ アレルギー性の個体により認識される DerpＩ中の免疫優性、マイナー及び クリプティックＴ細胞エピトープの決定 アレルギー性の個体により認識されるDerpＩ蛋白質配列中のＴ細胞エピトープ を決定するために、ダニアレルギー患者の末梢血液白血球を、完全培地にて、２ ×１０⁶／ｍｌで、２０μｇ／ｍｌの精製した天然DerpＩの存在下で培養するこ とによりＴ細胞株を樹立することが出来る。湿潤化ＣＯ₂インキュベーター中で ３７℃で７日間の培養した後に、生存可能細胞を、リンパ球分離用培地（ＬＳＭ 、ノースカロライナ、Durham在、Organon Technica）を用いる遠心分離によって 単離し、組換えＩＬ−２及び組換えＩＬ−４を含む完全培地にて更に２〜３週間 培養することが出来る。Ｔ細胞が「休止」していてもはや成長因子に対して応答 性でない場合は、２×１０⁴のＴ細胞を、２００μｌの完全培地中で、５×１０⁴ のガンマー線照射（３５００ラド）した末梢白血球（抗原提示細胞）と共に、種 々の濃度の完全な蛋白質から誘導したペプチドの存在下で培養することによる第 ２増殖アッセイを行なうことが出来る。これらの培養を、次いで、３日目に、ト リチウム化チミジン（１μＣｉ／ウェル）でパルス標識し、４日目に、ガラス繊 維 フィルター上に採取することが出来る。トリチウムの取込みを培地対照の少なく とも２倍より多く刺激するペプチドを、完全蛋白質（即ち、ペプチドは、少なく とも１つのマイナー又は免疫優性エピトープを含む）を与えたときに、天然にお いてＴ細胞に曝露されるＴ細胞エピトープを含むと規定する。培地対照の２倍よ り少ないトリチウム取込みを刺激するペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含まない か又はクリプティックペプチド（即ち、完全な蛋白質が与えられたときに、通常 、Ｔ細胞に曝露されないエピトープ）を含む。これらのペプチド中のクリプティ ックエピトープの存在を確認するために、同じ個体からの末梢白血球を、各ペプ チドの存在下で、ペプチド反応性Ｔ細胞株を樹立するために別々に培養すること によって、Ｔ細胞株を樹立することが出来る。次いで、「休止」Ｔ細胞を、各ペ プチド及びDerpＩ蛋白質でチャレンジすることが出来る。少なくとも１つのクリ プティックエピトープを含むペプチドは、そのペプチド又は完全な蛋白質の存在 下で、培地対照の少なくとも２倍より高レベルでＴ細胞株の増殖を刺激すること が出来、又はＴ細胞を寛容化することが出来る。同等物 当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例の多くの同等物を認識し、又は 常例的実験を用いて確認することが出来る。かかる同等物は、後述の請求の範囲 に含ま れるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者において蛋白質抗原に対する免疫寛容を誘導する方法であって、その患 者に、その抗原から誘導した少なくとも１種のクリプティックペプチド及び製薬 上許容し得るキャリアーを含む組成物の寛容化量を投与することを含む、上記の 方法。 ２．患者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。 ３．哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の方法。 ４．組成物を経口投与する、請求項１に記載の方法。 ５．蛋白質抗原がアレルゲンである、請求項１に記載の方法。 ６．アレルゲンが、下記よりなる群から選択する属のものである、請求項５に記 載の方法：Dermatophagoides 属、Felis 属、Ambrosia属、Lolium属、Cryptomeria 属、Alte rnaria 属、Alder 属、Betula属、Quercus 属、Olea属、Artemisia 属、Plantago 属、Parietaria属、Canine属、Blattella 属、Apis属、Periplaneta 属、及びSo rghum 属。 ７．アレルゲンが、Dermatophagoides pteronyssinus種のものである、請求項６ に記載の方法。 ８．アレルゲンが、DerpＩである、請求項７に記載の方法。 ９．蛋白質抗原が、自己抗原である、請求項１に記載の方法。 １０．自己抗原を、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質、ｒｈ因子、アセチル コリンレセプター、甲状腺細胞レセプター、基底膜蛋白質、甲状腺蛋白質、ＰＭ −１、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６４Ｋ）及びカルボキシペプチダーゼ Ｈよりなる群から選択する、請求項９に記載の方法。 １１．哺乳動物が、蛋白質抗原に感受性の哺乳動物である、請求項２に記載の方 法。 １２．組成物が、更に、蛋白質抗原から誘導された免疫優性エピトープを含むペ プチドを含む、請求項１に記載の方法。 １３．患者においてアレルゲンに対する免疫寛容を誘導する方法であって、その アレルゲンから誘導した少なくとも１つのクリプティックペプチド及び製薬上許 容し得るキャリアーを含む組成物の寛容化量を患者に経口投与することを含む、 上記の方法。 １４．アレルゲンが、下記よりなる群から選択する属のものである、請求項１３ に記載の方法：Dermatophagoides 属、Felis 属、Ambrosia属、Lolium属、Cryptomeria 属、Alte rnaria 属、Alder 属、Betula属、Quercus 属、Olea属、Artemisia 属、Plantago 属、Parietaria属、Canine属、Blattella 属、Apis属、Periplaneta 属、及びSo rghum 属。 １５．アレルゲンが、Dermatophagoides pteronyssinus種のものである、請求項 １４に記載の方法。 １６．アレルゲンがDerpＩである、請求項１５に記載の方法。 １７．患者がヒトである、請求項１３に記載の方法。 １８．患者がアレルゲンに感受性のヒトである、請求項１７に記載の方法。 １９．患者において蛋白質抗原に対する免疫寛容を誘導するための組成物であっ て、その蛋白質抗原から誘導したクリプティックペプチドの寛容化量及び製薬上 許容し得るキャリアーを含む、上記の組成物。 ２０．経口投与に適した形態の、請求項１９に記載の組成物。 ２１．蛋白質抗原がアレルゲンである、請求項１９に記載の組成物。 ２２．アレルゲンが下記よりなる群から選択する属のものである、請求項２１に 記載の組成物：Dermatophagoides 属、Felis 属、Ambrosia属、Lolium属、Cryptomeria 属、Alte rnaria 属、Alder 属、Betula属、Quercus 属、Olea属、Artemisia 属、Plantago 属、Parietaria属、Canine属、Blattella 属、Apis属、Periplaneta 属、及びSo rghum 属。 ２３．アレルゲンがDermatophagoides pteronyssinus種のものである、請求項２ ２に記載の組成物。 ２４．アレルゲンがDerpＩである、請求項２３に記載の組成物。 ２５．蛋白質抗原が自己抗原である、請求項１９に記載 の組成物。 ２６．自己抗原を、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質、ｒｈ因子、アセチル コリンレセプター、甲状腺細胞レセプター、基底膜蛋白質、甲状腺蛋白質、ＰＭ −１、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６４Ｋ）及びカルボキシペプチダーゼ Ｈからなる群より選択する、請求項２５に記載の組成物。 ２７．蛋白質抗原から誘導された免疫優性エピトープを含むペプチドの寛容化量 を更に含む、請求項１９に記載の組成物。 ２８．アレルゲンに対する経口寛容を患者において誘導するための組成物であっ て、そのアレルゲンから誘導したクリプティックペプチドの寛容化量及び製薬上 許容し得るキャリアーを含む、経口投与に適した形態の、上記の組成物。 ２９．蛋白質抗原から誘導した免疫優性エピトープを含むペプチドの寛容化量を 更に含む、請求項２８に記載の組成物。